JP3293793B2 - 受容体膜およびイオノホアのゲーテイング - Google Patents

受容体膜およびイオノホアのゲーテイング

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、それぞれの層にイ
オノホアが取り込まれており、膜のコンダクタンスがア
ナライトの存在または不在に依存することを特徴とする
膜脂質二重層に関するものである。また、本発明は、抗
体のＦｃ領域に特異的に結合する受容体を有する膜に関
するものである。さらに、本発明は、哺乳類動物に移植
する装置に関するもので、この装置の表面は受容体を含
む膜によって被覆されることを特徴とする。
【０００２】
【従来の技術】従来から、両親媒性分子は溶液中で凝集
し、２次元の膜配列を形成することが知られている。こ
の配列の形状は多様であり、例えば単一層、黒膜、ベシ
クルおよびリポソームがある。また、このような両親媒
性分子の多くは交差結合（クロスリンク）する部分を有
する。
【０００３】したがって、紫外線照射や電離性放射線照
射などのような適当な条件下で、両親媒性分子間のクロ
スリンクを行なわせることによって二次元配列を形成さ
せて両親媒性分子間の重合をさせることが可能である。
また、適当な受容体を両親媒性分子からなる配列に加え
ることも可能である。
【０００４】膜を介したイオンの選択的または非選択的
透過性は両親媒性分子からなる配列に存在する孔（ポ
ア）またはチャンネルの数、大きさ、化学的特性等に依
存する。また、これらのポアまたはチャンネルによって
透過溶解分子（permeating solubilised molecules）の
膜通過がなされる。また、イオノホアと呼ばれる分子を
取り込んだ膜の場合、イオンの膜透過が促進される。
【０００５】係属中の関連出願第ＷＯ８９／０１１５９
号は、受容体を両親媒性分子とともに拡散させて、その
受容体分子が取り込まれた膜を高特異的結合能を有する
バイオセンサーの生産に好適な表面結合特性を有する膜
として使用することについて開示している。また、その
ようなことを可能とさせる適当な修飾を受けた受容体分
子も開示している。さらに、この関連出願は、ポリペプ
チドからなるイオノホアのようなチャンネルを両親媒性
分子とともに拡散させ、イオンの透過性に関して特定の
性質をもった膜を形成させることについて開示してい
る。そして、この関連出願は、アナライトの結合による
イオンチャンネルの開閉（これは膜のコンダクタンスに
関係する）についても言及している。よって、本明細書
に記載された内容は、関連出願第ＷＯ８９／０１１５９
号に開示された内容を参考としている。
【０００６】上記した多様な成分から形成された膜は、
その膜構造をある温度（Ｔｃ）以上で維持する。このよ
うな温度Ｔｃは、遷移温度、溶解温度または相転移温度
とも呼ばれている。このような膜に存在するイオンチャ
ンネルおよび受容体は、脂質二重層の２つの層において
拡散移動することが可能である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従来から免疫グロブリ
ンは、特異性、親和性、多様性および安定性が高いた
め、分析用試薬として用いられてきた。抗原−抗体反応
は、ラジオイムノアッセイ（RIA）や酵素結合免疫吸着
アッセイ（ELISA：エリザ）などのような感度の高い診
断技術の基本となる。このことから、これらの技術は幅
広く利用されているが、市販の抗体をベースとしたデス
ポーザブルな診断キットは、半定量的であり、かつ検査
に時間を浪費するものである。また、このような診断キ
ットは測定信頼性に欠けるものであり、さらに分析能力
に限界がある。よって、求められる免疫学的アッセイシ
ステムは、検査がすばやくでき、信頼性、特異性、感受
性および定量性がすぐれたものでなくてはならない。
【０００８】ラジオイムノアッセイやエリザは、通常、
抗体をガラスまたはプラスチックの表面に非共有的に結
合させて、その抗体をイモビライズ（固定）するもので
ある。このことは、抗体の多くの結合部位が阻害させる
ことになるので、その抗体の抗体活性が低下し、また残
りの結合部位の数や親和性の正確な把握を困難とさせ
る。より最近になって、抗体結合部位の配置は、抗原結
合部位より離れた基を介して一表面に、抗体または抗体
断片、Ｆ（ａｂ）2およびＦａｂの特異的結合によって
なされるようになった。抗原と抗体との結合は、いろい
ろな方法によって検知することが可能であり、そのよう
な方法には電気的測定方法も含まれる。しかし、それぞ
れ検知されるべき新しいアナライトを必要とし、アナラ
イトに対する特異的抗体は、Ｆ（ａｂ）2およびＦａｂ
断片のさらなるリダクションが実施されるように多クロ
ーンからなる混合物から精製された親和性を有するもの
である必要がある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、抗原−抗体結
合部位が隠れていないか、もしくは遊離したモノクロー
ン抗体または多クローン抗体の抗原結合部分の配置に言
及するものである。モノクローナルな状態は、決して抗
原の検出に必要とされることではなく、またＦ（ａｂ）
2およびＦａｂ断片のさらなるリダクションも必要とす
るものではない。検出されるべきアナライトに対して生
じた抗体は、（Ｂ）両親媒性分子からなる自己凝集性単
層膜または二重層に取り込まれた（Ａ）アシル化抗体ま
たは抗体断片と結合する。また、受容体分子を含む膜
を、移植装置の被覆に用いることが可能であると考えら
れる。そして、そのような被覆は、その表面が生体親和
性を有するものであることが望ましい。
【００１０】生体親和性表面は、侵襲的な人工装置なら
ば、どれでも必要とされる。装置の種類と、それを移植
される生体の部位に依存して、人工装置はその表面があ
る種の好ましい細胞に対して接着性が高く、結果として
当該装置と、好ましくない細胞等とが接着しない性質を
もつ必要がある。なぜなら、フイブリノーゲンのような
血漿タンパク質の吸着または赤血球のような細胞の付着
は血栓症を引き起こすであろうし、また細胞の表面への
吸着は組織形成につながることから、これらは外来物質
表面と組織との間に好ましくない隔壁を形成してしまう
ことになる。しかし、侵襲的な人工代用器官を体内へ入
れるという観点からみれば、細胞表層接着物質は人工代
用器官を媒体とした生体内への細菌感染に対する防御壁
としての役割もある。
【００１１】上皮細胞や内皮細胞のような細胞と移植装
置表面との接着を促すため、フイブロネクチンやビトロ
ネクチンのような細胞表面結合性蛋白質を介して、当該
細胞の、当該侵襲的装置表面への接着を促す。これによ
り、好ましくないもの、例えばある種の細胞や血漿蛋白
質との結合が拒まれることになる。
【００１２】本発明が第一に目指すものは、アナライト
の存在または不在に依存した膜伝導性を有する膜からな
り、両親媒性分子の密に凝集した配列と、第一および第
二半膜貫通モノマーからなる複数のイオノホアと、少な
くとも第二半膜貫通モノマー上に設けられ、かつアナラ
イトまたはその一部分と結合可能な第一受容体分子とか
らなる膜を提供することであり、少なくとも第二半膜貫
通モノマーは膜内を側方拡散可能なものであり、また第
一受容体分子へのアナライトの結合は、第一半膜貫通モ
ノマーと第二半膜貫通モノマーとの相互関係を、イオノ
ホアを介した膜のイオン透過を許すかまたは阻止するよ
うに変化させるものであることを特徴とする。
【００１３】よって、本発明の好ましい実施態様は、第
一および第二層からなり、この第一層には第一半膜貫通
モノマーが設けられ、また第二層には第二半膜貫通モノ
マーが設けられている。
【００１４】半膜貫通モノマーは既知の分子からなるも
のであるが、好ましくはこの分子はグラミシジンＡモノ
マー、アンホテリシンＢ、そしてそれらの組み合わせた
ものとからなる群から選択されるものである。もっとも
好ましいモノマーとしては、グアジジンＡモノマーが挙
げられる。
【００１５】本発明の第一目的に沿った好ましい実施態
様では、第一層にある第一半膜貫通モノマーは第一層で
の側方拡散が阻害されているが、第二層にある第二半膜
貫通モノマーは第二層での側方拡散が可能である。
【００１６】第一層にある第一半膜貫通モノマーの側方
への拡散を阻害する方法は、いくつかの既知の方法にが
知られているが、モノマーおよび両親媒性分子のそれぞ
れが、他の分子にある少なくとも一つの対応する部位に
クロスリンクした少なくとも一つの部位を有するか、も
