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" Préparation d'hormone oestrogène".
La présente invention est relative à des prépara- tions d'hormone oestrogène solubles dans l'eau au départ d'urine de cheval, par exemple d'urine d'étalon ou de jument gravide . Le produit suivant l'invention se distingue, en général, des nombreuses préparations d'hormone oestrogène insolubles dans l'eau par son insolubilité substantielle dans des solvants organi- ques non miscibles à l'eau, tels que le benzol et l'éther, par sa solubilité substantielle dans l'eau, par sa grande stabilité lors de l'emmagasinage, par son manque de toxicité et par son aptitude à produire une kératinisation vaginale chez les rats adultes ovariecto- misés et à atténuer les syndromes de la ménopause chez les humains.
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Des substances solubles dans l'eau utilisables chimiquement et possédant en outre les caractéristiques indiquées ci-dessus, de même qu'une grande activité oestrogénique par voie buccale peuvent, par exemple, être obtenuesen concentrant de l'urine fraîche et partant non-hydrolysée ou préservée, de façon appropriée, contre toute hydrolyse. Cette concentration peut avantageuse- ment se faire par adsorption à l'aide d'un adsotbant et extraction subséquente à l'aide d'un solvant organi- que soluble dans l'eau . La matière adsorbante peut être constituée par du charbon de bois, de la terre à foulons, du triphosphate calcique et une argile adsorbante, le charbon de bois étant l'adsorbant préféré . L'agent d'ex- traction peut être une base organique azotée, telle que la pyridine, ou un mélange d'alcool et de chloroforme.
L'extrait est ensuite concentré par élimination du sol- vant et le concentrat aqueux ainsi obtenu est, de préfé- rence traité à l'aide/d'un solvant organique, non misci- ble à l'eau, tel que le benzol et/ou l'éther, de façon à éliminer les substances solubles dans ce solvant.
Les aspects importants du procédé décrit ci-avant résident dans le fait que la matière de départ est non- hydrolysée et que des conditions sont maintenues,pen- dant tout le procédé, pour empêcher une hydrolyse des principes actifs. Ainsi , la température est, de pré- férence,maintenue à un niveau relativement bas notamment entre 40 C et 50 C environ. La durée du traitement à une température supérieure à la température ambiante est aussi courte que possible et le pH est maintenu dans l'inter- valle allant de la neutralité à une faible alcalinité; soit entre 7 et 8,5 environ.
Le produit résultant, constitué par un concentrat aqueux (contenant environ 20 % de matière solide) ou, s'il
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est séché, par une poudre soluble dans l'eau, contient sensiblement tous les principes à activité oestrogénique h et autres principes térapeutiques solubles dans l'eau de l'urine de départ. En général, ce produit résultant contient entre 1 et 2 % environ des matières solides contenues dans l'urine de départ. Le produit contient des substances, qui le rendent stable, et, en même temps, il est exempt de toxicité, au sens thérapeutique, lors- qu'il est utilisé à des doses convenant pour atténuer les symptômes du syndrome de la ménopause .
Toutefois, lorsqu'il est nécessaire d'administrer un tel produit oestrogène, par voie buccale, à des doses trèsélevées pour une thérapie particulière, on a consta- té que la préparation indiquée ci-dessus peut, dans certains cas, provoquer de la nausée et d'autres pertur- bations gastriques . La demanderesse a découvert, à présent, que les facteurs responsables de ces perturba- tions peuvent être éliminés sans qu'une perte subatan- tielle des principes oestrogéniques et autres principes thérapeutiques soit constatée et sans que la stabilité soit diminuée.
Suivant une forme de réalisation préférée de l'in- vention le concentrai? aqueux est traité comme suit : Le pH est réglé à une valeur comprise dans l'intervalle allant de 2 à 6 environ, de préférence de 4 à 5 environ.
Le concentrat est alors lavé à l'aide d'un solvant orga- nique non miscible à l'eau, la température étant,de préférence, maintenue dans l'intervalle allant approxima- tivement de 15 C à 20 C environ bien que, lorsque les autres conditions sont propices, la température puisse s'élever jusqu'à 40 C. Le lavage se fait aussi vite que possible, les principes actifs étant recueillis dans la phase aqueuse. La chose importante consiste à
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coordonner les conditions de façon à empêcher l'hydrolyse.
Un extrait aqueux, contenant les substances oestrogènes et d'autres principes thérapeutiques solubles dans l'eau et exempt de la majeure partie de la masse et des impuretés indésirables,est ainsi obtenu . L'extrait est alors neu- tralisé , de préférence, à un pH de 7 à 8 environ. A ce moment, l'extrait peut être lavé à l'aide d'éther pour chasser l'excès de solvant, mais ce stade du procédé est facultatif . L'extrait neutralisé est alors séché, de préférence, par distillation sous vide à une tempéra- ture comprise dans l'intervalle s'étendant de 40 C en- viron à 50 C environ, de façon à former un résidu sensi- blement sec.
Ce résidu possède une activité oestrogénique étonnam- ment élevée par voie buccale et est caractérisé par l'abscer ce de substances sensiblement solubles dans le solvant et insolubles dans l'eau, lesquelles substances sont odo- riférantes et produisent des troubles gastriques et des nausées chez certains individus. Le produit est suscep- tible d'usage clinique, mais la demanderesse préfère continuer à la traiter, comme il sera décrit ci-après.
