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" Procédé de préparation d'hormones oestrogéniques ".
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La présente invention est relative à la prépara- tion de substances hydrosolubles oestrogéniquement actives à partir d'urine de cheval. Dans le brevet belge n 464.306 déposé le 4 avril 1946, on a décrit un produit caractérisé par les particularités suivantes : - il contient sensiblement la totalité des substances hydrosolubles oestrogéniquement actives par voie buccale, contenues dans l'urine de cheval non hydrolysée (urine de juments gravides ou d'étalons); - il est sensiblement soluble dans l'eau et sensi- blement insoluble dans le benzol et l'éther; - il convient pour le traitement du syndrome de la ménopause chez les humains et produit une cornification vaginale chez les rats adultes sur lesquels on a pratiqué l'ovariotomie, et - il est stable et théapeutiquement non toxique .
Dans le brevet belge susdit, on a décrit un procédé de préparation d'un produit tel que défini ci-dessus, dans lequel procédé on met de l'urine de cheval, qui n'a pas subi d'hydrolyse sensible, en contact, tout en mainte- nant des conditions propres à empêcher son hydrolyse, avec un agent susceptible de donner lieu à la séparation d'une fraction normalement hydrosoluble, contenant les substances hydrosolubles stabilisatrices et oestrogéniques actives parvoie buccale de l'urine de cheval, et on sépare la fraction susdite de l'agent susdit, dans des conditions propres à empêcher une hydrolyse notable . Le mode opéra- toire préféré du procédé décrit dans le brevet susdit, implique une adsorption et une élution.
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La demanderesse a trouvé à présent un procédé, grâce auquel on peut obtenir un produit similaire présen- tant, de manière inattendue, une activité plus élevée par unité de poids. Le procédé de la demanderesse impli- que le traitement d'urine de cheval à l'aide d'un sol- vant organique sensiblement insoluble dans l'eau, ce sol- vant étant choisi dans la classe comprenant les alcools et les cétones solubles dans l'eau à raison de moins de 6 %.
Les produits de la présente invention sont obtenus à partir d'urine de cheval sous forme liquide , séchée ou concentrée . L'urine de départ est, de préférnece, fraîche ou oonservée, de manière appropriée, par exemple à l'aide d'un mélange de chloroforme et d'alcool, pour en empêcher l'hydrolyse . Cette urine est, de préférence, celle de juments gravides ou d'étalons, la préférence étant accordée à l'urine de juments gravides, La matière de départ peut être constituée soit par de l'urine brute, soit par de l'urine , qui a été concentrée, par exemple séchée par pulvérisation ou partiellement purifiée . Tou- tefois, un avantage important du procédé réside dans son aptitude à être appliqué directement à de l'urine brute et à réaliser une séparation initiale maximum.
Les solvants d'extraction préférés sont l'hexanol, le cyclohexanol, le méthylcyclohexanol, la cyclohexano- ne et l'isophorone, la préférence étant donnée à l'hexanol.
Le procédé suivant l'invention convient, de manière inattendue, pour séparer les substances oestrogéniquement actives de l'urine, à l'exclusion des matières solides oestrogéniquement inertes. En d'autres mots, le rapport de l'extraction principe actif : matières solides est
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inopinément\favorable . Un précipité utilisable thérapeuti- quement peut être dérivé de l'extrait au solvant, par simple concentration, de préférence sous vide Le concentrat obtenu contient moins de 3 % environ des ma- tières solides urinaires et au moins 80% environ du princi- pe oestrogéniquement actif. Ce concentrât peut être utilisé directement comme produit thérapeutique, mais la demande- resse préfère le soumettre à un traitement ultérieur.
Un mo- de préféré d'exécution de ce traitement ultérieur est la suivant :
L'extrait obtenu en traitant l'urine de départ à l'ai- de d'un solvant est lavé tout d'abord à l'aide d'un hydroxy- de alcalin (de préférence une solution 2N) et ensuite,si on le désire, une seule fois, à l'aide d'un très petit volume d'eau, par exemple à l'aide d'un volume d'eau inférieur à 5% environ. On obtient ainsi un extrait lavé, dont sont éli- minées de grandes quantités de substances solubles dans les alcalis. L'extrait lavé est ensuite concentré, de pré- férence sous vide . On obtient ainsi un concentrat, dont la majeure partie du solvant insoluble dans l'eau est éliminée.
