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Procédé de préparation d'un vaccin. liquide des bactéries de Brucella abortus.
On sait depuis de nombreuses années que l'homme, les bovidés, les moutons, les chèvres et les porcs sont suscepti- bles d'être contaminés par des bactéries du groupe Brucella .
La bactérie Brucella abortus doit sa notoriété au fait qu'elle provoque notamment l'avortement épizootique chez les vaches.
Cette forme de brucellose entraîne non seulement la perte du foetus, mais peut être une cause directe de maladies et de baisse de production chez la mère. Chez les moutons et les chèvres, on rencontre des Infections provoquées par les Brucella melitensis qui engendrent également de graves maladies.
De très larges recherches ont été effectuées en vue de combattre efficacement les infections causées par la Brucella abortus. C'est ainsi qu'on est parvenu à cultiver cette bactérie
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sur milieu artificiel, tant solide que liquide, ce qui en principe, permettait de préparer des vaccins. D'autre part, on s'est effor- cé de déterminer quelles étaient les souches de cette bactérie qui, en pratique, procuraient l'immunité la plus efficace, sans provo- quer d'effets secondaires indésirables.
Parmi les différentes souches du groupe Bruoella abor- tus, on a notamment préparé des vaccins de la souche dite 19. Cet- te souche est avirumleetnet, administrée à l'état vivant, elle procure une bonne immunité. L'inconvénient est que les animaux traités à l'aide de ce vaccin présentât des titres d'agglutina- tion positifs, souvent persistants. Dès lors, ces animaux ne peu- vent plus être distingués sérologiquement par la suite, d'un ani- mal qui a contracté une infection naturelle. Une autre souche de
Brucella abortus, qui ne présente pas les inconvénients précités, est la souche 45/2- rough, sélectionnée par Mc. Ewen )Vet. Rec,
50, 1097, 1938).
Administrée à l'état vivant, cette souche procure une bonne immunité contre les infections produites par la Brucella abortus, alors qu'il n'apparaît pratiquement pas d'effets agglu- tinogènes. Du fait qu'après passage dans des animaux elle peut à nouveau reprendre une forme virulente, cette souche ne peut être appliquée que sous forme de vaccins inactivés.
Différents chercheurs se sont penchés sur le problème de la mise en formule la plus efficace du vaccin inactivé de
Brucella, Diverses publications ont apporté la démonstration du fait qu'un vaccin inactivé de Brucella abortus mis sous forme d'adjuvant procure une plus grande immunité que ce même vaccin placé dans un milieu uniquement aqueux (Live, J. Am. Veto Res.
10,34 (1949), Watkin & Dzenes, Can. J. of Comp. Med. and Veto
Sc. 16,78,1952 a).
Pour ces essais l'adjuvant était constitué par une huile minérale additionnée d'un émulsifiant. Comme émulsifiant, on utilisait l'Arlacel A, l'Arlacel B et le Falba.
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Ma. Ewen à également préparé un vaccin adjuvant inac- ttv4 à partir de la souche 45/20 rough, l'adjuvant étant constitué par quatre parties de paraffina -liquide B,P, et une partie de Falba (Vote Bec. 67, 546 (1955 . Il obtint une très bonne immuni- te su? des animaux d'expérience, sans qu'il se produise de titres dEEa'M-on géants, Me, Diarmid (Vêt. Poo ka 1067, 1957, 9et .
Roc, , Vit, 1960t Anne de l'Institut Pasteur 2,U, 792-799, 1962) a poursuivi les essais de Ma Ewen sur de petits animaux d'expérience . et sur des bovidés, et en a confirma les résultats,
Par contre, on a constate que ce vaccin provoquait un fâcheux gonflement local, que l'injection soit pratiquée par voie
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ântyamnsculaire ou sous-cutanée, Cet inconvénient est loin d'être ; négligeable du fait que la valeur des bovidés baisse, lorsque des gestions provoquent des modifications locales des tissus.