En outre, les produits bruts peuvent être obtenus en trai- tant , suivant les enseignements indiqués dans le présent mémoire, des matières plus brutes que les matières de dé- part préférées indiquées ci-dessus.
Le résidu susdit est dissous dans une faible quan- tité d'un alcool inférieur et la solution est traitée à l'aide d'un solvant cétonique , de manière à former un précipité contenant très peu de principes actifs. De nouvelles quantités de facteurs odoriférants et toxiques, caractéristiques des concentrats bruts d'urine, de même que des matières solides inertes, sont ainsi éliminées dans le précipité, qui ne contient que peu de principes
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oestrogéniques actifs. Le surnageant contenant les principes actifs est séparé et concentré jusqu'à succi- té . Le résidu séché est dissous dans un alcool infé- rieur et les principes actifs sont précipités par addi- tion d'un éther .
Il est à noter que lorsqu'on parle, dans le présent mémoire, d'un alcool inférieur, il s'agit d'un alcool contenant. cinq atomes de carbone ou moins, l'alcool méthylique et l'alcool éthylique étant préférés. Le traitement indiqué ci-avant, fait passer dans la solution d'extraction d'autres facteurs indésàrables, en particulier , des substances toxiques et des huiles . Le précipité est séparé, lavé à l'aide d'un éther et ensuite séché Le précipité séché con- tient une grande proportion des substances oestrogéniques solubles dans l'eau du concentrat de départ.
Les stades d'extraction à l'aide d'un solvant or- ganique non miscible à l'eau et de précipitation cétoni- que ont pour effet inattendu d'éliminer des solides iner- tes et des substances odoriférantes et toxiques, tout en ne réduisant pas,dans une mesure dépassant les prévisions raisonnables, les principes oestrogéniques solubles dans l'eau et en n'éliminant pas ou en n'inacti- vant pas les facteurs producteurs de la stabilité. Le produit obtenu par la demanderesse diffère du sulfate oestrome d' par sa stabilité et par son action thérapeu- tique améliorée . Le procédé suivant l'invention permet, comme le montre ce qui précède, d'obtenir un produit con- tenant des substances oestrogéniques solubles dans l'eau sous 'une forme concentrée mais néanmoins stable.
Bien que la demanderesse ait décrit dans le présent mémoire un procédé préféré, dans lequel on procède d'abord au lavage à l'aide d'un solvant insoluble dans l'eau et ensuite à la précipitation cétonique , il est également
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possible de renverser l'ordre de ces deux stades. D'au- tres modifications sont également possibles, si on se conforme aux enseignements généraux contenus dans le présent mémoire.
L'invention apparaîtra plus clairement,en référence aux exemples suivants illustrant des modes opératoires préférés .
Exemple 1
Environ 25 gallons d'urine fraîchement prélevées sur des juments gravides et contenant des principes oestrogéniques solubles dans l'eau sont préservés contre toute hydrolyse à l'aide d'un mélange d'alcool et de chloroforme .
On ajoute environ 560 grammes de charbon activé et le mélange est agité mécaniquement pendant 15 minutes. environ à une température appropriée comprise, par exem- ple, entre 15 C et 30 C environ. Le charbon est séparé par filtration. Le filtrat d'urine est à nouveau traité au moyen de charbon Les deux masses de charbon sont réunies . La presque totalité des substances oestrogéni- ques solubles dans l'eau a été extraite de l'urine. Le charbon est ensuite soit séché, soit laissé humide, le charbon de bois pouvant, par exemple, être utilisé direc- tement après la filtration ou être séché et ensuite utili- sé.
On ajoute alors au charbon (sec ou humide) environ trois litres d'une solution aqueuse contenant environ 90 % de pyridine et on mélange vivement à température ambiante . Ce mélange est agité ét ensuite laissé au repos dans un réfrigérateur pendant plusieurs heures. Le charbon est alors séparé par filtration et remis en suspension dans environ deux litres de solution fraî- che de pyridine (90%) . La suspension est ensuite lais-
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sée au repos pendant plusieurs heures, tout en agitant occasionnellement. Le charbon est séparé par filtration, remis en suspension dans environ deux litres de solution de pyridine et finalement essoré.
L'extrait et les lavages pyridiniques obtenus de la manière indiquée ci-dessus et formant un volume total d'environ huit litres sont mélangés et concentrés sous vide à faible température, soit entre 40 C et 50 C envi- ron, jusqu'à un volume à de 250 cm3 . Pendant le stade final de préparation, au cours duquel la pyridine est éliminée et le concentrat aqueux est obtenu, on empêche la réaction du mélange de devenir acide . On ajoute en- viron 250 cm3 d'eau . La solution obtenue constitue un concentrat contenant une grande proportion des substances oestrogéniques solubles dans l'eau renfermées dans l'urine de départ.
