AT402934B - Verwendung einer speziellen wässrigen zusammensetzung zur reinigung und desinfektion von gegenständen in der brauindustrie - Google Patents

Description

AT 402 934 B

Die Erfindung bezieht sich auf eine Biosensorkonstruktion durch On-Off Steuerung eines lonenkanals über biorekognitive Wechselwirkungen

Als Nachweissyteme für biologische Moleküle sind Enzymsensoren bekannt die die katalytische Wirkung von Biomolekülen verwenden, um ein spezifisches Biosignal z.B. die Konzentration von Glukose in 5 ein unspezifisches chemisches Signal z.B. Konzentration von Wasserstoffperoxid umzuwandeln, welches sodann elektrochemisch in eine elektrische Größe ( einen Strom oder ein Potential ) umgewandelt wird. Es ist bekannt, daß diese Sensortypen eine geringe Sensitivität und grundlegende Probleme durch die unspezifische Elektrochemie an Sensoroberflächen, welche neben Wasserstoffperoxid viele andere biologische Komponenten oxidieren kann, aufweisen. το Als Nachweissyteme für biologische Moleküle sind weiters optische Systeme wie Surface Plasmon Resonance - Sensoren bekannt welche die Oberflächenbindung von Biomolekülen in ein optisches Signal umzuwandeln vermögen. Es ist jedoch weiters bekannt, daß der große apparative Aufwand und die zwar im Vergleich zu den Enzymsensoren bessere aber für viele Anwendungen trotzdem nicht ausreichende Empfindlichkeit dieser Sensoren diese Technik nur für manche Bereiche einsetzbar macht . 75 Die Erfindung zielt darauf ab. durch einen neuartigen Sensoraufbau diese grundlegenden Einschränkungen zu beseitigen. ( siehe Fig. 1 ) Die Biokomponente soll in diesem Sensoraufbau nicht zur katalytischen Umsetzung des Analyten Verwendung finden, sondern als selektive Barriere zur umgebenden Lösung. Die Analyt dient sodann als Schlüssel zur On. Off Steuerung eines lonenkanals. Durch diesen lonenkanal können pro Sekunde und Kanal bis zu 107 Ionen in einen schmalen Membran - Elektrodenspalt ( 10 - 300 nm ) 20 fließen und dort direkt elektrochemisch (etwa 3 pA je offener Kanal| bestimmt werden. Eine Störung des Meßsignals durch andere Komponenten der Lösung wird durch eine selektive Membran mit eingebauten Kanalproteinen unterdrückt.

Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich von WO 89/01159 durch die mit »Molecular Modelling" mögliche sub-Nanometer genaue Anordnung eines Liganden am Kanaleingang des lonenkanals. WO 25 89 01159 beschreibt hingegen die Bindung von relative großen Rezeptormolekülen ( Antikörper, Enzyme.

Lektine... ) am Kanaleingang. Versuche zeigen jedoch, daß eine genaue Positionierung der Bindungsstelle des Rezeptormoleküls am Kanaleingang technisch kaum möglich ist und daher eine Veränderung des lonenstroms durch den lonenkanal nur indirekt erfolgt, wobei der Effekt relativ gering ist. Die vorliegende Erfindung hingegen nutzt die hochgenaue Positionierung eines kleinen Liganden am Eingang des Kanals 30 der sodann von einem großen Molekül (Analyt) erkannt und an der optimalen Stelle (Kanaleingang) gebunden wird. Diese Vorgangsweise ist nicht nur deutlich genauer sondern auch eine Umkehrung der Vorgangsweise von WO 89 01159 in dem das Rezeptorprotein, am Kanal immobilisiert, den Analyten biorekognitiv bindet, im vorliegenden Biosensor jedoch ein kleiner Ligand am lonenkanal vom Analyten erkannt und gebunden wird. 35 Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich von US 5.234.566 durch die Verwendung einzelner Membranen, nicht einer Vielzahl zwangsweise identer Membranen. Auch ist der Aufbau der Membran nicht nur durch „-.seif assembling" möglich sondern kann auch durch andere Techniken erfolgen (z.B. LB-Filme). Eine Abhängigkeit der Leitfähigkeit vom Membranpotential ist nicht erwünscht, ein optimale Verhalten des Kanals sollte nahezu dem Ohmschen Gesetz folgen. jo Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich von EP 0 441 120 A2 durch die nicht notwendige Vernetzung der Lipidmembran mit der Elektrodenoberfläche durch überbrückende Moleküle.Der dauernde Kontakt mit zwei wäßrigen Phasen ober- und unterhalb der Membran (Zeichen einer nicht stabilen Membran), ist kein notwendiger Teil der vorliegenden Erfindung. Die Verwendung einer Rahmenstruktur über die sich die Lipidmembran weitererstreckt vermeidet apolaren Wände, an die die Lipidmembran 45 grenzt, welche instabile und daher undichte Stellen der Membran darstellen würden.