Ce concentrat peut être traité de manière à en précipiter une fraction contenant les substances oestrogéniques hydro- solubles. Cette précipitation peut s'effectuer en ajoutant au concentrat un hydrocarbure aliphatique liquide inférieur, tel que l'hexane, le pentane ou l'heptane, la préférence étant donnée à l'hexane . Bien que la fraction obtenue puis- se être utilisée comme agent thérapeutique, la demanderesse préfère encore la soumettre à un traitement ultérieur.
Au lieu d'être traité par un hydro carbure , le concen- trat susdit peut être mélangé à une cétone hydrosoluble,la fraction insoluble dans la cétone étant rejetée, tandis que la fraction soluble dans la cétone et contenant le principe actif est concentrée, de préférence sous vide.Com- me cétones, on préfère employer de l'acétone et de la
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méthyléthylcétone .
La fraction soluble dans la cétone est ensuite addi- tionnée de l'hydrocarbure liquide précité, dans lequel les substances oestrogéniques hydrosolubles sont insolubles, 'de manière à former un mélange. Comme hydrocarbure, on emploie , de préférence, de l'hexane, comme il a été dit ci-dessus. Le mélange obtenu est ensuite extrait au moyen d'eau, en sorte que les substances oestrogéniques hydroso- lubles passent dans la phase aqueuse, tandis que dans la phase solvant passent des impuretés et des quantités varia- bles d'oestrogènes non conjugués, qui peuvent être récupé- rés.
Le nouveau produit,résultant du procédé complet décrit ci-dessus, contient les substances hydrosolubles oestrogé- niquement actives par voie buccale, contenues dans l'urine de cheval non hydrolysée, notamment les sulfates d'oestrone belle que l'équiline, l'équilénine, le bêta-oestradiol et la bêta-dihydro-équilénine. Physiquement le produit est sen siblement soluble dans l'eau, dans l'alcool méthylique et dans l'acétone, insoluble dans le benzène, le chloroforme et l'éther, stable, non toxique et contient moins de 1% environ des matières solides de l'urine de départ. Physio- logiquement , le produit est efficace pour le traitement du syndrome de la ménopause chez les humains et produit une cornification vaginale chez les rats adultes,sur lesquels on a pratiqué ltovariotomie .
Enfin le produit est pratiquement exempt de glycuronides, c'est-à-dire qu'il en contient moins de
0,5 % environ en poids.
Le produit peut être traité subséquemment par lavage, comme décrit dans le brevet belge n 476.705 déposé le 29 novembre 1947, à l'aide d'un solvant orga- nique insoluble dans l'eau, à un pH compris entre 4 et 6
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environ. La solution résultante est rendue faiblement alcaline et concentrée sous vide . Comme solvants préférés, on utilise les hydrocarbures colorés et en particulier le bichlorure d'éthylène . Le produit obte- nu à la suite de ce dernier traitement est sensible- ment inodore et exempt d'huiles phénoliques .
Le produit de la présente invention contient égale- ment les facteurs de stabilité essentiels pour maintenir l'activité du principe oestrogénique hydrosoluble . On a constaté également que ce produit ne contient pas moins de 20% environ de matière biologiquement active, ce pourcentage étant exprimé en sulfate sodique d'oes- trone, et est également sensiblement inodore et exempt d'huiles phénoliques.
D'autres particularités et détails de l'invention apparaîtront dans le schéma et dans l'exemple suivant illustrant des modes opératoires préférés.
Le schéma donné ci-après représente un mode opératoire complet du procédé suivant l'invention, ainsi qu'une variante d'un tel mode opératoire.
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SCHEMA Stade 1 - URINE - Extraction à l'aide d'un solvant insoluble dans l'eau (solubilité dans l'eau inférieure à 6%)
EMI7.1
J 1 la. Extrait solvant lb. Urine utilisée (rejetée) lit Concentration sous vide---,, Stade 2 Lavage au moyen d'hydroxyde alcalin (2N) l'a. Précipité de sub- stances oestrogé- niques hydrosolu- bles , 1 2a. Extrait lavé 2b. Matières solubles dans les alcalis (rejetées) Stade 3 - Concentration sous vide E##############'############## 3a. oncentrat 3b. Solvant L# ,3 -- . addition d'un hydrocarbure aliphatique liquide inférieur 41 Ik 3'a. Précipité de substances 3SA Hydrocarbure oestrogéniques sol.