On a préparé, en opérant comme indiqué ci-dessus, 400 ml de concentrat contenant une teneur en substances oestrogéniques solubles dans l'eau équivalente à 19 mg de sulfate sodique d'oestrone par ml (essai de Marrian Kober modifié ) . Ce concentrat est acidifié jusqu'à un pH à l'aide d'acide sulfurique aqueux à 15 % et extrait à quatre reprises à l'aide de 160 ml de bichlorure d'éthylène (chaque extraction) et à trois reprises à l'aide de 80 ml de bichlorure d'éthylène (chaque extrac- tion). Le concentrat aqueux est alors ajusté à pH 6,9 à l'aide d'hydroxyde sodique 5N et extrait à trois repri- ses à l'aide de 100 ml (chaque extraction) d'éther. Le concentrat aqueux ainsi débarrassé des matières toxi- ques , phénols et huiles odoriférantes est alors concen- tré sous vide jusqu'à siccité .
Ce traitement s'exécute à température ambiante et aussi rapidement que possible pour éviter l'hydrolyse de la substance active par l'aci- de.
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Le résidu séché est dissous dans 160 ml de méthanol et une précipitation des matières indésirables est obtenue en versant la solution méthanolique dans deux litres d'acétone .La solution de méthanol et d'acétone est filtrée, ce qui permet la séparation de 61 gms de matière insoluble et inactive . La solution contenant les substances oestrogéniques solubles dans l'eau est alors concentrée sous vide jusqu'à faible volume et les principes actifs sont précipités en versant le concentrat dans deux litres d'éther .Le précipité est séparé par filtration et séché sous vide .Il pèse 29,9 grammes et contient une quantité de principes oestrogéniques solubles dans l'eau équivalente à 20,5 % de sulfate sodique d'oes- trone mesurée par l'essai de Marrian Kober modifié.
La quantité indiquée ci-dessus représente une récupération de 80 % de la puissance oestrogénique du concentrat sous une forme soluble; dans l'eau.
Le produit résultant est une substance convenant pour être utilisée cliniquement et pour être administrée par voie buccale. Il est plus actif, lorsqu'il est administré par voie buccale,que l'oestrone libre dans l'atténuation du syndrome de la ménopause chez les humains et, lorsqu'il est administré à des rats adultes ovari-ectomisés, il est plus actif que l'oestrone libre en ce qui concerne la production d'une kératinisation vaginale .
Le produit précipité est également stable et sensi- blement insoluble dans les solvants organiques non misci- bles à l'eau, tels que le benzol et l'éther. Enfin, il est soluble dans l'eau et exempt de substances solubles dans le bichlorure d'éthylène et de substances insolubles dans l'acétone.
Exemple 2 100 cc du concentrat préparé comme dans l'exemple
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jusqu'au moment de l'ajustement du pH à la valeur 4 sont portés à sec sous vide et extraits à l'acétone . La solution acétonique est concentrée jusqu'à siccité et le résidu est redissous dans de l'eau, le pH de cette solu- tion aqueuse étant subséquemment porté à la valeur 4 par addition d'acide sulfurique à 15 % . La solution obtenue est extraite à l'aide. de quatre volumes identiques de bichlorure d'éthylène . La solution aqueuse est réglée à pH 7, lavée à l'aide d'un volume égal d'éther éthylique et l'excès.d'éther est éliminé sous vide .
Le concentrat aqueux résultant contient plus de 90 % de la quantité primi tive des substances oestrogéniques solubles dans l'eau con- tenues dans le concentrat de départ (essai de Marrian Kober modifié) . Ce concentrat résultant est concentré sous vide jusqu'à siccité et une poudre amorphe de cou- leur chamois est obtenue, laquelle poudre est facile- ment soluble dans l'eau et effectivement exempte: de substances odoriférantes.
Exemple 3
100 cc d'une solution alcoolique aqueuse à 15 % du concentrat purifié contenant 600 unités Collip ont été administrés par voie buccale, à des rats non adultes, en ue de mesurer l'activité oestrogénique . La solution du concentrat a été emmagasinée pendant quatre mois à 37 C dans des bouteilles en verre bouchées d'une contenan- ce de quatre onces. Pendant cette période, la solution a été essayée à trois reprises (à la f@@ du premier, du deàxième et du quatrième mois) . Aucune détérioration évidente n'est apparue à la suite de ces essais.
Il est évident que diverses modifications peuvent être apportées aux produits et modes opératoires spécifi- ques indiqués dans les exemples précédents, sans s'écarter
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de l'esprit de l'invention. Bien que n'épuisant pas le sujet, les remarques suivantes serviront de guide pour certaines des modifications, dont les procédés et produits sont susceptibles .
Les produits de la présente invention sont, de préférence, préparés en concentrant d'abord de l'urine de cheval non hydrolysée dans des conditions empêchant l'hydrolyse, de manière à former un concentrat contenant une substance oestrogénique soluble dans l'eau, en extrayant le concentrat à l'aide d'un solvant organique soluble dans l'eau de la substance dans des conditions empêchant l'hydrolyse, de manière à obtenir un extrait contenant ladite substance et enfin en concentrant l'extrait dans des conditions empêchant l'hydrolyse . Ce procédé s'effec- tue, de préférence, en absorbant un liquide urinaire non-hydrolysé à l'aide d'un adsorbant, de préférence, constitué par du charbon activé,
tout en maintenant une température modérée et un pH compris entre la neutralité et une faible alcalinité (de préférence de 7 à 8 en- viron),et en extrayant le produit de l'adsorbant dans des conditions similaires à l'aide d'un solvant soluble dans l'eau de la substance.