Die vorliegende Erfindung beinhaltet nicht die in WO 94 07593 geforderte direkte Vernetzung der Lipidmembran mit der Elektrodenoberfläche unter Verwendung überbrückender Linkerlipide. Ebenfalls unterscheidet sich die vorliegende Erfindung von EP 0 394 997 A1 dadurch, daß der Inhalt der Erfindung den Aufbau eines Biosensors unter Verwendung der Bindung eines Moleküls an einen immobilisierten so Liganden zur ein aus Steuerung eines lonenkanals in einer Membran nutzt und nicht den direkten Effekt organischer Moleküle 3uf den Kanal selbst. Weiters ist die multimere Strukur der Porine mit dem Anspruch 1 (stabiles Molekül) nicht vereinbar.

Das neuartigen Sensorprinzips beruht auf folgenden Erkenntnissen:

Als lonenkanal kann das sehr gut untersuchte und leicht zugängliche Kanalpeptid Gramicidin als Basis 55 eines neuen Affinitätssensors dienen. Sowohl die Sequenzen als auch genaue Moleküldaten unterschiedlicher Gramicidinderivate konnten in den letzten Jahren bestimmt werden. Die Sequenzhomologien sind durchwegs hoch. Die lonenkanäle werden dabei durch 2 assoziierte Moleküle Gramicidin gebildet. Die Raumstruktur des Peptids ist dabei eine 6.3 - Helix die zenvai einen offenen lonenkanal bildet und mit 2

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Tryptophanresten an den beiden Membranseiten dynamisch verankert ist.

Es konnte durch patch clamp Techniken gezeigt werden, daß an beiden Seiten der Membran Gramicidin - Monomere eingeschränkt frei floaten. Kommt es zu einer Assoziation von 2 Molekülen Gramicidin unterschiedlicher Membranseiten, so bildet sich ein durchgängiger lonenkanal ( siehe Fig. 1).

Chemische Modifikationen der Gramicidinpeptide am N - Terminus können nach Deformylierung ( = Abspaltung der Cappingstruktur des Peptids ) 2 Moleküle Gramicidin zu einem kovalenten Dimer (z.B. mit Weinsäure oder Malonsäure als Bisamide) verknüpfen ( siehe Figur). Diese Gramicidin-Dimer bilden die im Sinne der Patentanmeldung notwendigen stabilen lonenkanäle in natürlichen und artifiziellen Membranen. Untersuchungen des lonenkanals zeigten eine Inhibierbarkeit des lonentransfer durch eine starke Bindung von divalenten Kationen. Öffnet oder schließt sich ein einzelner lonenkanal in der Membran, so kann dies direkt durch einen lonenstrom von 107 Ionen / s durch die Membrankanal gemessen werden. Bisgramicidinmoleküle als lonenkanäle im Sinne der Erfindung sind durch ihre hohe Stabilität, die gut chemische Charakterisierung, die Möglichkeit einer Vielzahl chemischer Modifikationen und insbesondere durch die hohe Leitfähigkeit der Kanäle besonders gut geeignet.

Die zweite essentielle Komponente des neuen Sensorkonzepts ist die Membrantechnologie. Es wird dabei der Vorteil der black lipid membranes, d.h. der freie Zugang zu beiden Membranseiten mit dem Vorteil der seif assembling membranes, d.h der stabilen Anordnung eines selbst aufbauenden Lipidfilms kombiniert. Die Wahl eines Photogelpolymers als Trägermatrix für den Lipidfilm und die kovalente Kopplung der Lipidmonomer an diese Geloberfiäche stabilisiert den Lipidfilm gegen jede mechanische Zerstörung bzw. gegen das Floaten des zweiten Lipidfilms der Doppelmembran.

