AT403215B

AT403215B - Ionenfluss-modulierender dna- und rna-sensor

Info

Publication number: AT403215B
Application number: AT0194395A
Authority: AT
Original assignee: Schalkhammer Thomas Dr; Pittner Fritz
Priority date: 1995-11-28
Filing date: 1995-11-28
Publication date: 1997-12-29
Also published as: ATA194395A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Konstruktion eines DNA- und RNA-Sensors durch Steuerung von Membrankanälen über Nuklelnsäure-Hybndlslerung.

Als Nachweissysteme für DNA und RNA sind Enzym-markierte Assays (Northern-, Southern-Blott, PCR + ELISA...) bekannt. die die katalytische Wirkung von Enzymen verwenden, um ein spezifisches B ! OS ! gnat d. h. die Hybridislerung von DNA und RNA mit Hilfe eines z.B Enzymlabels in ein unspezihsches
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Durchführung aufweisen Als Nachweissysteme für DNA und RNA sind weiters optische Systeme wie Surface Plasmon Resonance-Sensoren bekannt, welche die Hybndlslerung von DNA und RNA auf einem Sensorchip in ein optisches Signal umzuwandeln vermögen. Es ist jedoch weiters bekannt, dass der grosse apparative Aufwand und die im Vergleich zu den Enzymassays mässige und daher für viele Anwendungen nicht ausreichende Empfindlichkeit dieser Sensoren diese Technik nur für manche Bereiche einsetzbar macht.

Die Erfindung zielt darauf ab, durch einen neues Sensorpnnzip die grundlegenden Einschränkungen der Nukieinsäureanalytik zu beseitigen. Die essentielle Biokomponente soll in diesem Sensoraufbau nicht zur katalytischen Verstärkung der Analytbindung Verwendung finden, sondern als selektive Barriere zur umgebenden Lösung. Die Analyt-DNA oder -RNA dient sodann direkt oder Indirekt zur Steuerung des lonenkanals. Durch diesen lonenkanal können pro Sekunde und Kanal bis zu 10 Millionen Ionen In einen schmalen ( < 10 um) Membran-Elektrodenraum einfliessen und dieser lonenfluss direkt elektrochemisch (etwa 1-10 pA je offener Kanal) bestimmt werden. Eine Störung des Messsignals durch andere Komponenten der Lösung wird durch die selektive Membran unterdrückt.

Die vorliegende Erfindung nutzt die genaue Immobilisierung eines kleinen Oligonukleotids und/oder einer interkaherenden Substanz am Eingang des Kanals. An diese wird anschliessend die grosse Analyt-DNA bzw. -RNA am Kanaleingang selektiv gebunden.
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zugänglichen Kanalpeptidemfamilie als Basis des neuen Hybndisierungssensors dienen. Sowohl die Sequenzen als auch genaue Moleküldaten unterschiedlicher Gramicidinderivate konnten In den letzten Jahren bestimmt werden. Die Sequenzhomologien sind durchwegs hoch. Die lonenkanäle werden dabei durch 2 assoziierte Moleküle Gramicidin gebildet.

Die Raumstruktur des Peptids ist dabei eine 6. 3 bzw. ss-Helix,die zentral einen offenen lonenkanal bildet und mit Tryptophanresten an den beiden Membranseiten dynamisch verankert ist.

Es konnte durch Patch Clamp Techniken gezeigt werden, dass an beiden Seiten der Membran Gramicidin - Monomere eingeschränkt frei floaten. Kommt es zu einer Assoziation zweier Molekülen Gramicidin von unterschiedlichen Membranseiten, so bildet sich ein durchgängiger lonenkanal. (siehe Fig.

1). Chemische Modifikationen der Gramicidinpeptide am N - Terminus können nach Deformylierung zwei Moleküle Gramicidin zu einem kovalenten D) mer (z. B. m) t Oxalsäure oder Malonsäure als Bisamide) verknüpfen. Diese Gramicidin-Dimere bilden z.

B. die) m Sinne der Patentanmeldung notwendigen stabilen lonenkanäle In natürlichen und artifiziellen Membranen. Öffnet oder schliesst sich ein einzelner tonenkanat In der Membran, so kann dies direkt durch einen lonenstrom von 10 Millionen Ionen je Sekunde durch den
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dung besonders gut geeignet durch ihre hohe Stabilität, die gute chemische Charaktensierung. die Möglichkeit einer Vielzahl chemischer Modifikationen und insbesondere durch die hohe Leitfähigkeit der Kanäle.