Le produit résultant est une substance soluble dans l'eam, insoluble dans le benzol et l'éther et contenant la presque totalité des principes oestrogéniques solubles dans l'eau de l'urine de départ et ordinairement moins de 2 % environ des matières solides contenues dans le liquide urinaire de départ. Il ne contient aucune quantité bubstan- tielle d'oestrogènes libres. Le produit est,en outre, stable . Toutefois, il contient encore des substances odoriférantes et inactives et des substances provoquant des troubles gastriques et des nausées chez certains indi- vidus .
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Lavage à l'aide d'un solvant.
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Dans l'opération de lavage, le maintien du pH dans l'intervalle compris entre 2 et 6 est capital Des'résul- tats supérieurs sont obtenus dans l'intervalle préféré s'étendant de 4 à 5 . Pour empêcher l'hydrolyse, il est également souhaitable d'opérer à basse température , de préférence entre 15 C et 20 C, et en tout cas en dessous de 40 0, quelle que soit la durée du traitement . L'opéra- tion de lavage est ordinairement répétée à plusieurs re- prises, de préférence de 4 à 6 fois.
Les agents d'extraction sont des solvants pour grais- se et huiles, pour phénols, pour phénols alcoyl-substitués et pour stérols non conjugués. Parmi les solvants possé- dant ces caractéristiques et convenant au but poursuivi, on peut citer, à titre d'exemple, les alcools aliphatiques à 5 atomes de carbone ou davantage, les alcools alicycli- ques tels que le cyclohexanol, les éthers tels que l'éther diéthylique, l'éther isopropylique, les hydrocarbures ali- phatiques tels que l'hexane et les hydrocarbures supérieurs de la même série, les hydrocarbures aromatiques tels que le benzène, le toluène, etc, les hydrocarbures alicyyli- ques tels que le cyclohexane, les hydrocarbures chlorés tels que le chloroforme, le bichlorure d'éthylène, le tri- chloréthylène, le tétrachlorure de carbone et le chloro- benzène,
les esters tels que l'acétate d'éthyle et l'acéta- te d'amyle, ou les cétones telles que la méthylisobutyl- cétone .
Parmi les groupes de solvants indiqués ci-dessus, on préfère les hydrocarbures chlorés et, en particulier,le bichlorure d'éthylène, étant donné que la demanderesse a constaté qu'une quantité étonnamment petite des principes oestrogéniques est extraite par ces solvants.
De plus, ces solvants ne sont pas inflammables et convien-
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nent donc mieux que les autres à des procédés sur une grande échelle .
Neutralisation --------------
Après extraction, la solution est neutralisée jusqu'à pH allant de la neutralité à une faible alcalinité .La demanderesse préfère opérer dans un intervalle compris entre 6 et 8,5 , et plus particulièrement entre 7 et 7,5 .La neutralisation peut se faire à l'aide d'un alcali , constitué, de préférence, par de l'hydroxyde sodi- que ou potassique
Lavage.
Le lavage de la solution neutralisée à l'aide d'un éther constitue une opération facultative , mais la deman- deresse a constaté que ce lavage est très avantageux, en ce sens qu'il élimine l'excès du solvant non-miscible à l'eau . L'éther isopropylique, l'éther éthylique ou tout autre solvant du solvant non miscible à l'eau peut être employé.
Séchage
Le séchage a pour but d'éliminer l'eau et de rendre la matière active propre à être traitée subséquemment. Une des méthodes préférées de séchage est celle qui consiste à sécher sous vide à une température comprise entre 40 et 50 C environ .
Précipitation
Le produit séché est dissous dans un alcool infé- rieur, tel que l'alcool méthylique et la matière indésira- ble est précipitée à l'aide d'un solvant cétonique solu- ble dans l'alcool. Comme exemples de solvants cétoniques convenant au but poursuivi , on peut citer l'acétone, l'alcool diacétone, l'acétonyl acétone, la méthyléthylcéto- ne, l'acétoacétate d'éthyle, la méthylisobutylcétone, l'iso- phorone, l'oxyde de mésityle, la méthyl-n-amylcétone et la
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diisobutylcétone . Toutefois, la cétone préférée est l'acétone .
On a constaté avec surprise qu'il se séparait, lors de la précipitation, de grandes quantités de matière insoluble dans le solvant cétonique et ne contenant, ainsi que la demanderesse l'a constaté, que peu de principes actifs, alors que le solvant cétonique contient une matière soluble dans l'acétone et renfermant les principes actifs.
Ce stade de précipitation se fait en ajoutant graduel- lement un excès de solvant cétonique, tout en agitant, jusqu'à fin de précipitation. Le surnageant est séparé par filtration où centrifugation et est ensuite concentré.
Précipitation à l'éther.
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Le concentrat résultant est dissous dans l'alcool et versé dans un excès d'un éther, l'éther éthylique et l'éther isopropylique étant préférés. Il se forme alors un précipité contenant la substance oestrogénique- ment active, les huiles et substances phénoliques solubles dans l'éther restant dans le surnageant . Le précipité est séparé et, de préférence, lavé à l'éther et séché.
Caractéristiques du produit -----------------------------
Le produit de l'invention préparé comme décrit ci-des- sus a les caractéristiques suivantes .