しくはそのように修飾された分子であることが望まし
い。適当な刺激、例えば紫外線照射や電離性放射線によ
ってクロスリンク可能な部位が重合して膜内においてひ
とつの層にクロスリンクした状態となる。
【００１７】本発明の第一目的に沿ったより好ましい実
施態様では、第一層およびそれに含まれるモノマーが固
体支持体に固定されることによって第一層にある第一半
膜貫通モノマーは第一層での側方拡散が阻害される。こ
のことは、第一層の両親媒性分子上に固体支持体または
その支持体上の該当する基と反応する基を設けることに
よってなされる。
【００１８】本発明の目的に沿ったさらに好ましい実施
態様では、膜は複数の受容体部位を有する複数の第二受
容体分子を有する。また、第二受容体分子は膜内を側方
に拡散することが妨害されていることが好ましい。膜が
二重層である場合、第二受容体分子は第二層に、受容体
部位が第二層において第一層から離れた外側方向に突出
していることが好ましい。
【００１９】ここで用いられる「受容体分子」という用
語は、幅広い意味を含むものである。すなわち、この受
容体分子は目的とするアナライトに結合するならばどの
ような化学物質でもよい。また受容体分子は、他の分子
を認識するものならばどのような化合物または組成物で
もよい。天然の受容体としては、抗体、酵素、レクチ
ン、色素、キレート剤などが含まれる。例えば、抗原に
対する受容体は抗体であり、一方抗体に対する受容体は
抗−抗体、または好ましくは特定の抗体によって認識さ
れる抗原である。さらに、カルシウムのようなイオンに
対する受容体はＥＤＴＡのようなキレート剤が受容体と
なる。
【００２０】第一および第二受容体分子は、同一の分子
あるいは異なる分子であり、好ましくは多クローン抗体
またはモノクローン抗体、少なくともひとつのＦａｂフ
ラグメントを含むそれらの断片、抗原、レクチン、ハプ
テン、キレート剤および色素からなる群、より好ましく
は抗体またはその断片からなる群から選択される。ま
た、第一受容体分子および付加的に第二受容体分子はア
ナライトと結合する２つの結合部位を有することが好ま
しい。
【００２１】第二受容体分子は、好ましくは抗体または
少なくともひとつのＦａｂフラグメントを含む断片また
は抗原である。受容体がＦａｂフラグメントまたは抗体
である場合、これはＷＯ８９／０１１５９の出願に記載
されている支持体と結合するであろう。
【００２２】この第二受容体は第二層での側方拡散を既
知の手段によって妨害される。このような既知の手段と
は、例えば第二層にある両親媒性分子への受容体分子の
クロスリンクである。受容体分子が支持体に結合す場
合、受容体の側方拡散は第二および第一層の両層に延び
た支持体を有することによって阻止することが可能であ
る。
【００２３】本発明の膜がバイオセンサーに利用される
場合、膜を固体表面に張り付け（付着、結合）ることが
望ましい。これは、膜内の両親媒性分子上に固体表面と
の反応性を有する分子を与えることによってなされる。
好ましい固体表面として、ヒドロゲル、セラミックス、
酸化物、シリコーン、ポリマーおよび遷移金属が含まれ
る。好ましい遷移金属は、金、プラチナおよびパラジウ
ムである。固体表面への膜の付着は、非共有結合または
共有反応によってなされる。例えば、固体表面上のビニ
ル基は、ビミル末端を有する脂質と共重合する。また、
硫黄末端を有する脂質は金属基質（例えば金またはパラ
ジウム）に粘着する。さらに、脂質を支えるために凝縮
または付加反応が利用される。もし必要ならば、固体基
質の修飾を行なう。これはシリル化またはシリカ表面の
ような既知の方法によってなされる。膜が二重層である
場合、第一層は固体表面に付着する。
【００２４】好ましくは、第二層は相転移温度を持つよ
うに選択され、膜がこの相転移温度よりも低い温度に冷
却された場合に第二層で相分離が生じて第一および（ま
たは）第二受容体分子に結合したアナライトが遊離され
る。これは、試験後の装置の「リセット」を行なう簡易
方法を提供する。
【００２５】本発明のこの目的に沿った好ましい実施態
様では、第一受容体はリンカー基によってイオノホアに
付着する。このリンカー基は、典型的にスペーサー基と
ひとつ以上の反応基とからなる。スペーサー基はイオノ
ホアに付着され、そして反応基は受容体分子への付着を
担う。スペーサー基は、炭化水素、エチレングリコール
のオリゴマー、オリゴぺプチド等からなり、また受容体
分子がカップリングするとイオノホアがイオンを透過さ
せるような長さからなるものである。反応基は、Ｎ−ヒ
ドロキシサクシニミドエステルまたはタンパク質のアミ
ノ基と共有結合する他の活性エステル、酸化糖残基に結
合するヒドラジン誘導体；チオール基に共有結合するマ
レイイミド誘導体；ビオチン；ストレプトアビジンまた
は抗体からなる。
【００２６】リンカー基はいくつかの反応基、例えば本
発明の好ましい一実施態様によればリンカー基は一方で
ストレプトアビシンに結合するビオチンに結合する。こ
の特定のリンカー基では、受容体分子はビオチニル化抗
体に結合し、抗体上のビオチンはストレプトアビジンに
結合する。
【００２７】本発明のより好ましい実施態様では、リン
カーの末端反応基は抗体のＦｃ部分に対して特異的な抗
体または抗体断片である。そのような末端反応基は、ア
ナライトに対して特異的な受容体分子である抗体のＦｃ
領域に結合するであろう。本発明のより好ましい実施態
様では、第二受容体分子は同様のリンカー基を用いてい
る膜に結合する。
【００２８】本発明の好ましい実施態様では、分離した
第二半膜貫通モノマー上の第一受容体分子はアナライト
上の異なる部位に結合する。それによってアナライトへ
の第一受容体の結合は膜を横切るイオンの流れを阻止す
る。本発明のより好ましいしい実施態様では、分離した
第二半膜貫通モノマー上の第一受容体分子はアナライト
上の異なる部位に結合して膜を横切るイオンの流れを阻
害するが、アナライトを添加することによって第一受容
体分子と添加されたアナライトとが競合的に結合するの
で、膜を横切るイオンの流れを可能とする。
【００２９】さらに本発明のより好ましいしい実施態様
では、少なくとも両親媒性分子の一部分は膜貫通両親媒
性物質で、これは古細菌脂質または尾部と尾部とが化学
的に結合した二重層両親媒性物質である。膜が単層とし
て存在する実施態様では、すべての両親媒性分子は膜貫
通両親媒性物質である。
【００３０】上記したように、リンカー分子上の好まし
い末端反応基のひとつは、ストレプトアビジンである。
多価の反応基を使用する場合、リンカー基はクロスリン
ク不可能であることが重要であり、このことによってい
かなるアナライトも存在しない状態で第一層にあるイオ
ノホアと第二層にあるイオノホアとの相互関係が変わ
る。
【００３１】したがって、ストレプトアビジンのような
分子が末端反応基として使用された場合、他のリンカー
基上にもうけられたビオチンとクロスリンクするストレ
プトアビジンの能力が阻害されることが要求される。こ
のことは、ストレプトアビジンをリンカー基に結合させ
るビオチン結合部位に隣接する、ストレプトアビジンの
ビオチン結合部位が、ビオチンに結合していることによ
って保証される。これは、ストレプトビジンを適当な量
からなるビオチンと事前にインキュベーションすること
によって達成される。
【００３２】競合的な影響が存在しない場合、平均的に
は、第一および第二層のそれぞれのイオノホアは、イオ
ンの膜通過を許す完全なチャンネルを作るために配列す
る。第二層にあるイオノホアが第一層にあるイオノホア
との配列から外に拡散したとすると、チャンネルは壊れ
てしまいイオンは膜を通過しなくなる。このような配列
に加えて、適当な膜に取り込まれた場合においてイオノ
ホアの拡散は、アナライトからなるひとつの単一分子の
ような小さなものを検出可能であろう。アナライトから
なるひとつの単一分子の結合は、完全なイオンチャンネ
ルの形成（イオンの膜通過を許す）または崩壊（イオン
の膜通過を停止する）を引き起こす。このような変化が
適当な時間経過すると、イオンの膜通過は受容体へのア
ナライトの結合のシグナルとして検出される。ひとつの
単一イオノホアにもとづく膜を横切る電流の測定は、す
でに知られており、またその電流は４ｐＡ／チャンネル
である。
【００３３】本発明が第二に目指すものは、アナライト
の存在または不在に依存した膜伝導性を有する膜で、両
親媒性分子の密に凝集した配列と、複数の膜貫通ヘリカ
ルペプチド凝集イオノホアとからなるもので、イオノホ
