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REVENDICATIONS
1. Procédé pour l'obtention d'acides gras d'origine humaine, Ca- ractérisé en ce qu'on extrait d'au moins un élément placentaire humain, en atmosphère inerte, les lipides totaux au moyen d'un mélange de solvants et, de ces lipides, on sépare un mélange d'acides gras contenant au moins 20% en poids d'acide arachidonique.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on le réalise sous atmosphère d'azote.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise un mélange d'un solvant peu polaire et d'un solvant très polaire.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme solvant un mélange d'hexane et d'isopropanol.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme solvant un mélange d'hexane et d'éthanol.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme solvant un mélange de cyclohexane et d'isopropanol.
7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme solvant un mélange d'éther de pétrole de bas point d'ébullition et d'éthanol.
8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme solvant un mélange de chlorure de méthylène et de méthanol.
9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajuste la teneur en eau de l'élément placentaire entre 15 et 45% en poids.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on sépare des lipides qu'on extrait du placenta total ou des résidus placentaires subséquents à l'extraction de "-globulines ou d'enzymes placentaires, un mélange d'acides gras contenant au moins 20% en poids d'acide arachidonique.
Les lipides totaux extraits d'au moins un élément placentaire humain contiennent différents acides gras d'origine humaine, dont certains d'entre eux sont des acides gras dits essentiels, non synthétisés dans le métabolisme humain.
Ainsi en est-il entre autres de l'acide arachidonique (5,8,11,14-Eicosatetraenoic acid, C 20:4) dont les sources diverses sont difficilement accessibles en quantités importantes ou d'un prix élevé.
Or les lipides totaux extraits du tissu placentaire ou des éléments placentaires résiduels de fabrication, à partir du placenta, de yglobulines, d'extraits aqueux ou d'enzymes, par exemple, sont relativement riches en acide arachidonique qui représente environ 20% des acides gras de ces lipides.
L'acide arachidonique est particulièrement important dans le métabolisme humain comme précurseur indispensable, en particulier et par exemple dans la synthèse endogène des prostaglandines E2 et
F2 a. Il joue également un rôle essentiel au niveau des membranes cellulaires comme constituant déterminant de leur viscosité et pouvant ainsi intervenir dans la réponse immunitaire. Etant donné la relative fragilité de cet acide gras à quatre doubles liaisons, ainsi que la texture et la composante antioxydante naturelle particulières de la matière première, et même son contenu variable en eau, les méthodes habituelles d'extraction des lipides ne sauraient conduire à des résultats satisfaisants tant sur les plans qualitatif que quantitatif.
Par ailleurs, il faut éviter également l'oxydation par l'air et respecter la qualité du matériel utilisé.
En effet, comme il ressort de la publication Nature , 217, 378379 (1968), on connaissait déjà l'obtention d'acides gras libres d'origine humaine à partir de plasma maternel, de plasma perfusé et de plasma de cordon ombilical, par extraction avec certains solvants, puis séparation par chromatographie.
La publication Chemical Abstracts , 60, 4548-4549 (1964), se rapporte également à l'extraction de lipides à partir de placentas humains et à l'obtention d'acides gras, par utilisation de solvants, puis dialyse sur membrane.
Le Chemical Abstracts , 94, 513-514 (1981), mentionne des méthodes d'extraction d'acides gras à partir de jaune d'oeuf.
De même, le Journal of the American Oil Chemists Society , 58, 599-601 (1981), se rapporte également à l'extraction d'acides gras contenus dans différents produits alimentaires, à l'aide de solvants.
L'état de la technique relevé utilise des méthodes d'extraction et des techniques à but purement analytique, portant sur de petites quantités de matière première faisant intervenir des solvants différents, méthodes et techniques qui ne sauraient s'adapter à une production industrielle, à partir de résidus de placenta, réalisable par l'objet de l'invention.
Afin d'améliorer l'obtention d'acides gras d'origine humaine,
I'invention est caractérisée en ce qu'on extrait d'au moins un élément placentaire humain, en atmosphère inerte, les lipides totaux au moyen d'un mélange de solvants et, de ces lipides, on sépare un mélange d'acides gras contenant environ 20% en poids d'acide arachidonique.