Die zweite Teil des neuen Sensorkonzepts ist die Membrantechnologie. Es wird dabei der Vorteil der black lipid membranes"d. h. der freie Zugang zu beiden Membranseiten mit dem Vorteil der "self assembling membranes"d. h der stabilen Anordnung eines selbst aufbauenden Lipidfilms kombiniert. Die Wahl eines Photo- oder Elektropolymers als Trägermatnx für den Lipidfilm und die kovalente Kopplung der Upidmonomere an diese Geloberfläche stabilisiert den Lipidfilm gegen mechanische Zerstörung, bzw. gegen das Floaten des zweiten Lipidfilms der Doppelmembran.

Dünnschichttechnologische Verfahrensschntte sind ein weiterer wichtiger Teil Im Rahmen des Sensoraufbaus. Dabei soll zuerst der elektrochemische Sensor nach etablierten dünnschlchttechnologlschen
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lacken z. BRahmenstruktur für den Lipidfilm aufgebaut. Der nächste Schritt ist sodann die Füllung der hydrophoben Rahmenstruktur mit einem hydrophilen Gel Photopolymer als Trägersystem für die Liprdmembran Diese belden Schntte können technolgisch vorteilhaft auch In umgekehrter Reihenfolge ausgeführt werden
Die Kopplung des Fängeroligonukleotids an den Gramicidin Kanal erfolgt durch selektive chemische Modifikation der carboxyterminalen Struktur.

Die Erfindung zielt darauf ab, eine neuartiges, hochsensitives Sensorpnnzip mit der Erfassung einzelner DNA bzw. RNA-Moleküle zu schaffen. Die Empfindlichkeit wird real durch die Bindungskonstante DNA DNA

bzw RNAIDNA und durch den Zeltbedarf des Aufeinandertreffens der belden Nukleinsäuremoleküle begrenzt.

Weiters zielt die Erfindung auf den Aufbau solcher Sensoren mit Dünnschichttechnologle-kompatiblen Methoden Wie Dünnschichtsubstraten, Sputtern und Aufdampfen der Metallelektroden, Einsatz von Photoiakken und mit photosensitive Polymeren hergestellten, dünnschichttechnoigischen Lpidmembranträgern ab und beinhaltet darüber hinaus auch den neuartigen Aufbau von Llpld- oder Polymermembranen an Phasen- Grenzflächen.

Die DNA-Analytik stellt Immer grössere Anforderungen an die Selektivität und Sensitivität von Messsystemen. Schnellere und Insbesondere einfachere Testverfahren in der DNA-Diagnostik ermöglichen vielfach erst die routinemässige Bestimmung von Tumorgenen, Viren, Erbkrankheiten... In der Arztpraxis oder zumindest abseits etablierter Universitätskliniken. Darüber hinaus kann auch die direkte Messung durch den Patienten neuartige Möglichkeiten eröffnen.

Der Einsatz des neuen Sensortyps ermöglicht die Nutzung der Fähigkeit zur Hybridisierung von AnalytDNA und-RNA mit Fängeroligonukleotlden am Sensorkopf.

Die Erfindung zielt darauf ab, einen DNA/RNA-Sensorchip mit etwa folgenden Arbeitsschntten aufzubau-
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Die Kopplung des Fängerohgonukleotids an das carboxyterminale Ethanolamin (des Gramicidin A) erfolgt durch Aktivlerung der beiden freien terminalen OH-Gruppen des Moleküls mit z. B. Divinylsulfon oder Chloramelsensäure-nitrophenylester. Sodann kann das linkermodifizierte Oligonukleotid durch seine terminale NH2 bzw. SH Gruppe selektiv gebunden werden. Es können auch beide terminalen OH - Gruppen
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aktiviert(Ethylendiamin) oder einer Dimercaptoverbindung umgesetzt werden. Das sich durch die Umsetzung bildende Bisgramicidinderivat trägt sodann zwei terminale reaktive Amino (oder SH)-Gruppen. Die Kopplung der Fängeroligonukleotide Ist unter Beispiele beschrieben.

Die Fertigung der Sensorchips folgt dann dem Schema der aufgelisteten Beispiele.