アは複数の膜貫通ヘリカルぺプチドモノマーを有し、そ
れぞれのモノマーがアナライトに対する反応性を有する
受容体分子を設けていることを特徴とする膜を提供する
ことである。アナライトの受容体分子への結合は、膜貫
通ヘリカルぺプチドの凝集を妨害する。
【００３４】本発明のこのような目的に沿った好ましい
一実施態様では、膜貫通ヘリカルぺプチドモノマーはア
ラメシチンモノマーである。
【００３５】本発明のこのような目的に沿ったより好ま
しい実施態様では、受容体分子は多クローンまたはモノ
クローン抗体、少なくともひとつのＦａｂフラグメント
を含む抗体断片、レクチン、ハプテン、キレート剤およ
び色素からなる群から選択されるものである。しかし、
ここでは受容体分子は少なくともひとつのＦａｂフラグ
メントを含む抗体断片が好適であり、またより好ましく
はひとつのＦａｂフラグメントである。
【００３６】膜は、二重層または単層として存在する。
膜が単層の場合、両親媒性分子は膜貫通両親媒性物質、
例えば古細菌脂質または尾部間が化学的にリンクされた
二重層両親媒性物質であることが望ましい。
【００３７】本発明が目的とする膜がバイオセンサーと
して利用される場合、膜は固体表面に付着されることが
好ましい。このことは、固体表面に対する反応性がある
基を膜の両親媒性分子上に設けることによって達成され
る。好ましい固体表面としては、ヒドロゲル、セラミッ
ク、酸化物、シリコン、ポリマーおよび遷移金属があ
る。好ましい遷移金属は、金、プラチナおよびパラジウ
ムである。固体表面への膜の付着は、共有反応または非
共有的な相互作用によってなされる。
【００３８】本発明のこのような目的に沿ったより好ま
しい実施態様では、受容体分子はリンカー基を介して膜
貫通ヘリカルぺプチドに付着している。このリンカー基
は、すでに述べた本発明の第一目的のところに記載され
たものと同じである。
【００３９】すでに知られているように、アラメチシン
イオノホアは伝導性イオノホアを形成するようにして凝
集した複数のアラメチシンモノマーからなる。膜内での
アラメチシンの凝集／結合は、これらのモノマーがアナ
ライトと結合する受容体とともに提供された場合に阻害
される。
【００４０】本発明が第三に目指すものは、アナライト
の存在または不在に依存した膜伝導性を有し、かつ自己
凝集性両親媒性分子の密に凝集した配列からなる膜を提
供することである。自己凝集性両親媒性分子の少なくと
も一部分は、支持体と結合した受容体分子で、この受容
体分子は抗体のＦｃ領域と反応性があり、かつ受容体部
位を有する。受容体分子は、Ｆｃ受容体、抗体、Ｆ（ａ
ｂ）2およびＦａｂフラグメントのＦｃ結合ドメインか
らなる群から選択されるもので、また支持体は脂質頭部
基、炭化水素鎖、クロスリンク可能な分子および膜タン
パク質からなる群から選択される。この支持体は受容体
分子と受容体部位から離れた端で結合する。アナライト
に対する反応性のある抗体分子はＦｃ領域によって受容
体分子に結合する。
【００４１】ここで用いられている「Ｆｃ受容体」と
は、免疫グロブリンのＦｃ領域に対して反応性のある細
胞膜受容体を意味する。本発明のこのような目的に沿っ
た好ましい実施態様では、受容体分子は多クローン抗体
から好適に得られる。ここでは、受容体分子はアミノ酸
側鎖または炭化水素部分を介して支持体に共有的に付着
する。
【００４２】本発明のより好ましい実施態様では、支持
体に結合した受容体分子は膜の二重層または単層の中を
側方拡散する。本発明のより好ましい実施態様では、ア
ナライトと反応性のある抗体はモノクローン抗体であ
る。ここでは、アナライトと反応性のある抗体は、好ま
しくは同一アナライトに存在する異なるエピトープに対
する２つ以上の異なるモノクローン抗体からなる。
【００４３】当業者に容易に理解されるように、種特異
的抗体のＦｃ部分に直接反応する受容体分子を用いて、
例えば抗マウスＦｃ抗体または抗マウスＦｃ抗体Ｆａｂ
断片のＦ（ａｂ）2を用いて、本発明の膜をどのような
マウス抗体にでも使用可能とすることができる。
【００４４】本発明にもとづく膜は、通常、抗マウスＦ
ｃ抗体のような種特異的抗体のＦｃ部分に対して生ずる
抗体をまず調製される。このようなＦｃ抗体断片（Ｂ）
を抗体断片として用いて、その抗体断片の末端アミノ酸
側鎖または炭化水素部分を介して支持体に共有的に結合
させ、そして自己凝集的両親媒性単層または二重層に取
り込む。目的とするアナライトに対して生じた検出され
るべき抗体（Ａ）は、モノクローン抗体また多クローン
抗体である。抗体（Ａ）は、単層または二重層に取り込
まれた抗Ｆｃ抗体断片（Ｂ）によってＦｃ領域を介して
自己凝集的単層または二重層に結合する。
【００４５】受容体分子がＦｃ受容体のＦｃ結合ドメイ
ンである場合、Ｆｃ受容体はＦｃδＲＩまたはＦｃδＲ
ＩＩまたはＦｃδＩＩＩとして知られている受容体クラ
スから選択される。特に、Ｆｃ受容体が免疫グロブリン
ＧのＦｃ部分に対して反応性があることが好ましい。
【００４６】上記したように、Ｆｃ受容体のＦｃ結合ド
メインだけが使用されるか、必要に応じてトランスメン
ブランドメインとともに使用される。この部分が全受容
体分子を単離することによって生ずる一方で、遺伝子工
学的技術を用いてトランシメンブランドメインとともに
細胞外Ｆｃ結合ドメインまたは細胞外Ｆｃ結合ドメイン
を作ることが望ましいと考えられる。これを達成するた
めに、Ｆｃ受容体をコードするクローン化された遺伝子
を関連したひとつまたは複数のドメインを産生するよう
に修飾する。もちろん、これは遺伝子配列の一部を削除
することが含まれる。
【００４７】また、Ｆｃ受容体および抗体に対して遺伝
子配列をさらに修飾することも考えられる。これらのこ
とは、例えば、膜分子と、Ｆｃ受容体または抗体結合ド
メインとの化学的なクロスリンクのために、Ｆｃ受容体
の細胞外ドメイン、または抗体に対してスルフィドリル
基を与えるシステイン残基を含むひとつまたそれ以上の
アミノ酸添加が必要とされる。このことは、部位特異的
突然変移によって達成される。
【００４８】また、Ｆｃ結合ドメインをコードする遺伝
子配列を修飾して、抗体結合に対する受容体の親和性の
増加および（または）ＦｃσＲＩ、ＦｃσＲＩＩＩおよ
び（または）ＦｃσＲＩＩＩに結合される免疫グロブリ
ンＧ分子の範囲の増加を図ることが考えられる。さら
に、抗体結合ドメインの遺伝子配列を修飾して結合親和
性を増加させることができる。
【００４９】膜の脂質マトリックスは、抗体の取り込み
と、それぞれの抗体分子の適切な配列を可能とする。こ
の自己凝集された単層また二重層は、ラングミュア・ブ
ロジェット方法、リポームまたＢＬＭのような既に知ら
れている方法によって形成される。
【００５０】好ましくは、抗原結合反応を検出するの
は、トランスダクションの測定によってなされる。本発
明の膜が金属、ポリマーまたはヒドロゲルのような伝導
性固形支持体に付着することが好ましい。検出機能は、
抗原・抗体結合を検出できる伝導性固形支持体の選択に
よって達成される。この結合の検出は、伝導性固形支持
体表面上の膜にある両親媒性分子からの抗体・抗原複合
体の好ましい相分離に依存するであろうことから、むき
出しの伝導性固形支持体は液体環境にさらされてトラン
スダクション測定値の変化をもたらす。膜に取り込まれ
かつ自由に拡散する抗体断片に結合した抗体の相分離
は、同一のアナライトに対して生じた少なくとも２つの
異なる抗体による目的とする抗原への結合に依存する。
２つまたはそれ以上の抗体の結合は、抗体のクラスター
形成を引き起こさせる。このことは、抗体を与える単層
または二重層の相が液体環境に対して「漏れ易い（リー
キー）」ことを示している。この「漏れ易さ」は、伝導
性固形支持体のトランスダクション特性を変化させ、膜
による液体環境からの絶縁をもはや維持することができ
なくなる。
【００５１】膜に存在する抗体の密度は、抗体を支持す
るものと両親媒性物質との比の変化によって変化する。
本発明の膜の安定性の増加は、膜を固形支持体に置くこ
とによって達成される。選択された固形支持体の適当な
処置は、両親媒性物質の炭化水素鎖と固体支持体との共
有的な結合を可能とする。膜に用いられる両親媒性物質
の選択は、抗体の結合に対して、既に知られているよう
に、固体支持体の単層または二重層が分裂してその表面
がリーキーとなる。この装置は、試験溶液に存在する抗
体の選択された最小量に全か無かの反応を示すように設
計されよう。まとめると、本発明のこのような側面は、
アナライト検出のための受容体として抗体を最低限度調