3t c. Eau 3'd. Solution aqueuse de substances oestrogé- niques hydrosolubles Stade 4 - Addition de cétone hydrosoluble l 1 - i 4a. Fraction d'oestrogène 4b. Fraction insoluble soluble dans la cétone dans la cétone Stade Co centration sous vide Stade 5 - Concentration sous vide 5a. C'oncentrat 5b. Solvant Stade 6 - Addition d'hydrocarbure aliphatique liquide inférieur et d'eau j################, 6a. Solution aqueuse de 6b. Fraction insoluble substances oestro- dans l'hydrocarbure géniques hydroso- (oestrogènes non conjugés) lubles
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Exemple I
50 gallons d'urine de juments gravides sontextraits à deux reprises à l'aide de dix gallons (volume 5 fois moindre) d'hexanol. On obtient ainsi 20 gallons d'extrait hexanolique .
Cet extrait est lavé à l'aide de 20 litres d'hydroxyde sodique 2N et soumis à une séparation dans une centrifuge Sharples. La fraction hexanolique est lavée, dans un cas, une seule fois à l'aide de 10 litres d'eau, tandis que, dans un autre cas, le lavage à l'eau est sup- primé . Le mélange est concentré sous vide jusqu'à un vo- lume d'1 litre . Au mélange concentré on ajoute 5 litres d'acétone et on soumet le mélange obtenu à une centrifuga- tion . Le centrifugat est concentré sous vide jusqu'à un volume d'1 litre , puis additionné de 2 litres d'hexane.
Le mélange obtenu est extrait une première fois à l'aide de 500 cc. d'eau et une seconde fois à l'aide de 250 ce. d'eau. La solution aqueuse obtenue contient les substances oestrogéniques hydrosolubles. La matière estrogénique obtenue est lyophylisée de manière à donner 86 grammes de matières solides contenant 20 % de sulfate sodique d'oestrone , ainsi que le révèle l'essai de Kober- Les matières solides sont dissoutes dans l'eau et le pH de la solution obtenue est ajusté à 4 au moyen d'acide chlorhydrique . Cette solution est lavée à deux reprises au moyen de bichlorure d'éth ylène . Le pH de la phase aqueuse est ajusté à 8 au moyen d'hydroxyde sodique 1N.
Le résidu obtenu pèse 72 grammes. On obtient finalement un produit solide contenant 27 % de substances oestrogéni- ques hydrosolubles, ce pourcentage étant calculé sous forme de sulfate sodique d'oestrone et déterminé par essai biologique et par l'essai de Kober.
La matière finale contient des traces de glycuronides .
Sa teneur en azote est d'environ 0,46 %. Sa teneur en
A
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soufre hydrolysable est de 5,54 %. Enfin sa teneur en cendres est d'environ 17,4 %.
Exemple 2
700 ce. d'urine de juments gravides prélevée en fin de gestation sont extraits à l'aide de 2 portions de 140 cc., (volume 5 fois moindre) des alcools .,1 et cétones mentionnés ci-dessous* La séparation est effec- tuée par centrifugation* Le tableau I indique la variation de la quantité de matières solides extraites pendant chaque extraction et les quantités d'oestrogène présentes dans les solides obtenus, en utilisant les divers solvants suivant la présente invention- Les résultats indiqués dans les tableaux suivants montrent clairement que les alcools et les cétones dont la solubi- lité dans l'eau est inférieure à 6% présentent une aptitude inattendue à extraire sélectivement le prin- cipe oestrogénique hydrosoluble de l'urine de cheval,
à l'exclusion des matières oestrogéniquement inertes.