Der Träger der Lipid- oder Polymermembran baut sich aus zwei unterschiedlichen photostruktunerbaren Polymeren auf : Einer Rahmenstruktur aus hydrophobem d. h. lipophilem Photolack und einem hydrophilen Photopolymer Innerhalb der Rahmenstruktur als Membranträger.

Die Rahmenstruktur aus hydrophobem d. h. lipophilem Photolack kann durch photostruktunerbare Polymere aus der Halbleiterindustrie aufgebaut werden. Es eignen sich dafür die etablierten Phototacke vom Typ AZ (Hoechst), die durch nachfolgendes Einbacken bei Temperaturen über 150 Grad völlig vernetzten und daher völlig unlöslich werden Ausgehend von den in den letzten Jahren entwickelten hydrophoben Photolacken aus der Halbleltenndustne können analog auch hydrophile Polymersysteme aufgebaut werden. Dabei können hydrophile Polymervorstufen durch bivalente Photovernetzer kovalent verbunden werden. Es bildet sich ein Polymernetzwerk mit steuerbarer Porengrösse, welches als struktunerbares Trägermaterial zur ImmobilisIerung von Membranen und lonenkanäle dient.

Insbesondere Polyvinylpyrrolidonpolymere mit hydrophilen Seltengruppen können als viskose Lösungen durch Spinnprozesse auf die Sensorrohlinge aufgebracht werden und durch Photocrosslinker (meist Carben und Nltren-Bildner z. B. 4,4'-Biazidostilben-2,2'-disulfonsäure)mit langweligem UV (360 nm) zu Polymerfilmen vernetzt werden. Die reaktiven funktionellen Gruppen des Polymers können dann aktiviert und zur Kopplung von Proteinen, Peptiden und Lipiden verwendet werden
Da Lipidfilme sowohl untereinander als auch an der Zellwand nicht durch kovalente Wechselwirkungen gebunden sind, können sie leicht unter desintegrierenden Bedingungen extrahiert werden.

Dazu eignen sich hydrophobe Agenzien, Detergent ! en und Alkahen. Zum Aufbau einer stabilen Lipidmembran müssen zwei grundsätzHche Probleme gelöst werden : Stabile Bindung des lipidfilms an die Unterlage und das Verhindern des Abfloatens des oberen Lipidfilm Im Llplddoppellayer. Die stabile Bindung des unteren Lipidfilm an die Geloberfläche erfolgt durch hydrophobe, ionische oder kovalente Kopplung von z. B. Thiolipiden an eine chemisch reaktive Oberfläche.

Dabei wird vor der Aufbringung des Thio-Lfpidfilms auf die Oberfläche dieselbe in folgender Welse modifiziert : Einführung reaktiver Gruppen (z. B durch Sauerstoff- oder Chlorplasma) und Kopplung der reaktiven Gruppen mit bivalenten Crosslinkern wie z. B. Divinylsulfon. Der in der genannten Welse aktivierte Sensor wird In ein Bad mit in organischem LM gelösten Thio - lipiden getaucht, es erfolgt das self assembling"und die kovalente Bindung des Lipidfiims Der zweite Lipidfilm kann am ersten kovalent gebunden Lipidfilm durch den Einbau von symmetrischen Doppellipiden verankert werden. Diese tragen mindestens eine reaktive Gruppe z. B. Thiolgruppe, um an der Gelmatnx fixiert zu sein.

Ein Anteil an frei beweglichen Lipiden ermöglicht die fluide Struktur der Uptdmembran.

Der Einbau des DNA/RNA-modifzierten Kanals erfolgt zugleich mit dem "self assembling" des Lipidfilms Ein Liganden -modifiziertes Bisgramicidin besitzt noch eine freie reaktive Gruppe am zweiten Carboxyterminus des Bisgramicidinmoleküls. Diese kann In analoger Weise wie die Lipide kovalent mit der Geloberfläche koppeln und so den Kanal fest (d. h kovalent) mit dem Trägerpolymer verbinden.

Der Lipidfilm kann jedoch auch durch eine beliebige andere Membran ersetzt werden, da es m SensorSetup die Aufgabe der Membran Ist, zwei unterscheidbare Kompartimente zu schaffen. Analog der Technologie ionensensitiver Elektroden kann z. B. Polyyinylchlond mit hohem Weichmacheranteil als Membranmatnx verwendet werden. Auch hydrophobe Schichten z. B aus Teflon, durch Plasmapolymerisation aufgebracht, eignen sich als Membranmatnx. Durch leitfähigkeit und Impedanz kann die Ausbildung
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und quantifiziert werden.