Nature physique a) Poudre amorphe solide b) Solution aqueuse
Le produit contient une pluralité de substances oestrogéniques solubles dans l'eau, des composés organiques azotés, par exemple, du sulfate d'indoxyle et une quantité fractions substantielle de solubles dans les alcalis.
Caractéristiques chimiques a) pratiquement insoluble dans les solvants organi-
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ques non miscibles à l'eau, notamment l'éther et le benzol ; b) sensiblement exempt de matière soluble dans les solvants gras; c) sensiblement exempt de substances phénoliques ; d) soluble dans l'eau, l'alcool, l'acétone, la pyridine et l'alcool méthylique, e) l'hydrolyse du produit par la chaleur, un acide ou un alcali donne lieu à la libération de substances oestrogéniques libres non miscibles à l'eau et solubles dans les solvants organiques, tels que l'éther ou le benzol.
Stabilité
Stable sous forme de poudre sèche ou de solution aqueuse, à température ambiante, vis-à-vis de l'auto-hydro- lyse.
Qualités esthétiques
Pratiquement exempt d'odeur répréhensible, de goût et de facteurs provoquant des troubles intestinaux et des nausées.
Effet pharmacologique a) plus efficace par voie buccale que l'oestrone li- bre pour l'atténuation du syndrome de la ménopause; b) plus efficace que le sulfate d'oestrone dans la thérapie, par voie buccale , de la ménopause. c) exempt de toxicité à des doses thérapeutiquement actives, d) atténue les symptomes autonomiques et emotionnels habituels accompagnant le syndrome de la ménopause; e) approximativement 2 à 2 1/2 fois plus actif que la quantité équivalente d'oestrone libre dans la production d'une kératinisation vaginale, après administration par voiebuccale aux rats adultes ovariectomisés.
Au point de vue chimique, le produit a une plus grande activité que celle développée par la teneur apparente en d' sulfate sodique d'oestrone mesurée par le test de Marrian
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Kober modifié (estimation colorimétrique) décrit dans "The Elimination of Estrin in Urine with the Photo-Electric Colorimeter" par E.H. Venning et al (J.B.C. 120 225 1937).
Les concentrations en ions hydrogènes (pH) mentionnées dans le présent mémoire ont été mesurées à l'aide du pH mètre à électrode de verre du "Beckman Laboratory", aucune cor.nec- tion n'étant introduite pour la concentration en ions métal- liques .
Il est.évident que diverses modifications peuvent être introduites dans les modes opératoires décrits, sans que l'on s'écarte de l'esprit de l'invention tel qu'il est défini dans les revendications ci-annexées. Les modes opé- ratoires et moyens décrits en sont qu'illustratifset ne sont limités que par l'état de la technique .
REVENDICATIONS --------------
1. Procédé pour la préparation d'une substance hormo- nale oestrogénique soluble dans l'eau, caractérisé en ce qu'on acidifie un concentrat aqueux d'urine, contenant des princi- pes oestrogéniques solubles dans l'eau, jusqu'à un pH com- pris dans l'intervalle allant approximativement de 2 à 6, en ce qu'on extrait le concentrat acidifié à l'aide d'un solvant organique sensiblement insoluble dans l'eau de manière à éliminer les substances solubles dans le sol- vant organique et insolubles dans l'eau et à obtenir une fraction aqueuse contenant les principes actifs et en ce qu'on neutralise cette dernière fraction.
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"Preparation of estrogen hormone".
The present invention relates to water-soluble estrogen hormone preparations starting from horse urine, for example urine of a stallion or of a pregnant mare. The product according to the invention is distinguished, in general, from the numerous preparations of estrogen hormone insoluble in water by its substantial insolubility in organic solvents immiscible with water, such as benzol and ether, by its substantial solubility in water, by its high stability during storage, by its lack of toxicity and by its ability to produce vaginal keratinization in ovariectomized adult rats and to attenuate menopause syndromes in humans.
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Water-soluble substances which can be used chemically and additionally possess the characteristics indicated above, as well as a high estrogenic activity by the oral route can, for example, be obtained by concentrating fresh urine and therefore not hydrolyzed or suitably preserved against hydrolysis. This concentration can advantageously be effected by adsorption with the aid of an adsorbent and subsequent extraction with the aid of an organic solvent soluble in water. The adsorbent material may be charcoal, fuller's earth, calcium triphosphate and adsorbent clay, with charcoal being the preferred adsorbent. The extractant can be a nitrogenous organic base, such as pyridine, or a mixture of alcohol and chloroform.
The extract is then concentrated by removing the solvent and the aqueous concentrate thus obtained is preferably treated with an organic solvent, immiscible with water, such as benzol and / or ether, so as to remove substances soluble in this solvent.
Important aspects of the process described above are that the starting material is unhydrolyzed and that conditions are maintained throughout the process to prevent hydrolysis of the active ingredients. Thus, the temperature is preferably kept at a relatively low level, in particular between 40 C and 50 C approximately. The time of treatment at a temperature above room temperature is as short as possible and the pH is kept in the range of neutral to low alkalinity; ie between 7 and 8.5 approximately.