Die dritte Neuerung im Rahmen des Sensorkonzepts soll die Verwendung von dünnschichttechnologischen Verfahrensschritten im Rahmen des Sensoraufbaus sein. Dabei soll zuerst der elektrochemische Sensor nach etablierten dünnschichttechnologischen Verfahren gefertigt werden. Sodann soll mit Photolak-ken z.B aus der AZ - Serie oder mit Probimid - Lack die Rahmenstruktur des Lipidfilms aufgebaut werden. Der nächste Schritt ist sodann die Füllung der hydrophoben Rahmenstruktur mit einem hydrophilen Gel Photopolymer als Trägersystem für die Lipidmembran.

Die Kopplung des On / Off Schalters auf den Gramicidin Kanal erfolgt sodann durch selektive chemische Modifikation der carboxyterminalen - Ethanolamin Cappingstruktur. Dabei soll ein kleines durch Biorekognition erkanntes Molekül durch die Bindung eines großes Moleküls den lonenkanal reversibel verschließen ( siehe Fig. 1).

Die Erfindung zielt somit darauf ab eine neuartiges hochsensitives Sensorprinzip mit der theoretischen Empfindlichkeit eines einzigen Analytmoleküls zu schaffen . Die Empfindlichkeit wird nur durch die Bindungskonstante Ligand / Bindungsmolekül und durch den Zeitbedarf des statistischen Aufeinandertreffens der beiden Moleküle begrenzt.

Weiters zielt die Erfindung auf den Aufbau solcher Sensoren mit Dünnschichttechnolgie-kompatiblen Methoden wie Dünnschichtsubstraten, Sputtern und Aufdampfen der Metallelektroden, Einsatz von Photolak-ken und mit photosensitiven Polymeren hergestellten dünnschichttechnolgischen Lipidmembranträgern ab und beinhaltet darüber hinaus auch den neuartigen Aufbau von kovalent gebunden Lipidmembranen an Polymer-Flüssigkeits-Grenzflächen Die moderne medizinisch - biochemische Analytik stellt immer größere Anforderungen an die Selektivität und Spezifität von Meßsystemen.

Schnellere und insbesondere einfachere Testverfahren in der Diagnostik ermöglichen vielfach erst die routinemäßige Bestimmung wichtiger körpereigener und körperfremder Substanzen in der Arztpraxis oder zumindest abseits etablierter Universitätskrankenanstalten. Darüber hinaus kann auch die direkte Messung von Blut- oder Urininhaltsstoffen durch den Patienten neuartige Möglichkeiten eröffnen.

Der Einsatz des neuen Sensortyps ermöglicht die Nutzung aller biochemischen und chemischen Affinitätreaktionen zwischen kleinen diagnostisch oder umweltanalytisch relevanten Ligandenmolekülen und einem großen den lonenkanal sperrenden Molekül .

Der Einsatz der Erfindungung kann daher z.B. als Blut HIV - Antikörper Sensor zur HIV - Diagnostik und zur Verlaufskontrolle von HIV - Infektionen erfolgen. Die derzeit im Handel befindlichen HIV - Tests sind trotz hoher Standards im diagnostischen Fenster von etwa 3 - 6 Wochen zu unsensitiv und damit in vielen Fällen zu unsicher.

Dies führt einerseits zu quälender Unsicherheit für Betroffene bei unklaren Testergebnissen führen andererseits können dadurch in Blutbanken immer noch trotz sorgfältiger Überprüfungen positive Seren in den Verkehr gelangen.

Insbesondere in Ländern der dritten Welt sind die bestehenden Einmaltests zu teuer aber auch in vielen Fällen zu kompliziert in der Handhabung. 3

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Es kann daher ein selektives Peptid aus dem V3 * loop des gp41 Proteins als Erkennungsdeterminante an den Kanaleingang des Gramicidins gebunden werden.

Die Sequenz LGLWGCSGKLIC (eine Teilsequenz des HIV - Proteins gp41) bindet nun iherseits an Serumantikörper von nahezu 100 % aller HIV - infizierten Personen.

Zusätzlich muß die Sequenz LGMWGCSGKLIC für HIV - infizierte aus Westafrika verwendet werden. Eine bindende Sequenz für HIV - 2 lautet LNSWGCAFRQVC.

Dabei bilden jeweils die beiden Cysteine sowohl bei HIV 1 als auch HIV 2 eine Disulfidbrücke die für die volle Antigenität des Peptids essentiell ist. In der Mitte der dadurch gebildeten sogenannten V3 - loop ist eine basische Aminosäure essentiell. Für manche seltene Seren können auch noch flankierende Sequenzen von etwa 5 Aminosäure die Antigenität verbessern.