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TABLEAU I Extractions initiales
EMI10.1
<tb> Solvant <SEP> 1ère <SEP> extraction <SEP> 2ème <SEP> extraction
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> :Solides: <SEP> Kober: <SEP> % <SEP> oestrogènes <SEP> Solides: <SEP> Kober: <SEP> % <SEP> oestrogè-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> : <SEP> mg. <SEP> mg. <SEP> extrait <SEP> d'uri- <SEP> mg. <SEP> mg <SEP> :nes <SEP> rési-
<tb>
<tb>
<tb> : <SEP> : <SEP> : <SEP> ne <SEP> duels <SEP> ex-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> traits
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hexanol <SEP> : <SEP> 930 <SEP> 15 <SEP> 48 <SEP> : <SEP> 500 <SEP> : <SEP> 7,6 <SEP> 46
<tb>
EMI10.2
-'---,--.:a----=----- ...'--.....----- "" ---... -.. "" ..'-... - - - ..'-.-.......!.----. 4 .... 4 .
EMI10.3
<tb>
Cyclohexanol <SEP> : <SEP> 1400 <SEP> : <SEP> 17 <SEP> 54 <SEP> : <SEP> 1300 <SEP> : <SEP> 7,0 <SEP> 48
<tb>
EMI10.4
#####
EMI10.5
<tb> Méthylcyclo- <SEP> : <SEP>
<tb> -hexanol <SEP> (tech-:
<tb> nique) <SEP> : <SEP> 1050 <SEP> 14 <SEP> 45 <SEP> 600 <SEP> : <SEP> 8,6 <SEP> : <SEP> 49
<tb>
EMI10.6
-¯..!...---,.,..,.-.
EMI10.7
<tb> Cyclohexanone <SEP> 625 <SEP> 10,6: <SEP> 38 <SEP> 630 <SEP> 6,6 <SEP> : <SEP> 34
<tb>
EMI10.8
--0¯"--" -!...-""'¯!--- - -.¯----...--...- -¯-<;;>""¯L¯¯---"'"-------=--=--
EMI10.9
<tb> Isophorone <SEP> : <SEP> 850 <SEP> : <SEP> 16,4: <SEP> 56 <SEP> : <SEP> 360 <SEP> : <SEP> 5,6 <SEP> : <SEP> 40
<tb>
EMI10.10
..L..----- ........--=4 ..a-----""''------"-=M¯--- suite du Tableau I Solvant Combiné
EMI10.11
<tb> Solides <SEP> Kober <SEP> : <SEP> % <SEP> principe <SEP> originel <SEP> :
<SEP> % <SEP> oestrogènes <SEP> dans
<tb>
<tb>
<tb> mg, <SEP> ; <SEP> mg. <SEP> solides
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hexanol <SEP> 1420 <SEP> 22,6 <SEP> . <SEP> 72 <SEP> 1,6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cyclohexanol <SEP> ; <SEP> 2700 <SEP> 24,0 <SEP> : <SEP> 76 <SEP> 0,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Méthylcyclo- <SEP> ; <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> hexanol <SEP> tech-
<tb>
<tb> nique <SEP> 1650 <SEP> 22,6 <SEP> . <SEP> 72 <SEP> 1,4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cyclohexanone <SEP> 1280 <SEP> 182, <SEP> 59 <SEP> 1,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Isophorone <SEP> 1210 <SEP> : <SEP> 23,0 <SEP> :
<SEP> 74 <SEP> 1,9
<tb>
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Les deux extraits sont combinés et lavés une fois à l'aide d'un volume cinq fois moindre d'hydroxy- de sodique 2N et une autre fois à l'aide d'un volume dix fois moindre d'eau . Le tableau II montre la perte en matières solides, après lavage des extraits,et la quantité de chromogènes présents dans les solides fi- naux déterminée par la méthode Kober.