Leitfähigkeits- und Strommessungen ähnlich der Patch Clamp Messung an lonenkanälen In intakten Zellen oder an Membranfragmenten sind das Messpnnzip des Membrankanalbiosensors. Die In der genannten Welse aufgebauten Sensoren liefern als Mikroleitfähigkeltsblosensoren ein dem lonenfluss proportionales Stromsignal. Als Messaufbau sind mit Elektrometerverstärkern (z B. OPA 111 oder 128 Burr Brown) ausgestattete Verstärker geeignet. Auch alle Messplätze für Einzelionenkanalmessungen in der Patch Clamp Technik im Bereich bis 0. 1 pA sind für die neuartigen im Rahmen der Erfindung beschriebenen Sensoren geeignet.

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Austührungsbeisprieien näher erläutert.

Beispiel 1 : Aufbau der Sensorsubstrate * Verwendung von Sensorsubstraten aus Alkali-,Pyrex-Glas oder Kunststoff (Polyimid) * Herstellung von Photomasken über CAD, DXF - File und Patterngenerator . Herstellung von Tochtermasken * Hochvakuumbedampfung bzw. Sputtern der Elektroden z. B. 50 nm Titan, 100 nm Gold,
Anlage : Balzers, ESQ 110, BB800 059BD mit 270
Elektronenstrahlumlenkkanone bei 2. 10-5 Torr, 150'C 1 nm/s bzw. Laborantage der Fa.

Balzers * Photolack AZ5218 E, positiv 4000 rpm, 30 s * Msak-aligner Kari Süss Modell MA 45, 360 nm 350 W, 7. 5 s * Photolack-Entwickler AZ-Developer/Hoechst 60 s * Einbacken bei 120 C. 30 min * Gold ätzen mit KI/12 * Titan ätzen mit gepufferter HF * 30 min, 80.

C, Ultraschall mit AZ - Remover
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. Kaschieren auf Haftfolie * Sägen der Wafer mit 100 um Diamantsäge Beispiel 2 : Reinigung des Gramtcidin A Gramiodin A wird von Gramicidin B und C aus der Mischung (= Gramicidin 0) auf einer Sl -100 Polyol Säule der Firma Serva mit einem Gradient von 0-80 % Methanol getrennt.

Beispiel 3 : Carboxyterminale Modifikation des Gramicidins
500 mg Gramicidin A werden mit 10 ml Benzol gerührt, ein 3-5 facher Überschuss des Carboxylgruppen modifizierten Liganden zugegeben und mit 10 fachem molaren Überschuss eines Carbodiimids (z. B Dicyclohexylcarbodiimid) versetzt. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur im Dunkeln vorgenommen Der Verlauf der Reaktion wird auf Siligagel-Platten mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie (Chloroform 1 Methanol/Wasser :100/10/1)verfolgt.

Das Reaktionsgemisch wird sodann auf einer präparativen C-18 Reversed Phase Säule mit Methanol Wasser gereinigt.

Beispiel 4 : Synthese des Bisgramicidins
Das Ausgangsprodukt ist desformyliertes Gramicidin A welches durch Spaltung von Gramicidin A mit wasserfreier Salzsäure in Methanol und nachfolgende Reingung In präparativen C-18 reversed phase Säulen mit Methanol 1 Wasser synthetisch gewonnen wird.

Die Dimerisierung des desformylierten Gramicidin A erfolgt durch Zusatz eines 5 fachen molaren Überschusses von Diphenylphosphorylazid zu einer Lösung von einem molaren Teil des desformylierten Gramicidin A's und einem Überschuss der Dicarbonsäure 3 - 10 fach (z. B. Oxalsäure, Malonsäure) in Dimethylformamid unter -10. C. Die Reaktionsdauer bei 0 C beträgt 24 - 48 Stunden. Nach Stoppen der Reaktion mit Ethanol wird das Reaktionsgemisch nach einigen organisch/wässrigen Extraktionsschritten zur Trockene eingeengt und nach Aufnehmen des Rückstands in einer kleien Menge Methanol auf einer präparativen C-18 Reversed Phase Säule mit dem Laufmittelsystem Methanol 1 Wasser (90 110 bis 95/5) gereinigt.