製して取り込むことによって調製される膜を提供する。
【００５２】本発明の膜は、抗体分子を用いた現存装置
に対して以下のような利点を有する。 １．すべての抗体分子に対して抗体結合部位の適切な配
置が、自己凝集した両親媒性単層または二重膜の内在成
分に結合することによって達成される。 ２．膜内の受容体分子の密度を調整することが可能であ
り、そのことから目的とするアナライトの最も感度の高
い検出に最適である。 ３．抗Ｆｃ種特異的受容体分子を有する、本発明にもと
づく膜は、膜に用いられる抗体であって、選択された種
で調製されたいずれの抗体の使用をも可能にするが、こ
れにはこの抗体をモノクローンにすることなく、またＦ
（ａｂ）2またはＦａｂフラグメントにすることも必要
ない。 ４．電気的な測定は、同一のアナライトに結合する２つ
またはそれ以上の抗体の凝集によって起こる抗原結合の
変化と単層または二重層の相分離とを検出する伝導性固
形支持体を用いた結合アッセイにおいてすばやく結果を
出すことを可能とする。
【００５３】本発明が第４に目ざすものは、哺乳類の体
内に移植するのに適した装置であり、この装置は、両親
媒性分子の密に凝集した配列を有する膜によって囲まれ
たものである。この両親媒性分子の少なくとも一部分は
支持体に結合した受容体分子を含むものである。この受
容体分子は、受容体部位を有し、またこの受容体分子は
抗体および抗体断片から選択されるものである。支持体
は脂質頭部基、炭化水素鎖、クロスリンク可能な分子お
よび膜タンパク質からなる群からなる群より選ばれる。
支持体は、受容体部位から離れた一端で受容体分子と結
合する。この結合は、受容体部位が装置から離れた膜表
面上に置かれるか、そこから突出したかたちでなされ
る。受容体分子は、細胞又は細胞表面付着性蛋白質と反
応する。
【００５４】このような目的に沿った本発明の好ましい
実施態様では、膜はまた複数のイオンチャンネルを含
む。このイオンチャンネルはβヘリックスを形成するぺ
プチドであることが好ましい。また、より好ましくはそ
れはグラミシジンであることが好ましい。
【００５５】本発明の第二の目的に沿った好ましい実施
態様では、受容体分子はＦ（ａｂ）2またはＦａｂフラ
グメントである。また、好ましくは受容体分子はフィブ
ロネクチン、ビトロネクチン、内皮細胞または表皮細胞
であり、より好ましくはフイブロネクチンに対するもの
である。
【００５６】本発明のより好ましい実施態様では、装置
表面またはその表面に設けられた基と反応する基を膜に
設けることによって装置への膜の付着がなされる。さら
に、本発明にもとづく他の実施態様では、受容体分子は
Ｆ（ａｂ）2またはＦａｂフラグメントであり、それら
の末端スルフヒドリル基を介して支持体に結合する。
【００５７】本発明の他のより好ましい実施態様によれ
ば、両親媒性分子およびイオンチャンネルおよび（また
は）受容体分子はと支持体とからなる結合体は、それぞ
れのクロスリンク可能部位が他の分子のクロスリンク可
能部位とクロスリンクすることによって形成される。
【００５８】本発明では、装置の生体適合性は、その装
置が移植される哺乳類種において天然に存在する両親媒
性分子またはその誘導体またはその人工合成産物をパラ
ジウム、チタニウム、プラチナ、銀または金のような金
属との結合に関与する基とともに用いることによって強
化される。このような両親媒性物質を用いることは、宿
主−装置拒絶反応の度合いを減少させることにつなが
る。また、装置が移植される哺乳類種から生じた抗体ま
たは抗体断片を用いることによっても宿主−装置拒絶反
応の度合いを減少させることにつながる。あるいは、抗
体断片に対する抗体を修飾して拒絶を減少させる。
【００５９】内皮細胞または表皮細胞への結合は、移植
可能な装置を一定方向にアシル化された抗体または抗体
断片を取り込んだ重合化または重合化されていない両親
媒性物質からなる自己凝集性単層または二重層によって
被覆することによって促進される。フイブロネクチンま
たはビトロネクチンのような細胞表層結合タンパク質に
対して生じた抗体または抗体断片を使用することによっ
て、それを被覆された移植可能な装置と内皮細胞または
表皮細胞との結合が起き、付着が促進される。そのよう
な表皮細胞または内皮細胞によって被覆された装置の表
面は、哺乳類の体にとって外来表面とは認識されず、血
栓や組織形成を引き起こすような強い血小板粘着を防ぐ
ことが可能となる。細胞表面結合は、体内へ挿入された
カテーテルによる感染をふせぐことも可能とする。抗フ
イブロネクチン抗体および内皮細胞または表皮細胞に対
する他の抗体はすでに知られており、またそれらは種特
異的である傾向がある。
【００６０】上記したように、自己凝集性単層また二重
層は天然の脂質分子またはその誘導体からなるものであ
ることが望ましい。抗体または抗体断片の両親媒性物質
に対する特異的なクロスリンクは、それぞれの抗体が適
切に配置されていることを保証する。すなわち、すべて
の部位が抗原へ結合可能であるということであり、この
ことによって結合密度を調整することが可能である。
【００６１】本発明のさらなる利点は、膜にイオンチャ
ンネルが設けられることによって、イオンが装置へ向け
て膜を通過することが可能となる。脂質のような両親媒
性物質は、移植可能な装置の被覆のための生体適合マト
リクッスを提供し、またイオンチャンネルが取り込まれ
ることによって電荷の移動のための透過性が与えられ
る。いくつかのイオンチャンネルを用いることが可能で
あるが、本発明ではグラミシジンをイオンチャンネルと
して用いた。特に、グラミシジンＡおよびその類似体が
好ましい。
【００６２】グラミシジンＡのようなイオンチャンネル
の取り込みは、移植可能な装置表面に抗細菌性を与え
る。これはグラミシジンの抗細菌作用にもとづくもので
ある。両親媒性物質およびイオンチャンネルから構成さ
れる自己凝集性単層または二重層に抗内皮または抗表皮
抗体が存在することによって、電荷の移動過程を阻害す
ることなく血小板の粘着または組織形成を阻害すること
が可能である。このことから、そのような膜は、電荷の
移動にもとづいて検出または適用される一方で、組織形
成が生じず、また血栓を生じさせないような表面が必要
とされるペースメーカーなどのような電極を有する移植
装置と組み合わせられて使用される。
【００６３】当業者に十分理解されるものであるが、本
発明の第一の目的に沿った膜のコンダクタンスは、アナ
ライトの存在に依存したイオノホアのゲーテイングに依
存する。このゲーテイングは、他の層のイオノホアと関
連したひとつの層のイオノホアが配置変換されることに
よって起こる。このようなゲーテイング機構は、３つの
タイプが可能である。すなわち、「局部的な崩壊による
ゲーテイング」、「側方向配置変換によるゲーテイン
グ」および「縦方向分裂によるゲーテイング」である。
【００６４】
【発明の実施の形態】これらの３つのタイプのゲーテイ
ング機構をより詳細に理解するために、本発明の第一の
目的に沿った好ましい実施態様を添付した図面を参照と
しながら説明する。
【００６５】図１は、本発明の第一態様にもとづく膜の
概略を示す図で、アナライトの結合によって、局部的な
崩壊によるゲーテイングが起こり、膜コンダクタンスは
減少する場合を説明するものである。図２は、本発明の
第一態様にもとづく膜の概略を示す図で、アナライトの
存在によって側方配置転換によるゲーテイングが起こ
り、膜コンダクタンスが減少する場合を説明するもので
ある。図３は、本発明の第一態様にもとづく膜の概略を
示す図で、アナライトの存在によって縦方向の分裂が起
こり、膜のコンダクタンスが減少する場合を説明するも
のである。
【００６６】図４は、本発明の第一態様にもとづく膜の
概略を示す図で、アナライトの存在によって側方配置転
換が起こり膜のコンダクタンスが上昇する場合を説明す
るものである。図５は、修飾されたグラミシジンを合成
するための反応スキームを説明するものである。図６
は、本発明の第一態様にもとづく膜のインピーダンス測
定結果を示すものである。図７ないし図９は、本発明の
第一態様にもとづく膜のゲーテイングを示す実験結果を
示すものである。
【００６７】図１を見ればわかるように、膜１０は第一
層１１と第二層１２とからなり、それぞれの層は両親媒
性分子１３の配列からなる。また、第一層１１と第二層
１２にそれぞれイオノホア１５および１４が設けられて
いる。イオノホア１５の末端はリンカー基２６を介して
受容体分子１６と結合している。アナライトが存在しな