TABLEAU II
Extraits lavés
EMI11.1
<tb> Extrait <SEP> initial <SEP> Extrait <SEP> lave <SEP> %* <SEP> Pertes: <SEP> :%Kober
<tb> Solvant <SEP> Solides <SEP> Kober <SEP> Solides <SEP> . <SEP> Kober <SEP> Solides <SEP> Kober <SEP> :dans
<tb> sol <SEP> fi-
<tb>
EMI11.2
....."'"'. --Oo<c':"".. r--.... ..-.= ...-- -------......-... --....---- """"'-=0-----'-"-"--'" ,........---.----' ..............-----""---'"----""
EMI11.3
<tb> Hexanol <SEP> 1420 <SEP> mg.: <SEP> 22,6mg <SEP> 420 <SEP> 17,3 <SEP> 70% <SEP> 24% <SEP> : <SEP> 4,1
<tb>
EMI11.4
-- ¯a. ----,,-...0 -....... ....!.....- ¯K- .. - -=--=-=--¯.... '..... -----------..- "" --
EMI11.5
<tb> Cyclohexanol: <SEP> 2700 <SEP> mg.: <SEP> 24,0 <SEP> : <SEP> 1400 <SEP> : <SEP> 20,0 <SEP> : <SEP> 50 <SEP> : <SEP> 17 <SEP> : <SEP> 1,4
<tb>
<tb>
<tb> Méthylcyclo- <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> :
<SEP> :
<tb> hexanol <SEP> : <SEP> 1650 <SEP> : <SEP> 22,6 <SEP> : <SEP> 420 <SEP> : <SEP> 15,9 <SEP> : <SEP> 75 <SEP> : <SEP> 30 <SEP> 3,8
<tb>
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EMI11.7
<tb> Cyclohexa- <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> :
<tb> none <SEP> 1280 <SEP> : <SEP> 18,2 <SEP> : <SEP> 380 <SEP> : <SEP> 14,8 <SEP> : <SEP> 70 <SEP> 19 <SEP> : <SEP> 3,9
<tb>
<tb>
<tb> Isophorone <SEP> : <SEP> 1210 <SEP> : <SEP> 23,0 <SEP> 270 <SEP> : <SEP> 10,8: <SEP> 78 <SEP> : <SEP> 53 <SEP> 4,0
<tb>
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"Process for the preparation of estrogenic hormones".
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The present invention relates to the preparation of estrogenically active water-soluble substances from horse urine. In Belgian patent No. 464,306 filed on April 4, 1946, a product characterized by the following features was described: - it contains substantially all of the water-soluble estrogenically active substances by the oral route, contained in unhydrolyzed horse urine (urine of pregnant mares or stallions); - it is substantially soluble in water and substantially insoluble in benzol and ether; - it is suitable for the treatment of menopause syndrome in humans and produces vaginal cornification in adult rats with ovariotomy, and - it is stable and therapeutically non-toxic.
In the aforementioned Belgian patent, a process for preparing a product as defined above has been described, in which the process is brought into contact with horse urine, which has not undergone significant hydrolysis, while maintaining conditions such as to prevent its hydrolysis, with an agent capable of giving rise to the separation of a normally water-soluble fraction, containing the water-soluble stabilizing and estrogenic substances active, reaches the mouth from the urine of the horse, and is separated the aforementioned fraction of the aforesaid agent, under conditions such as to prevent significant hydrolysis. The preferred mode of operation of the process described in the above patent involves adsorption and elution.
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The Applicant has now found a process by which a similar product can be obtained which unexpectedly has a higher activity per unit weight. Applicant's method involves the treatment of horse urine with the aid of an organic solvent substantially insoluble in water, this solvent being selected from the class comprising the soluble alcohols and ketones. water at a rate of less than 6%.
The products of the present invention are obtained from horse urine in liquid, dried or concentrated form. The starting urine is preferably fresh or preserved, suitably, for example with a mixture of chloroform and alcohol, to prevent hydrolysis. This urine is preferably that of pregnant mares or stallions, preference being given to the urine of pregnant mares. The starting material can be constituted either by raw urine or by urine, which has been concentrated, for example spray dried or partially purified. An important advantage of the method, however, is its ability to be applied directly to crude urine and to achieve maximum initial separation.
Preferred extraction solvents are hexanol, cyclohexanol, methylcyclohexanol, cyclohexanone and isophorone, preference being given to hexanol.
The process according to the invention is unexpectedly suitable for separating estrogenically active substances from urine, excluding estrogenically inert solids. In other words, the ratio of the extraction active ingredient: solids is
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unexpectedly \ favorable. A therapeutically usable precipitate can be derived from the solvent extract by simple concentration, preferably in vacuo. The obtained concentrate contains less than about 3% urinary solids and at least about 80% estrogenically. active. This concentrate can be used directly as a therapeutic product, but the applicant prefers to subject it to further processing.