The resulting product, consisting of an aqueous concentrate (containing about 20% of solid matter) or, if it
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is dried, by a water-soluble powder, contains substantially all the principles of estrogenic activity h and other water-soluble terapeutic principles of the starting urine. In general, this resulting product contains between about 1 and 2% of the solids contained in the starting urine. The product contains substances which make it stable and at the same time it is free from toxicity in the therapeutic sense when used in doses suitable to alleviate the symptoms of the menopause syndrome.
However, when it is necessary to administer such an estrogenic product, orally, in very high doses for a particular therapy, it has been found that the above preparation may in some cases cause nausea. and other gastric disturbances. The Applicant has now discovered that the factors responsible for these disturbances can be eliminated without a sudden loss of estrogenic and other therapeutic principles being observed and without the stability being reduced.
According to a preferred embodiment of the invention the concentrate? The aqueous solution is treated as follows: The pH is adjusted to a value in the range of about 2 to 6, preferably about 4 to 5.
The concentrate is then washed with an organic solvent immiscible with water, the temperature preferably being maintained in the range of approximately 15 ° C to about 20 ° C., although when the other conditions are favorable, the temperature can rise to 40 C. The washing is done as quickly as possible, the active principles being collected in the aqueous phase. The important thing is to
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coordinate conditions to prevent hydrolysis.
An aqueous extract, containing estrogenic substances and other therapeutic principles soluble in water and free from most of the bulk and unwanted impurities, is thus obtained. The extract is then neutralized, preferably at a pH of about 7 to 8. At this time, the extract can be washed with ether to remove excess solvent, but this stage of the process is optional. The neutralized extract is then dried, preferably by vacuum distillation at a temperature in the range of from about 40 ° to about 50 ° C, so as to form a substantially dry residue.
This residue possesses surprisingly high estrogenic activity by the oral route and is characterized by the abscence of substances substantially soluble in solvent and insoluble in water, which substances are odoriferous and produce gastric disturbances and nausea in some individuals. The product is susceptible to clinical use, but the Applicant prefers to continue to treat it, as will be described below.
Further, the raw materials can be obtained by processing, in accordance with the teachings given herein, raw materials more than the preferred starting materials given above.
The aforesaid residue is dissolved in a small amount of a lower alcohol and the solution is treated with a ketone solvent, so as to form a precipitate containing very few active ingredients. New amounts of odoriferous and toxic factors, characteristic of crude urine concentrates, as well as inert solids, are thus eliminated in the precipitate, which contains only a few principles.
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active estrogenics. The supernatant containing the active principles is separated and concentrated to the point of success. The dried residue is dissolved in a lower alcohol and the active ingredients are precipitated by the addition of an ether.
It should be noted that when we speak, in this specification, of a lower alcohol, it is a containing alcohol. five or less carbon atoms, with methyl alcohol and ethyl alcohol being preferred. The treatment indicated above causes other undesirable factors to pass into the extraction solution, in particular toxic substances and oils. The precipitate is separated, washed with ether and then dried. The dried precipitate contains a large proportion of the water-soluble estrogenic substances of the starting concentrate.
The stages of extraction using an organic solvent immiscible with water and of keton precipitation have the unexpected effect of removing inert solids and odoriferous and toxic substances, while not not reducing, to an extent beyond reasonable expectations, the estrogenic principles soluble in water and by not eliminating or by not activating the factors producing stability. The product obtained by the Applicant differs from estromatic sulfate by virtue of its stability and by its improved therapeutic action. The process according to the invention makes it possible, as the above shows, to obtain a product containing water-soluble estrogenic substances in a concentrated but nevertheless stable form.
Although the Applicant has described in the present specification a preferred method, in which the washing is carried out first with the aid of a solvent insoluble in water and then with the ketone precipitation, it is also
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possible to reverse the order of these two stages. Other modifications are also possible, if one adheres to the general teachings contained herein.
The invention will appear more clearly with reference to the following examples illustrating preferred procedures.
Example 1
About 25 gallons of urine freshly collected from pregnant mares and containing water-soluble estrogenic principles are preserved from hydrolysis using a mixture of alcohol and chloroform.
About 560 grams of activated charcoal are added and the mixture is mechanically stirred for 15 minutes. at about a suitable temperature of, for example, between about 15 C and 30 C. The carbon is separated by filtration. The urine filtrate is again treated with charcoal. The two masses of charcoal are combined. Almost all of the water soluble estrogenic substances were extracted from the urine. The charcoal is then either dried or left moist, for example the charcoal can be used directly after filtration or can be dried and then used.
About three liters of an aqueous solution containing about 90% pyridine are then added to the charcoal (dry or wet) and the mixture is vigorously mixed at room temperature. This mixture is stirred and then left to stand in a refrigerator for several hours. The charcoal is then filtered off and resuspended in about two liters of fresh pyridine solution (90%). The suspension is then left
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Seated at rest for several hours, while shaking occasionally. The charcoal is filtered off, resuspended in about two liters of pyridine solution and finally drained.
The extract and the pyridine washes obtained in the manner indicated above and forming a total volume of about eight liters are mixed and concentrated under vacuum at low temperature, i.e. between 40 ° C. and 50 ° C., up to a volume to 250 cm3. During the final stage of preparation, in which the pyridine is removed and the aqueous concentrate is obtained, the reaction of the mixture is prevented from becoming acidic. About 250 cc of water are added. The solution obtained constitutes a concentrate containing a large proportion of the water-soluble estrogenic substances contained in the starting urine.
