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" Préparation d'hormone oestrogène".
La présente invention est relative à des prépara- tions d'hormone oestrogène solubles dans l'eau au départ d'urine de cheval, par exemple d'urine d'étalon ou de jument gravide . Le produit suivant l'invention se distingue, en général, des nombreuses préparations d'hormone oestrogène insolubles dans l'eau par son insolubilité substantielle dans des solvants organi- ques non miscibles à l'eau, tels que le benzol et l'éther, par sa solubilité substantielle dans l'eau, par sa grande stabilité lors de l'emmagasinage, par son manque de toxicité et par son aptitude à produire une kératinisation vaginale chez les rats adultes ovariecto- misés et à atténuer les syndromes de la ménopause chez les humains.
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Des substances solubles dans l'eau utilisables chimiquement et possédant en outre les caractéristiques indiquées ci-dessus, de même qu'une grande activité oestrogénique par voie buccale peuvent, par exemple, être obtenuesen concentrant de l'urine fraîche et partant non-hydrolysée ou préservée, de façon appropriée, contre toute hydrolyse. Cette concentration peut avantageuse- ment se faire par adsorption à l'aide d'un adsotbant et extraction subséquente à l'aide d'un solvant organi- que soluble dans l'eau . La matière adsorbante peut être constituée par du charbon de bois, de la terre à foulons, du triphosphate calcique et une argile adsorbante, le charbon de bois étant l'adsorbant préféré . L'agent d'ex- traction peut être une base organique azotée, telle que la pyridine, ou un mélange d'alcool et de chloroforme.
L'extrait est ensuite concentré par élimination du sol- vant et le concentrat aqueux ainsi obtenu est, de préfé- rence traité à l'aide/d'un solvant organique, non misci- ble à l'eau, tel que le benzol et/ou l'éther, de façon à éliminer les substances solubles dans ce solvant.
Les aspects importants du procédé décrit ci-avant résident dans le fait que la matière de départ est non- hydrolysée et que des conditions sont maintenues,pen- dant tout le procédé, pour empêcher une hydrolyse des principes actifs. Ainsi , la température est, de pré- férence,maintenue à un niveau relativement bas notamment entre 40 C et 50 C environ. La durée du traitement à une température supérieure à la température ambiante est aussi courte que possible et le pH est maintenu dans l'inter- valle allant de la neutralité à une faible alcalinité; soit entre 7 et 8,5 environ.
Le produit résultant, constitué par un concentrat aqueux (contenant environ 20 % de matière solide) ou, s'il
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est séché, par une poudre soluble dans l'eau, contient sensiblement tous les principes à activité oestrogénique h et autres principes térapeutiques solubles dans l'eau de l'urine de départ. En général, ce produit résultant contient entre 1 et 2 % environ des matières solides contenues dans l'urine de départ. Le produit contient des substances, qui le rendent stable, et, en même temps, il est exempt de toxicité, au sens thérapeutique, lors- qu'il est utilisé à des doses convenant pour atténuer les symptômes du syndrome de la ménopause .
Toutefois, lorsqu'il est nécessaire d'administrer un tel produit oestrogène, par voie buccale, à des doses trèsélevées pour une thérapie particulière, on a consta- té que la préparation indiquée ci-dessus peut, dans certains cas, provoquer de la nausée et d'autres pertur- bations gastriques . La demanderesse a découvert, à présent, que les facteurs responsables de ces perturba- tions peuvent être éliminés sans qu'une perte subatan- tielle des principes oestrogéniques et autres principes thérapeutiques soit constatée et sans que la stabilité soit diminuée.
Suivant une forme de réalisation préférée de l'in- vention le concentrai? aqueux est traité comme suit : Le pH est réglé à une valeur comprise dans l'intervalle allant de 2 à 6 environ, de préférence de 4 à 5 environ.
Le concentrat est alors lavé à l'aide d'un solvant orga- nique non miscible à l'eau, la température étant,de préférence, maintenue dans l'intervalle allant approxima- tivement de 15 C à 20 C environ bien que, lorsque les autres conditions sont propices, la température puisse s'élever jusqu'à 40 C. Le lavage se fait aussi vite que possible, les principes actifs étant recueillis dans la phase aqueuse. La chose importante consiste à
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coordonner les conditions de façon à empêcher l'hydrolyse.