A preferred way of performing this further processing is as follows:
The extract obtained by treating the starting urine with a solvent is washed first with an alkali hydroxide (preferably a 2N solution) and then, if one desired, only once, using a very small volume of water, for example using a volume of water less than about 5%. A washed extract is thus obtained, from which large quantities of substances soluble in alkalis are removed. The washed extract is then concentrated, preferably under vacuum. A concentrate is thus obtained, from which most of the water-insoluble solvent is removed.
This concentrate can be treated so as to precipitate therefrom a fraction containing the water-soluble estrogenic substances. This precipitation can be carried out by adding to the concentrate a lower liquid aliphatic hydrocarbon, such as hexane, pentane or heptane, preference being given to hexane. Although the fraction obtained can be used as a therapeutic agent, the Applicant still prefers to subject it to further processing.
Instead of being treated with a hydrocarbon, the aforesaid concentrate can be mixed with a water-soluble ketone, the fraction insoluble in the ketone being discarded, while the fraction soluble in the ketone and containing the active principle is concentrated, so preferably in vacuo. As ketones, it is preferred to use acetone and
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methyl ethyl ketone.
The ketone soluble fraction is then added to the above liquid hydrocarbon, in which the water soluble estrogenic substances are insoluble, so as to form a mixture. As the hydrocarbon, hexane is preferably used, as has been said above. The resulting mixture is then extracted with water, so that the water-soluble estrogenic substances pass into the aqueous phase, while in the solvent phase pass impurities and varying amounts of unconjugated estrogen, which can. be recovered.
The new product, resulting from the complete process described above, contains the oestrogenically active water-soluble substances orally, contained in the unhydrolyzed horse urine, in particular the estrone sulfates beautiful as equilin, equilenin , beta-estradiol and beta-dihydro-equilenin. Physically the product is slightly soluble in water, in methyl alcohol and in acetone, insoluble in benzene, chloroform and ether, stable, nontoxic and contains less than about 1% of the solids of the starting urine. Physiologically, the product is effective for the treatment of menopausal syndrome in humans and produces vaginal cornification in adult rats, in which ovariotomy has been performed.
Finally the product is practically free from glycuronides, that is to say it contains less
About 0.5% by weight.
The product can be treated subsequently by washing, as described in Belgian patent no. 476,705 filed November 29, 1947, using an organic solvent insoluble in water, at a pH between 4 and 6.
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about. The resulting solution is made weakly alkaline and concentrated in vacuo. As preferred solvents, colored hydrocarbons and in particular ethylene dichloride are used. The product obtained as a result of this latter treatment is substantially odorless and free from phenolic oils.
The product of the present invention also contains the stability factors essential to maintain the activity of the water-soluble estrogenic principle. This product has also been found to contain not less than about 20% of biologically active material, this percentage being expressed as sodium ester sulfate, and is also substantially odorless and free from phenolic oils.
Other features and details of the invention will appear in the diagram and in the following example illustrating preferred procedures.
The diagram given below represents a complete operating mode of the process according to the invention, as well as a variant of such an operating mode.
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SCHEME Stage 1 - URINE - Extraction using a solvent insoluble in water (solubility in water less than 6%)
EMI7.1
J 1 the. Solvent extract lb. Urine used (rejected) bed Concentration under vacuum --- ,, Stage 2 Wash with alkali hydroxide (2N) a. Precipitate water-soluble estrogenic substances, 1 2a. Washed extract 2b. Alkali soluble matter (discarded) Stage 3 - Concentration under vacuum E ############### '############### 3a. oncentrate 3b. Solvent L #, 3 -. addition of a lower liquid aliphatic hydrocarbon 41 Ik 3'a. Precipitate substances 3SA Hydrocarbon estrogenic sol.
3t c. Water 3'd. Aqueous solution of water-soluble estrogenic substances Stage 4 - Addition of water-soluble ketone l 1 - i 4a. Estrogen fraction 4b. Insoluble fraction soluble in ketone in ketone Stage Vacuum concentration Stage 5 - Vacuum concentration 5a. Concentrate 5b. Solvent Stage 6 - Addition of lower liquid aliphatic hydrocarbon and water j #################, 6a. Aqueous solution of 6b. Insoluble fraction oestro- substances in the hydrocarbon genic hydroso- (unconjugated estrogens) soluble
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Example I
50 gallons of urine from pregnant mares is extracted twice with ten gallons (5 times less volume) of hexanol. This gives 20 gallons of hexanol extract.