400 ml of concentrate containing a content of estrogenic substances soluble in water equivalent to 19 mg of sodium estrone sulphate per ml (modified Marrian Kober test) were prepared, by operating as indicated above. This concentrate is acidified to a pH using 15% aqueous sulfuric acid and extracted four times with 160 ml of ethylene dichloride (each extraction) and three times with of 80 ml of ethylene dichloride (each extraction). The aqueous concentrate is then adjusted to pH 6.9 with 5N sodium hydroxide and extracted three times with 100 ml (each extraction) of ether. The aqueous concentrate thus freed from toxic substances, phenols and odoriferous oils is then concentrated in vacuo to dryness.
This treatment is carried out at room temperature and as rapidly as possible in order to avoid hydrolysis of the active substance by the acid.
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The dried residue is dissolved in 160 ml of methanol and a precipitation of the undesirable matters is obtained by pouring the methanolic solution into two liters of acetone. The solution of methanol and acetone is filtered, which allows the separation of 61 gms of insoluble and inactive material. The solution containing the estrogenic substances soluble in water is then concentrated under vacuum to low volume and the active ingredients are precipitated by pouring the concentrate into two liters of ether. The precipitate is filtered off and dried under vacuum. weighs 29.9 grams and contains a quantity of water-soluble estrogenic principles equivalent to 20.5% sodium estrogen sulfate measured by the modified Marrian Kober test.
The amount indicated above represents a recovery of 80% of the estrogenic potency of the concentrate in a soluble form; in water.
The resulting product is a substance suitable for clinical use and for oral administration. It is more active, when administered orally, than free estrone in alleviating menopausal syndrome in humans and, when given to ovariectomized adult rats, it is more active than free estrone with regard to the production of vaginal keratinization.
The precipitated product is also stable and substantially insoluble in organic solvents immiscible with water, such as benzol and ether. Finally, it is soluble in water and free from substances soluble in ethylene dichloride and substances insoluble in acetone.
Example 2 100 cc of the concentrate prepared as in the example
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until the pH is adjusted to the value 4 are brought to dryness under vacuum and extracted with acetone. The acetone solution is concentrated to dryness and the residue is redissolved in water, the pH of this aqueous solution being subsequently brought to the value 4 by the addition of 15% sulfuric acid. The solution obtained is extracted with the aid. of four identical volumes of ethylene dichloride. The aqueous solution is adjusted to pH 7, washed with an equal volume of ethyl ether and the excess ether is removed in vacuo.
The resulting aqueous concentrate contains more than 90% of the original amount of the water-soluble estrogenic substances contained in the starting concentrate (modified Marrian Kober test). This resulting concentrate is concentrated in vacuo to dryness and an amorphous buff powder is obtained which powder is readily soluble in water and effectively free of odoriferous substances.
Example 3
100 cc of a 15% aqueous alcoholic solution of the purified concentrate containing 600 Collip units were administered orally to non-adult rats in order to measure estrogenic activity. The concentrate solution was stored for four months at 37 ° C in stoppered, four ounce glass bottles. During this period, the solution was tried three times (at the end of the first, second and fourth months). No obvious deterioration appeared as a result of these tests.
It is evident that various modifications can be made to the specific products and procedures given in the foregoing examples without departing from
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of the spirit of the invention. Although not exhausting the subject, the following remarks will serve as a guide for some of the modifications, of which the processes and products are susceptible.
The products of the present invention are preferably prepared by first concentrating unhydrolyzed horse urine under conditions preventing hydrolysis, so as to form a concentrate containing a water-soluble estrogenic substance, by extracting the concentrate with the aid of an organic solvent soluble in water from the substance under conditions preventing hydrolysis, so as to obtain an extract containing said substance and finally concentrating the extract under conditions preventing hydrolysis hydrolysis. This process is preferably carried out by absorbing a non-hydrolyzed urine liquid using an adsorbent, preferably consisting of activated charcoal,
while maintaining a moderate temperature and a pH between neutrality and low alkalinity (preferably approximately 7 to 8), and extracting the product from the adsorbent under similar conditions using a solvent water soluble substance.
The resulting product is a substance soluble in amm, insoluble in benzol and ether and containing almost all of the water-soluble estrogenic principles of the starting urine and usually less than about 2% of the solids contained. in the starting urine fluid. It does not contain any substantial amount of free estrogen. The product is also stable. However, it still contains odoriferous and inactive substances and substances causing gastric disturbances and nausea in some individuals.
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Wash with solvent.
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In the washing operation it is essential to maintain the pH in the range of 2 to 6. Higher results are obtained in the preferred range of 4 to 5. To prevent hydrolysis, it is also desirable to operate at low temperature, preferably between 15 C and 20 C, and in any case below 40 0, regardless of the duration of the treatment. The washing operation is usually repeated several times, preferably 4 to 6 times.
