<Desc/Clms Page number 1>
Procédé de préparation de produits à base de provitamine D apte à être rendue active vis-à-vis des poussins.
Depuis qu'on sait que la cholestérine contient de faibles quantités de provitamine D, on a essayé de concen- trer cette stérine à provitamine D et de l'isoler à l'état aussi pur que possible. Notamment, après la découverte de Waddell (Journ. of the Biol.Chemistry, Tome 105,Juillet 1954, N 4, pages 711 à 739) que cette provitamine diffère de l'er- gostérine végétale en ce qui concerne son aptitude à être ac- tivée pour former de la vitamine D active vis-à-vis des pous- sins, la préparation de la provitamine D animale à l'état sensi- blement pur a gagné une grande importance.
Pour concentrer @
<Desc/Clms Page number 2>
cette provitamine, on a cherché à appliquer différents procédés, par exemple, la cristallisation fractionnée, l'éva- poration fractionnée dans le vide poussé, l'extraction frac- tionnée du composé de digitonine, l'adsorption fractionnée à l'aide de substances d'adsorption déterminées, mais aucun de ces procédés n'a donné un résultat appréciable.
On a trouvé qu'il est possible de concentrer consi- dérablement la provitamine D mentionnée en partant d'un éther d'un mélange de stérines contenant de la provitamine D et en augmentant la teneur en provitamine D par adsorption frac- tionnée à un degré tel, de préférence à au moins 40 à 50%, qu'on puisse continuer cette augmentation par recristallisa- tion dans un solvant,de préférence, dans de l'alcool méthy- lique.
Conformément à l'invention, on utilise pour, l'éthé- rification un acide qui ne donne pas lieu en lui-même à une adsorption particulièrement forte parcequ'autrement les é- carts d'adsorbabilité des différentes stérines présentes dans le mélange, écarts qui permettent en fait d'effectuer la sépa- ration, ne pourraient se manifester.
Comme matière première, on utilise, de préférence, des mélanges de stérines qui possèdent déjà une teneur assez élevée en provitamine D-poussins. Des mélanges de stérines dont cette teneur est particulièrement élevée, peuvent être obtenus à partir des invertébrés tels que les moules d'eau salée, moules d'eau douce, littorines, vers de farine, limaces, buccins, vers de terre, etc.
Dans la préparation, à partir des invertébrés men- tionnés ci-dessus, des matières premières destinées à être utilisées pour l'exécution de la présente invention, on doit - @
<Desc/Clms Page number 3>
tenir compte du fait que la provitamine D-poussins est une matière relativement instable et sensible à l'oxygène.
Un procédé de préparation convenable dans lequel des traitements nuisibles à la provitamine D sont évités, est, par exemple, le suivant:
On sèche ia masse mouiue à traiter aans le vide à une température modérée(par exemple, de 50 C environ) ou'bien, après l'avoir moulue et, éventuellement, triturée à l'aide de sable, à l'aide de sulfate de sodium, d'alcool ou d'acé- tone. De la matière première ainsi préparée, on extrait ensuite la graisse. Pour cette extraction on utilise, de préfé- rence, des solvants à bas point d'ébullition tels que l'éther ordinaire ou l'éther de pétrole et on évite, de préférence, l'emploi de substances extractives halogénées telles que le chloroforme ou le tétrachlorure de carbone car ces substances peuvent donner lieu à la production d'acide chlorhydrique.
Il est avantageux d'éviter un contact prolongé avec l'éther car celui-ci contient souvent des peroxydes ou, tout au moins, la production de peroxydes est difficile à éviter en cas d'emploi d'éther. Si la matière première a été séchée à l'aide d'alcool ou d'acétone, la partie de la graisse dissoute peut être récupérée par évaporation à siccité du solvant dans le vide ou, après dilution avec de l'eau, par extraction avec de l'éther ordinaire ou de l'éther de pétrole. La solution de graisse est débarrassée par filtration des albumines éventuellement en suspension, le solvant étant enlevé par distillation.