Un extrait aqueux, contenant les substances oestrogènes et d'autres principes thérapeutiques solubles dans l'eau et exempt de la majeure partie de la masse et des impuretés indésirables,est ainsi obtenu . L'extrait est alors neu- tralisé , de préférence, à un pH de 7 à 8 environ. A ce moment, l'extrait peut être lavé à l'aide d'éther pour chasser l'excès de solvant, mais ce stade du procédé est facultatif . L'extrait neutralisé est alors séché, de préférence, par distillation sous vide à une tempéra- ture comprise dans l'intervalle s'étendant de 40 C en- viron à 50 C environ, de façon à former un résidu sensi- blement sec.
Ce résidu possède une activité oestrogénique étonnam- ment élevée par voie buccale et est caractérisé par l'abscer ce de substances sensiblement solubles dans le solvant et insolubles dans l'eau, lesquelles substances sont odo- riférantes et produisent des troubles gastriques et des nausées chez certains individus. Le produit est suscep- tible d'usage clinique, mais la demanderesse préfère continuer à la traiter, comme il sera décrit ci-après.
En outre, les produits bruts peuvent être obtenus en trai- tant , suivant les enseignements indiqués dans le présent mémoire, des matières plus brutes que les matières de dé- part préférées indiquées ci-dessus.
Le résidu susdit est dissous dans une faible quan- tité d'un alcool inférieur et la solution est traitée à l'aide d'un solvant cétonique , de manière à former un précipité contenant très peu de principes actifs. De nouvelles quantités de facteurs odoriférants et toxiques, caractéristiques des concentrats bruts d'urine, de même que des matières solides inertes, sont ainsi éliminées dans le précipité, qui ne contient que peu de principes
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oestrogéniques actifs. Le surnageant contenant les principes actifs est séparé et concentré jusqu'à succi- té . Le résidu séché est dissous dans un alcool infé- rieur et les principes actifs sont précipités par addi- tion d'un éther .
Il est à noter que lorsqu'on parle, dans le présent mémoire, d'un alcool inférieur, il s'agit d'un alcool contenant. cinq atomes de carbone ou moins, l'alcool méthylique et l'alcool éthylique étant préférés. Le traitement indiqué ci-avant, fait passer dans la solution d'extraction d'autres facteurs indésàrables, en particulier , des substances toxiques et des huiles . Le précipité est séparé, lavé à l'aide d'un éther et ensuite séché Le précipité séché con- tient une grande proportion des substances oestrogéniques solubles dans l'eau du concentrat de départ.
Les stades d'extraction à l'aide d'un solvant or- ganique non miscible à l'eau et de précipitation cétoni- que ont pour effet inattendu d'éliminer des solides iner- tes et des substances odoriférantes et toxiques, tout en ne réduisant pas,dans une mesure dépassant les prévisions raisonnables, les principes oestrogéniques solubles dans l'eau et en n'éliminant pas ou en n'inacti- vant pas les facteurs producteurs de la stabilité. Le produit obtenu par la demanderesse diffère du sulfate oestrome d' par sa stabilité et par son action thérapeu- tique améliorée . Le procédé suivant l'invention permet, comme le montre ce qui précède, d'obtenir un produit con- tenant des substances oestrogéniques solubles dans l'eau sous 'une forme concentrée mais néanmoins stable.
Bien que la demanderesse ait décrit dans le présent mémoire un procédé préféré, dans lequel on procède d'abord au lavage à l'aide d'un solvant insoluble dans l'eau et ensuite à la précipitation cétonique , il est également
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possible de renverser l'ordre de ces deux stades. D'au- tres modifications sont également possibles, si on se conforme aux enseignements généraux contenus dans le présent mémoire.
L'invention apparaîtra plus clairement,en référence aux exemples suivants illustrant des modes opératoires préférés .