En travaillant en atmosphère neutre ou inerte et dans des récipients de verre ou d'acier inoxydable, par exemple, il faut en particulier choisir un mélange de solvants dont l'un est peu polaire, stable et non hydrolysé à l'air et à la lumière, par exemple: I'hexane, le chlorure de méthylène, la trichlorotrifluoroéthane, l'éther de pétrole de bas point d'ébullition, le cyclohexane, l'isopropyléther et l'autre solvant très polaire, par exemple: le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, et cela dans des proportions convenables et pratiques pour faciliter une bonne récupération de ces solvants, compte tenu également d'une certaine quantité d'eau contenue dans la matière première de départ.
Il est donc nécessaire, pour obtenir les conditions d'extraction les meilleures, d'ajuster de cas en cas la teneur en eau de façon que le mélange obtenu avec les deux types de solvant ait le meilleur coefficient de solubilité pour les lipides placentaires.
De plus, afin qu'il n'y ait pas défaut d'extraction des lipides totaux, il faut optimiser les proportions suivantes: poids de matière première/volume du solvant peu polaire/volume du solvant très polaire/eau, cela pour détruire les interactions lipides-protéines.
Lorsque les matières premières utilisées sont contenues dans des emballages paraffinés, il est tout d'abord indispensable de les extraire en présence d'une quantité déterminée d'eau, à froid ou à chaud, par un solvant peu polaire qui permet de séparer les cires et les paraffines, ainsi qu'une partie de lipides neutres dont la teneur en acide arachidonique est toutefois beaucoup plus faible que celle des phospholipides.
On peut également éviter l'altération des lipides et, par conséquent, des acides gras qui en seront séparés, en utilisant la méthode de la colonne sèche avec un mélange de solvants approprié.
Les acides gras totaux, obtenus ensuite de ces lipides, et contenant au moins 20% d'acide arachidonique, peuvent être estérifiés par des monoalcools ou des polyols, ou utilisés comme source pour l'enrichissement en ou l'isolation de l'un ou l'autre des acides gras les constituant. Les produits obtenus par le procédé objet de cette invention peuvent être utilisés en médecine humaine ou vétérinaire, en cosmétique, en diététique ou comme intermédiaire de synthèse.
Les exemples ci-dessous illustrent l'invention:
Exemple 1:
Le résidu d'extraction de placenta, dont la proportion d'eau est ajustée par ajout ou centrifugation, est extrait à froid par un solvant constitué de trois parties en volume d'hexane et deux parties en volume d'isopropanol, à raison de 1800 ml du mélange de solvant pour 100 g de résidu, en présence de 0,2 g/l de BHT et sous atmosphère d'azote (BltT = butyl-hydroxy-toluéne).
Après filtration et évaporation du solvant, le résidu de lipides totaux (1,6-1,9 g) est redissous dans 12 ml de soude méthanolique
0,8N. On chauffe une heure sous agitation, avec barbotage d'azote.
Après refroidissement, les lipides non saponifiés sont extraits à l'hexane (ce qui fournit, après évaporation du solvant, un résidu, dont on peut extraire par exemple la sphingomyéline, par précipitation à l'acétate d'éthyle).
Dans la solution aqueuse, la décomposition en acides gras libres des savons dissous s'effectue en ajoutant 1,42 g d'HCI aqueux à 37%.
Le temps de réaction est d'une heure sous agitation (sous reflux).
Les acides gras libérés sont extraits par de l'hexane. La solution organique, séparée de la phase aqueuse, est lavée à l'eau jusqu'à neutralité; par séchage de la phase organique, puis évaporation du solvant, on obtient un mélange d'acides gras contenant 20-25% de C20:4(env. 1,0 g).
(De la solution aqueuse résiduelle, on peut purifier les gangliosides par chromatographie sur adsorbants spécifiques.)