Die Bindung des Serumantikörpers führt im Rahmen der Erfindung zu einer Kanaibiockade. Dieser Effekt kann dann mit hoher Sensitivität und auch Selektivität gemessen werden. Nach einem Test wird der Sensor kurz mit einem Chaotrop gewaschen und der gebundene Antikörper entfernt. Sodann kann der Sensor für den nächsten Test verwendet werden.

Der Einsatz der Erfindungung kann weiters auch als Harn Östrogensensor zur Bestimmung der fruchtbaren Tage erfolgen. Die Erkennung der fruchtbaren Tage im Rahmen des weiblichen Zykluses ist durch die 24 -48 Stunden vorangehende deutliche Harn-Östrogenspitze mit guter Genauigkeit möglich. ELISA - Tests zur Bestimmung dieses Harn-Parameters ( oder von LH ) sind seit einiger Zeit im Handel. Jedoch sind diese Tests nur Einmaltest und überaus teuer, so daß eine Dauermessung durch den Patienten nicht möglich ist. Das neue Sensorprinzip kann einen Sensorkopf ermöglichen der zumindest eine Zyklusdauer d.h. etwa 28 Tage verwendet werden kann und deutlich genauere Aussagen über den Zykluszustand ermöglicht. Dieses Testsystem kann sowohl bei unerfülltem Kinderwunsch die genaue Messung der empfängnisbereiten Tagen ermöglichen als auch als eine äußerst schonende Methode zur Empfängnisregelung verwendet werden. Die Überwachung der Wirkung von Antiöströgenen im Rahmen der Tumortherapie stellt einen weiteren wichtigen Einsatzbereich des Sensors dar. Auch im Verlauf einer Schwangerschaft ist die Messung des Östrogenspiegels von diagnostischer Bedeutung.

Der Sensor kann über spezifische Antikörperbindung Östrogen und dessen 17-Glucuronido- und Sulfokonjugate erkennen. Die Menge der Harnöstrogene kann sodann als Zeitintegration über offene und geschlossene Zeiten an einem Kanal, oder auch als Mittelwertsstrom (bzw. dessen Zeitabhängigkeit ) an einigen 10 bis 100 lonenkanälen bestimmt werden. Als großer Unterschied zu den vorangegangenen HIV -Sensortyp soll hier jedoch in reversibler Weise die Bindung an den Kanal in einem Verdrängungsassay genutzt werden (siehe Abbildung 1). Als zusätzlich Komponente wird hier der Sensor mit einer analytperme-ablen aber antikörperimpermeablen Membran überzogen. Im Intermembranraum befinden sich Antikörper die selektiv mit Östrogen und seinen Harnderivaten reagieren und um einen gleichartigen Liganden am lonenkanaleingang kompetitieren. So wird durch eine steigende Menge Harnöstrogen der lonenfluß durch die Membran von beinahe Null auf einen dem Östrogenspiegel proportionalen Wert erhöht.

Als äußere Membran kann dabei ein kommerziell erhältlicher Typ einer Dialysemembran verwendet werden.

In einfacher Weise kann dieser Sensor sodann leicht verändert auch z.B. zur Messung des Hormons Progesteron verwendet werden.

Die Erfindung zielt darauf ab einen Sensor mit etwa folgenden Arbeitsschritten aufzubauen : 1. ) Chemische Synthese eines lonenkanals z.B. Bisgramicidin A und kovalente Kopplung der Liganden an den Kanaleingang 2. ) Dünnschichttechnologischer Sensoraufbau 3. ) Polymermembranaufbau des Sensors 4. ) Lipidcoating des Sensors, 5. ) Einbau des ligandenmodifizierten lonenkanals 6. ) Einbau in ein Kunststoffgehäuse 7. ) Für reversible Messungen Aufbringen des reversiblen Bindungsmoleküls und Einbau einer semipermeablen Membran 8. ) Messung mit dem lonenkanalsensor

Die chemische Synthese eine lonenkanals kann am Beispiel des lonenkanalpeptids Gramicidin erläutert werden . Die Synthese des Kanalpeptids Gramicidin A und dessen kovalenten Dimeren des Bisgramicidins geht von Gramicidin D aus. Mit Hilfe von silica oder reversed ph · Chromatographie kann sodann reines Gramicidin A gewonnen werden. Dieses kann mit wasserfreier f ure in einem organischen Lösungsmittel z. B. Methanol deformyliert werden. Das Produkt wird sodam «derum mit reversed phase Chromatographie gereinigt. Die Dimerisierung erfolgt dann durch Kopplung mit einem Malonsäureester, Weinsäuree- 4

AT 402 934 B ster oder strukturell verwandten Crosslinkern. Dabei wird der Diethylester der Dicarbonsäure und Gramicidin A in DMF gelöst und langsam DPPA ( Diphenylphosphorylazid ) zugegeben. Nach der Reaktion wird das Produkt wiederum mit reversed phase Chromatographie gereinigt.