Beispiel 5 : Aufbau der Rahmenstruktur Der Photolack AZ 1505 wird durch Spincoaten auf den Sensorchip aufgebracht (7000 rpm, 2 min).

Softbake bei 80. C für 30 Minuten
Belichtung mit Photomaske mit UV (365 nm) 5 s
Postbake bei 80. C für 5 Minuten
Entwickeln mit einer 2. 83% Tetraethylammmoniumhydroxid-Lösung 60 s
Curing : 1 h auf 160. C Beispiel 6 : Aufbau des hydrophilen Lipidträgerpolymers
Das hydrophile photovernetzte Gel wird nach folgender Vorschrift aufgebaut : 2. 5 % (w/v) PVP (Polyvinylpyrrolidon MW : 360. 000 oder 1. 000. 000) In destilliertem Wasser und 0. 75 % (w/v) 4,4'-Diazidostilben-2,2'-disufonsäure in destilliertem Wasser werden gemischt (3 : 2 v/v).

Die Präpolymerlösung wird entweder in die Photolackrahmenstruktur pipettiert oder der Sensor wird durch ein Eintauch- oder Spinbeschichtungsverfahren mit der Präpolymerlösur1g überzogen.

Das Photopolymer wird durch Belichten mit einer 50 W Quecksilberdampflampe für 5 s durch Einwirken von UV-A und UV-B gehärtet und überschüssiger Vernetzer durch einen Waschschritt in Phosphatpuffer 0. 1 M, pH = 7. 0 entfernt.

Beispiel 7 : Reinigung von Platinsensorelektroden
Nach der Verwendung von löslichen Thio-Verbindungen sind Metalloberflächen chemisch bzw. elektrochemisch blockiert = derivatisiert. Um die kovalente Bindung der Thiole mit der Elektrodenoberfläche zu brechen, wird die Elektrode elektrochemisch zwischen -600 und + 1200 mV (bis in den Bereich der Sauerstoffentwicklung) versus Ag/AgCI gereinigt. Die elektrochemische Reinigung erfolgt durch Anlegen einer zeitlich variablen Spannung an einen in neutralen Puffer eingetauchten Sensor.

Beispiel 8 : Llpid- und Kanalbeschichtung der Sensorelektroden
Die in einem organischen Lösungsmittel gelösten Lipide (2-10 u. g/100 cm2 Oberfläche) und DNA-
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auf einem LB-Trog gespreitet. In einem automatisierten LB-System wird der Lipidfilm von einer fluiden in eine semikristalline Phase komprimiert. Der Sensor wird sodann durch den Lipidfilm gezogen wobei ein Nanoaktuator der Firma Physik-Instrumente/Deutschland (von einem DC-Motor mit der Auflösung von 60nm angetrieben) verwendet werden kann. Ungesättigte Lipidfilme werden mit einer Photomaske bedeckt und durch das Licht einer 50W Mitteldruck Quecksilberdampflampe etwa 120 Sekunden vernetzt. Dabei werden die Lipide sowohl innerhalb der Lipidschicht als auch mit einem reaktiven Träger vernetzt.

Beispiel 9 : Kopplung von SH-Oligonukleotiden an ein NH2-Kanalpeptid
Ein Kanalpeptid mit reaktiver NH2 -Gruppe (20mg/ml) wird in Phosphatpuffer 0. 1 M/EDTA 0. 1 M gelöst (bei hydrophoben Peptiden unter Zugabe eines Lösungsvermittters) und 0. 5-5mg/ml Sulfosuccinimi- dyl- (4-Jodacetyl) aminobenzoat zugegeben. Die Reaktionsdauer beträgt bei Raumtemperatur und unter

Lichtschutz 20-60 Minuten. Nach der Abtrennung des Kopplungsreagenzes durch HPLC wird ein 1-5 fach molarer Überschuss an SH-modtfertem Oligonukleotid zugegeben Die Reaktionsdauer beträgt be 4#C und unter Lichtschutz 8#16 Stunden.

Als Reaktionslösung kann ein Phosphatbuffer 0. 1 M mit 0 1 M EDTA pH = 8. 3 verwendet werden. Der Überschuss an reaktivem Kanalpeptid wird mit Cystein abgefangen und die Mischung auf einer semipräparativen HPLC-Säule gereinigt.