Exemple 1
Environ 25 gallons d'urine fraîchement prélevées sur des juments gravides et contenant des principes oestrogéniques solubles dans l'eau sont préservés contre toute hydrolyse à l'aide d'un mélange d'alcool et de chloroforme .
On ajoute environ 560 grammes de charbon activé et le mélange est agité mécaniquement pendant 15 minutes. environ à une température appropriée comprise, par exem- ple, entre 15 C et 30 C environ. Le charbon est séparé par filtration. Le filtrat d'urine est à nouveau traité au moyen de charbon Les deux masses de charbon sont réunies . La presque totalité des substances oestrogéni- ques solubles dans l'eau a été extraite de l'urine. Le charbon est ensuite soit séché, soit laissé humide, le charbon de bois pouvant, par exemple, être utilisé direc- tement après la filtration ou être séché et ensuite utili- sé.
On ajoute alors au charbon (sec ou humide) environ trois litres d'une solution aqueuse contenant environ 90 % de pyridine et on mélange vivement à température ambiante . Ce mélange est agité ét ensuite laissé au repos dans un réfrigérateur pendant plusieurs heures. Le charbon est alors séparé par filtration et remis en suspension dans environ deux litres de solution fraî- che de pyridine (90%) . La suspension est ensuite lais-
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sée au repos pendant plusieurs heures, tout en agitant occasionnellement. Le charbon est séparé par filtration, remis en suspension dans environ deux litres de solution de pyridine et finalement essoré.
L'extrait et les lavages pyridiniques obtenus de la manière indiquée ci-dessus et formant un volume total d'environ huit litres sont mélangés et concentrés sous vide à faible température, soit entre 40 C et 50 C envi- ron, jusqu'à un volume à de 250 cm3 . Pendant le stade final de préparation, au cours duquel la pyridine est éliminée et le concentrat aqueux est obtenu, on empêche la réaction du mélange de devenir acide . On ajoute en- viron 250 cm3 d'eau . La solution obtenue constitue un concentrat contenant une grande proportion des substances oestrogéniques solubles dans l'eau renfermées dans l'urine de départ.
On a préparé, en opérant comme indiqué ci-dessus, 400 ml de concentrat contenant une teneur en substances oestrogéniques solubles dans l'eau équivalente à 19 mg de sulfate sodique d'oestrone par ml (essai de Marrian Kober modifié ) . Ce concentrat est acidifié jusqu'à un pH à l'aide d'acide sulfurique aqueux à 15 % et extrait à quatre reprises à l'aide de 160 ml de bichlorure d'éthylène (chaque extraction) et à trois reprises à l'aide de 80 ml de bichlorure d'éthylène (chaque extrac- tion). Le concentrat aqueux est alors ajusté à pH 6,9 à l'aide d'hydroxyde sodique 5N et extrait à trois repri- ses à l'aide de 100 ml (chaque extraction) d'éther. Le concentrat aqueux ainsi débarrassé des matières toxi- ques , phénols et huiles odoriférantes est alors concen- tré sous vide jusqu'à siccité .
Ce traitement s'exécute à température ambiante et aussi rapidement que possible pour éviter l'hydrolyse de la substance active par l'aci- de.
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Le résidu séché est dissous dans 160 ml de méthanol et une précipitation des matières indésirables est obtenue en versant la solution méthanolique dans deux litres d'acétone .La solution de méthanol et d'acétone est filtrée, ce qui permet la séparation de 61 gms de matière insoluble et inactive . La solution contenant les substances oestrogéniques solubles dans l'eau est alors concentrée sous vide jusqu'à faible volume et les principes actifs sont précipités en versant le concentrat dans deux litres d'éther .Le précipité est séparé par filtration et séché sous vide .Il pèse 29,9 grammes et contient une quantité de principes oestrogéniques solubles dans l'eau équivalente à 20,5 % de sulfate sodique d'oes- trone mesurée par l'essai de Marrian Kober modifié.
La quantité indiquée ci-dessus représente une récupération de 80 % de la puissance oestrogénique du concentrat sous une forme soluble; dans l'eau.