Die Kopplung der Affinitätsliganden an das carboxyterminale Ethanolamin ( des Gramicidin A ) erfolgt durch Aktivierung der beiden freien terminalen OH - Gruppen des Moleküls mit z.B. Divinylsulfon oder Chlorameisensäure-nitrophenylester.

Sodann kann der Ligand durch seine OH, NH2, oder SH Gruppe selektiv terminal gebunden werden.

Es können auch beide terminalen OH - Gruppen des Bisgramicidins mit Vinylsulfon oder Chloramei-sensäure-nitrophenylester aktiviert und mit einem Diamin (Ethylendiamin ) oder einer Dimercaptoverbindung umgesetzt werden. Das sich durch die Umsetzung bildenden Bisgramicidinderivat trägt sodann zwei terminale reaktive Amino ( oder SH )- Gruppen . Sodann kann mit lodactamido-capronsäure-N-hydroxysucci-nimid-estern die zur Kopplung von Histidinen nötige alkylierende Gruppe in das Molekül eingeführt werden.

Die Kopplung von Östrogenen erfolgt an der Position 6 ( Östriol, Östron) oder an Position 17 ( Östradiol ) der konjugierten Ringsysteme. Als Liganden für Östradiol dienen dabei 170-Östradiol 17-hemisuccinat, 17/3-Östradiol 3 - gylcidylether oder 170-Östradiol 6-(0-carboxymethyl)oxim. 17/3-Östradiol 17-hemisuccinat und 17/S-Östradiol 6-(0-carboxymethyl)oxim sollen an das bereits beschriebene bisaminomodifizierten Bisgramicidin über eine Amidbindung kovalent verknüpft werden. 17/S-Östradiol 3 - gylcidylether koppelt direkt an das bereits beschriebene bisaminomodifizierte Bisgramicidin.

Zur Kopplung des HIV - Peptid kann einerseits nach Schutz der Aminogruppe des Lysins (Arginins) im V3-loop die N-terminale Aminogruppe zur Kopplung verwendet werden. Als zweite Strategie können einige zusätzliche terminale Histidine in das Peptid eingeführt werden. Diese können dann über alkylierende Crosslinker an den Carboxyterminus des Gramicidins gebunden werden.

Die Fertigung der Biosensorsubstrate erfolgt durch dünnschichttechnologische Verfahren. Die Fertigung folgt dabei dem Schema siehe Beispiele.

Die nach den genannten Verfahren hergestellten beschichteten Sensorsubstrate werden sodann durch Polymer- dünnschichttechnologische Verfahren für den Einsatz in elektrochemischen lonenkanal - Biosensoren modifiziert.

Der Träger der Lipidbiomembran baut sich aus zwei unterschiedlichen photostrukturierbaren Polymeren auf : Einer Rahmenstruktur aus hydrophobem d.h. lipophilem Photolack und einem hydrophiles Photopolymer innerhalb der Rahmenstruktur als Membranträger.

Die Rahmenstruktur aus hydrophobem d.h. lipophilem Photolack kann durch photostrukturierbaren Polymere aus der Halbleiterindustrie aufgebaut werden. Es eignen sich dafür einerseits etablierte Photolack vom Typ AZ (Hoechst) die durch nachfolgendes Einbacken bei Temperaturen über 150 Grad völlig vernetzten und daher völlig unlöslich werden. Ein photostrukturierbarer Polyimidlack ( z.B. Probimide 408 ) weist ebenfalls eine außergewöhnlich gute chemische Resistenz auf muß jedoch bei Temperaturen zwischen 350 und 400 Grad eingebrannt werden.

Ausgehend von den in den letzten Jahren entwickelten hydrophoben photostrukturierbaren Polymeren aus der Halbleiterindustrie können analog auch hydrophile Polymersysteme aufgebaut werden. Dabei können biokompatible, hydrophile und quellfähige Polymervorstufen durch bivalente Photovernetzer vernetzt werden. Es bildet sich ein Polymernetzwerk mit steuerbarer Porengröße, welches als strukturierbares Trägermaterial zur Immobilisierung der Biokomponenten d.h. Lipidmembranen und lonenkanäle dient.

