AT401652B - Verfahren zur steigerung der aktivität von lipasen - Google Patents
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Description
AT 401 652 B
Lipasen, die enzymatisch Bindungen von Carbonsäurederivaten knüpfen oder zu lösen vermögen, gewinnen als Biokatalysatoren zur Synthese wertvoller chemischer Verbindungen auch im großtechnischen Bereich immer mehr an Bedeutung. Da die Wirtschaftlichkeit eines enzymatischen Verfahrens unter anderem mit der Aktivität des eingesetzten Enzyms wächst, hat es nicht an Versuchen gefehlt, Verfahren zu finden, mit deren Hilfe die Aktivität einer Lipase gesteigert werden kann.
Aus Enzyme Microb. Technol. Vol. 11 (1989), pp. 44 - 48 ist beispielsweise bekannt, daß die Aktivität einer Lipase beim Lösen oder beim Knüpfen von Carbonsäureesterbindungen durch Modifikation von Aminosäureseitenketten der Lipase durch Umsetzung mit bestimmten Aldehyden, Carbonsäuren, Carbonsäureanhydriden, Zuckern, Imiden, Sulfonyihalogeniden beeinflußt werden kann. Die Umsetzung von Lipasen mit solchen Reagentien ist aber ein relativ aufwendiger Prozeß. Außerdem treten bei der Carbonesterspaltung immer Aktivitätsverluste und keine Steigerungen auf.
In JP 87/43658 (Chemical Abstracts Vol. 111, 230697), JP 89/185636 (Chemical Abstracts Vol. 115, 227116) und JP 89/322909 (Chemical Abstracts Vol. 115, 202027) ist vorgeschlagen, Lipasen in Gegenwart eines Aktivators, wie einer oberflächenaktiven Substanz, z. B. Lecithin, Sucrosefettsäureester, Dextrin, Polyole, hydrophile Aminosäuren, Peptide zu immobilisieren. Dadurch soll die Aktivität einer immobilisierten Lipase gegenüber einer solchen, die nicht in Gegenwart eines der oben angeführten Aktivatoren immobilisiert wurde, bei einer Veresterungs- oder Umesterungsreaktion ansteigen. Nachteilig bei diesem Verfahren ist, daß die Lipase zur Aktivitätssteigerung immobilisiert werden muß, wobei bekanntlich große Mengen an Aktivität durch Besetzung des aktiven Zentrums durch das Trägermaterial verlorengehen, sodaß die immobilisierte, aktivierte Lipase weniger Aktivität aufweist, als die gleiche Menge nicht immobilisierter, nicht aktivierter Lipase.
In J. Chem. Soc. Perkin Trans 2 (1991), pp. 1851 - 1854 ist beschrieben, daß eine Lipase durch Zugabe eines Detergens und anschließender Lyophilisierung in organischen Lösungsmitteln löslich gemacht werden kann, wobei die Aktivität der Lipase erhalten bleiben soll. Tatsächlich treten aber bei Lipasen, die auf diese Art behandelt wurden, Aktivitätsverluste bei der enzymatischen Hydrolyse eines Carbonsäurederivates auf. Außerdem kann das im Lyophilisat anwesende Detergens die enzymatische Reaktion bei vielen Substraten empfindlich stören oder überhaupt verhindern.
Es sind auch mehrere Verfahren bekannt, bei denen eine Lipase mit Alkoholen, Detergentien oder Proteinen in Kontakt gebracht wird, und diese Mischung die gewünschte Reaktion durchführt, wobei jedoch die Aktivatoren immer in der Reaktionsmischung bleiben.