Exemple 2:
1 kg de résidu d'extraction du placenta contenant des parties d'emballage paraffiné, après addition d'une certaine quantité d'eau, et en présence de 2 g/l de butylhydroxytoluène, est extrait sous atmosphère d'azote à chaud (ou plus longtemps à froid) par 20004000 ml d'hexane (ce qui élimine les cires et la paraffine contaminantes). Après séparation du solvant, la suspension aqueuse est extraite en deux fois par au total 18 1 du solvant hexane-isopropanol (3:2) sous atmosphère d'azote. Après filtration et évaporation du solvant, on obtient env. 19,0 g de lipides totaux (pratiquement privés de paraffine) dont on peut obtenir un mélange d'acides gras comme dans l'exemple 1 (env. 10 g).
Exemple 3:
On dissout 42 g de lipides totaux, obtenus selon exemple 1, par exemple, dans 100 ml de chloroforme et on y ajoute 500 ml d'acétone. On abandonne le mélange quelques heures à - 30" C; on filtre pour obtenir environ 17 g de précipité. Dans le solvant restent dissous environ 25 g de lipides qui peuvent être traités pour en séparer les acides gras comme dans l'exemple I et en donner environ 14 g contenant 10-15% d'acide arachidonique.
On remet le précipité obtenu (environ 17 g) en solution dans 200 ml de chloroforme en y ajoutant alors 500 ml d'acétate d'éthyle.
Un nouveau précipité d'environ 10,3 g est séparé (le surnageant est conservé pour isoler la phosphatidylcholine, entre autres) et redissous dans 100 ml de méthanol, auquel on ajoute 5 g de NaOH dissous dans 40 ml d'eau.
On abandonne une nuit à la température ambiante, puis on ajoute 400 ml de CHCl3. On obtient alors une solution opalescente à laquelle on ajoute 180 ml d'eau. On laisse ensuite décanter, et on sépare la phase chloroformique qui doit être lavée avec deux fois 100 ml de CH3OH/H2O 1:1.
Les deux phases aqueuses supérieures obtenues sont mélangées, et fournissent, après acidification, environ 5,7 g d'acides gras libres contenant de 25 à 30% d'acide arachidonique.
(Par évaporation de la phase chloroformique précédente, on obtient aussi environ 3.2 g de sphingomyéline impure que l'on purifie par précipitation à l'acétate d'éthyle.) Exemple 4:
42 g de lipides totaux obtenus sont dissous dans 100 ml d'hexane; on y ajoute ensuite 500 ml d'acétone et on abandonne le mélange quelques heures à - 30- C. On filtre pour obtenir 20-21 g de précipité de phospholipides.
Celui-ci est dispersé dans 200 ml d'une solution physiologique (NaCI 0,9%) à pH 8 à laquelle on ajoute une quantité déterminée de phospholipase A2 d'origine pancréatique porcine.
La solution est laissée pendant 18 heures sous agitation à température ambiante; après acidification à pH 2. on ajoute à cette dispersion en deux fois 200 ml d'éther; après agitation. les phases éthérées réunies sont décantées et lavées à l'eau. L'éther est séché (sur
CaSO4), puis distillé, ce qui donne un mélange d'acides gras libres (environ 11,5 g) composés de 35-45% d'acide arachidonique, plus des lysophospholipides et sphingomyélines résiduels. Les acides gras libres en sont séparés par chromatographie sur alumine (ce qui retient les lysophospholipides, ainsi que la sphingomyéline qui peuvent être ultérieurement élués et purifiés).
Exemple 5:
100 g de résidu d'extraction de placenta, partiellement déshydratés, sont mélangés dans un mortier avec 400 g de sulfate de sodium anhydre. Puis on incorpore le tout à 600 g de Celite 545 et on remplit une colonne de verre adéquate.
Sous léger courant d'azote, on élue alors la masse avec un solvant composé de neuf parties de chlorure de méthylène et d'une partie de méthanol, afin d'en extraire les lipides totaux. La solution obtenue, complétée en chassant à l'azote à travers la colonne. est évaporée dans un ballon rotatif à température basse (env. 30-35 C) et l'on recueille alors environ 2 g de lipides totaux non altérés.