Or, la Demanderesse a mis au point un procédé de pré- parution d'un vaccin adjuvant d'une souche inactivée de Brucella
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afeortws, ainsi qu'un procédé d'administration d'un vaccin de ce genre gs'âce auquel on peut obtenir une immunité relativement élevée chez les bovidés, sans que la valeur du bétail en soit diminuée pour autant.
Des expériences effectuées par la Demanderesse ont per- mis de constater que la culture dans un milieu liquide donne un Fondement notablement plus élevé en bactéries de Brucella abor- tus que la culture sur milieu solide. D'autre part, la Deman- deresse à constaté qu'un vaccin fabriqué à l'aide d'une culture de ces bactéries dans un milieu liquide procure une plus grande immunité qu'un vaccin contenant le même nombre de ces bactéries cultivées sur un milieu solide. Ces résultats ont notamment été
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notes avec des bactéries de Brucella abortus Me. Ewen 45/20 rough ou avec des stades d'évolution de ces bactéries.
Suivant une forme préférée de l'invention on utilise spécialement les bactérien
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- de cette souche ou des stades d'évolution de ces bactéries.
De plus, la Demanderesse a constaté que les résultats atteints avec un vaccin adjuvant dont l'émulsifiant était consi- tué par un émulsifiant ea-dans-hytle .avec. une valeur H.L.B. de
1-8 et un émulsifiant huile-dans-eau avec une valeur H.L.B. de
13-18, alors que la quantité d'émulsifiant huile-dans-eau repré- sente 10 à 2% en volume, de l'émulsifiant eau-dans-huie, étaient meilleurs que ceux obtenus avec un vaccin adjuvant correspondant,, dans lequel on n'utilise qu'un émulsifiant, du type eau-dans-huile.
Le vaccin oonsidéré en premier lieu a une plus grande stabilité ! que le vaccin adjuvant de l'autre type et présente, à basse tem- pérature, une viscosité nutablement plus faible,
Ces avantages se manifestent en particulier lorsqu'on utilise comme ém7lifiant eau-dans-huile, les mono-, bi-, ou triesters d'oléate de mannide, de sorbitane, de mantine, ou des mélanges de ces esters, de préférence du mono-oléate de man- nide, et comme émulsifiant hile-dans-eau, des dérivés de poly- oxyéthylène d'esters d'un polyalcool et d'un acide gras, avec 12-20 atomes de carbone,
de préférence un dérivé de polyoxyéthy- lène d'huile de ricin qui contient en moyenne 35-45 groupes d'oxy- éthylène par molécule d'huile de ricin. Grâce à cette dernière propriété, le vaccin cité en premier lieu est plus aisément in- jectable que celui de l'autre type, alors que la grande stabilité de l'émulsion permet d'obtenir une longue action antigène et une haute immunité. La Demanderesse a également constaté qu'en in- jectant un vaccin adjuvant par voie intramusculaire, on évite en grande partie l'apparition d'un gonflement à l'endroit bü s'ef- fectue l'injection, ce qui n'est pas le cas lorsque le vaccin est administré par voie sous-cutanée. L'injection se fait de préférence dans les muscles du cou, juste devant l'omoplate.
A cet endroit, l'injection est pratiquement indolore, alors que le gonflement,' s'il se produit, n'a qu'une faible étendue, et se situe en un
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endroit où la viande a peude valeur. D'autre part, les muscles situés juste devant l'omoplate sont peu contractiles, de sorte que le vaccin reste bien localisé et qu'il ne peut se produire aucun gonflement en dehors de l'endroit où s'est effectuée l'in- jection. La vaccination est répétée au moins une fois, en vue d'obtenir une immunité maximale.
On procède de préférence à deux injections, séparées par un intervalle de 8 à 12 semaines. ! Lordqu'on procède de cette façon, l'immunité, compte tenu de différences éventuelles d'animal à animal, est aussi bonne que celle qui peut être obtenue avec une injection d'un vaccin vivant de la souche 19, avec l'avantage qu'il ne se pré- sente pas ou guère de titres d'agglutination.