This extract is washed with 20 liters of 2N sodium hydroxide and subjected to separation in a Sharples centrifuge. The hexanol fraction is washed, in one case, only once with 10 liters of water, while in another case the water wash is omitted. The mixture is concentrated in vacuo to a volume of 1 liter. To the concentrated mixture is added 5 liters of acetone and the resulting mixture is subjected to centrifugation. The centrifugate is concentrated under vacuum to a volume of 1 liter, then added with 2 liters of hexane.
The mixture obtained is extracted for the first time using 500 cc. of water and a second time using 250 cc. of water. The resulting aqueous solution contains the water-soluble estrogenic substances. The estrogenic material obtained is lyophilized to give 86 grams of solids containing 20% sodium estrone sulfate, as revealed by the Kober test- The solids are dissolved in water and the pH of the solution. obtained is adjusted to 4 by means of hydrochloric acid. This solution is washed twice with ethylene dichloride. The pH of the aqueous phase is adjusted to 8 using 1N sodium hydroxide.
The residue obtained weighs 72 grams. Finally, a solid product is obtained containing 27% water-soluble estrogenic substances, this percentage being calculated as sodium estrone sulfate and determined by bioassay and by the Kober test.
The final material contains traces of glycuronides.
Its nitrogen content is approximately 0.46%. Its content
AT
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hydrolyzable sulfur is 5.54%. Finally, its ash content is approximately 17.4%.
Example 2
700 cc. urine of pregnant mares taken at the end of gestation are extracted using 2 portions of 140 cc., (volume 5 times less) of the alcohols., 1 and ketones mentioned below * The separation is carried out by centrifugation * Table I shows the variation in the amount of solids extracted during each extraction and the amounts of estrogen present in the solids obtained, using the various solvents according to the present invention. The results shown in the following tables clearly show that alcohols and ketones with a solubility in water of less than 6% exhibit an unexpected ability to selectively extract the water-soluble estrogenic principle from horse urine,
excluding estrogenically inert materials.
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TABLE I Initial extractions
EMI10.1
<tb> Solvent <SEP> 1st <SEP> extraction <SEP> 2nd <SEP> extraction
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>: Solids: <SEP> Kober: <SEP>% <SEP> estrogens <SEP> Solids: <SEP> Kober: <SEP>% <SEP> estrogè-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>: <SEP> mg. <SEP> mg. <SEP> extract <SEP> from uri- <SEP> mg. <SEP> mg <SEP>: nes <SEP> resi-
<tb>
<tb>
<tb>: <SEP>: <SEP>: <SEP> ne <SEP> duels <SEP> ex-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> traits
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hexanol <SEP>: <SEP> 930 <SEP> 15 <SEP> 48 <SEP>: <SEP> 500 <SEP>: <SEP> 7.6 <SEP> 46
<tb>
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-'---, - .: a ---- = ----- ...' - .....----- "" ---... - .. "" ..'-... - - - ..'-.-.......! .----. 4 .... 4.
EMI10.3
<tb>
Cyclohexanol <SEP>: <SEP> 1400 <SEP>: <SEP> 17 <SEP> 54 <SEP>: <SEP> 1300 <SEP>: <SEP> 7,0 <SEP> 48
<tb>
EMI10.4
#####
EMI10.5
<tb> Methylcyclo- <SEP>: <SEP>
<tb> -hexanol <SEP> (tech-:
<tb> nique) <SEP>: <SEP> 1050 <SEP> 14 <SEP> 45 <SEP> 600 <SEP>: <SEP> 8,6 <SEP>: <SEP> 49
<tb>
EMI10.6
-¯ ..! ...---,., .., .-.
