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" Procédé de préparation d'hormones oestrogéniques ".
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La présente invention est relative à la prépara- tion de substances hydrosolubles oestrogéniquement actives à partir d'urine de cheval. Dans le brevet belge n 464.306 déposé le 4 avril 1946, on a décrit un produit caractérisé par les particularités suivantes : - il contient sensiblement la totalité des substances hydrosolubles oestrogéniquement actives par voie buccale, contenues dans l'urine de cheval non hydrolysée (urine de juments gravides ou d'étalons); - il est sensiblement soluble dans l'eau et sensi- blement insoluble dans le benzol et l'éther; - il convient pour le traitement du syndrome de la ménopause chez les humains et produit une cornification vaginale chez les rats adultes sur lesquels on a pratiqué l'ovariotomie, et - il est stable et théapeutiquement non toxique .
Dans le brevet belge susdit, on a décrit un procédé de préparation d'un produit tel que défini ci-dessus, dans lequel procédé on met de l'urine de cheval, qui n'a pas subi d'hydrolyse sensible, en contact, tout en mainte- nant des conditions propres à empêcher son hydrolyse, avec un agent susceptible de donner lieu à la séparation d'une fraction normalement hydrosoluble, contenant les substances hydrosolubles stabilisatrices et oestrogéniques actives parvoie buccale de l'urine de cheval, et on sépare la fraction susdite de l'agent susdit, dans des conditions propres à empêcher une hydrolyse notable . Le mode opéra- toire préféré du procédé décrit dans le brevet susdit, implique une adsorption et une élution.
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La demanderesse a trouvé à présent un procédé, grâce auquel on peut obtenir un produit similaire présen- tant, de manière inattendue, une activité plus élevée par unité de poids. Le procédé de la demanderesse impli- que le traitement d'urine de cheval à l'aide d'un sol- vant organique sensiblement insoluble dans l'eau, ce sol- vant étant choisi dans la classe comprenant les alcools et les cétones solubles dans l'eau à raison de moins de 6 %.
Les produits de la présente invention sont obtenus à partir d'urine de cheval sous forme liquide , séchée ou concentrée . L'urine de départ est, de préférnece, fraîche ou oonservée, de manière appropriée, par exemple à l'aide d'un mélange de chloroforme et d'alcool, pour en empêcher l'hydrolyse . Cette urine est, de préférence, celle de juments gravides ou d'étalons, la préférence étant accordée à l'urine de juments gravides, La matière de départ peut être constituée soit par de l'urine brute, soit par de l'urine , qui a été concentrée, par exemple séchée par pulvérisation ou partiellement purifiée . Tou- tefois, un avantage important du procédé réside dans son aptitude à être appliqué directement à de l'urine brute et à réaliser une séparation initiale maximum.
Les solvants d'extraction préférés sont l'hexanol, le cyclohexanol, le méthylcyclohexanol, la cyclohexano- ne et l'isophorone, la préférence étant donnée à l'hexanol.
Le procédé suivant l'invention convient, de manière inattendue, pour séparer les substances oestrogéniquement actives de l'urine, à l'exclusion des matières solides oestrogéniquement inertes. En d'autres mots, le rapport de l'extraction principe actif : matières solides est
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inopinément\favorable . Un précipité utilisable thérapeuti- quement peut être dérivé de l'extrait au solvant, par simple concentration, de préférence sous vide Le concentrat obtenu contient moins de 3 % environ des ma- tières solides urinaires et au moins 80% environ du princi- pe oestrogéniquement actif. Ce concentrât peut être utilisé directement comme produit thérapeutique, mais la demande- resse préfère le soumettre à un traitement ultérieur.
Un mo- de préféré d'exécution de ce traitement ultérieur est la suivant :
L'extrait obtenu en traitant l'urine de départ à l'ai- de d'un solvant est lavé tout d'abord à l'aide d'un hydroxy- de alcalin (de préférence une solution 2N) et ensuite,si on le désire, une seule fois, à l'aide d'un très petit volume d'eau, par exemple à l'aide d'un volume d'eau inférieur à 5% environ. On obtient ainsi un extrait lavé, dont sont éli- minées de grandes quantités de substances solubles dans les alcalis. L'extrait lavé est ensuite concentré, de pré- férence sous vide . On obtient ainsi un concentrat, dont la majeure partie du solvant insoluble dans l'eau est éliminée.