Par suite du haut rendement en bactéries par ml de liquide de culture et de leur valeur immunisante, l'invention offre l'avantage supplémentaire qu'il est possible d'injecter-, A chaque vaccination une petite quantité de vaccin adjuvant (2 si) contenant un grand nombre de bactéries inaotivées, à avoir 40.109 par ml. de liquide de vaccin. En pratique, un Dopage plus faible, à savoir 200.109 bactéries suffit par in- Section.. En général, on administre 50-500.109 bactéries par injection par animal.
EXEMPLE On a ajouté, dans une ampoule contenant; des germes vivants ayant subi une cryodessichtion de Brucella abortus de al souche 45/20 (nombre total de germen 50.109). 2 ml d'une so- luiton saline tryptose, physiologique. Ensuite, dans 20 tubes rem- plis d'agar tryptose, on a versé 0,05 ml de la suspension pré- citée. Les tubes ont été conservés pendant 24 heures, tout en étant agités à l'air, à 37 C.
Ensuite on a ajouté à chaque tube,
2 ml d'un'agent liquide, dont on avait préparé un litre de la façon suivante:100- ml d'eau du robinet, 30 gr de protéose paptoj "Difco". 30 gr do glucose (qualité pharmaceutique) , 10 gr
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de complexe de vitamine B, sous forme d'extrait de levure, 2,004 gr de phosphate secondaire de sodium (NaNPO.2H2O).
A l'aide des cultures ainsi obtenues on a ensemencé des agitateurs contenant chacun 200 ml de l'agent liquide cité dans le précédent alinéa. Les agitateurs furent aérés deux fois pen- dant 24 heures, à 37 C Le contenu de chaque agitateur fut en- suite divisé en 10 parties égales et chaque partie versée dans un agitateur contenant 200 ml de l'agent liquide précité.
Chaque agitateur fut aéré deux fois, pendant 24 heures à 37 c. A la.fin.du troisième joue,con a compté le nombre de ger- mes (inacivéwou vivants) par ml. Celui-ci s'élevait en moyenne à 150.109 En d'autres mots, le facteur de multiplication était de 6 (concentration de départ des germes : 25.10 germes par ml).
Le nombre de germes vivants par ml. s'élevait dans les cultures, environ 75.10'. Ensuite les bactéries furent inactivées en chauffant les cultures à 60 c pendant deux heures. Le liquide fut centrifugé, le liquide clair rejeté et le produit de centrifgug- tion fut remis en suspension dans le l'eau additionnée de morthi- olate, dans le 'rapport de l à 10.000. La concentration finale des 'germes- s'élevait à 400.109 par m;l.
55 ml de la suspension ainsi obtenue furent homogé- néisés, goutte à goutte, tout en agitant énergiquement, dans des conditions stériles, dans un mélange stérile de 40 cm' d'huile de vaccin (marque Bayai F), viscosité 9 c.p.à 37,7 C trakret d'ébulltion 314-357 c. 4,7 cm3 de monaléage de mannide et 0,3 cm3 d'huile de ricin polyoxyéthylée contenant environ 40 moles d'oxyéthylène par mole d'huile de ricin.
Le vaccin ainsi préparé fut conservé pendant 4 mois, à 40 C, après quoi il était encore parfaitement stable et ne présentait aucune séparation d'huile. Lorsque, dans exactement les mêmes conditions, et avec l'utilisation des mêmes composants, mais en omettent l'huile de ricin polyoxyéthylée, on réalisa un second vaccin adjuvant,
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celui-ci présentait, après conservation dans les mêmes conditions, au bout de 4 mois, 65% de séparation d'huile rapportée à la quan- tité d'huile minérale initiale, tandis que la possibilité d'in- jection de ce dernier vaccin étaient notablement moindre, surtout à basse température (5-10 C)
Avec le vaccin adjuvant ainsi préparé,
on a vacciné des - bovidés dans les muscles du cou juste devant l'omoplate. On a in- jeeté à chaque animal 2 ml, contenant environ 400.109 bactéries ou germes. Parmi les sept animaux vaccinés, un seul d'entre eux présenta une réaction, alors que chez les autres animaux ne s'est mani- festé aucun gonflement ou ce gonflement n'était guère étendu.