い場合（図１（ａ）の場合）は、イオノホア１４と１５
が縦列してチャンネルを形成するので、イオンは膜を通
過することが可能となる。
【００６８】図１（ｂ）に示すように、アナライト１７
を添加すると、このアナライト１７は受容体分子１６に
結合する。その結果、受容体分子間のクロスリンクが生
じてイオノホア１４と１５との縦列配置が局部的にズレ
ることになる。このため、イオノホア１４および１５に
よる膜のイオン透過が阻害される。
【００６９】図２では、膜１０は第一層１１と第二層１
２とからなり、それぞれの層は両親媒性分子１３の配列
からなる。また、第一層１１と第二層１２にそれぞれイ
オノホア１５および１４が設けられている。しかし、第
一層１１に設けられたイオノホア１４は図中符号２５に
よって示されたクロスリンク２５によって側方拡散が妨
害されている。イオノホア１５の末端にはリンカー基２
６を介して第一受容体１８が結合されている。また、第
二受容体１９は第二層１２に内在するようにして設けら
れており、また側方向拡散が阻害されている。アナライ
トが存在しない場合（図２（ａ）の場合）、イオノホア
１４と１５が縦列してチャンネルを形成するので、イオ
ンは膜を通過することが可能となる。
【００７０】アナライト２０を添加することによって、
これらのチャンネルが壊れることになる。すなわち、図
２（ｂ）に示すように、アナライト２０は第一受容体１
８と第二受容体１９とに結合する。第二受容体１９は第
二層２０内を側方拡散することができないので、第二受
容体１９に結合したアナライト２０の第一受容体１８へ
の結合はイオノホア１５を動かしてイオノホア１４との
縦列配置を壊す。この様式を「側方向配置転換によるゲ
ーテイング」と呼ぶ。
【００７１】図３では、膜１０は第一層１１と第二層１
２とからなり、それぞれの層は両親媒性分子１３の配列
からなる。また、第一層１１と第二層１２にそれぞれイ
オノホア１５および１４が設けられている。イオノホア
１５の末端にはリンカー基２６を介して第一受容体２１
が結合されている。アナライトが存在しない場合は、イ
オノホア１４と１５が縦列してチャンネルを形成する。
【００７２】アナライトを添加することによって、イオ
ノホア１５および第二層１２は、イオノホア１４および
第一層１１から引き離される。これによって第一層１１
と第二層１２との間に空間が生じ、チャンネルはもはや
イオンの膜透過を実施できなくなる。このようや様式か
らなるゲーテイング機構を縦方向分裂によるゲーテイン
グと呼ぶ。
【００７３】別のタイプの側方向配列変換によるゲーテ
イングを図４に示した。図４（ａ）に示すように、膜１
０は第一層１１と第二層１２とからなり、それぞれの層
は両親媒性分子１３の配列からなる。また、第一層１１
と第二層１２にそれぞれイオノホア１５および１４が設
けられている。イオノホア１４は第一層１１内での側方
拡散を図中符号２５によって示されたクロスリンクによ
って阻害されている。また、イオノホア１５の末端には
リンカー基２６を介して第一受容体２２が結合されてい
る。アナラトが存在しない場合（図４（ａ）の場合）、
イオノホア１４および１５は、第二受容体２３と第一受
容体２２とが結合しているために一直線上に縦列されて
いない。この場合、第二受容体２３は検出されるべきア
ナライトまたはその類似体である。
【００７４】図４（ｂ）に示すように、第一受容体２２
は第一受容体２３から離れ、そしてイオノホア１５は側
方向拡散してイオノホア１４と一直線上に縦列される。
これによって、チャンネルが形成されるので、イオノホ
ア１４および１５による膜のイオン透過が可能となる。
本発明の姿をより詳細に理解するために、以下の実施例
にもとづいてその好ましいかたちを説明する。
【００７５】実施例１：リンカー・グラミシジン
【化１】 −スペーサー基は、炭化水素、エチレングリコールのオ
リゴマー、オリゴぺプチド等で、レセプター分子がカッ
プリングした際にグラミシジンがイオンを導くことが可
能な長さからなるものである。 −反応基は、Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステルまた
はタンパク質のアミン基に共有結合するための他の活性
化エステル、酸化糖残基に結合するためのヒドラジン誘
導体、またはチオール基に共有結合するためのマレイイ
ミド誘導体、ビオチン、ストレプトアビジンまたは抗体
からなるものである。
【００７６】タンパク質結合のための修飾グラミシジン
の合成 １．化合物１（スキーム１を見よ） コハク酸無水物（２ｇ）とベンジルアルコール（２．２
ｇ）とをピリジン（１０ｍｌ）に溶解して４５℃で１８
時間加熱した。冷却混合物を塩化水素酸（１Ｍ，２００
ｍｌ）に注いで、ジクロロメタン（３ｘ５０ｍｌ）で抽
出した。化合したＣＨ2Ｃｌ2抽出物を乾燥（Ｎａ2Ｓ
Ｏ4）させ、そして蒸発させて白色固形物からなる化合
物１（２ｇ）を得た。
【００７７】２．化合物２ 化合物１（２ｇ）を８０チオニルクロライド（１０ｍ
ｌ）とともに３時間、室温で攪拌した。過剰のチオニル
クロライドは蒸留処理し、残留物をテトラエチレングリ
コール（２５ｍｌ）およびピリジン（２０ｍｌ）で処理
して、２４時間攪拌した。混合物を塩化水素酸（１Ｍ，
３００ｍｌ）に注いで、ＣＨ2Ｃｌ2（３ｘ５０ｍｌ）で
抽出した。化合したＣＨ2Ｃｌ2抽出物を乾燥（Ｎａ2Ｓ
Ｏ4）させ、そして蒸発させた。残留物はエチルアセテ
ートを抽出液として用いたシリカゲルによって瀘過し、
淡黄色油（１．２ｇ）を得た。
【００７８】３．化合物３ 化合物２（０．５ｇ）とコハク酸無水物（０．２ｇ）を
ピリジン（２ｍｌ）に混合し、２４時間攪拌した。この
混合物を塩化水素酸（１Ｍ，１００ｍｌ）に注ぎ、ジク
ロロメタン（３ｘ３０ｍｌ）で抽出した。化合したＣＨ
2Ｃｌ2抽出物を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）かつ蒸発させて淡黄
色油（０．５ｇ）として化合物３を得た。
【００７９】４．化合物４ グラミシジン（０．１１２ｇ）、化合物３（０．３０７
ｇ）、ジクロロヘキシルジニミド（０．１３ｇ）、そし
て触媒量からなる４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ピ
リジンを乾燥ジオキサン（１０ｍｌ）に混合して２４時
間攪拌した。過剰のジオキサンを減圧下で除去し、残留
物をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／
メタノール／水／トリエチルアミン ４００：４２：
４：１エルート）にかけて、白色固形物（０．５３ｇ）
として目的化合物を得た。
【００８０】５．化合物５ 化合物４（０．０２ｇ）をエタノールに溶解し、１０％
パラジウム／チャーコールを添加した。そして、混合物
は１気圧、２時間の条件で水素存在下で水素添加した。
そして、混合物を瀘過し、残留物をシリカゲルクロマト
グラフィー（ジクロロメタン／メタノール／水／トリエ
チルアミン ４００：４２：４：１エルート）にかけ
て、白色固形物（０．１９ｇ）として目的化合物を得
た。
【００８１】６．化合物６ 化合物５（０．０１９ｇ）をジシクロヘキシルカルボジ
イミド（０．０１ｇ）ともにジクロロメタン（３ｍｌ）
に溶解し、つづいてＮ−ヒドロキシサクシニミド（０．
００６ｇ）を添加した。この混合物を２４時間攪拌し
た。そし、過剰の溶媒を蒸発させた。残留物はエタノー
ルに取り、そして水を加えて沈澱させて白色固形物
（０．１５ｇ）として化合物６を得た。
【００８２】７．化合物７ ビオチニル化グラミシジンＡ 乾燥、蒸留ジクロロメタン（１２ｍｌ）中に含まれるグ
ラミシジンＡ（４９ｍｇ，２７μｍｏｌ）、Ｎ−ＢＯＣ
−グリシン（４８．５ｍｇ，２７７μｍｏｌ）、ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（２８．５ｍｇ、１３８μｍ
ｏｌ）および４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ピリジ
ン（６．５ｍｇ、５３μｍｏｌ）からなる混合物を２５
分間還流した。そして、室温で２０分間冷却し、減圧下
で蒸発乾燥させた。残留物をシリカゲルクロマトグラフ
ィーにかけてジクロロメタン／メタノール／水／酢酸
（４００：４０：４：１）によって溶離して、Ｏ−（Ｎ
−ＢＯＣ−グリシル）−グラミシジンＡ（７０ｍｇ）含
有主紫外線活性分画；Ｒｆ（CH2Cl2/MEOH/H2O/ACOH）：
０．２９を産出した。