Ce concentrat peut être traité de manière à en précipiter une fraction contenant les substances oestrogéniques hydro- solubles. Cette précipitation peut s'effectuer en ajoutant au concentrat un hydrocarbure aliphatique liquide inférieur, tel que l'hexane, le pentane ou l'heptane, la préférence étant donnée à l'hexane . Bien que la fraction obtenue puis- se être utilisée comme agent thérapeutique, la demanderesse préfère encore la soumettre à un traitement ultérieur.
Au lieu d'être traité par un hydro carbure , le concen- trat susdit peut être mélangé à une cétone hydrosoluble,la fraction insoluble dans la cétone étant rejetée, tandis que la fraction soluble dans la cétone et contenant le principe actif est concentrée, de préférence sous vide.Com- me cétones, on préfère employer de l'acétone et de la
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méthyléthylcétone .
La fraction soluble dans la cétone est ensuite addi- tionnée de l'hydrocarbure liquide précité, dans lequel les substances oestrogéniques hydrosolubles sont insolubles, 'de manière à former un mélange. Comme hydrocarbure, on emploie , de préférence, de l'hexane, comme il a été dit ci-dessus. Le mélange obtenu est ensuite extrait au moyen d'eau, en sorte que les substances oestrogéniques hydroso- lubles passent dans la phase aqueuse, tandis que dans la phase solvant passent des impuretés et des quantités varia- bles d'oestrogènes non conjugués, qui peuvent être récupé- rés.
Le nouveau produit,résultant du procédé complet décrit ci-dessus, contient les substances hydrosolubles oestrogé- niquement actives par voie buccale, contenues dans l'urine de cheval non hydrolysée, notamment les sulfates d'oestrone belle que l'équiline, l'équilénine, le bêta-oestradiol et la bêta-dihydro-équilénine. Physiquement le produit est sen siblement soluble dans l'eau, dans l'alcool méthylique et dans l'acétone, insoluble dans le benzène, le chloroforme et l'éther, stable, non toxique et contient moins de 1% environ des matières solides de l'urine de départ. Physio- logiquement , le produit est efficace pour le traitement du syndrome de la ménopause chez les humains et produit une cornification vaginale chez les rats adultes,sur lesquels on a pratiqué ltovariotomie .
Enfin le produit est pratiquement exempt de glycuronides, c'est-à-dire qu'il en contient moins de
0,5 % environ en poids.
Le produit peut être traité subséquemment par lavage, comme décrit dans le brevet belge n 476.705 déposé le 29 novembre 1947, à l'aide d'un solvant orga- nique insoluble dans l'eau, à un pH compris entre 4 et 6
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environ. La solution résultante est rendue faiblement alcaline et concentrée sous vide . Comme solvants préférés, on utilise les hydrocarbures colorés et en particulier le bichlorure d'éthylène . Le produit obte- nu à la suite de ce dernier traitement est sensible- ment inodore et exempt d'huiles phénoliques .
Le produit de la présente invention contient égale- ment les facteurs de stabilité essentiels pour maintenir l'activité du principe oestrogénique hydrosoluble . On a constaté également que ce produit ne contient pas moins de 20% environ de matière biologiquement active, ce pourcentage étant exprimé en sulfate sodique d'oes- trone, et est également sensiblement inodore et exempt d'huiles phénoliques.
D'autres particularités et détails de l'invention apparaîtront dans le schéma et dans l'exemple suivant illustrant des modes opératoires préférés.
Le schéma donné ci-après représente un mode opératoire complet du procédé suivant l'invention, ainsi qu'une variante d'un tel mode opératoire.
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SCHEMA Stade 1 - URINE - Extraction à l'aide d'un solvant insoluble dans l'eau (solubilité dans l'eau inférieure à 6%)
EMI7.1
J 1 la. Extrait solvant lb. Urine utilisée (rejetée) lit Concentration sous vide---,, Stade 2 Lavage au moyen d'hydroxyde alcalin (2N) l'a. Précipité de sub- stances oestrogé- niques hydrosolu- bles , 1 2a. Extrait lavé 2b. Matières solubles dans les alcalis (rejetées) Stade 3 - Concentration sous vide E##############'############## 3a. oncentrat 3b. Solvant L# ,3 -- . addition d'un hydrocarbure aliphatique liquide inférieur 41 Ik 3'a. Précipité de substances 3SA Hydrocarbure oestrogéniques sol.