Insbesondere Polyvinylpyrrolidonpolymere mit hydrophilen Seitengruppen (-OH, Ester amide,.) können als viskose Lösungen durch Spinnprozesse auf die Sensorrohlinge aufgebracht werden und durch Photocrosslinker (meist Carben und Nitren - Bildner z.B. 4,4'-Biazidostilben-2,2'-disulfonsäure) mit langwelligem UV ( 350 - 390 nm ) zu Polymerfilmen vernetzt werden. Die reaktiven funktionellen Gruppen des Polymers können dann aktiviert und zur Kopplung von Proteinen, Peptiden und Lipiden verwendet werden.

Da Lipidfilme sowohl untereinander als auch an der Zellwand nicht durch kovalente Wechselwirkungen gebunden sind, können sie leicht unter desintegrierenden Bedingungen extrahiert werden. Dazu eignen sich hydrophobe Agenzien, Detergentien und Alkali. Zum Aufbau einer stabilen Lipidmembran müssen zwei grundsätzliche Probleme gelöst werden : Stabile Bindung des Lipidfilms an die Unterlage und das Verhindern des Abfloatens des oberen Lipidfilms im Lipiddoppellayer

Die stabile Bindung des unteren Lipidfilms an die Geloberfläche erfolgt durch kovalente Kopplung von Thiolipiden an eine chemisch reaktive Geloberfläche Dabei wird vor der Aufbringung des seif assembling Thio-Lipidfilms auf die Oberfläche dieselbe in folgender Weise modifiziert : Einführung reaktiver OH -Gruppen ( z.B. durch Sauerstoffplasma ) und Kopplung der OH - Gruppen mit bivalenten OH und SH reaktiven Crosslinkern wie z.B. Divinylsulfon

Sodann wird der in der genannten Weise aktivierte Sensor in ein Bad mit in organischem LM gelösten Thio - Lipiden getaucht, es erfolgt das seif assembling. 5

Claims (14)