Le produit résultant est une substance convenant pour être utilisée cliniquement et pour être administrée par voie buccale. Il est plus actif, lorsqu'il est administré par voie buccale,que l'oestrone libre dans l'atténuation du syndrome de la ménopause chez les humains et, lorsqu'il est administré à des rats adultes ovari-ectomisés, il est plus actif que l'oestrone libre en ce qui concerne la production d'une kératinisation vaginale .
Le produit précipité est également stable et sensi- blement insoluble dans les solvants organiques non misci- bles à l'eau, tels que le benzol et l'éther. Enfin, il est soluble dans l'eau et exempt de substances solubles dans le bichlorure d'éthylène et de substances insolubles dans l'acétone.
Exemple 2 100 cc du concentrat préparé comme dans l'exemple
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jusqu'au moment de l'ajustement du pH à la valeur 4 sont portés à sec sous vide et extraits à l'acétone . La solution acétonique est concentrée jusqu'à siccité et le résidu est redissous dans de l'eau, le pH de cette solu- tion aqueuse étant subséquemment porté à la valeur 4 par addition d'acide sulfurique à 15 % . La solution obtenue est extraite à l'aide. de quatre volumes identiques de bichlorure d'éthylène . La solution aqueuse est réglée à pH 7, lavée à l'aide d'un volume égal d'éther éthylique et l'excès.d'éther est éliminé sous vide .
Le concentrat aqueux résultant contient plus de 90 % de la quantité primi tive des substances oestrogéniques solubles dans l'eau con- tenues dans le concentrat de départ (essai de Marrian Kober modifié) . Ce concentrat résultant est concentré sous vide jusqu'à siccité et une poudre amorphe de cou- leur chamois est obtenue, laquelle poudre est facile- ment soluble dans l'eau et effectivement exempte: de substances odoriférantes.
Exemple 3
100 cc d'une solution alcoolique aqueuse à 15 % du concentrat purifié contenant 600 unités Collip ont été administrés par voie buccale, à des rats non adultes, en ue de mesurer l'activité oestrogénique . La solution du concentrat a été emmagasinée pendant quatre mois à 37 C dans des bouteilles en verre bouchées d'une contenan- ce de quatre onces. Pendant cette période, la solution a été essayée à trois reprises (à la f@@ du premier, du deàxième et du quatrième mois) . Aucune détérioration évidente n'est apparue à la suite de ces essais.
Il est évident que diverses modifications peuvent être apportées aux produits et modes opératoires spécifi- ques indiqués dans les exemples précédents, sans s'écarter
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de l'esprit de l'invention. Bien que n'épuisant pas le sujet, les remarques suivantes serviront de guide pour certaines des modifications, dont les procédés et produits sont susceptibles .
Les produits de la présente invention sont, de préférence, préparés en concentrant d'abord de l'urine de cheval non hydrolysée dans des conditions empêchant l'hydrolyse, de manière à former un concentrat contenant une substance oestrogénique soluble dans l'eau, en extrayant le concentrat à l'aide d'un solvant organique soluble dans l'eau de la substance dans des conditions empêchant l'hydrolyse, de manière à obtenir un extrait contenant ladite substance et enfin en concentrant l'extrait dans des conditions empêchant l'hydrolyse . Ce procédé s'effec- tue, de préférence, en absorbant un liquide urinaire non-hydrolysé à l'aide d'un adsorbant, de préférence, constitué par du charbon activé,
tout en maintenant une température modérée et un pH compris entre la neutralité et une faible alcalinité (de préférence de 7 à 8 en- viron),et en extrayant le produit de l'adsorbant dans des conditions similaires à l'aide d'un solvant soluble dans l'eau de la substance.
Le produit résultant est une substance soluble dans l'eam, insoluble dans le benzol et l'éther et contenant la presque totalité des principes oestrogéniques solubles dans l'eau de l'urine de départ et ordinairement moins de 2 % environ des matières solides contenues dans le liquide urinaire de départ. Il ne contient aucune quantité bubstan- tielle d'oestrogènes libres. Le produit est,en outre, stable . Toutefois, il contient encore des substances odoriférantes et inactives et des substances provoquant des troubles gastriques et des nausées chez certains indi- vidus .