On y ajoute 12 ml de soude méthanolique à 0,8N et on continue à séparer les acides gras comme dans l'exemple 1. On obtient finalement environ 1,0-1,2 g d'un mélange d'acides gras contenant au moins 20% d'acide arachidonique.
Exemple 6:
100 g de lipides sont séchés sous vide à 90 C pendant 30 minutes. Puis on laisse refroidir vers 60 C et sous atmosphère d'azote on y ajoute alors 33 g d'éthanol et 1,4 g de KOH en pastilles.
Après agitation du mélange pendant I heure et demie à 2 heures, on abandonne pour décantation à 50 C.
La phase supérieure est séparée et lavée une première fois avec 15% d'eau en agitant faiblement à 60 C pendant 15 minutes. Un deuxième lavage avec 15% d'eau, en agitant plus vigoureusement à la même température, est suivi d'un troisième lavage à 80 > C, puis d'un quatrième au cours duquel on vérifie la neutralité des eaux de lavages. On sèche ensuite sous vide les esters formés, puis on les distille sous 2-3 mm de Hg à 180-210 C.
Le rendement en esters des acides gras est de 80-95%.
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CLAIMS
1. Process for obtaining fatty acids of human origin, characterized in that at least one human placental element is extracted, in an inert atmosphere, the total lipids by means of a mixture of solvents and , from these lipids, a mixture of fatty acids containing at least 20% by weight of arachidonic acid is separated.
2. Method according to claim 1, characterized in that it is carried out under a nitrogen atmosphere.
3. Method according to claim 1, characterized in that a mixture of a slightly polar solvent and a very polar solvent is used.
4. Method according to claim 1, characterized in that a mixture of hexane and isopropanol is used as solvent.
5. Method according to claim 1, characterized in that a mixture of hexane and ethanol is used as solvent.
6. Method according to claim 1, characterized in that a mixture of cyclohexane and isopropanol is used as solvent.
7. Method according to claim 1, characterized in that a solvent is used a mixture of low boiling petroleum ether and ethanol.
8. Method according to claim 1, characterized in that a mixture of methylene chloride and methanol is used as solvent.
9. Method according to claim 1, characterized in that the water content of the placental element is adjusted between 15 and 45% by weight.
10. Method according to one of claims 1 to 9, characterized in that the lipids which are extracted from the total placenta or the placental residues subsequent to the extraction of "-globulins or placental enzymes are separated, a mixture fatty acids containing at least 20% by weight of arachidonic acid.
Total lipids extracted from at least one human placental element contain different fatty acids of human origin, some of which are so-called essential fatty acids, which are not synthesized in human metabolism.
This is the case, inter alia, with arachidonic acid (5,8,11,14-Eicosatetraenoic acid, C 20: 4), the various sources of which are difficult to access in large quantities or at high prices.
However, the total lipids extracted from the placental tissue or from the residual placental elements of manufacture, from the placenta, from yglobulins, aqueous extracts or enzymes, for example, are relatively rich in arachidonic acid which represents approximately 20% of fatty acids. of these lipids.
Arachidonic acid is particularly important in human metabolism as an essential precursor, in particular and for example in the endogenous synthesis of prostaglandins E2 and
F2 a. It also plays an essential role at the level of cell membranes as a constituent determining their viscosity and thus being able to intervene in the immune response. Given the relative fragility of this fatty acid with four double bonds, as well as the texture and the particular natural antioxidant component of the raw material, and even its variable water content, the usual methods of lipid extraction cannot lead to satisfactory results both qualitatively and quantitatively.
In addition, air oxidation must also be avoided and the quality of the material used must be respected.
Indeed, as appears from the publication Nature, 217, 378379 (1968), it was already known to obtain free fatty acids of human origin from maternal plasma, perfused plasma and umbilical cord plasma, by extraction with certain solvents, then separation by chromatography.
The publication Chemical Abstracts, 60, 4548-4549 (1964), also relates to the extraction of lipids from human placentas and to the obtaining of fatty acids, by the use of solvents, then dialysis on a membrane.
Chemical Abstracts, 94, 513-514 (1981), mentions methods of extracting fatty acids from egg yolk.