Dix semaines après la première vaccination, on procéda à une se- conde injection du même vaccin, également à raison de 2 ml par animal.
Suivant un autre plan d'expérience, on a préparé un vaccin adjuvant d'un vaccin liquide obtenu hors d'une culture sur milieu solide de bactéries de Brucella abortus de la souche 4.5/20. Sur milieu solide, le rendement en germes est inférieur celui obtenu dans le milieu liquide.
Lors de la préparation du liquide de vaccin on a veillé à atteindre également une concen- tration de 400.109 germes par ml. La transformation de liquide de vaccin en vaccin adjuvant s'est faite de la même façon que pour la préparation du vaccin adjuvant d'un liquide de vaccin provenant d'une culture dans un milieu liquide, de sorte que l'on a obtenu finalement deux vaccins adjuvants contenant le même nombre de germes par ml. et qui ne différaient que par le mode de culture des germes, On a également injecté le second type de vaccin adju- vant à un groupe de sept bovidés, par voie intramusculaire, dans le cou, devant l'omoplate. Les dosages étaient identiques pour chaque animal et pour chaque groupe.
En vue de déterminer l'efficacité des vaccinations, on
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a déterminé, 6 et 12 semaines après la seconde vaccination, la concentration en anticorps protecteurs, en mesurant le titre de Coombs du sérum. Dans les deux cas, on a constaté que le vaccin adjuvant préparé à l'aide de bactéries cultivées dans le milieu liquide procurait un titre de Coo'mbs supérieur- à celui produit par le vaccin adjuvant préparé à l'aide de bactéries cultivées sur milieu solide.
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A method of preparing a vaccine. liquid of Brucella abortus bacteria.
It has been known for many years that humans, cattle, sheep, goats and pigs are susceptible to contamination by bacteria of the Brucella group.
The bacteria Brucella abortus owes its notoriety to the fact that it causes epizootic abortion in cows in particular.
This form of brucellosis not only results in the loss of the fetus, but can be a direct cause of disease and decreased production in the mother. In sheep and goats, infections caused by Brucella melitensis are found which also cause serious illness.
Extensive research has been done to effectively combat infections caused by Brucella abortus. This is how we managed to cultivate this bacterium
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on an artificial medium, both solid and liquid, which in principle made it possible to prepare vaccines. On the other hand, efforts have been made to determine which strains of this bacterium in practice provide the most effective immunity without causing undesirable side effects.
Among the various strains of the aborted Bruoella group, vaccines of the so-called 19 strain have in particular been prepared. This strain is avirumleetnet, administered in the living state, it provides good immunity. The disadvantage is that animals treated with this vaccine showed positive agglutination titers, often persistent. Therefore, these animals can no longer be distinguished serologically from an animal which has contracted a natural infection. Another strain of
Brucella abortus, which does not have the aforementioned drawbacks, is the 45/2-rough strain, selected by Mc. Ewen) Vet. Rec,
50, 1097, 1938).
Administered alive, this strain provides good immunity against infections produced by Brucella abortus, while virtually no agglutinogenic effects appear. Due to the fact that after passage through animals it can again take on a virulent form, this strain can only be applied in the form of inactivated vaccines.
Different researchers have looked into the problem of the most effective formulation of the inactivated vaccine of
Brucella, Various publications have demonstrated that an inactivated Brucella abortus vaccine in adjuvant form provides greater immunity than this same vaccine placed in an aqueous medium only (Live, J. Am. Veto Res.
10.34 (1949), Watkin & Dzenes, Can. J. of Comp. Med. and Veto
Sc. 16,78,1952 a).
For these tests, the adjuvant consisted of a mineral oil added with an emulsifier. As an emulsifier, Arlacel A, Arlacel B and Falba were used.
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Ma. Ewen also prepared an adjuvant vaccine inact-ttv4 from the strain 45/20 rough, the adjuvant consisting of four parts of paraffin-liquid B, P, and one part of Falba (Vote Bec. 67, 546 (1955. He obtained very good immunity to experimental animals, without any giant dEEa'M-on titers occurring, Me, Diarmid (Vêt. Poo ka 1067, 1957, 9et.