So betrifft DE-OS 35 45 056 die Umesterung zwischen einem Öl oder Fett und einem anderen Öl oder Fett oder Fettsäure in einem organischen Lösungsmittel. Dabei wird in einem ersten Schritt eine Mischung aus Öl oder Fett, einem Trägermaterial, Wasser oder einem niederen Dihydroxy- oder Trihydroxyalkohol und Lipase reagieren gelassen, um das Öl oder Fett zu zersetzen. Nach Abfiltrieren des restlichen Öls oder Fettes aus dem Zersetzungsprodukt wird ein aktiviertes Lipasepräparat erhalten, bestehend aus Lipase und Träger. Dieses Lipasepräparat wird in einem weiteren Schritt mit Wasser oder einem niederen Dihydroxy-oder Trihydroxyalkohol versetzt. Nach 2 gesonderten Aktivierungsschritten im nicht wäßrigen Medium bleibt der Aktivator in der Lipase. ln US-PS 5,100.796 wird eine Waschmittelzusammensetzung, bestehend aus einem bestimmten, amtlich hinterlegten Pseudomonas-Stamm und aus 1 - 30 % Detergens beschrieben. Die Enzymaktivität wird durch Waschen verschiedener verschmutzter Gewebe (Standardtest EMPA) bestimmt. GB-PS 1 574 269 betrifft eine Enzym-Präparation enthaltend eine Lipase nicht tierischen Ursprungs und 5 - 50 % eines tierischen Eiweißes als Stabilisator. Auch hier bleibt das Protein in der Enzympräparation und wird nicht aus der Lipase entfernt.
Es wurde nun unerwarteterweise gefunden, daß durch die Behandlung einer Lipase mit einem Aktivator, ausgewählt aus einem Alkohol und/oder einem Detergens und/oder einem Protein eine außergewöhnliche Aktivitätssteigerung der Lipase beim Lösen und/oder Knüpfen von Bindungen eines Carbonsäurederivates erzielt wird, ohne die Lipase modifizieren oder immoblisieren zu müssen, die auch dann erhalten bleibt, wenn der Aktivator in der enzymatischen Reaktionsmischung stark verdünnt oder überhaupt daraus entfernt wird.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Aktivitätssteigerungen einer Lipase beim Lösen und/oder Knüpfen von Bindungen eines Carbonsäurederivates, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Lipase in einem wäßrigen Verdünnungsmittel mit einem Aktivator, ausgewählt aus einem Alkohol und/oder einem Detergens und/oder einem Protein in geeigneter Konzentration in Kontakt gebracht wird, worauf der Aktivator stark verdünnt oder überhaupt entfernt wird und die derart behandelte Lipase in eine enzymatische Reaktion zum Lösen und/oder Knüpfen von Bindungen von Carbonsäurederivaten eingesetzt wird.
Eine Lipase, die in Tieren, Pflanzen und Pilzen vorkommt, ist ein Enzym, das befähigt ist, Bindungen von Carbonsäurederivaten, vornehmlich Carbonsäureesterbindungen durch Hydrolyse zu lösen oder durch 2 ΑΤ 401 652 Β
Veresterung oder Umesterung zu lösen und/oder zu knüpfen. Bevorzugte Lipasen, die erfindungsgemäß aktiviert werden können, sind Lipasen aus Pilzen, beispielsweise der Gattung Candida, Pseudomonas, Geotrichum, Rhizomucor oder aus Pflanzen, beispielsweise aus Weizenkeimen. Besonders bevorzugt werden Lipasen aus Pilzen aktiviert.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Lipase in einem wäßrigen Verdünnungsmittel gelöst oder zumindest angelöst und mit einem wasserlöslichen Aktivator vermischt, wobei eine Aktivierungsmischung entsteht, in der erfindungsgemäß eine hohe Aktivatorkonzentration wesentlich ist.
Als wäßriges Verdünnungsmittel kommen etwa Wasser, eine wäßrige Salzlösung, bevorzugt eine wäßrige Pufferlösung in Betracht. Das wäßrige Verdünnungsmittel kann gegebenenfalls übliche organische Hilfslösungsmittel enthalten, die zum Anlösen oder Lösen des Substrates dienen, das mit Hilfe der Lipase umgesetzt werden soll. Organische Hilfslösungsmittel werden im allgemeinen in Konzentrationen von höchstens 10 Gew% in der Reaktionslösung eingesetzt.
Als Aktivator kommen ein Alkohol, ein Detergens oder ein Protein oder Mischungen solcher Verbindungen in Frage.
Unter Alkohol sind aliphatische oder aromatische Alkohole zu verstehen. Aromatische Alkohole sind bevorzugt solche, die eine Phenylgruppe enthalten, wie Benzyl-, Phenylethylalkohol. Aliphatische Alkohole sind solche mit 3 bis 22 C-Atomen, etwa Propanol, Butanol, Hexanol, Dodecanol, Eicosanol oder deren Isomeren wie iso-Propanol, iso-Pentanol, 2-Ethyl-hexanol. Besonders bevorzugt sind aliphatische Alkohole, ganz bevorzugt solche mit 3 bis 16 und überaus bevorzugt solche mit 3 bis 8 C-Atomen. Bevorzugte Alkohole sind einwertige Alkohole und solche, die wasserlöslich sind.