3t c. Eau 3'd. Solution aqueuse de substances oestrogé- niques hydrosolubles Stade 4 - Addition de cétone hydrosoluble l 1 - i 4a. Fraction d'oestrogène 4b. Fraction insoluble soluble dans la cétone dans la cétone Stade Co centration sous vide Stade 5 - Concentration sous vide 5a. C'oncentrat 5b. Solvant Stade 6 - Addition d'hydrocarbure aliphatique liquide inférieur et d'eau j################, 6a. Solution aqueuse de 6b. Fraction insoluble substances oestro- dans l'hydrocarbure géniques hydroso- (oestrogènes non conjugés) lubles
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Exemple I
50 gallons d'urine de juments gravides sontextraits à deux reprises à l'aide de dix gallons (volume 5 fois moindre) d'hexanol. On obtient ainsi 20 gallons d'extrait hexanolique .
Cet extrait est lavé à l'aide de 20 litres d'hydroxyde sodique 2N et soumis à une séparation dans une centrifuge Sharples. La fraction hexanolique est lavée, dans un cas, une seule fois à l'aide de 10 litres d'eau, tandis que, dans un autre cas, le lavage à l'eau est sup- primé . Le mélange est concentré sous vide jusqu'à un vo- lume d'1 litre . Au mélange concentré on ajoute 5 litres d'acétone et on soumet le mélange obtenu à une centrifuga- tion . Le centrifugat est concentré sous vide jusqu'à un volume d'1 litre , puis additionné de 2 litres d'hexane.
Le mélange obtenu est extrait une première fois à l'aide de 500 cc. d'eau et une seconde fois à l'aide de 250 ce. d'eau. La solution aqueuse obtenue contient les substances oestrogéniques hydrosolubles. La matière estrogénique obtenue est lyophylisée de manière à donner 86 grammes de matières solides contenant 20 % de sulfate sodique d'oestrone , ainsi que le révèle l'essai de Kober- Les matières solides sont dissoutes dans l'eau et le pH de la solution obtenue est ajusté à 4 au moyen d'acide chlorhydrique . Cette solution est lavée à deux reprises au moyen de bichlorure d'éth ylène . Le pH de la phase aqueuse est ajusté à 8 au moyen d'hydroxyde sodique 1N.
Le résidu obtenu pèse 72 grammes. On obtient finalement un produit solide contenant 27 % de substances oestrogéni- ques hydrosolubles, ce pourcentage étant calculé sous forme de sulfate sodique d'oestrone et déterminé par essai biologique et par l'essai de Kober.
La matière finale contient des traces de glycuronides .
Sa teneur en azote est d'environ 0,46 %. Sa teneur en
A
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soufre hydrolysable est de 5,54 %. Enfin sa teneur en cendres est d'environ 17,4 %.
Exemple 2
700 ce. d'urine de juments gravides prélevée en fin de gestation sont extraits à l'aide de 2 portions de 140 cc., (volume 5 fois moindre) des alcools .,1 et cétones mentionnés ci-dessous* La séparation est effec- tuée par centrifugation* Le tableau I indique la variation de la quantité de matières solides extraites pendant chaque extraction et les quantités d'oestrogène présentes dans les solides obtenus, en utilisant les divers solvants suivant la présente invention- Les résultats indiqués dans les tableaux suivants montrent clairement que les alcools et les cétones dont la solubi- lité dans l'eau est inférieure à 6% présentent une aptitude inattendue à extraire sélectivement le prin- cipe oestrogénique hydrosoluble de l'urine de cheval,
à l'exclusion des matières oestrogéniquement inertes.
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TABLEAU I Extractions initiales
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<tb> Solvant <SEP> 1ère <SEP> extraction <SEP> 2ème <SEP> extraction
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<tb> :Solides: <SEP> Kober: <SEP> % <SEP> oestrogènes <SEP> Solides: <SEP> Kober: <SEP> % <SEP> oestrogè-
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<tb> : <SEP> mg. <SEP> mg. <SEP> extrait <SEP> d'uri- <SEP> mg. <SEP> mg <SEP> :nes <SEP> rési-
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<tb> traits
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<tb> Hexanol <SEP> : <SEP> 930 <SEP> 15 <SEP> 48 <SEP> : <SEP> 500 <SEP> : <SEP> 7,6 <SEP> 46
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-'---,--.:a----=----- ...'--.....----- "" ---... -.. "" ..'-... - - - ..'-.-.......!.----. 4 .... 4 .
EMI10.3
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Cyclohexanol <SEP> : <SEP> 1400 <SEP> : <SEP> 17 <SEP> 54 <SEP> : <SEP> 1300 <SEP> : <SEP> 7,0 <SEP> 48
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EMI10.4
#####
EMI10.5
<tb> Méthylcyclo- <SEP> : <SEP>
<tb> -hexanol <SEP> (tech-:
<tb> nique) <SEP> : <SEP> 1050 <SEP> 14 <SEP> 45 <SEP> 600 <SEP> : <SEP> 8,6 <SEP> : <SEP> 49
<tb>
EMI10.6
-¯..!...---,.,..,.-.