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Lavage à l'aide d'un solvant.
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Dans l'opération de lavage, le maintien du pH dans l'intervalle compris entre 2 et 6 est capital Des'résul- tats supérieurs sont obtenus dans l'intervalle préféré s'étendant de 4 à 5 . Pour empêcher l'hydrolyse, il est également souhaitable d'opérer à basse température , de préférence entre 15 C et 20 C, et en tout cas en dessous de 40 0, quelle que soit la durée du traitement . L'opéra- tion de lavage est ordinairement répétée à plusieurs re- prises, de préférence de 4 à 6 fois.
Les agents d'extraction sont des solvants pour grais- se et huiles, pour phénols, pour phénols alcoyl-substitués et pour stérols non conjugués. Parmi les solvants possé- dant ces caractéristiques et convenant au but poursuivi, on peut citer, à titre d'exemple, les alcools aliphatiques à 5 atomes de carbone ou davantage, les alcools alicycli- ques tels que le cyclohexanol, les éthers tels que l'éther diéthylique, l'éther isopropylique, les hydrocarbures ali- phatiques tels que l'hexane et les hydrocarbures supérieurs de la même série, les hydrocarbures aromatiques tels que le benzène, le toluène, etc, les hydrocarbures alicyyli- ques tels que le cyclohexane, les hydrocarbures chlorés tels que le chloroforme, le bichlorure d'éthylène, le tri- chloréthylène, le tétrachlorure de carbone et le chloro- benzène,
les esters tels que l'acétate d'éthyle et l'acéta- te d'amyle, ou les cétones telles que la méthylisobutyl- cétone .
Parmi les groupes de solvants indiqués ci-dessus, on préfère les hydrocarbures chlorés et, en particulier,le bichlorure d'éthylène, étant donné que la demanderesse a constaté qu'une quantité étonnamment petite des principes oestrogéniques est extraite par ces solvants.
De plus, ces solvants ne sont pas inflammables et convien-
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nent donc mieux que les autres à des procédés sur une grande échelle .
Neutralisation --------------
Après extraction, la solution est neutralisée jusqu'à pH allant de la neutralité à une faible alcalinité .La demanderesse préfère opérer dans un intervalle compris entre 6 et 8,5 , et plus particulièrement entre 7 et 7,5 .La neutralisation peut se faire à l'aide d'un alcali , constitué, de préférence, par de l'hydroxyde sodi- que ou potassique
Lavage.
Le lavage de la solution neutralisée à l'aide d'un éther constitue une opération facultative , mais la deman- deresse a constaté que ce lavage est très avantageux, en ce sens qu'il élimine l'excès du solvant non-miscible à l'eau . L'éther isopropylique, l'éther éthylique ou tout autre solvant du solvant non miscible à l'eau peut être employé.
Séchage
Le séchage a pour but d'éliminer l'eau et de rendre la matière active propre à être traitée subséquemment. Une des méthodes préférées de séchage est celle qui consiste à sécher sous vide à une température comprise entre 40 et 50 C environ .
Précipitation
Le produit séché est dissous dans un alcool infé- rieur, tel que l'alcool méthylique et la matière indésira- ble est précipitée à l'aide d'un solvant cétonique solu- ble dans l'alcool. Comme exemples de solvants cétoniques convenant au but poursuivi , on peut citer l'acétone, l'alcool diacétone, l'acétonyl acétone, la méthyléthylcéto- ne, l'acétoacétate d'éthyle, la méthylisobutylcétone, l'iso- phorone, l'oxyde de mésityle, la méthyl-n-amylcétone et la
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diisobutylcétone . Toutefois, la cétone préférée est l'acétone .
On a constaté avec surprise qu'il se séparait, lors de la précipitation, de grandes quantités de matière insoluble dans le solvant cétonique et ne contenant, ainsi que la demanderesse l'a constaté, que peu de principes actifs, alors que le solvant cétonique contient une matière soluble dans l'acétone et renfermant les principes actifs.