Roc,, Vit, 1960t Anne of the Institut Pasteur 2, U, 792-799, 1962) continued Ma Ewen's tests on small experimental animals. and on bovids, and confirmed the results,
On the other hand, it was found that this vaccine caused an annoying local swelling, that the injection is practiced by
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ntyamnsular or subcutaneous. This inconvenience is far from being; negligible because the value of bovids decreases when management causes local tissue changes.
Now, the Applicant has developed a process for the preparation of an adjuvant vaccine of an inactivated strain of Brucella.
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afeortws, as well as a method of administering such a vaccine gs''with which relatively high immunity can be obtained in bovids without diminishing the value of the cattle.
Experiments carried out by the Applicant have made it possible to observe that the culture in a liquid medium gives a substantially higher basis in aborted Brucella bacteria than the culture on a solid medium. On the other hand, the Applicant has found that a vaccine produced using a culture of these bacteria in a liquid medium provides greater immunity than a vaccine containing the same number of these bacteria cultivated on a. solid medium. These results were notably
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notes with bacteria of Brucella abortus Me. Ewen 45/20 rough or with stages of evolution of these bacteria.
According to a preferred form of the invention, the bacterial
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- of this strain or of the stages of evolution of these bacteria.
In addition, the Applicant has observed that the results obtained with an adjuvant vaccine, the emulsifier of which was considered to be an ea-in-hytle emulsifier. an H.L.B. of
1-8 and an oil-in-water emulsifier with an H.L.B. of
13-18, while the amount of oil-in-water emulsifier represents 10 to 2% by volume, of the water-in-oil emulsifier, were better than those obtained with a corresponding adjuvant vaccine, in which only an emulsifier of the water-in-oil type is used.
The vaccine considered in the first place has greater stability! than the adjuvant vaccine of the other type and has, at low temperature, a nutably lower viscosity,
These advantages are manifested in particular when the water-in-oil em7lifier is used, mono-, bi- or triesters of oleate of mannide, of sorbitan, of mantin, or of mixtures of these esters, preferably of mono mannide oleate, and as hil-in-water emulsifier, polyoxyethylene derivatives of esters of a polyalcohol and of a fatty acid, with 12-20 carbon atoms,
preferably a polyoxyethylene derivative of castor oil which contains an average of 35-45 oxyethylene groups per molecule of castor oil. Thanks to this last property, the vaccine mentioned in the first place is more easily injectable than that of the other type, while the great stability of the emulsion makes it possible to obtain a long antigenic action and a high immunity. The Applicant has also found that by injecting an adjuvant vaccine intramuscularly, the appearance of swelling at the site where the injection takes place is largely avoided, which is not possible. the case when the vaccine is administered subcutaneously. The injection is preferably given into the muscles of the neck, just in front of the scapula.
At this point the injection is practically painless, while the swelling, if it occurs, is of small extent, and is situated at one point.
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place where meat is of little value. On the other hand, the muscles located just in front of the scapula are not very contractile, so that the vaccine remains well localized and that no swelling can occur outside the place where the injection took place. jection. The vaccination is repeated at least once, in order to obtain maximum immunity.
Two injections are preferably given, separated by an interval of 8 to 12 weeks. ! If this is done, the immunity, taking into account any differences from animal to animal, is as good as that which can be obtained with an injection of a live vaccine of strain 19, with the advantage that no or hardly any agglutination titers.
Owing to the high yield of bacteria per ml of culture liquid and their immunizing value, the invention offers the additional advantage that it is possible to inject - At each vaccination a small quantity of adjuvant vaccine (2 si) containing a large number of inaotivated bacteria, to have 40.109 per ml. vaccine fluid. In practice, a lower Doping, ie 200.109 bacteria is sufficient per section. In general, 50-500.109 bacteria are administered per injection per animal.