Ein Detergens ist eine oberflächenaktive Substanz. Detergentien und deren Herstellung sind allgemein bekannt. Bevorzugt ist unter Detergens ein ionisches Detergens, besonders bevorzugt ein solches mit saurem Charakter oder dessen Salze zu verstehen. Ganz besonders bevorzugt sind Alkyl- oder Arylsulfonsäuren oder deren Salze, beispielsweise Natriumdodecylsulfat.
Ein Protein ist ein Makropeptid mit mehr als 100 Aminosäuren, das in Wasser oder in wäßrigen Systemen löslich ist, bevorzugt ein globuläres Protein, wie ein Plasma-, Milch-, Eier- oder Samenprotein, beispielsweise Albumine, Globuline. Als Protein kommt aber etwa auch ein Enzym mit der Raumstruktur einer Protease, beispielsweise Trypsin in Betracht, wobei sich gezeigt hat, daß die aktivitätssteigernde Wirkung des Enzyms auf die Lipase nicht auf die enzymatische Wirkungsweise des verwendeten Enzyms zurückzuführen ist.
Bevorzugt wird als Protein ein solches mit der Raumstruktur einer Protease eingesetzt.
Die Konzentration der Lipase in der Aktivierungsmischung hängt im wesentlichen von deren Löslichkeit im wäßrigen Verdünnungsmittel ab und ist im allgemeinen nicht kritisch. In Versuchen wurden Konzentrationen von 0,01 bis 10 Gew. % angewandt.
Der Aktivator wird entweder in einem wäßrigen Verdünnungsmittel wie oben angegeben gelöst oder als solcher der Aktivierungsmischung zugegeben. Unter hoher Aktivatorkonzentration in der Aktivierungsmischung ist gemeint, daß die Konzentration des Aktivators in der Aktivierungsmischung bedeutend höher sein muß, als dies in der enzymatischen Reaktionslösung, in der die aktivierte Lipase eingesetzt wird, der Fall zu sein braucht. Die geeignete Konzentration des Aktivators in der Aktivierungsmischung kann durch einfache Vorversuche mit Hilfe einer Verdünnungsreihe und/oder durch verschieden lange Einwirkzeiten des Aktivators und jeweilige Aktivitätsmessung der behandelten Lipase leicht bestimmt werden. Es hat sich gezeigt, daß für jeden Aktivator eine bestimmte Konzentration oder eine bestimmte Einwirkzeit des Aktivators auf die Lipase nicht unterschritten werden darf, da sonst keine Aktivierung der Lipase eintritt. Eine zu hohe Konzentration oder eine zu lange Einwirkzeit des Aktivators kann hingegen zur völligen Desaktivierung der Lipase führen.
Im Fall von Butanol oder iso-Propanol als Aktivator hat sich gezeigt, daß eine Konzentration des Alkohols von etwa 15 bis 65 Gew% in der Aktivierungsmischung hervorragende Ergebnisse bezüglich der Aktivitätssteigerung der Lipase liefert.
Natriumdodecylsulfat als Detergens wird optimal in Konzentrationen von etwa 0,02 bis 0,2 Gew% in der Aktivierungsmischung eingesetzt.
Bei Trypsin als Protein wurde in Vorversuchen festgestellt, daß eine Konzentration von 0,1 bis 1,0 Gew% in der Aktivierungsmischung vorteilhaft ist.
Die Aktivierungsmischung, die die Lipase und den Aktivator in wäßriger Verdünnung enthält, wird, bevorzugt bei Raumtemperatur, kurzzeitig, das heißt etwa 0,5 Minuten bis etwa 1 Stunde, bevorzugt 1 bis 30 Minuten, geschüttelt oder gerührt. Wird der Aktivator in der geeigneten Konzentration eingesetzt, tritt unerwarteterweise eine Aktivitätssteigerung der Lipase ein.