1. ΑΤ 402 934 Β Der zweite Lipidfilm kann am ersten kovalent gebunden Lipidfilm durch den Einbau von symetrischen Bis - Lipiden verankert werden. Diese tragen ebenfalls mindestens eine Thiogruppe um an der Gelmatrix fixiert zu sein. Ein Anteil an frei beweglichen Lipiden ermöglicht die fluide Struktur der Lipidmembran. Der Einbau des modifizierten Gramicidinkanals erfolgt im gleichen Arbeitsschritt mit dem seif assem-bling des Lipidfilms. Das Liganden - modifizierte Bisgramicidin besitzt noch eine freie reaktive Gruppe am zweiten Carboxyterminus des Bisgramicidinmoleküls. Diese kann in analoger Weise wie die Lipide kovalent mit der Geloberfläche koppeln und so den Kanal fix ( d.h. kovalent) in der Membran verankern. Durch Wechselstrom - Leitfähigkeit. Phasenwinkel und Impedanz kann die Ausbildung von Inhomogenitäten und die Dichtheit der Lipidmembranschichten auf Metalloberflächen direkt beobachtet und quantifiziert werden. Insbesondere die Bildung seif assembling von Filmen äußert sich direkt in einer Änderung der Sensorkapazität. Elektrochemische Leitfähigkeit- und Strommessungen ähnlich der Patch clamp Messung an lonenkanä-len in intakten Zellen oder an Membranfragmenten in der Spitze von Glaspipetten durch „mega seal" gebunden sind das fundamentale Meßprinzip des lonenkanalbiosensors. Die in der genannten Weise aufgebauten Sensoren liefern als Mikroleitfähigkeitsbiosensoren ein dem lonenfluß proportionales Stromsignal. Als Meßplätze sind z.B. mit OPA 128 (Burr Brown) Eingangsstufen ausgestattet Verstärker geeignet. Auch alle Meßplätze für Einzelionenkanalmessungen in der patch clamp Technik im Bereich bis 0.1 pA sind für den neuartigen im Rahmen der Erfindung beschriebenen Sensoren optimal geeignet. Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert Beispiel 1 : Aufbau der Sensorsubstrate • Verwendung von Sensorsubstraten aus Aluminiumoxid. Glas oder Kunststoff (Polycarbonat) • Herstellung von Photomasken über CAD. PS - Fiie, Photoplotter, Eisenoxidmaske, bzw. Kunststofffilmmaske • Photolack AZ5218 E. positiv 5000 rpm. 30 s • Mask-aligner: Karl Süss Modell MA 45. 360 nm 350 W. 7.5 s oder • Photolack - Entwickler AZ - Developer Hoechst 60 s • Einbacken 120*C, 30 min • Hochvakuumbedampfung bzw. Sputtern der Elektroden z.B. 50 nm Titan, 100 nm Platin, oder Gold bzw. Palladium. Anlage : Balzers. ESQ 110. BB800 059BD mit 270· Eiektronenstrahlumlenkkanone bei 2.10-- Torr, 150*C 1 nm s bzw. Laboranlage der Fa. Balzers • Floaten : 30 min. 80 *C. Ultraschall mit AZ - Remover • Isopropanol Waschschritt • Sägen der Wafer mit 100 u.m Diamantsäge mit Computersteuerung • Aufbringen einer Ag. AgCI - Referenzelektrode durch Ag - Polymer - Lack und Curing bei 110*C. 30 min Beispiel 2 : Reinigung des Gramicidin A Gramicidin D wird auf einer Sl - 100 Polyol Säule der Firma Serva mit einem Gradient von 0-80 % Methanol Wasser von den anaeren Gramicidinen ( B.C ) abgetrennt. Beispiel 3 : Carboxyterminale Modifikation des Gramicidins 500 mg Gramicidin A werden mit 10 ml Benzol gerührt, ein 3 · 5 facher Überschuß des Carboxygrup-pen modifizierten Liganden zugegeben und mit 10 fachem molaren Überschuß eines Carbodiimids ( z.B. Dicyclohexylcarbodiimid ) versetzt. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur im Dunkeln vorgenommen. Der Verlauf der Reaktion wird mit auf Siligagel - Platten mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie ( Chloroform Methanol ' Wasser : 100 10 1) verfolgt. Das Reaktionsgemisch wird sodann auf einer präparativen C-18 reversed phase Säule mit Methanol / Wasser gereinigt. Beispiel 4: Synthese des Bisgramicidins Das Ausgangsprodukt ist desformyliertes Gramicidin A welches durch Spaltung von Gramicidin A mit wasserfreier Salzsäure in Methanol und nachfolgende Reingung mit präparativen C-18 reversed phase 6 AT 402 934 B Säule mit Methanol / Wasser synthetisch gewonnen wird. Die Dimerisierung des ist desformyliertes Gramicidin A erfolgt durch Zusatz eines 5 fachen molaren Überschußes von Diphenylphosphorylazid zu einer Lösung von einem molaren Teil desformyliertem Gramicidin A und einem Überschuß ( 3 - 10 ) fach der Dicarbonsäure (z.B. Malonsäure) in Dimethylformamid bei unter - 10 · C. Die Reaktionsdauer bei 0 · C beträgt 24- 48 Stunden. Nach Stoppen der Reaktion mit Ethanol wird das Reaktionsgemisch nach einigen organisch / wässrigen Extraktionsschritten zur Trockene eingeengt und nach Aufnehmen des Rückstands in einer kleien Menge Methanol auf einer präparativen C-18 reversed phase Säule mit dem Laufmittelsystem Methanol / Wasser ( 90 / 10 bis 95 / 5) gereinigt. Beispiel 5 : Aufbau der hydrophoben Rahmenstruktur * Der Polyimidphotolack Probimide 408 wird durch