【００８３】Ｏ−グリシルグラミシジンＡ Ｏ−（Ｎ−ＢＯＣ−グリシル）−グラミシジンＡ（３５
ｍｇ）を窒素存在下において再蒸留トリフルオロ酢酸
（２ｍｌ）に溶解した。この溶液を５分間攪拌し、そし
て蒸発乾燥させた。残留物をベンゼン（４ｍｌ）でトリ
チュレート（triturate）させ、そして蒸発乾燥させ
た。これによって得られた産物をシリカカラムクロマト
グラフィーにかけた。ジクロロメタン／メタノール／水
／酢酸（４００：４０：４：１）によって溶離し、Ｏ−
グリシルグラミシジンＡ（３３ｍｇ）からなるメージャ
ー、極性分画を得た。
【００８４】Ｏ−（ビオチニル−ε−アミノカプロイル
−グリシル）−グラミシジンＡ ジクロロメタン／メタノール（２：１、１．５ｍｌ）中
に含まれるＯ−グリシルグラミシジンＡ（１６ｍｇ）と
ビオチニル−ε−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシサク
シニミドエステル（３．５ｍｇ）とからなる混合物を２
８時間攪拌し、そして蒸発乾燥させた。残留物をシリカ
ゲルクロマトグラフィーにかけた。ジクロロメタン／メ
タノール／水（２００：３０：３）によって溶離し、Ｏ
−（ビオチニル−ε−アミノカプロイル−グリシル）−
グラミシジンＡ（９ｍｇ）を得た。
【００８５】ストレプトアビジン・ビオチン複合体を介
した伝導性グラミシジンチャンネルへの抗体の結合 グラミシジンイオンチャンネルへ受容体を結合させため
のリンカー手段としてストレプトアビジンを利用する一
方で、チャンネルの伝導性を維持するために、ストレプ
トアビジン分子に、チャンネルのクロスリンクを阻止す
るようにして占有された適当なビオチン結合部位を有す
るグラミシジン結合ビオチンを結合させることが不可欠
である。さらに、ストレプトアビジン分子の反対側のビ
オチン結合部位は、選択されるビオチニル化受容体の結
合のために維持される必要がある。
【００８６】そのような形態は、種々の方法によって達
成される。そのうちのひとつの方法は以下の通りであ
る。 １．１２．５μＭ濃度となるように添加されたビオチニ
ル化グラミシジンを含む５０ｍｇ／ｍｌのグリセロール
モノオールエート／Ｎ−デカン溶液から黒膜（黒脂質
膜、ＢＬＭと呼ぶ）を形成した。このＢＬＭのインピー
ダンスを図６において線３０で示した。
【００８７】２．図６の線３１に示すようなインピーダ
ンスの増加を図るために、１０μｌのビオチン／ストレ
プトアビジンのプレフォームした１：１複合体をＢＬＭ
に添加した。伝導性ビオチニル化グラミシジンチャンネ
ルによって顕著な残留性コンダクタンスが残った。
【００８８】３．１０μｌの抗Ｆｃ抗体を黒脂質膜に添
加した。抗Ｆｃ抗体の結合は、図６の線３２に示された
膜インピーダンスの付随的減少によって明らかである。 ４．２５μｌの抗ＨＣＧ抗体を黒脂質膜に添加した。抗
ＨＣＧ抗体の抗Ｆｃ抗体への結合は、図６の線３３およ
び３４によって示されたインピーダンスの増加によって
明らかである。観察された抗ＨＣＧ抗体の結合によるイ
ンーピーダンスの増加は、黒脂質膜においてグラミシジ
ンイオンチャンネルがゲーテイングされることの証明で
ある。
【００８９】実施例２ Ｎ−ダンシル−ジミリストイルフォスファチジルエタノ
ールアミン クロロホルム／メタノール（３：１、４ｍｌ）にジミリ
ストイルフォスファチジルエタノールアミン（６５ｍ
ｇ，０．１０２ｍｍｏｌ）、ダンシルクロライド（３
７．５ｍｇ）およびトリエチルアミン（１５μｌ）を含
む混合物を室温で２４時間攪拌し、そして蒸発乾燥し
た。得られた残留物をジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶
解し、重炭酸カリウム水溶液（２．５％ｗ／ｖ，２０ｍ
ｌ）で洗浄した。有機相を分離し、水相をジクロロメタ
ン（２ｘ１０ｍｌ）で抽出した。そして、混ざり合った
有機相を乾燥（Na2SO4）、瀘過および乾燥蒸発させた。
残留物をシリカカラムクロマトグラフィーにかけて、ジ
クロロメタン／メタノール（９：１）で溶離させ、黄色
蛍光産物（３８ｍｇ）；Rf(CH2Cl2/MEOH, 4:1）0.41を
得た。
【００９０】実施例３ リンカー脂質 Ｎ−４−（４−マレイイミドフェニル）−ブチリル−ジ
ミリストイルファスファチジルエタノールアミン クロロホルム／メタノール（４：１，５ｍｌ）にジミリ
ストイルファスファチジルエタノールアミン（６４ｍ
ｇ）およびトリエチルアミン（１４μｌ）を含む溶液
に、固形４−（４−マレイミドフェニル）−ブチル酸Ｎ
−ヒドロキシヒドロキシサクシニミドエステル（４８ｍ
ｇ）を添加し、混合物を室温で２時間攪拌した。この混
合物を蒸発乾燥させた後、クロロホルム（３０ｍｌ）に
溶解し、塩化ナトリウム水溶液（１％、２０ｍｌ）で２
回洗浄し、乾燥（Na2SO4）、瀘過および乾燥蒸発させ
た。得られた残留物をシリカカラムクロマトグラフィー
にかけて、クロロホルム、クロロホルム／メタノール
（９５：５）、クロロホルム／メタノール（９０：１
０）およびクロロホルム／メタノール（８０：２０）で
溶離させ、標記化合物（５３ｍｇ）を得た。
【００９１】当業者には容易に理解されるであろうが、
反応性に富んだ他のリンカー脂質および受容体の結合の
ためのスペーサー基は容易に合成されるだろう（Ｊ．コ
ーナーら（１９８５）ファーマコル．セラ（Pharmacol.
Ther.）第２８巻、３４１−３６５）。
【００９２】実施例４ 一般的な抗原結合表面は種特異的免疫グロブリンＧ抗Ｆ
ｃ抗体、抗体断片またはＦｃレセプターのＦｃ結合ドメ
インが自己凝集性両親媒性分子からなる単層または二重
層へ、抗Ｆｃ分子結合部位が抗体分子を結合可能なよう
にして配置されるようにして、結合されることによって
作られる。抗Ｆｃ分子の結合は、グラミシジンような膜
タンパク質また脂質のどちらかに結合した種々のリンカ
ーを用いることによって実行される（実施例１および実
施例２を参照）。自己凝集性両親媒性分子からなるバイ
オレイヤー（生物学的層）は、リポソーム、ＢＬＭまた
は支持体（サポーテイング・サブストレイト）上で生産
される。
【００９３】この実施例では、多クローン性抗マウス免
疫グロブリンＧ抗Ｆｃ抗体を抗Ｆｃ分子と両親媒性脂質
分子からなる単一ラメラ状リポソーム（小さな単一ラメ
ラベシクル）とを用いる。
【００９４】手短に言えば、小さな単一ラメラベシクル
はソニケーションおよび超遠心によって調製および分画
することが可能である（C. Huang (1969) Biochemistry
8,344-350; Y. Barenholz, D.Gibbes, B.J. Litman,
J. Goll, T.E. Thompson, F.D.Carlson (1977) Biochem
istry 16, 2806-10; J. Surrkuusk, B.R. Lentz, Y.Bar
enholz, R.L. Bittones, T.E. Thomson (1976) Biochem
istry, 15, 1393-1401; C.F. Schmidt, D. Lichtenber
g, T.E. Thompson (1981) Biochemistry, 20,4792-9
7）。
【００９５】クロマトグラフィー的に精製された卵黄レ
シチンおよびコレステロールを１：１の比でもってクロ
ロホルムに溶解した。実施例２に示すようにして合成さ
れた蛍光脂質マーカー（Dansyl-PE）を１％モル比とな
るように混合物に加えた。実施例１および実施例３に示
したようにして合成されたリンカー・グラミシジンまた
はリンカー脂質を１％モル比で加えた。特に実施例１の
化合物６、グラミシジンのＮ−ヒドロキシ−サクシニミ
ド誘導体と、実施例１の化合物７、グラミシジンのビオ
チン誘導体とが、分離実験に用いられた。溶媒を吸引除
去し、脂質はシクロヘキサン：メタノール（９５：５）
から凍結乾燥した。混合物を１００ｍＭ燐酸緩衝溶液
（ＰＢＳ）、ｐＨ７．９に溶解してボルテックスで攪拌
した。脂質分散液をカップホーンソニファイアーを固定
したブランソンソニファイアー（Ｂ−１２）を用い、氷
上で３０分間（３分または２分の冷却サイクルでもっ
て）超音波処理した。小さなラメラベシクルを、ベック
マンＴｉ７５ローターを用いて１８０，０００ｘｇ、１
０℃、９０分の条件で超遠心することによって分画し
た。
【００９６】単一ラメラベシクルを含む領域ＩＩＩを取
り除いた（Y. Barenholz, D. Gibbes, B.J. Litman, J.