Likewise, the Journal of the American Oil Chemists Society, 58, 599-601 (1981), also relates to the extraction of fatty acids from various food products using solvents.
The state of the art recorded uses extraction methods and techniques for purely analytical purposes, relating to small quantities of raw material involving different solvents, methods and techniques which cannot be adapted to industrial production, from placenta residues, achievable by the subject of the invention.
In order to improve the obtaining of fatty acids of human origin,
The invention is characterized in that total lipids are extracted from at least one human placental element, in an inert atmosphere, by means of a mixture of solvents and, from these lipids, a mixture of fatty acids containing about 20% by weight of arachidonic acid.
When working in a neutral or inert atmosphere and in glass or stainless steel containers, for example, you must in particular choose a mixture of solvents, one of which is slightly polar, stable and not hydrolyzed in air and light, for example: hexane, methylene chloride, trichlorotrifluoroethane, petroleum ether of low boiling point, cyclohexane, isopropyl ether and the other very polar solvent, for example: methanol, l ethanol, isopropanol, and this in suitable and practical proportions to facilitate good recovery of these solvents, also taking into account a certain amount of water contained in the starting raw material.
It is therefore necessary, in order to obtain the best extraction conditions, to adjust case by case the water content so that the mixture obtained with the two types of solvent has the best solubility coefficient for placental lipids.
In addition, so that there is no defect in the extraction of total lipids, the following proportions must be optimized: weight of raw material / volume of weakly polar solvent / volume of very polar solvent / water, this in order to destroy the lipid-protein interactions.
When the raw materials used are contained in paraffined packaging, it is first of all essential to extract them in the presence of a determined quantity of water, cold or hot, with a slightly polar solvent which makes it possible to separate the waxes and paraffins, as well as a portion of neutral lipids, the arachidonic acid content of which is however much lower than that of the phospholipids.
It is also possible to avoid the alteration of the lipids and, consequently, of the fatty acids which will be separated therefrom, by using the dry column method with an appropriate mixture of solvents.
Total fatty acids, then obtained from these lipids, and containing at least 20% arachidonic acid, can be esterified with monoalcohols or polyols, or used as a source for the enrichment in or the isolation of one or more the other of the fatty acids constituting them. The products obtained by the process which is the subject of this invention can be used in human or veterinary medicine, in cosmetics, in dietetics or as a synthesis intermediate.
The examples below illustrate the invention:
Example 1:
The placenta extraction residue, the proportion of water of which is adjusted by addition or centrifugation, is cold extracted with a solvent consisting of three parts by volume of hexane and two parts by volume of isopropanol, at a rate of 1800 ml of the solvent mixture per 100 g of residue, in the presence of 0.2 g / l of BHT and under a nitrogen atmosphere (BltT = butyl-hydroxy-toluene).
After filtration and evaporation of the solvent, the total lipid residue (1.6-1.9 g) is redissolved in 12 ml of methanolic soda
0.8N. It is heated for one hour with stirring, with bubbling nitrogen.
After cooling, the non-saponified lipids are extracted with hexane (which provides, after evaporation of the solvent, a residue, from which one can extract, for example, sphingomyelin, by precipitation with ethyl acetate).
In the aqueous solution, the decomposition into free fatty acids of the dissolved soaps is carried out by adding 1.42 g of aqueous HCl at 37%.
The reaction time is one hour with stirring (under reflux).
The released fatty acids are extracted with hexane. The organic solution, separated from the aqueous phase, is washed with water until neutral; by drying the organic phase, then evaporating the solvent, a mixture of fatty acids containing 20-25% of C20: 4 is obtained (approx. 1.0 g).
(From the residual aqueous solution, the gangliosides can be purified by chromatography on specific adsorbents.)
Example 2:
1 kg of placenta extraction residue containing paraffinized packaging parts, after adding a certain amount of water, and in the presence of 2 g / l of butylhydroxytoluene, is extracted under a hot nitrogen atmosphere (or longer cold) with 20004000 ml of hexane (which removes contaminating waxes and paraffin). After separation of the solvent, the aqueous suspension is extracted twice with a total of 18 l of the hexane-isopropanol solvent (3: 2) under a nitrogen atmosphere. After filtration and evaporation of the solvent, approx. 19.0 g of total lipids (practically paraffin free) from which a mixture of fatty acids can be obtained as in Example 1 (approx. 10 g).