Es hat sich dabei herausgestellt, daß beim Einsatz einer sehr stark verdünnten Aktivatorlösung als enzymatische Reaktionlösung oder nach dem Entfernen des Aktivators aus der Aktivierungsmischung durch 3
AT 401 652 B beispielsweise Dialyse, Ultrafiltration, Lyophilisierung die Aktivität der aktivierten Lipase genauso hoch bleibt, wie in einer Aktivierungsmischung, in der der Aktivator in der zur Aktivierung nötigen hohen Konzentration anwesend ist. Diese offensichtliche Stabilität der Aktivierung, die auch dann aufrecht bleibt, wenn der Aktivator in der enzymatischen Reaktionsmischung nicht mehr, oder nur mehr in sehr verdünnter Form anwesend ist, ist dabei völlig unerwartet, insbesonders deshalb, weil zur Aktivierung der Lipase eine geringe Aktivatorkonzentration nicht ausreicht. Wie bereits beschrieben, darf nämlich eine bestimmte Aktivatorkonzentration nicht unterschritten werden, da es sonst nicht zu einer Aktivierung der Lipase kommt. Eine mögliche Erklärung dieses Phänomens könnte sein, daß bei der Aktivierung eine Konformationsände-rung von Peptidketten in der Lipase, die sich in geänderten Fluoreszenzeigenschaften der Lipase äußert, eintritt, wodurch dem Substrat bei der enzymatischen Reaktion der Lipase ein besserer Zugang zum aktiven Zentrum ermöglicht wird.
Die erfindungsgemäß aktivierte Lipase, die ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist, ist als Biokatalysator mit erhöhter Aktivität gegenüber einer nicht aktivierten Lipase in üblichen enzymatischen Reaktionen, die mit Hilfe einer Lipase katalysierbar sind, einsetzbar, wodurch Lipase eingespart oder die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion erhöht werden kann. Das Verfahren stellt daher eine Bereicherung der Technik dar.
Beispiel 1
Von einer Candida rugosa Lipase OF der Fa. Meito wurde durch 2 minütiges Schütteln in 0.1 m Natriumphosphatpuffer, pH 5 und Abzentrifugieren von ungelösten Substanzen einen 3gew%ige wäßrige Lösung hergestellt. 500 ul dieser Lösung wurden mit 400 ul Isopropanol 1 Minute bei Raumtemperatur geschüttelt. In gleicher Weise wurde die 3gew%ige Lösung der Lipase anstatt mit Isopropanol zu Vergleichszwecken mit Wasser behandelt. Von diesen Mischungen wurde je eine 1 : 50 Verdünnung mit Hilfe von Natriumphosphatpuffer hergestellt. Die Aktivität der Lipasen in diesen Verdünnungen bei der Hydrolyse von p-Nitrophenylbutyrat wurde gemessen und verglichen. Dazu wurden 23 ul p-Nitrophenylbutyrat mit 5 ml einer 1gew%igen Polyvinylalkohollösung geschüttelt, abzentrifugiert und der Überstand verwendet. 200 ul des Überstandes wurden mit 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7) gemischt. Dazu wurden je 25 ul der auf 1 : 50 aktivierten und der nicht aktivierten Lipase zugegeben. Die Reaktionsmischungen wurden geschüttelt und die Absorptionsänderung bei 405 nm verfolgt.
Dabei ergab sich eine Aktivitätssteigung der aktivierten Lipase gegenüber der nicht aktivierten von 300 %.
Beispiel 2 wurde nach der im Beispiel 1 beschriebenen Art und Weise ausgeführt, wobei anstatt der Candida rugosa Lipase a) eine Pseudomonas fluorescens Lipase b) eine Geotrichum candidum Lipase verwendet wurde. Die Aktivitätssteigerung der aktivierten Lipase, die gemäß Beispiel 1 gemessen wurde, gegenüber einer nicht aktivierten Lipase betrug a) 500 % b) 200 %.
Beispiel 3 wurde wie Beispiel 1 durchgeführt, wobei anstatt Isopropanol 1-Butanol verwendet wurde. Dabei stieg die Aktivität der aktivierten Lipase gegenüber einer nicht aktivierten um 260 %.