Ensuite, on saponifie la graisse de la manière usuelle tout en évitant, de préférence, les températures très élevées et en utilisant, par exemple, une solution de soude ou de potasse caustique dans de l'alcool à 80% au moins. Eventuellement
<Desc/Clms Page number 4>
on peut débarrasser la solution de savon par distillation d'une partie de l'alcool, après quoi on peut obtenir la par- tie insaponifiable soit en étendant d'eau la solution de savon et en extrayant ensuite la partie insaponifiable à l'aide d'éther ordinaire ou d'éther de pétrole, soit en précipitant les savons de chaux dans la solution aqueuse de savon en traitant par un sel calcaire et en en extrayant , par exemple à l'aide d'acétone, les constituants insaponifia- bles précipités simultanément avec les savons de chaux.
La fraction de stérines peut fréquemment'être séparée de la partie insaponifiable ainsi obtenue, par exemple par recristallisation dans l'alcool; pour la purification ultérieure , on peut utiliser avec beaucoup de succès une recristallisa- tion dans l'alcool méthylique dans lequel certaines impuretés, par exemple des substances huileuses, ou certains constituants colorés de lipoïdes ne sont que peu solubles et peuvent être éliminés de cette façon. Plus particulièrement dans les cas où les constituants insaponifiables contiennent des quantités appréciables de substances colorantes telles que les carotinoïdes, une partie de la provitamine peut être détruite sous l'action de la lumière et de l'air; il est, par conséquent, désirable de tenir compte de cette circons- tance.
EXEMPLE I -----------
On mit en dissolution 7g d'un mélange d'acétate de stérine contenant 6,7% d'acétate de provitamine et préparé au moyen d'une stérine provenant de moules d'eau salée (mytilus edulis), dans 105 centimètres cubes d'un mélange de
<Desc/Clms Page number 5>
benzène et d'éther de pétrole (point d'ébullition 40 - 60 C, proportion de 1:1). On versa cette solution dans une colonne d'adsorption préparée d'après Brockmaan à l'aide de 315 g d'oxyde d'aluminium et ayant un diamètre de 33 mms, cette colonne ayant été traitée au préalable par de l'éther de pétrole. La préparation d'une telle colonne d'adsorption est décrite dans l'ouvrage d'A. Wintersteiner et G. Stein, Z.f.
Physiol.Chem.Tome 220, pages 247 et suivantes, 1933. La solution étant incorporée à la colonne, on développa avec au total 520 centimètres cubes d'un solvant (mélange de benzène et d'éther de pétrole dans une proportion de 1 :1). le filtrat, 625 centimètres cubes, contenait 4,43 g de mé- lange d'acétates ne contenant qu'une faible quantité'd'acétate de provitamine. Le développement étant terminé, on enleva avec précaution à l'aide d'une spatule les 2 cms supérieurs de la colonne qui avaient pris, à cause d'impuretés, une couleur jaune, et ensuite on effectua l'élution de la colonne entière avec 600 centimètres cubes d'un mélange de benzène et d'alcool méthylique (11:1). L'éluat obtenu renfermait 2,51 g de mélange d'acétates contenant 15% d'acétate de provitamine.
On mit en dissolution 2,47 g de cette préparation dans 57,5 centimètres cubes d'un mélange de benzène et d'éther de pétrole (1:1) et on soumit cette solution à une seconde adsoption. (Colonne de 112,5 g d'Al2O3, diamètre 20 mms, 200 centimètres cubes de liquide développant). On enleva le filtrat, 237,5 centimètres cubes, ainsi que les 2 cms supérieurs de la colonne et on élua la colonne subsistante avec 200 centimètres cubes du mélange de benzène et d'alcool méthylique (11:1). L'éluat contenait 0,78 g de mélange d'acétate a environ 30 % d'acétate de provitamine.
On
<Desc/Clms Page number 6>
soumit cette préparation pour la troisième fois à une adsorption : on mit en dissolution 0,77 g dans 12 centimètres cubes de mélange de benzène et d'éther de pétrole (1:1), (colonne de 36 g d'Al2O3, diamètre de 11 mms, 115 centimètres cubes de liquide développant). On recueillit le filtrat en deux parties distinctes; le développement étant terminé on enleva les premiers 80 centimètres cubes ainsi que les 2 cms supérieurs de la colonne et on combina les 47 centimètres cubes résiduels du filtrat avec l'éluat avec 100 centimètres cubes de mélange de benzène et d'alcool méthylique (11:1).