Goll, T.E. Thompson & F.D. Carlson, (1977) Biochem
istry 16, 2806-10）。原料（オリジナルマテリア
ル）、すなわち１−５μｍｏｌ全脂質のうちの１０％か
ら領域IIIベシクルが形成された。これは、リン脂質濃
度（G.R.Bartlett(1959) J.Biol. Chem. 234, 466-46
8）およびダンシル−ＰＥフルオレッセス、５２３ｎｍ
によって決定された。ＧＡまたは誘導体の取り込みは、
ベシクルを、セファロースＣＬ４Ｂおよび蛍光物質ダン
シル−ＰＥを含む分画の２８０ｎｍでのＧＡ吸収を測定
することによってさらに分画することによって決定し
た。ベシクル調製は、ただちに抗体結合に供した。
【００９７】抗Ｆｃ抗体は、以下の方法でリンカーを有
する残基に組み合わされる。抗マウス免疫グロブリンＧ
多クローン性抗Ｆｃ抗体と125Ｉ 標識抗Ｆｃ抗体とをベ
シクル含有１００ｍＭ燐酸緩衝溶液（ｐＨ７．９）に添
加した（濃度１−５ｍｇ／ｍｌ）。（もし、ビオチンが
グラミシジンまたは脂質上のリンカーに対して反応性の
ある基であったとしたら、ストレトアビジンを抗体に対
して１：１のモル比となるようにして添加する。インキ
ュベーションは３７℃で３０分、ベシクルを添加する前
に実施する）。混合物は、２０℃で１２時間インキュベ
ーションする。そして、ベシクルに結合した抗Ｆｃ抗体
をセファロースＣＬ−４Ｂクロマトグラフイーでもって
未結合抗Ｆｃ抗体から分離する。抗Ｆｃ抗体のベシクル
への結合は、125Ｉ 標識抗体の特異的活性とダンシルＰ
Ｅのベシクル内での蛍光を測定することとによって決定
した。ベシクルに共有的に結合した抗Ｆｃ抗体を含む分
画は、マウスモノクローン抗体免疫グロブリンＧ抗体を
用いた抗原結合活性のためのラジオイムノアッセイによ
って調べたところ活性が認められた。
【００９８】表面処理 実施例５ 非細胞毒性表面は、チタニウム、パラジウム、プラチ
ナ、金または銀のような金属によって被覆された表面に
チオール部分を介して両親媒性分子を吸着させることに
よって調製した。この分子は、天然の脂質またはその誘
導体で、例えばスルフヒドリル末端を有するフォスファ
チジルコリン（L.C.Coyl et al. 1989, Chimstry of Ma
terials 1, 606-611）またはチオールを有する合成化合
物、例えばアルカン（E.B. Troughton, 1988, Langmui
r, 4, 365）またはポリエチレン酸化物のような親水性
頭部基を有するアルカン誘導体である。
【００９９】この実施例では、アルカン誘導体であるド
デカン・チオール、ポリエチレンオキシド・チオールお
よびドデカンポリエチレンオキシド・チオールを、高純
度蒸留エタノールから金属表面へ合成、吸着して細胞毒
性を調べた。
【０１００】パラジウム被覆スライドガラスを、真空下
で清浄スライドにパラジウムをスパッタリングすること
によって調製した。そして、ただちにチオール脂質／蒸
留エタノール溶液に移した。このチオール脂質は、例え
ば11-メルカプト-3,6,9-トリオクサンデカンー1ーオルと1
ー(1、2ージミリシトイルグリセリル)ー2ー(11ーメルカプトー
3,6,9-トリオキサアンデカンー1ーイル）ーサクシネート、
ドデカンチオルである。チオール脂質被覆スライドガラ
スの抵抗測定は、細胞毒性試験の前に実施した。
【０１０１】細胞毒性試験は、チオール脂質被覆スライ
ドガラスへの直接接触２４時間後に細胞数および細胞形
態を調べることによって行なった。対照群は、未処理の
スライドガラスと未処理のパラジウム被覆スライドガラ
スとを用いた。１０％牛胎児血清で増殖させたヒツジ内
皮細胞およびマウス線維芽細胞に、チオール脂質被覆ス
ライドガラスを含むスチレン処理細胞培養皿に添加した
（それぞれの培養皿に、30,000細胞／cm2）。
【０１０２】このスライドを３６．５℃で２４時間、気
圧調整されたオーブン内でインキュベーションした。生
体染色および細胞数測定のどちらでも細胞致死が示され
なかった。どちらの場合も、細胞はチオール脂質被覆ス
ライドガラスに粘着しているとともに、細胞培養皿にも
粘着していた。
【０１０３】実施例６ ビトロネクチンまたはファイブロネクチンのような細胞
粘着タンパク質に対する抗体は、実施例５のような非細
胞毒性チオール脂質被覆スライドガラスに付着する。こ
の付着は、実施例１および３に示したようなアミノ、カ
ルボキシルまたはスルフヒドリル基と反応する脂質上の
クロスリンク可能な分子を用いてアミノ酸側鎖、例えば
Ａｒｇ、Ｌｙｓ，Ａｓｐ，ＧｌｕまたはＣｙｓを介して
なされる。したがって、内皮または表皮細胞に結合可能
な非細胞毒性表面が提供される。また、グラミシジンを
添加することによってその表面に電荷伝達能力を与える
ことができる。
【０１０４】実施例７ 膜ゲーテイング装置 黒脂質膜（ＢＬＭ）装置は、直径が０．５ｍｍの穴が形
成された隔壁によって隔てられた２つの１０ｃｃチェン
バーを有する。これらのチェンバーはＢＬＭ溶液とテフ
ロンによって支持されたＢＬＭに穴を有する。ひとつの
チャンバーは、１０倍の対物レンズのガラスウインドウ
に固定した。２つのチェンバーはポリアクリルアミド
（ペルスペックス）からなるもので、また隔壁はＰＴＦ
Ｅ（テフロン）からなる。チェンバーは、テフロンで絶
縁されたステンレススチール製ボルトによって固定され
ている。ガスケットは、補強されたメデカルグレードの
シリコンゴムからなるもので、ぺルスぺックス部品とテ
フロン部品とのあいだに設けられる。膜の電気的インピ
ーダンスは、銀／塩化銀電極、リストＬＭ−ＥＰＣ７パ
ッチクランプ増幅器およびコンピューターによって制御
された信号発生装置を組み合わせたものによって測定さ
れた。励起（excitation）は０．１Ｈｚから１００Ｈｚ
へ曲線を描いて延びるサイン波である。電圧は２０ｍＶ
にセットされ、そして膜電流増幅は、第６オーダーバン
ドパスフイルターによって１ｋＨｚに制限されたバンド
幅を持つ０．５ｍＶ／ｐＡにセットされた。
【０１０５】装置は、蒸留エタノールと、蒸留脱イオン
水とによって洗浄された。界面活性剤は洗浄に使用すべ
きではなく、界面活性剤の痕跡と思われるものはすべて
除去した。エタノールの痕跡は真空チェンバー内で部品
を吸引することによって除去した。ｎ−デカンに含まれ
るビオチニル化グラミシジンの１２．５μＭ溶液を調製
し、この溶液に１００ｍｇ／ｍｌのグリセロールモノレ
ートを添加した。シリコンゴム製のチューブを５０μｌ
シリンジに固定し、このシリンジに溶液を約１０ｍｌ満
たして隔壁の凸状面にある穴を横切る脂質膜をふく（ワ
イプ）するのに用いた。この膜は数分のうちにＢＬＭを
形成した。
【０１０６】側方分離ゲートの滴定試験 この測定はアビジン・ビオチニル化グラミシジンゲート
を示すために設定されたもので、またゲート機構を示す
ためのものでもある。ストレプトアビジンはビオチンの
ための４つの結合部位を有しており、滴定の目的は、ひ
とつ以上の結合部位がビオニチル化グラミシジンチャン
ネルを阻害するのに必要であるかどうかを調べることで
ある。測定は、一連のストレプトアビジン溶液（ビオチ
ンによって阻害された結合部位が０、１、２、３および
４つのもの）でもって測定した。
【０１０７】はじめに、約２５０メグオームのイオンコ
ンダクタンスを有するＢＬＭをグリセロールモノレート
（５００ｍｇ／ｍｌ）とｎ−デカンに含まれるビオチニ
ル化グラミシジンとからなる溶液から形成した。このＢ
ＬＭを０．１Ｍ塩類溶液に浸した。そして、ビオチンと
ストレプトアビジンとの比がそれぞれ、４、３．８、
３．６および３．２：１からなる溶液を、それぞれ１０
ｍｌずつ連続して、ＢＬＭの片側面にある塩類溶液に添
加した。その結果、ＢＬＭのインピーダンス増加は認め
られなかった。
【０１０８】しかし、ビオチンを付着していないストレ
プトアビジンを他の面上の溶液に添加した場合、インピ
ーダンスは約２５０メガオームから約１２，０００メガ
オームへ上昇した。同様に、モル比３．２：１のものの
みを作ったばかりのＢＬＭに添加した場合、インピーダ
ンスは約２５０メガオームから約８，０００メガオーム
へ上昇した。
【０１０９】図７は、イオン的に伝導性のあるＢＬＭに
ストレプトアビジンを添加した場合の基本的なゲート効
果を示した。図７では、直線４０はストレプトアビジン
添加をしていないＢＬＭのインピーダンスを示してい
る。また、直線４１はストレプトアビジン添加後のイン
ピーダンスである。
【０１１０】図８は、ビオチン：ストレプトアビジンの
比が４：１（直線４３）、３．８：１（直線４４）およ
び３．６：１（直線４５）からなるそれぞれの混合物を
添加した場合の滴定結果である。直線４２は、ビオチニ
ル化グラミジン含有ＢＬＭのインピーダンスを示すもの
で、約２５０メガオームのイオン伝導性が認められた。
【０１１１】図９は、新鮮なビオチニル化含有グラミシ
ジンに３．２：１ビオチン：ストレプトアビジンを添加
した場合の効果を示している。図９では、ビオチニル化
グラミシジンを取り込んだ膜のインピーダンスは直線４
７で示されており、ストレプトアビジン添加の効果は直
線４８で示されている。そして、３．２：１ビオチン：
ストレプトアビジンの効果は直線４９で示されている。
【０１１２】これらの図では、縦軸にインピーダンスを
取り、横軸に周波数を取って、対数でインピーダンスの
スペクトルが示されている。インピーダンスの範囲は、
１０メグオームから１００メグオームの範囲で、３．０
を通る直線は１００メグオームを表わす。周波数の範囲
は、１ミリヘルツから１００ヘルツで、０．０を通る直
線は１ヘルツを表わす。インピーダンススペクトラムの
ほとんどは、２つの異なる成分からなり、４５Oライン
が膜の容量成分であるスへ゜クトラムの高周波数端で、
水平ラインが抵抗成分を表わす。低インピーダンスで
は、抵抗成分は完全に容量成分を支配する。高インピー
ダンスでは、容量成分の変化が起こり、膜の形態変化が
起こる一方でイオンチャンネルの変化を示す抵抗の変化
が起こる。
【０１１３】図７は、グリセロールモノオレート（５０
ｍｇ／ｍｌ）およびｎ−デカンに含まれるビオチニル化
グラミシジン（１２．５μＭ）からなる溶液から形成さ
れたＢＬＭに関するもので、約２５０メグオームのイオ
ンコンダクタンスが得られた（直線４０）。直線４１