Ce stade de précipitation se fait en ajoutant graduel- lement un excès de solvant cétonique, tout en agitant, jusqu'à fin de précipitation. Le surnageant est séparé par filtration où centrifugation et est ensuite concentré.
Précipitation à l'éther.
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Le concentrat résultant est dissous dans l'alcool et versé dans un excès d'un éther, l'éther éthylique et l'éther isopropylique étant préférés. Il se forme alors un précipité contenant la substance oestrogénique- ment active, les huiles et substances phénoliques solubles dans l'éther restant dans le surnageant . Le précipité est séparé et, de préférence, lavé à l'éther et séché.
Caractéristiques du produit -----------------------------
Le produit de l'invention préparé comme décrit ci-des- sus a les caractéristiques suivantes .
Nature physique a) Poudre amorphe solide b) Solution aqueuse
Le produit contient une pluralité de substances oestrogéniques solubles dans l'eau, des composés organiques azotés, par exemple, du sulfate d'indoxyle et une quantité fractions substantielle de solubles dans les alcalis.
Caractéristiques chimiques a) pratiquement insoluble dans les solvants organi-
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ques non miscibles à l'eau, notamment l'éther et le benzol ; b) sensiblement exempt de matière soluble dans les solvants gras; c) sensiblement exempt de substances phénoliques ; d) soluble dans l'eau, l'alcool, l'acétone, la pyridine et l'alcool méthylique, e) l'hydrolyse du produit par la chaleur, un acide ou un alcali donne lieu à la libération de substances oestrogéniques libres non miscibles à l'eau et solubles dans les solvants organiques, tels que l'éther ou le benzol.
Stabilité
Stable sous forme de poudre sèche ou de solution aqueuse, à température ambiante, vis-à-vis de l'auto-hydro- lyse.
Qualités esthétiques
Pratiquement exempt d'odeur répréhensible, de goût et de facteurs provoquant des troubles intestinaux et des nausées.
Effet pharmacologique a) plus efficace par voie buccale que l'oestrone li- bre pour l'atténuation du syndrome de la ménopause; b) plus efficace que le sulfate d'oestrone dans la thérapie, par voie buccale , de la ménopause. c) exempt de toxicité à des doses thérapeutiquement actives, d) atténue les symptomes autonomiques et emotionnels habituels accompagnant le syndrome de la ménopause; e) approximativement 2 à 2 1/2 fois plus actif que la quantité équivalente d'oestrone libre dans la production d'une kératinisation vaginale, après administration par voiebuccale aux rats adultes ovariectomisés.
Au point de vue chimique, le produit a une plus grande activité que celle développée par la teneur apparente en d' sulfate sodique d'oestrone mesurée par le test de Marrian
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Kober modifié (estimation colorimétrique) décrit dans "The Elimination of Estrin in Urine with the Photo-Electric Colorimeter" par E.H. Venning et al (J.B.C. 120 225 1937).
Les concentrations en ions hydrogènes (pH) mentionnées dans le présent mémoire ont été mesurées à l'aide du pH mètre à électrode de verre du "Beckman Laboratory", aucune cor.nec- tion n'étant introduite pour la concentration en ions métal- liques .
Il est.évident que diverses modifications peuvent être introduites dans les modes opératoires décrits, sans que l'on s'écarte de l'esprit de l'invention tel qu'il est défini dans les revendications ci-annexées. Les modes opé- ratoires et moyens décrits en sont qu'illustratifset ne sont limités que par l'état de la technique .
REVENDICATIONS --------------
1. Procédé pour la préparation d'une substance hormo- nale oestrogénique soluble dans l'eau, caractérisé en ce qu'on acidifie un concentrat aqueux d'urine, contenant des princi- pes oestrogéniques solubles dans l'eau, jusqu'à un pH com- pris dans l'intervalle allant approximativement de 2 à 6, en ce qu'on extrait le concentrat acidifié à l'aide d'un solvant organique sensiblement insoluble dans l'eau de manière à éliminer les substances solubles dans le sol- vant organique et insolubles dans l'eau et à obtenir une fraction aqueuse contenant les principes actifs et en ce qu'on neutralise cette dernière fraction.