Résultat: 224 mg d'un mélange d'acétates à 57% environ.
On recristallisa ce mélange d'acétate à trois reprises dans de l'alcool méthylique (20, 15 et 12 centimètres cubes) et on obtint alors 49 mg d'acétate de stérine bien cristallisé dont le spectre d'absorption entre 3100 et 2500 U.A. était sensiblement analogue à celui de l'acétate d'ergostérine mais qui possédait, après saponification et irradiation, une activité antirachitique vis-à-vis des poussins qui était très élevée par rapport à l'ergostérine irradiée. Après avoir été recristallisé de nouveau dans l'alcool méthylique, l'acétate fondait dans un tube capillaire dans le vide à une température de 160 à 1610, le pouvoir rotatoire étant [#] D = - 78 (dans le benzène).
A partir de cet acétate, on put obtenir la stérine par saponification et par recristallisation à l'aide d'alcool méthylique. Elle fonda dans le vide à 149,5 - 150 et son pouvoir rotatoire était [#]D = - 118 (dans le benzène).
Son spectre d'absorption était sensiblement identique à celui de l'ergostérine.
<Desc/Clms Page number 7>
EXEMPLE II -----------
En traitant 8 g d'un mélange de stérines provenant de moules et contenant, mesuré spectroscopiquement, environ 16% de provitamine, par 10g d'anhydride isobutyrique et 20 centimètres cubes de pyridine, on transforma ce mélange en l'isobutyrate. On chauffa dans le vide pendant une heure et demie à 110 C, on refroidit la solution et la versa dans 200 centimètres cubes d'alcool. On filtra le mélange d'iso- butyrate précipité, on le lava avec de l'alcool froid jusqu'à ce qu'il fût exempt de pyridine et on le sécha.
Résultat: 7,5g.
On mit en dissolution 7,45 g de ce mélange d'iso- butyrate dans 105 centimètres cubes d'un solvant constitué par des parties égales de benzène et d'éther de pétrole, point d'ébullition 40 - 60 C. On versa cette solution dans une colonne d'adsorption de 317 g d'Al2O3 produite de la manière indiquée dans l'exemple I. On lava la colonne avec 1960 centimètres cubes de solvant. Du fait que l'éther de provitamine fut adsorbé plus fortement, les :éthers des au- tres stérines contenues dans le mélange, apparaissaient dans le filtrat plus tôt que l'éther de provitamine.
En observant l'absorption du filtrat dans la région comprise entre 3000 et 2800 A (au moyen d'une cellule photo-électrique à cadmium et d'un filtre en verre uviol) on put déterminer le moment où l'éther de provitamine apparut dans le filtrat ainsi que le moment de sa concentration maximum. On re- cueillit le filtrat en trois parties; la première partie fut recueillie jusqu'à ce que l'éther de provitamine appa- rut, la seconde partie jusqu'à ce que l'éther de provitami- ne atteignit sa concentration maximum et la troisième parn
<Desc/Clms Page number 8>
tie jusqu'à ce que l'éther de provitamiene füt sensiblement enlevé par lavage.de la colonne.
Dans l'exemple envisagé les premiers 375 centimètres cubes contenaient 0,62 g d'isobutyrate exempt d'éther de provitamine; les 110 centimètres cubes suivants contenaient 4,50 g d'isobutyrate à environ 7,5% d'éther de provitamine et les 1580 centimètres cubes résiduels 2,32 g d'isobutyrade à environ 37,5% d'isobutyrate de provitamine. On mit en dissoluation ces 2,32 g dans 8 centimètres cubes du solvant et on versa cette solution, suivie de 1455 centimètres cubes du solvant, dans la même colonne. On recueillit le filtrat en parties; les derniers 960 centimètres cubes contenaient 0,59 g de mélange d'isobutyrates contenant environ 84% d'isobutyrate de provitamine.