EXAMPLE In an ampoule containing; live germs which have undergone a freeze-drying of Brucella abortus from al strain 45/20 (total number of germs 50.109). 2 ml of a physiological tryptose saline solution. Then, into 20 tubes filled with tryptose agar, 0.05 ml of the above suspension was poured. The tubes were stored for 24 hours, while being stirred in air, at 37 C.
Then we added to each tube,
2 ml of a liquid agent, one liter of which had been prepared as follows: 100 ml of tap water, 30 g of paptoj "Difco" proteose. 30 gr of glucose (pharmaceutical grade), 10 gr
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of vitamin B complex, in the form of yeast extract, 2.004 gr of secondary sodium phosphate (NaNPO.2H2O).
Using the cultures thus obtained, stirrers each containing 200 ml of the liquid agent mentioned in the previous paragraph were inoculated. The agitators were aerated twice over 24 hours at 37 ° C. The contents of each agitator were then divided into 10 equal parts and each part poured into a agitator containing 200 ml of the above liquid agent.
Each shaker was aerated twice, for 24 hours at 37 c. At the end of the third cheek, count the number of germs (inacivated or alive) per ml. This averaged 150.109 In other words, the multiplication factor was 6 (starting germ concentration: 25.10 germs per ml).
The number of living germs per ml. amounted in crops, about 75.10 '. Then the bacteria were inactivated by heating the cultures at 60 ° C for two hours. The liquid was centrifuged, the clear liquid discarded, and the centrifugation was resuspended in water with morthilolate added, in the ratio of 1 to 10,000. The final concentration of germs was 400.109 per ml.
55 ml of the suspension thus obtained were homogenized, dropwise, while stirring vigorously, under sterile conditions, in a sterile mixture of 40 cm 3 of vaccine oil (brand Bayai F), viscosity 9 cp to 37 , 7 C trakret d'ébulltion 314-357 c. 4.7 cm3 of monalearage of mannide and 0.3 cm3 of polyoxyethylated castor oil containing about 40 moles of oxyethylene per mole of castor oil.
The vaccine thus prepared was stored for 4 months at 40 ° C., after which it was still perfectly stable and showed no oil separation. When, under exactly the same conditions, and with the use of the same components, but omitting polyoxyethylated castor oil, a second adjuvant vaccine was produced,
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this showed, after storage under the same conditions, at the end of 4 months, 65% of oil separation relative to the initial quantity of mineral oil, while the possibility of injection of the latter vaccine were notably less, especially at low temperatures (5-10 C)
With the adjuvant vaccine thus prepared,
bovids were vaccinated in the neck muscles just in front of the scapula. Each animal was injected with 2 ml, containing about 400.109 bacteria or germs. Of the seven vaccinated animals, only one of them showed a reaction, while in the other animals no swelling was evident or the swelling was hardly extensive.
Ten weeks after the first vaccination, a second injection of the same vaccine was given, also at a rate of 2 ml per animal.
According to another experimental design, an adjuvant vaccine was prepared for a liquid vaccine obtained from a culture on solid medium of bacteria of Brucella abortus of the strain 4.5 / 20. On solid medium, the seed yield is lower than that obtained in the liquid medium.
When preparing the vaccine liquid, care was taken to also achieve a concentration of 400.109 bacteria per ml. The conversion of vaccine liquid to adjuvant vaccine was done in the same way as for the preparation of adjuvant vaccine from vaccine liquid from culture in liquid medium, so that ultimately two adjuvant vaccines containing the same number of germs per ml. and which differed only in the method of culturing the germs. The second type of adjuvant vaccine was also injected into a group of seven bovids, intramuscularly, in the neck, in front of the scapula. The dosages were identical for each animal and for each group.
In order to determine the effectiveness of vaccinations, we
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determined, 6 and 12 weeks after the second vaccination, the concentration of protective antibodies, by measuring the Coombs titer of the serum. In both cases, it was found that the adjuvant vaccine prepared using bacteria grown in liquid medium provided a higher Coo'mbs titre than that produced by the adjuvant vaccine prepared using bacteria grown on medium. solid.