Beispiel 10. Kopplung von NHz-Oiigonukieottden an ein SH-Kanalpeptid
Ein Oligonukleotid mit readtiver, Terminaler NH2 -Gruppe (20mg/ml) wird in NaHC03 0. 2 M EDTA 0 1 M, pH = 9. 3 gelöst (bel hydrophoben Peptiden unter Zugabe eines Lösungsvermittlers) und 0 5-5mg ml Sulfosuccinimidyl-4N-maleinimidonethyl cyclohexan1-carboxylat zugegeben. Die Reaktionsdauer beträgt bel Raumtemperatur und unter Lichtschutz 10-30 Minuten. Nach der Abtrennung des Kopplungsreagenzes durch HPLC wird ein 1-5 fach molarer Überschuss an SH-Modifiziertem Kanalpeptid zugegeben Die Reaktionsdauer beträgt bei 4-C und unter Lichtschutz 8-16 Stunden.

Als Reaktionslösung kann ein
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0. 0. 1wird mit Cystein abgefangen und die Mischung auf einer semlpräparatlven HPLC-Säule gereinigt Beispiel 11 : Kopplung von NH2 -Oligonukleohden an ein NH2-Kanalpeptid
Ein Oligonukleotid mit reaktiver, terminaler NH2 -Gruppe (20mg/ml) wird in 0. 2 M NaHC03 pH = 9. 3 gelöst (bel hydrophoben Peptiden unter Zugabe eines Lösungsvermittlers) und 1-5mg ml Bls- (sulfosuccinimidyl) suberat zugegeben. Die Reaktionsdauer beträgt bei Raumtemperatur und unter Lichtschutz 5-20 Minuten. Nach der Abtrennung des Kopplungsreagenzes durch HPLC wird ein 1-5 fach molarer Überschuss an NH2-modifiziertem Kanalpeptid zugegeben. Die Reaktionsdauer beträgt bei 4-C und unter Lichtschutz 8-16 Stunden.

Als Reaktionslösung kann 0. 2 M NaHC03 pH = 9. 3 verwendet werden. Der Überschuss an reaktivem Kanalpeptid wird mit Cystein abgefangen und die Mischung auf einer semipräpara- tiven HPLC-Säule gereinigt.

Beispiel 12 : Oligonukleotide für einen Herpes-Virus Sensor
Als Fängeroligonukleotide werden komplementäre Sequenzen von 15-30 bp zu Sequenzen aus der Viruspolymerase auf einem Oligonukleotidsynthesizer gewonnen. Als Sequenzen werden komplementäre Sequenzen zu den Nukleotidsequenzen die den folgenden Aminosäuresequenzen entsprechen verwendet :
Herpes i : PAGPRGAGRG
ERPEEEGEDE
Herpes 11 : PHNPRGA TQT
GDGNGDEDLD
Humaner Herpes VI : RILPRGIMHD RQGIGYKGA T Cytomegalovirus : PGSAQGSGKR
VSPGSGSNSS Vanecella-Zoster : RGSNREFLHS
DVIPDVGDVE Epstein-Barr : LRLIPKCFQT
ILPMPSASDR Beispiel 13 :

Oligonukleotide für einen HIV1'2-Virus Sensor
Als Fängeroligonukleotide werden komplementäre Sequenzen von 15-30 bp zu Sequenzen aus dem Protein gp41 auf einem Oligonukleotidsynthesizer gewonnen. Als Sequenzen werden komplementäre Sequenzen zu den Nukleotidsequenzen die den folgenden Aminosäuresequenzen entsprechen verwendet : HiV1 LGLWGCSGKLIC
LGMWGCSGKLIC H ! V2 : LNSWGCAFRQVC

Beispiel14-AufbaueinerElektropclymermemburamatrixmitsubstrlutertenPolypyrrolen
Als Monomer können z B 1-Carboxyalkyl-pyrrol, 2- (1-Pyrroloacetyl) -glycin, 1-Alkylpyrrol, 4-Carboxybenzylpyrrol.

4-Nitrophenylpyrrol, 4- (3-Pyrrolo)-4-ketobuttersäure.

3- ( (Keto-4-nitrophenyl) methyl) pyrrol oder analoge Verbindungen verwendet werden.