On recristallisa 0,58 g de ce dernier mélange, d'abord dans 50 centimètres cubes d'un mélange d'éther et d'alcool méthylique et ensuite dans 25 centimètres cubes d'alcool; on obtint ainsi 0,43 g d'isobutyrate de provitamine à 94%.
EXEMPLE III ------------
A partir ci-environ 8 kg de Tubifex on prépara la fraction de stérines de la manière indiquée dans la description. En la traitant par de l'anhydride acétique etdela pyri- dine on transforma cette fraction en l'acétate. On soumit le mélange d'acétates obtenu à une filtration fractionnée dans une colonne d'adsorption d'Al2O3 prépar.ée sensiblement de la même manière que dans l'exemple II.A partie de 12,5 g du mélange dacétates contenant 24% d'acétate de provitamine, on obtint après un seul traitement une fraction de 5,10 g contenant environ 47% d'acétate de provitamine. Cette fraction fut utilisée pour le second traitement qui donna une fraction de 3,12 g à environ 62% d'acétate de provitamine.
On soumit cette dernière fraction de nouveau au même trai-
<Desc/Clms Page number 9>
tement; la fraction la plus forte, pesant 1,11 g, contenait environ 83% d'acétate de provitamine. Ob recristallisa cette préparation dans de l'alcool méthylique et on obtint 0,97 g contenant 91% d'acétate de provitamine. Après avoir recristallisé de nouveau dans l'alcool méthylique, on trouva que la teneur en acétate de provitamine était de 96%.
<Desc / Clms Page number 1>
Process for the preparation of products based on provitamin D capable of being made active with regard to chicks.
Since it became known that cholesterin contains small amounts of provitamin D, attempts have been made to concentrate this provitamin D sterin and to isolate it as pure as possible. Notably, after the discovery by Waddell (Journ. Of the Biol. Chemistry, Tome 105, July 1954, N 4, pages 711 to 739) that this provitamin differs from vegetable ergosterin as regards its ability to be ac - Activated to form active vitamin D with respect to chicks, the preparation of animal provitamin D in a substantially pure state has gained great importance.
To focus @
<Desc / Clms Page number 2>
this provitamin, attempts have been made to apply various methods, for example, fractional crystallization, fractional evaporation in a high vacuum, fractional extraction of the digitonin compound, fractional adsorption using substances. adsorption determined, but none of these methods gave an appreciable result.
It has been found that it is possible to considerably concentrate the mentioned provitamin D by starting with an ether of a mixture of sterins containing provitamin D and increasing the provitamin D content by fractional adsorption to a degree. such, preferably at least 40 to 50%, that this increase can be continued by recrystallization from a solvent, preferably from methyl alcohol.
In accordance with the invention, an acid is used for etherification which does not in itself give rise to particularly strong adsorption because otherwise the adsorbability gaps of the various sterins present in the mixture. which in fact allow the separation to take place, could not be manifested.
As raw material, sterin mixtures are preferably used which already have a fairly high content of provitamin D-chicks. Mixtures of sterins of which this content is particularly high can be obtained from invertebrates such as saltwater mussels, freshwater mussels, littorines, mealworms, slugs, whelks, earthworms, etc.
In the preparation, from the above-mentioned invertebrates, of raw materials for use in carrying out the present invention, one should - @
<Desc / Clms Page number 3>
be aware that provitamin D-chicks is a relatively unstable and oxygen sensitive material.
A suitable method of preparation in which detrimental treatments with provitamin D are avoided is, for example, the following:
The wet mass to be treated is dried in a vacuum at a moderate temperature (for example about 50 ° C.) or well, after having been ground and, optionally, triturated with sand, with sulfate. sodium, alcohol or acetone. From the raw material thus prepared, the fat is then extracted. For this extraction, low boiling point solvents such as ordinary ether or petroleum ether are preferably used and the use of halogenated extractives such as chloroform or carbon tetrachloride as these substances can give rise to the production of hydrochloric acid.