EMI10.7
<tb> Cyclohexanone <SEP> 625 <SEP> 10,6: <SEP> 38 <SEP> 630 <SEP> 6,6 <SEP> : <SEP> 34
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EMI10.8
--0¯"--" -!...-""'¯!--- - -.¯----...--...- -¯-<;;>""¯L¯¯---"'"-------=--=--
EMI10.9
<tb> Isophorone <SEP> : <SEP> 850 <SEP> : <SEP> 16,4: <SEP> 56 <SEP> : <SEP> 360 <SEP> : <SEP> 5,6 <SEP> : <SEP> 40
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..L..----- ........--=4 ..a-----""''------"-=M¯--- suite du Tableau I Solvant Combiné
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<tb> Solides <SEP> Kober <SEP> : <SEP> % <SEP> principe <SEP> originel <SEP> :
<SEP> % <SEP> oestrogènes <SEP> dans
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<tb> mg, <SEP> ; <SEP> mg. <SEP> solides
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<tb> Hexanol <SEP> 1420 <SEP> 22,6 <SEP> . <SEP> 72 <SEP> 1,6
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<tb> Cyclohexanol <SEP> ; <SEP> 2700 <SEP> 24,0 <SEP> : <SEP> 76 <SEP> 0,9
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<tb> Méthylcyclo- <SEP> ; <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> hexanol <SEP> tech-
<tb>
<tb> nique <SEP> 1650 <SEP> 22,6 <SEP> . <SEP> 72 <SEP> 1,4
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb> Cyclohexanone <SEP> 1280 <SEP> 182, <SEP> 59 <SEP> 1,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Isophorone <SEP> 1210 <SEP> : <SEP> 23,0 <SEP> :
<SEP> 74 <SEP> 1,9
<tb>
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Les deux extraits sont combinés et lavés une fois à l'aide d'un volume cinq fois moindre d'hydroxy- de sodique 2N et une autre fois à l'aide d'un volume dix fois moindre d'eau . Le tableau II montre la perte en matières solides, après lavage des extraits,et la quantité de chromogènes présents dans les solides fi- naux déterminée par la méthode Kober.
TABLEAU II
Extraits lavés
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<tb> Extrait <SEP> initial <SEP> Extrait <SEP> lave <SEP> %* <SEP> Pertes: <SEP> :%Kober
<tb> Solvant <SEP> Solides <SEP> Kober <SEP> Solides <SEP> . <SEP> Kober <SEP> Solides <SEP> Kober <SEP> :dans
<tb> sol <SEP> fi-
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....."'"'. --Oo<c':"".. r--.... ..-.= ...-- -------......-... --....---- """"'-=0-----'-"-"--'" ,........---.----' ..............-----""---'"----""
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<tb> Hexanol <SEP> 1420 <SEP> mg.: <SEP> 22,6mg <SEP> 420 <SEP> 17,3 <SEP> 70% <SEP> 24% <SEP> : <SEP> 4,1
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-- ¯a. ----,,-...0 -....... ....!.....- ¯K- .. - -=--=-=--¯.... '..... -----------..- "" --
EMI11.5
<tb> Cyclohexanol: <SEP> 2700 <SEP> mg.: <SEP> 24,0 <SEP> : <SEP> 1400 <SEP> : <SEP> 20,0 <SEP> : <SEP> 50 <SEP> : <SEP> 17 <SEP> : <SEP> 1,4
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<tb> Méthylcyclo- <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> :
<SEP> :
<tb> hexanol <SEP> : <SEP> 1650 <SEP> : <SEP> 22,6 <SEP> : <SEP> 420 <SEP> : <SEP> 15,9 <SEP> : <SEP> 75 <SEP> : <SEP> 30 <SEP> 3,8
<tb>
EMI11.6
. -:0--"..."'" .-...........-"....¯...a...--....-........-.-.........-------->..-1.- ':-..-¯--"-"'-----
EMI11.7
<tb> Cyclohexa- <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> :
<tb> none <SEP> 1280 <SEP> : <SEP> 18,2 <SEP> : <SEP> 380 <SEP> : <SEP> 14,8 <SEP> : <SEP> 70 <SEP> 19 <SEP> : <SEP> 3,9
<tb>
<tb>
<tb> Isophorone <SEP> : <SEP> 1210 <SEP> : <SEP> 23,0 <SEP> 270 <SEP> : <SEP> 10,8: <SEP> 78 <SEP> : <SEP> 53 <SEP> 4,0
<tb>
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.