は、膜の両側の溶液に１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン
を１０μｌ添加したものに関するもので、約１２，００
０メグオームへのインピーダンス増加が認められた。
【０１１４】図８では、直線４２はＢＬＭ含有ビオチニ
ル化グラミシジンに関するもので、約２５０メグオーム
のイオンコンダクタンスが得られた。直線４３は、スト
レプトアビジンを添加したもので、すべてのビオチン部
位がビオチンによってブロックされ、ビオチニル化グラ
ミシジンは結合することができないので、コンダクタン
スの変化は認められない。同様に、直線４４および４５
はストレプトアビジン上のビオチン結合部位の数が２つ
以下であり、インピーダンスの増加は認められない。す
なわち、グラミシジンの崩壊は起こらない。しかし、イ
ンピーダンスの減少は結合が起こったことを示してい
る。非ビオチニル化ストレプトアビジンをＢＬＭの同一
側につづけて添加した場合、それ以上のインピーダンス
変化は認められず、またゲーテイングを伴わない結合が
起こった。このことから、ゲーテイングは単一の結合に
もとづくものというよりもクロスリンクによることがわ
かった。上記したすべての添加は、膜の片側のみに実施
された。ストレプトアビジンをＢＬＭの他の側に添加す
ると、ＢＬＭの他の側のコンダクタンスは約１２，００
０メグオームに増加した。これは、イオンチャンネルゲ
ーテイング機構はストレプトアビジンのビオチニル化グ
ラミシジンへの結合に影響されないことを示している。
すなわち、ストレプトアビジンの競合的結合がゲーテイ
ング効果を阻害する唯一のファクターである。
【０１１５】図９の直線４６は、ビオチニル化グラミシ
ジンを含むＢＬＭを示しており、イオンコンダクタンス
は約２５０メグオームである。直線４７は、ビオチニル
化ストレプトアビジン添加の効果を示している。このビ
オチニル化ストレプトアビジンは、３．２：１ビオチ
ン：ストレプトアビジンとして調製された。これによれ
ば、３．２：１の比で多くの二重結合が可能であること
が示されている。インピーダンスの増加は、直線４６よ
り上の直線４７に示されており、このことは多くのスト
レプトアビジン分子が３．２：１ビオチン：ストレプト
アビジンの比で完全にビオチニル化されている。このこ
とは期待通りである。
【０１１６】図６は、バイオセンサー膜の調製に該当す
るインピーダンスのスペクトラムと抗ＨＣＧ抗体の感知
と関係したスペクトラムの変化とを示すものである。ス
トレプトアビジンは、分子の反対側の極にある接近した
対からなるビオチン結合部位からなる４つのビオチン結
合単位からなる。ビオチンを共有的に結合したグラミシ
ジン含有二重層のコンダクタンスに対するストレプトア
ビジンの効果は、二重層方向に向いたひとつまたは両方
の対応するビオチン結合部位に依存しており、これはグ
ラミシジン結合ビオチンに役に立つ。ストレプトアビジ
ン・ビオチン結合部位は、遊離ビオチン分子によってふ
さがれることによって利用不可能となる。すなわち、ビ
オチンは他のものには共有的に結合しないことを示して
いる。ビオチンをストレプトアビジンへ添加すること
は、ビオチンとストレプトアビジンとの比に依存した
０、１、２、３または４結合ビオチンを有すストレプト
アビジンの２方向分配を必要とする。この分配は表１に
示した。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】ビオチンを結合していないストレプトアビ
ジンは２つの隣接した結合部位を有するものしか含まれ
ない。また、３つの結合ビオチンを有するストレプトア
ビジンは、ひとつのビオチン結合部位を有するものしか
含まれない。一方、ひとつまたは２つのビオチンはひと
つまたはふたつの隣接するビオチン結合部位かなる混合
物を含む。よって、隣接する利用可能な結合部位に対し
て過剰な単一結合部位が含まれるストレプトアビジンの
試料は、ストレプトアビジンに対して過剰のビオチンを
加えることによって調製される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の第一態様にもとづく膜の概略を示す
図で、アナライトの結合によって、局部的な崩壊による
ゲーテイングが起こり、膜コンダクタンスは減少する場
合を説明するものである。
【図２】 本発明の第一態様にもとづく膜の概略を示す
図で、アナライトの存在によって側方配置転換によるゲ
ーテイングが起こり、膜コンダクタンスが減少する場合
を説明するものである。
【図３】 本発明の第一態様にもとづく膜の概略を示す
図で、アナライトの存在によって縦方向の分裂が起こ
り、膜のコンダクタンスが減少する場合を説明するもの
である。
【図４】 本発明の第一態様にもとづく膜の概略を示す
図で、アナライトの存在によって側方配置転換が起こり
膜のコンダクタンスが上昇する場合を説明するものであ
る。
【図５】 修飾されたグラミシジンを合成するための反
応スキームを説明するものである。
【図６】 本発明の第一態様にもとづく膜のインピーダ
ンス測定結果を示すものである。
【図７】 本発明の第一態様にもとづく膜のゲーテイン
グを示す実験結果を示すものである。
【図８】 本発明の第一態様にもとづく膜のゲーテイン
グを示す実験結果を示すものである。
【図９】 本発明の第一態様にもとづく膜のゲーテイン
グを示す実験結果を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブルース・アンドリュー・コーンネル オーストラリア国・2089・ニュー・サウ ス・ウェールズ・ニュートラル・ベイ・ ウィコム・ロード・58 (72)発明者 ヴィジョレタ・ルシジャ・ブロニスラヴ ァ・ブラアク−マクスヴィティス オーストラリア国・2023・ニュー・サウ ス・ウェールズ・ベルビュー・ヒル・ビ リガ・ロード・11／39 (72)発明者 ロナルド・ジョン・ペース オーストラリア国・2607・オーストラリ アン・キャピタル・テリトリー・ファラ ー・ホークスベリー・クレセント・138 (72)発明者 リオネル・ジョージ・キング オーストラリア国・2122・ニュー・サウ ス・ウェールズ・マースフィールド・ト ラファルガー・プレイス・15／５ (72)発明者 バークハード・ラギューズ オーストラリア国・2075・ニュー・サウ ス・ウェールズ・セント・アイブズ・ム ーディーズ・ロード・２ (72)発明者 クレイル・ローズマリー・バックスター オーストラリア国・2037・ニュー・サウ ス・ウェールズ・グレブ・ボイス・スト リート・53 (72)発明者 ルース・ミルナ・ホール オーストラリア国・2038・ニュー・サウ ス・ウェールズ・アナンデール・ジョン ストン・ストリート・148 (72)発明者 キャロル・アン・モーリス オーストラリア国・2049・ニュー・サウ ス・ウェールズ・ピーターシャム・フォ ート・ストリート・19 (72)発明者 ピーター・ダミエン・ジョン・オスマン オーストラリア国・2070・ニュー・サウ ス・ウェールズ・ウェスト・リンドフィ ールド・キャラマー・ロード・20 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/327 G01N 33/566 A61K 39/395 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳類動物の体内に移植可能な装置であ
    って、この装置はその表面を膜で覆われ、この膜は自己
    凝集性の両親媒性分子が凝集配列したものを含み、前記
    自己凝集性の両親媒性分子の少なくとも一部分は、支持
    体に共役した受容体分子を含み、前記受容体分子は受容
    部位を有し、前記受容体分子は抗体および抗体断片から
    なる群より選択され、前記支持体は脂質頭部基、炭化水
    素鎖、クロスリンク可能な分子、および膜タンパク質か
    らなる群から選ばれ、前記受容部位は、前記膜の表面
    の、前記装置から離れた末端にあるか、又は前記装置か
    ら離れた前記膜の表面から突出し、前記受容部位は、細
    胞表面付着性蛋白質又は細胞と反応することを特徴とす
    る装置。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載された装置であって、前
    記膜は複数のイオンチャンネルを含むものであることを
    特徴とする装置。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載された装置であって、前
    記イオンチャンネルはグラミシジンであることを特徴と
    する装置。
  4. 【請求項４】 請求項１-３のいずれかに記載された装
    置であって、前記受容体分子はＦ（ａｂ）2またはＦａ
    ｂフラグメントであることを特徴とする装置。
  5. 【請求項５】 請求項１-４のいずれかに記載された装
    置であって、前記受容体分子は、抗-フィブロネクチン
    抗体、抗-ビトロネクチン抗体、抗-内皮細胞抗体、また
    は抗-表皮細胞抗体であることを特徴とする装置。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載された装置であって、前
    記受容体分子が、抗-フィブロネクチン抗体、又は抗-ビ
    トロネクチン抗体であることを特徴とする装置。
  7. 【請求項７】 請求項１-６のいずれかに記載された装
    置であって、前記両親媒性分子はクロスリンク可能な部
    位を有するもので、それぞれのクロスリンク可能な部位
    は他の分子のクロスリンク可能な部位とクロスリンクし
    ていることを特徴とする装置。
  8. 【請求項８】 請求項１-７のいずれかに記載された装
    置であって、前記両親媒性分子は、前記装置が移植され
    る哺乳類動物種に天然に存在する非細胞毒性の両親媒性
    分子、その誘導体、または合成両親媒性物質であり、か
    つ、パラジウム、チタニウム、プラチナ、銀または金か
    らなる群から選択された金属表面に付着するためのチオ
    ール基を有するものであることを特徴とする装置。
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