The extractants are solvents for fats and oils, for phenols, for alkyl-substituted phenols and for unconjugated sterols. Among the solvents which have these characteristics and which are suitable for the purpose pursued, there may be mentioned, by way of example, aliphatic alcohols with 5 or more carbon atoms, alicyclic alcohols such as cyclohexanol, ethers such as diethyl ether, isopropyl ether, aliphatic hydrocarbons such as hexane and higher hydrocarbons of the same series, aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, etc., alicyyl hydrocarbons such as cyclohexane , chlorinated hydrocarbons such as chloroform, ethylene dichloride, trichlorethylene, carbon tetrachloride and chlorobenzene,
esters such as ethyl acetate and amyl acetate, or ketones such as methyl isobutyl ketone.
Among the groups of solvents indicated above, preferred are chlorinated hydrocarbons and, in particular, ethylene dichloride, since the Applicant has found that a surprisingly small amount of estrogenic principles is extracted by these solvents.
In addition, these solvents are not flammable and are suitable for
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They are therefore better at large-scale processes than others.
Neutralization --------------
After extraction, the solution is neutralized to a pH ranging from neutral to low alkalinity. The Applicant prefers to operate within a range of between 6 and 8.5, and more particularly between 7 and 7.5. Neutralization can be done with the aid of an alkali, preferably consisting of sodium or potassium hydroxide
Washing.
Washing the neutralized solution with an ether constitutes an optional operation, but the Applicant has found that this washing is very advantageous, in that it removes the excess of the solvent immiscible with the water. water. Isopropyl ether, ethyl ether or any other solvent of the water immiscible solvent can be employed.
Drying
The purpose of drying is to remove water and make the active material suitable for subsequent treatment. One of the preferred drying methods is that which consists of drying under vacuum at a temperature of between 40 and 50 C approximately.
Precipitation
The dried product is dissolved in a lower alcohol, such as methyl alcohol, and the unwanted material is precipitated with an alcohol soluble ketone solvent. As examples of ketone solvents suitable for the purpose pursued, there may be mentioned acetone, alcohol diacetone, acetonyl acetone, methyl ethyl ketone, ethyl acetoacetate, methyl isobutyl ketone, isophorone,. mesityl oxide, methyl-n-amyl ketone and
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diisobutyl ketone. However, the preferred ketone is acetone.
It was surprisingly found that, during precipitation, large quantities of material insoluble in the ketone solvent and containing, as the Applicant has observed, only a few active ingredients separated, while the ketone solvent contains a material soluble in acetone and containing the active ingredients.
This precipitation stage is carried out by gradually adding an excess of ketone solvent, while stirring, until precipitation is complete. The supernatant is separated by filtration or centrifugation and is then concentrated.
Ether precipitation.
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The resulting concentrate is dissolved in alcohol and poured into an excess of an ether, ethyl ether and isopropyl ether being preferred. A precipitate is then formed containing the estrogenically active substance, the ether-soluble oils and phenolics remaining in the supernatant. The precipitate is separated and, preferably, washed with ether and dried.
Product Features -----------------------------
The product of the invention prepared as described above has the following characteristics.
Physical nature a) Solid amorphous powder b) Aqueous solution
The product contains a plurality of water soluble estrogenic substances, nitrogenous organic compounds, for example, indoxyl sulfate, and a substantial fraction of alkali soluble.
Chemical characteristics a) practically insoluble in organic solvents
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ques immiscible with water, especially ether and benzol; b) substantially free of matter soluble in fatty solvents; (c) substantially free from phenolic substances; d) soluble in water, alcohol, acetone, pyridine and methyl alcohol, e) hydrolysis of the product by heat, acid or alkali gives rise to the release of free estrogenic substances not miscible with water and soluble in organic solvents, such as ether or benzol.
Stability
Stable as a dry powder or an aqueous solution, at room temperature, with respect to self-hydrolysis.
Aesthetic qualities
Practically free of objectionable odor, taste and factors causing intestinal disturbances and nausea.
Pharmacological effect a) more effective orally than free estrone for alleviating menopausal syndrome; b) more effective than estrone sulphate in oral therapy of menopause. c) free from toxicity at therapeutically active doses, d) alleviates the usual autonomic and emotional symptoms accompanying menopause syndrome; e) approximately 2 to 2 1/2 times more active than the equivalent amount of free estrone in producing vaginal keratinization, after oral administration to ovariectomized adult rats.
From a chemical point of view, the product has a greater activity than that developed by the apparent content of sodium estrone sulfate measured by the Marrian test.
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Modified Kober (colorimetric estimation) described in "The Elimination of Estrin in Urine with the Photo-Electric Colorimeter" by E.H. Venning et al (J.B.C. 120 225 1937).
The concentrations of hydrogen ions (pH) mentioned herein were measured using the glass electrode pH meter from the "Beckman Laboratory", no connection being introduced for the concentration of metal ions. liques.
It is obvious that various modifications can be introduced in the described procedures, without departing from the spirit of the invention as defined in the appended claims. The operating modes and means described are only illustrative thereof and are only limited by the state of the art.
CLAIMS --------------
1. Process for the preparation of a water-soluble estrogenic hormonal substance, characterized in that an aqueous urine concentrate, containing water-soluble estrogenic principles, is acidified to a concentration of water-soluble estrogen. pH ranging from approximately 2 to 6, in that the acidified concentrate is extracted with an organic solvent substantially insoluble in water so as to remove the soluble substances in the sol- vant organic and insoluble in water and to obtain an aqueous fraction containing the active ingredients and in that the latter fraction is neutralized.