Beispiel 4
Eine 3gew%ige Lösung der Candida rugosa OF Lipase, hergestellt wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde a) mit einer 0,125gew%igen wäßrigen Natriumdodecylsulfatlösung und b) zum Vergleich mit Wasser im Volumsverhältnis 1 : 1 gemischt und 1 Minute geschüttelt. Die Lipaselösungen gemäß a) und b) wurden mit Phosphatpuffer jeweils auf 1 : 50 verdünnt. Bei der Aktivitätsbestimmung gemäß Beispiel 1 ergab sich eine Aktivitätssteigerung der aktivierten Lipase gegenüber der nicht aktivierten um etwa 350 %. 4
Claims (8)
- AT 401 652 B Beispiel 5 Eine 0,025gew%ige Lösung einer Candida rugosa OF Lipase, hergestellt nach der im Beispiel 1 beschriebenen Methode, wurde mit einer 0,5gew%igen, wäßrigen Lösung von Trypsin aus Rinderpankreas (Boehringer-Mannheim) im Verhältnis 1:15 Minuten geschüttelt. 25 ul dieser Mischung wurden auf 1 : 20 mit Phosphatpuffer verdünnt. Gleichermaßen wurde mit einer wäßrigen Lösung des Trypsins, dessen enzymatische Aktivität durch Behandlung mit N-Tosyl-L-lysin-chlormethylketon (TLCK) inhibiert war, verfahren. Die Aktivitätsmessung, die gemäß Beispiel 1 durchgeführt wurde, zeigte für die Lipasen, die mit Trpysin und die mit inhibierten Trypsin aktiviert worden waren, eine Aktivitätssteigerung von etwa 250 % gegenüber einer nicht aktivierten Lipase. Beispiel 6 Candida rugosa Lipase wurde gemäß Beispiel 5 mit Trypsin aktiviert, wobei die Konzentration der wäßrigen Trypsinlösung, die zur Aktivierung verwendet wurde, variiert wurde. Bei der Aktivitätsmeßung gemäß Beispiel 1 wurde a) mit einer Trypsinkonzentration von 0,025 Gew.% nach 25 Minuten Aktivierung b) mit einer Trypsinkonzentration von 0,5 Gew.% nach 5 Minuten Aktivierung c) mit einer Trypsinkonzentration von 2 Gew.% nach 2 Minuten eine Aktivitätssteigerung von jeweils 250 % gegenüber einer nicht aktivierten Lipase festgestellt. Beispiel 7 Candida rugasa Lipase wurde nach der im Beispiel 1 beschriebenen Art und Weise aktiviert. Die Aktivatorkonzentration wurde in beiden Fällen durch Dialyse bzw. Ultrafiltration auf weniger als 0,001 Gew.% reduziert, und die Aktivitäten dieser Lipaselösungen gemäß Beispiel 1 wurden gemessen. Dabei wurde eine Aktivitätssteigerung der aktivierten Lipase gegenüber einer nicht aktivierten um 300% gemessen. Die Aktivität der Lipase war also durch Entfernung des Aktivators nicht vermindert worden. Patentansprüche 1. Verfahren zur Aktivitätssteigerungen einer Lipase beim Lösen und/oder Knüpfen von Bindungen eines Carbonsäurederivates, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lipase in einem wäßrigen Verdünnungsmittel mit einem Aktivator, ausgewählt aus einem Alkohol und/oder einem Detergens und/oder einem Protein, in geeigneter Konzentration in Kontakt gebracht wird, worauf der Aktivator stark verdünnt oder überhaupt entfernt wird und die derart behandelte Lipase in eine enzymatische Reaktion zum Lösen und/oder Knüpfen von Bindungen von Carbonsäurederivaten eingesetzt wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichent, daß als Lipase eine Lipase aus Pflanzen oder aus Pilzen aktiviert wird.
- 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Lipase eine Lipase aus Pilzen aktiviert wird.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Aktivator ein einwertiger Alkohol eingesetzt wird.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,daß als Aktivator ein aliphatischer Alkohol mit 3 bis 22 C-Atomen eingesetzt wird.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Aktivator ein ionisches Detergens mit saurem Charakter oder dessen Salz eingesetzt wird.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Aktivator ein globuläres Protein eingesetzt wird. 5 AT 401 652 B
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Aktivator ein Enzym mit der Raumstruktur einer Protease eingesetzt wird. 6
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Patent Citations (3)
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