Die Monomere werden In 0. 5 prozentiger Lösung in Acetonitril gelöst und 2. 5 % Leitsalz (LICI04, NR4BF4, NR4Pf6 R-Alkyl) zugegeben. Die klare Lösung wird 10 Minuten mit Argon gespült. Dann werden die Elektroden cyclovoltammetrisch mit den Elektropolymeren überzogen (Scangeschwindlgkelt = 100mV/s Der Spannungsbereich wird dabei so gewählt, dass eine deutliche anodische Stromzunahme durch den Po ! ymerisat) onsvorgang während der ersten Zyklen beobachtet werden kann z. B.-300 bis 1400 mV versus Ag/AgCI.

Claims

Patentansprüche 1. Biosensor. dadurch gekennzeichnet, dass in Membranen Kanäle oder kanalbildende Moleküle einge- baut sind, an welchen kovalent ein oder mehrere Oligonukleotide, Oligonukleotidanaloga, DNA- oder RNA-Moleküle immobilisiert sind. 2. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran über Metall- oder Halbleiter- elektroden direkt oder mit einem Submembranvolumen von weniger als 3 cm3 auf dem Sensorsubstrat angebracht ist, wobei die aufgebrachten Elektroden durch Dünnschichttechnologie, Dickschichttechno- logle oder aus dünnen gewalzten Metallfolien gefertigt sind.

3. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran durch wasserhaltige und/oder leitfähige kovalent oder Ionisch vernetzte Polymere, Biopolymer, Gele, Dendrimere oder knstalline Festkörper getragen wird. EMI6.1 ren oder kristallinen Festkörpern kovalent gebunden ist.

5. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Rahmen für die Membran aufweist, der durch Photostruktuneren einer Dünnschicht von Polymeren, Gläsern, Keramiken, Kohlen- stoff, Metallen oder Halbleitern erzeugt ist.

6. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er Kanalmoleküle aus Peptiden oder Proteinen aufweist.

7. Biosensor nach Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass er als Kanäle Peptidkanäle mit einer 6. 3 Helix aufweist.

8. Biosensor nach Anspruch 1, 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass er als Kanäle Peptidkanäle aus Gramtcidinen, modifizierten Gramicidinen und deren kovalent verknüpften Dimeren, insbesondere N- terminal verknüpften Dimeren aufweist.

9. Biosensor nach Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass er als Kanäle kovalent vernetzte Alamethicin Kanäle aufweist.

10. Biosensor nach Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass er als Kanäle stabile monomere Baktenentoxine aufweist.

11. Biosensor nach Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Liganden am oder nahe dem Carboxyterminus des Kanalpeptids gebunden sind. <Desc/Clms Page number 7>

12. Biosensor nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, dass er als Kanäle synthetische zyklische Peptide oder zyklische aus Zuckereinheiten aufgebaute Moleküle Wie hydrophob modifizierte Cyclodex- tnne aufweist.

13. Blosensor nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, dass er als Kanäle Löcher In einer Membran aufweist.

14. Blosensor nach Anspruch 1 und 13. dadurch gekennzeichnet, dass er eine Membran mit Löchern, hergestellt durch radioaktiven Beschuss der Membran, durch nasschemisches Ätzen, durch Plasmaätzen, durch Aufbau einer solationsschicht um leitende Inseln, mit nanotechnologischen Scannern oder Stempeltechniken, aufweist.

15. Blosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran auf einer Seite von einer wässerig/organischen oder organischen oder siliziumorganischen Flüssigkeit bedeckt Ist 16. Biosensor nach Anspruch 1 und 15, dadurch gekennzeichnet, dass in der organischen oder siliziumor- ganischen Flüssigkeit Salze oder bnencamer gelöst sind 17. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von DNA und RNA mit Hilfe eines Biosensors nach den Ansprüchen 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die durch die Hybridisierung in den Membrank- anäien hervorgerufene Änderung des lonen- und/oder Elektronenstroms gemessen wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet. dass zur Verstärkung der kanalstromändern- den Wirkung der Hybridisierung DNA- und/oder RNA-interkalierende Substanzen eingesetzt werden.

19. Verfahren nach Anspruch 18. dadurch gekennzeichnet, dass zur Verstärkung der kanaistromändern- den Wirkung der Hybndlsierung DNA-und/oder RNA-bindende Proteine eingesetzt werden.

20. Verwendung des Biosensors nach Anspruch 1 zur Bestimmung humaner, pflanzlicher, tierischer, viraler oder bakterieller DNA und RNA.

21. Verwendung des Biosensors nach Anspruch 1 zum Nachweis von Viren der Herpes und HIV Gruppe.