It is advantageous to avoid prolonged contact with the ether since the latter often contains peroxides or, at least, the production of peroxides is difficult to avoid when using ether. If the raw material has been dried with alcohol or acetone, the part of the dissolved fat can be recovered by evaporating the solvent to dryness in a vacuum or, after dilution with water, by extraction with ordinary ether or petroleum ether. The fat solution is removed by filtration of the albumins optionally in suspension, the solvent being removed by distillation.
Then, the fat is saponified in the usual manner, while preferably avoiding very high temperatures and using, for example, a solution of sodium hydroxide or caustic potash in at least 80% alcohol. Eventually
<Desc / Clms Page number 4>
part of the alcohol can be removed from the soap solution by distillation, after which the unsaponifiable part can be obtained either by diluting the soap solution with water and then extracting the unsaponifiable part with the aid of 'ordinary ether or petroleum ether, either by precipitating the lime soaps from the aqueous soap solution by treating with a calcareous salt and extracting therefrom, for example with the aid of acetone, the unsaponifiable constituents precipitated simultaneously with lime soaps.
The fraction of sterins can frequently be separated from the unsaponifiable part thus obtained, for example by recrystallization from alcohol; for further purification, recrystallization from methyl alcohol can be used with great success in which certain impurities, for example oily substances, or certain colored constituents of lipoids are only sparingly soluble and can be removed in this way. . More particularly in cases where the unsaponifiable constituents contain appreciable amounts of coloring substances such as carotinoids, part of the provitamin can be destroyed under the action of light and air; it is, therefore, desirable to take this circumstance into account.
EXAMPLE I -----------
7g of a mixture of sterin acetate containing 6.7% of provitamin acetate and prepared by means of a sterin obtained from saltwater mussels (mytilus edulis) were dissolved in 105 cubic centimeters of a mix of
<Desc / Clms Page number 5>
benzene and petroleum ether (boiling point 40 - 60 C, proportion 1: 1). This solution was poured into an adsorption column prepared according to Brockmaan using 315 g of aluminum oxide and having a diameter of 33 mm, this column having been treated beforehand with petroleum ether. . The preparation of such an adsorption column is described in the work of A. Wintersteiner and G. Stein, Z.f.
Physiol.Chem.Tome 220, pages 247 and following, 1933. The solution being incorporated in the column, one developed with a total of 520 cubic centimeters of a solvent (mixture of benzene and petroleum ether in a proportion of 1: 1). the filtrate, 625 cubic centimeters, contained 4.43 g of acetate mixture containing only a small amount of provitamin acetate. The development being finished, we removed with care using a spatula the upper 2 cms of the column which had taken, because of impurities, a yellow color, and then carried out the elution of the entire column with 600 cubic centimeters of a mixture of benzene and methyl alcohol (11: 1). The eluate obtained contained 2.51 g of a mixture of acetates containing 15% of provitamin acetate.
2.47 g of this preparation were dissolved in 57.5 cubic centimeters of a mixture of benzene and petroleum ether (1: 1) and this solution was subjected to a second adsorption. (Column of 112.5 g of Al2O3, diameter 20 mms, 200 cubic centimeters of developing liquid). The filtrate, 237.5 cubic centimeters, as well as the top 2 cms of the column were removed and the remaining column was eluted with 200 cubic centimeters of the mixture of benzene and methyl alcohol (11: 1). The eluate contained 0.78 g of an acetate mixture of about 30% provitamin acetate.
We
<Desc / Clms Page number 6>
submitted this preparation for the third time to adsorption: 0.77 g was dissolved in 12 cubic centimeters of a mixture of benzene and petroleum ether (1: 1), (column of 36 g of Al2O3, diameter of 11 mms, 115 cubic centimeters of developing liquid). The filtrate was collected in two distinct parts; when the development is complete, the first 80 cubic centimeters and the upper 2 cms of the column were removed and the residual 47 cubic centimeters of the filtrate with the eluate were combined with 100 cubic centimeters of mixture of benzene and methyl alcohol (11: 1).
Result: 224 mg of a mixture of approximately 57% acetates.