EMI10.7
<tb> Cyclohexanone <SEP> 625 <SEP> 10.6: <SEP> 38 <SEP> 630 <SEP> 6.6 <SEP>: <SEP> 34
<tb>
EMI10.8
--0¯ "-" -! ...- "" '¯! --- - -.¯ ----... - ...- -¯ - <;;> "" ¯L ¯¯ --- "'" ------- = - = -
EMI10.9
<tb> Isophorone <SEP>: <SEP> 850 <SEP>: <SEP> 16.4: <SEP> 56 <SEP>: <SEP> 360 <SEP>: <SEP> 5.6 <SEP>: < SEP> 40
<tb>
EMI10.10
..L ..----- ........-- = 4 ..a ----- "" '' ------ "- = M¯ --- continued from Table I Combined Solvent
EMI10.11
<tb> Solids <SEP> Kober <SEP>: <SEP>% <SEP> original <SEP> principle <SEP>:
<SEP>% <SEP> estrogens <SEP> in
<tb>
<tb>
<tb> mg, <SEP>; <SEP> mg. <SEP> solids
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hexanol <SEP> 1420 <SEP> 22.6 <SEP>. <SEP> 72 <SEP> 1.6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cyclohexanol <SEP>; <SEP> 2700 <SEP> 24.0 <SEP>: <SEP> 76 <SEP> 0.9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Methylcyclo- <SEP>; <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> hexanol <SEP> tech-
<tb>
<tb> nique <SEP> 1650 <SEP> 22.6 <SEP>. <SEP> 72 <SEP> 1.4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cyclohexanone <SEP> 1280 <SEP> 182, <SEP> 59 <SEP> 1,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Isophorone <SEP> 1210 <SEP>: <SEP> 23.0 <SEP>:
<SEP> 74 <SEP> 1.9
<tb>
<Desc / Clms Page number 11>
The two extracts are combined and washed once with five times the volume of 2N sodium hydroxide and once again with ten times the volume of water. Table II shows the loss of solids, after washing the extracts, and the amount of chromogens present in the final solids determined by the Kober method.
TABLE II
Washed extracts
EMI11.1
<tb> Extract <SEP> initial <SEP> Extract <SEP> lava <SEP>% * <SEP> Losses: <SEP>:% Kober
<tb> Solvent <SEP> Solids <SEP> Kober <SEP> Solids <SEP>. <SEP> Kober <SEP> Solids <SEP> Kober <SEP>: in
<tb> sol <SEP> fi-
<tb>
EMI11.2
..... "'"'. --Oo <c ': "" .. r --.... ..-. = ...-- -------......-... --... .---- "" "" '- = 0 -----'- "-" -' ", ........ --- .---- '..... .........----- "" --- '"----" "
EMI11.3
<tb> Hexanol <SEP> 1420 <SEP> mg .: <SEP> 22.6mg <SEP> 420 <SEP> 17.3 <SEP> 70% <SEP> 24% <SEP>: <SEP> 4.1
<tb>
EMI11.4
-- at. ---- ,, -... 0 -....... ....! .....- ¯K- .. - - = - = - = - ¯ .... '..... -----------..- "" -
EMI11.5
<tb> Cyclohexanol: <SEP> 2700 <SEP> mg .: <SEP> 24.0 <SEP>: <SEP> 1400 <SEP>: <SEP> 20.0 <SEP>: <SEP> 50 <SEP> : <SEP> 17 <SEP>: <SEP> 1.4
<tb>
<tb>
<tb> Methylcyclo- <SEP>: <SEP>: <SEP>: <SEP>: <SEP>:
<SEP>:
<tb> hexanol <SEP>: <SEP> 1650 <SEP>: <SEP> 22.6 <SEP>: <SEP> 420 <SEP>: <SEP> 15.9 <SEP>: <SEP> 75 <SEP >: <SEP> 30 <SEP> 3.8
<tb>
EMI11.6
. -: 0 - "..." '".-...........-" .... ¯ ... a ... - ....-.... ....-.-.........--------> ..- 1.- ': -..- ¯ - "-"' -----
EMI11.7
<tb> Cyclohexa- <SEP>: <SEP>: <SEP>: <SEP>: <SEP>: <SEP>:
<tb> none <SEP> 1280 <SEP>: <SEP> 18.2 <SEP>: <SEP> 380 <SEP>: <SEP> 14.8 <SEP>: <SEP> 70 <SEP> 19 <SEP >: <SEP> 3.9
<tb>
<tb>
<tb> Isophorone <SEP>: <SEP> 1210 <SEP>: <SEP> 23.0 <SEP> 270 <SEP>: <SEP> 10.8: <SEP> 78 <SEP>: <SEP> 53 < MS> 4.0
<tb>
** ATTENTION ** end of DESC field can contain start of CLMS **.