Spincoaten auf den Sensorchip aufgebracht ( 5000 rpm, 2 min). * Softbake bei 110 ’C für 15 Minuten * Belichtung mit Photomaske mit UV ( 365 nm) 10 s * Postbake bei 100 *C für 5 Minuten * Entwicklen mit Tauch- oder Sprayentwickler 60 s (z.B. QZ 3301) Curing : Linear in 1 h auf 350 * C, dann 350 * C für 30 Minuten Beispiel 6 : Aufbau des hydrophilen Lipidträgerpolymers Das hydrophile photovernetzte Gel wird nach folgender Vorschritt aufgebaut : 2.5 % (w/v) PVP ( Polyvinylpyrrolidon MW : 360.000 oder 1.000.000) in destilliertem Wasser und 0.75 % (w/v) 4.4'-Diazidostilben-2,2'-disulfonsäure in destilliertem Wasser werden gemischt ( 3:2 v/v). Die Präpolymerlösung wird entweder in die Photolackrahmenstruktur pipettiert oder der Sensor wird durch ein Eintauch- oder Spinbeschichtungsverfahren mit der Präpolymerlösung überzogen. Das Photopolymer wird durch Belichten mit einer 50 W Quecksilberdampflampe für 5 s durch Einwirken von UV-A und UV-B gehärtet und überschüssiger Vernetzer durch einen Waschschritt in Phosphatpuffer pH = 7.0 0.1 M entfernt. Beispiel 7 : Aufbau des Biosensors Der Ablauf der Beschichtungsschritte und des Meßaufbaus ist in Figur 2 zusammengefaßt. Patentansprüche 1. Biosensor, dadurch gekennzeichnet, daß als Meßprinzip ein lonenstrom durch die Kanäle von in Lipidmembranen eingebauten kanalbildenden Molekülen verwendet wird, wobei durch die Bindung von Effektormolekülen, welche beliebige Moleküle darstellen, die an einen Liganden aus der Gruppe von Hormonen, Peptiden, Enzyminhibitoren, Umwelttoxinen, Pharmawirkstoffen, Thiolen oder Chelatbildnern binden, der lonenstrom verringert wird, und dabei die Verringerung durch die Bindung von Effektormolekülen an am Kanal kovalent immobilisierten Ligandenmolekülen bewirkt wird, und jeder Kanal aus einem stabilen Molekül oder mehreren stark gebundenen, nicht in Untereinheiten dissozierenden Molekülen besteht.
2. 2. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Meßsignal der lonenstrom durch die Kanäle gemessen wird, wobei die Messung elektrochemisch über die lonenkonzentrationen, als Leitfähigkeit quer durch die Membran, als Kapazität der Membran oder als Konzentration fluoreszierender Ionen wie Europium im inneren Membrankompartiment erfolgen kann.
3. 3. Biosensor nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidmembran über Metallelektroden direkt oder mit einem Submembranvolumen von weniger als 3 cm3 angebracht ist, wobei die auf dem Sensorsubstrat aufgebrachten Elektroden durch Dünnschichttechnologie, Dickschichttechnologie oder aus dünnen gewalzten Metallfolien gefertigt sind.
4. 4. Biosensor nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidmembran durch wasserhaltige und/oder leitfähige, kovalent oder ionisch vernetzte Polymere, Biopolymere oder Gele getragen 7 AT 402 934 B wird.
5. 5. Biosensor nach Anspruch 1,2 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidmembran auf den wasserhaltigen und/oder leitfähigen kovalent oder ionisch vernetzten Polymeren, Biopolymeren oder Gelen kovalent gebunden ist.
6. 6. Biosensor nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Rahmen für die Lipidmembran durch Photostrukturieren eines Dünnfilms von Polymeren, Gläsern, Keramiken, Kohlenstoff oder Metallen erzeugt ist.
7. 7. Biosensor nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Kanalmoleküle Peptide oder Proteine verwendet werden.
8. 8. Biosensor nach Anspruch 1,2 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Kanal ein Peptidkanal mit einer 6.3 Helix verwendet wird.
9. 9. Biosensor nach Anspruch 1,2, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Kanäle Peptidkanäle aus Gramicidinen und deren kovalent verknüpften Dimeren, insbesondere N- terminal verknüpften Dimeren eingesetzt werden.
10. 10. Biosensor nach Anspruch 1,2 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Kanäle kovalent vernetzte Alamethicin Kanäle verwendet werden.
11. 11. Biosensor nach Anspruch 1,2 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Kanäle Bakterientoxine verwendet werden.
12. 12. Biosensor nach Anspruch 1,2 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung des Liganden am oder nahe dem Carboxyterminus des Kanalpeptids erfolgt.
13. 13. Biosensor nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Kanäle synthetische zyklische Peptide oder zyklische, aus Zuckereinheiten aufgebaute Moleküle wie hydrophob modifizierte Cyclod-extrine verwendet werden.
14. 14. Verwendung des Biosensors nach Anspruch 1 und 2 zur Messung von Hormonen, viralen Proteinen und Peptiden, bakteriellen Proteinen und Peptiden, Umweltgiften und Teilpeptiden aus diagnostisch wichtigen humanen Proteinen. Hiezu 2 Blatt Zeichnungen 8