This acetate mixture was recrystallized three times from methyl alcohol (20, 15 and 12 cubic centimeters) and 49 mg of well-crystallized sterin acetate were then obtained, the absorption spectrum of which was between 3100 and 2500 A.U. was substantially similar to that of ergosterine acetate but which possessed, after saponification and irradiation, an antirachitic activity towards chicks which was very high compared with irradiated ergosterin. After being recrystallized again from methyl alcohol, the acetate melted in a capillary tube under vacuum at a temperature of 160 to 1610, the optical rotation being [#] D = - 78 (in benzene).
From this acetate, the sterin could be obtained by saponification and by recrystallization with methyl alcohol. It melted in a vacuum at 149.5 - 150 and its optical rotation was [#] D = - 118 (in benzene).
Its absorption spectrum was substantially identical to that of ergosterine.
<Desc / Clms Page number 7>
EXAMPLE II -----------
By treating 8 g of a mixture of sterins obtained from molds and containing, spectroscopically measured, about 16% provitamin, with 10 g of isobutyric anhydride and 20 cubic centimeters of pyridine, this mixture was converted into the isobutyrate. It was heated in a vacuum for an hour and a half at 110 C, the solution was cooled and poured into 200 cubic centimeters of alcohol. The precipitated isobutyrate mixture was filtered, washed with cold alcohol until free of pyridine, and dried.
Result: 7.5g.
7.45 g of this mixture of isobutyrate are dissolved in 105 cubic centimeters of a solvent consisting of equal parts of benzene and petroleum ether, boiling point 40 - 60 C. This is poured in. solution in an adsorption column of 317 g of Al2O3 produced as indicated in Example I. The column was washed with 1960 cubic centimeters of solvent. Because the provitamin ether adsorbed more strongly, the ethers of the other sterins in the mixture appeared in the filtrate earlier than the provitamin ether.
By observing the absorption of the filtrate in the region between 3000 and 2800 A (by means of a cadmium photocell and a UV glass filter) it was possible to determine the moment when the provitamin ether appeared in the cell. the filtrate as well as the time of its maximum concentration. The filtrate is collected in three parts; the first part was collected until the provitamin ether appeared, the second part until the provitamin ether reached its maximum concentration and the third part
<Desc / Clms Page number 8>
until the provitamiene ether was substantially washed off the column.
In the example considered, the first 375 cubic centimeters contained 0.62 g of isobutyrate free of provitamin ether; the next 110 cubic centimeters contained 4.50 g of isobutyrate at about 7.5% provitamin ether and the remaining 1580 cubic centimeters contained 2.32 g of isobutyrade at about 37.5% provitamin isobutyrate. These 2.32 g were dissolved in 8 cubic centimeters of the solvent and this solution was poured, followed by 1455 cubic centimeters of the solvent, into the same column. The filtrate was collected in parts; the last 960 cubic centimeters contained 0.59 g of isobutyrate mixture containing about 84% provitamin isobutyrate.
0.58 g of the latter mixture was recrystallized, first in 50 cubic centimeters of a mixture of ether and methyl alcohol and then in 25 cubic centimeters of alcohol; 0.43 g of 94% provitamin isobutyrate was thus obtained.
EXAMPLE III ------------
From about 8 kg of Tubifex the sterin fraction was prepared as indicated in the description. Treating it with acetic anhydride and pyridine converted this fraction into the acetate. The acetate mixture obtained is subjected to fractional filtration in an Al2O3 adsorption column prepared substantially in the same manner as in Example II.A portion of 12.5 g of the acetate mixture containing 24% d 'provitamin acetate, a fraction of 5.10 g was obtained after a single treatment, containing about 47% of provitamin acetate. This fraction was used for the second treatment which gave a fraction of 3.12 g at about 62% provitamin acetate.
This last fraction was again subjected to the same treatment.
<Desc / Clms Page number 9>
mentally; the largest fraction, weighing 1.11 g, contained about 83% provitamin acetate. Ob recrystallized this preparation from methyl alcohol and 0.97 g was obtained containing 91% provitamin acetate. After recrystallizing again from methyl alcohol, the content of provitamin acetate was found to be 96%.