Example 3:
42 g of total lipids, obtained according to Example 1, for example, are dissolved in 100 ml of chloroform and 500 ml of acetone are added thereto. The mixture is left for a few hours at -30 ° C. and filtered to obtain approximately 17 g of precipitate. In the solvent, approximately 25 g of lipids remain which can be treated to separate the fatty acids as in Example I and in give about 14 g containing 10-15% arachidonic acid.
The precipitate obtained (approximately 17 g) is put back into solution in 200 ml of chloroform, then adding 500 ml of ethyl acetate.
A new precipitate of about 10.3 g is separated (the supernatant is kept to isolate phosphatidylcholine, among others) and redissolved in 100 ml of methanol, to which 5 g of NaOH dissolved in 40 ml of water are added.
It is left overnight at room temperature, then 400 ml of CHCl3 are added. An opalescent solution is then obtained to which 180 ml of water are added. Then allowed to settle, and the chloroform phase is separated which must be washed with twice 100 ml of CH3OH / H2O 1: 1.
The two upper aqueous phases obtained are mixed, and provide, after acidification, about 5.7 g of free fatty acids containing 25 to 30% of arachidonic acid.
(By evaporation of the preceding chloroform phase, about 3.2 g of impure sphingomyelin are also obtained, which is purified by precipitation with ethyl acetate.) Example 4:
42 g of total lipids obtained are dissolved in 100 ml of hexane; 500 ml of acetone are then added thereto and the mixture is left for a few hours at -30 ° C. It is filtered to obtain 20-21 g of phospholipid precipitate.
This is dispersed in 200 ml of a physiological solution (NaCl 0.9%) at pH 8 to which a determined quantity of phospholipase A2 of porcine pancreatic origin is added.
The solution is left for 18 hours with stirring at room temperature; after acidification to pH 2. 200 ml of ether are added to this dispersion in two batches; after shaking. the combined ethereal phases are decanted and washed with water. The ether is dried (on
CaSO4), then distilled, which gives a mixture of free fatty acids (about 11.5 g) composed of 35-45% arachidonic acid, plus residual lysophospholipids and sphingomyelins. The free fatty acids are separated from it by chromatography on alumina (which retains the lysophospholipids, as well as the sphingomyelin which can be subsequently eluted and purified).
Example 5:
100 g of partially dehydrated placenta extraction residue are mixed in a mortar with 400 g of anhydrous sodium sulfate. Then the whole is incorporated into 600 g of Celite 545 and a column of suitable glass is filled.
Under a slight stream of nitrogen, the mass is then eluted with a solvent composed of nine parts of methylene chloride and one part of methanol, in order to extract the total lipids therefrom. The solution obtained, completed by chasing with nitrogen through the column. is evaporated in a rotary flask at low temperature (approx. 30-35 C) and about 2 g of total unaltered lipids are collected.
12 ml of 0.8N methanolic sodium hydroxide are added thereto and the fatty acids are continued to separate as in Example 1. Finally, approximately 1.0-1.2 g of a mixture of fatty acids containing at least is obtained. 20% arachidonic acid.
Example 6:
100 g of lipids are dried under vacuum at 90 ° C. for 30 minutes. Then allowed to cool to 60 C and under a nitrogen atmosphere is then added 33 g of ethanol and 1.4 g of KOH in pellets.
After stirring the mixture for 1.5 hours to 2 hours, it is left for decantation at 50 C.
The upper phase is separated and washed a first time with 15% water, with gentle agitation at 60 ° C. for 15 minutes. A second wash with 15% water, with more vigorous stirring at the same temperature, is followed by a third wash at 80> C, then a fourth during which the neutrality of the washings is checked. The esters formed are then dried under vacuum, then distilled under 2-3 mm Hg at 180-210 C.
The yield of fatty acid esters is 80-95%.