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Das luteotropes Hormon (LH) und follikelstimulierendes Hormon (FSH) ausschüttende Releasinghormon LH-RH/FSH-RH der Struktur
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:(Biochem. Biophys. Res. Commun. 43,1334 [1971]) wurde bereits in vielen Positionen modifiziert. Dabei fand man, dass durch Ersatz von Gly in der Position 6 durch D-Alanin (Biochemistry 12, 4616 [1973]) oder durch Ersatz von Gly-NH2 in der Position 10 durch Äthylamid, Propylamid oder Isopropylamid (J. Med. Chem. l6, 1144 [1973]) die Aktivität gesteigert wird. Werden die beiden Modifikationen kombiniert, so erhält man Analoga mit noch stärkerer Wirkung (Biochem. Biophys. Res.
Commun. 57. 335 [1974]). Der erfolgreiche Austausch von Gly durch D-Aminosäuren wurde erstmals am Insulin gezeigt (Scientia Sinica XVI, 71 bis 78 [1973]).
Der Ersatz von Glycin in der Position 6 durch stärker lipophile D-Aminosäuren, wie z. B.
D-Valin, D-Leucin oder D-Prolin führte zu Analogen mit geringerer LH-RH-Wirkung (Abstracts of The Endocrine Society 55th Annual Meeting, [1973 ], S. A 145). Es war deshalb sehr überraschend, dass der Austausch von Glycin durch stark lipophile unnatürliche D-Aminosäuren, die eine tert. Butylgruppe enthalten, noch stärker wirksame Analoge als die bereits bekannten in 6-Stellung ausgetauschten Analoga ergab.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von neuen Peptiden der allgemeinen Formel
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worin X D-Ser (Bu ), D-Thr (But), D-Cys (But), D-Asp (OBut), D-Glu (OBut), D-Orn (Boc) oder D-Lys (Boc) und Y Glycinamid, eine NH-Alkylgruppe, in der der Alkylrest 1 bis 3 C-Atome enthält, bzw. den Cyclopropylrest darstellt und diese Gruppen gegebenenfalls durch OH oder Fluoratome substituiert sein können, und gegebenenfalls Leu7 durch Ser (But), Cys (But), Asp (OBut), Glu (OBut), Orn (Boc) oder Lys (Boc) ersetzt sein kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung dieser Peptide ist dadurch gekennzeichnet. dass man ein gegebenenfalls geschütztes Peptidderivat der allgemeinen Formel H-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y, (II)
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im alkalischen oder schwach sauren Medium abspaltbare Schutzgruppen abspaltet.
Besonders lang wirkende LH-RH-Analoga werden erhalten, wenn Leu neben der erfindungsgemäss vorgesehenen Modifikation in Position 6 durch Ser (But), Cys (But), Asp (OBut) oder Glu (OBut) ausgetauscht ist und/oder Y in der allgemeinen Formel (I) eine gegebenenfalls durch Fluor substituierte NH-Alkylgruppe von 2 bis 3 C-Atomen bedeutet.
Von grosser Bedeutung sind die erfindungsgemäss erhältlichen Peptide, bei denen für X D-Ser (Bu t), D-Thr (Bu t), D-Cys (Bu t), D-Glu (OBu") oder D-Asp (OBu ) steht. Diese Verbindungen sind oral wirksam ; oral wirksame Peptide dieser Kettenlänge waren bisher nicht bekannt. Das ist besonders überraschend, da die tert. Butyläther und tert. Butylester in saurem Medium instabil sind.
Bei der Synthese der neuen Peptide dürfen nur Methoden verwendet werden, unter denen die sauer leicht abspaltbaren tert. Butylreste in Position 6 nicht abgespalten werden.
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Beim erfindungsgemässen Verfahren wendet man vorzugsweise die ohne Racemisierung verlaufende Azidkupplung oder die DCC/1-Hydroxybenzotriazol- bzw. DCC/3-Hydroxy-4-oxo-3, 4-dihydro-1, 2, 3- - benzotriazin-Methode an. Man kann auch aktivierte Ester einsetzen.
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B.oxycarbonylrest (= Z-Rest) oder schwach sauer abspaltbare Gruppen, wie z. B. 2- (p-Diphenyl)-iso- propyloxycarbonyl-oder 2- (3, 5-Dimethoxyphenyl)-isopropyloxycarbonylrest an. Bei Derivaten, die Cys (But) enthalten, wird der Z-Rest unter Zusatz von Triäthylamin oder N-Äthylmorpholin abhydriert.
Die Guanidofunktion des Arginins kann bei der Bereitstellung von Vorstufenprodukten für das erfindungsgemässe Verfahren ungeschützt bleiben oder durch eine Nitrogruppe blockiert werden, welche bei der nächstfolgenden Hydrierung abgespalten wird. Sie kann aber auch durch sauer abspaltbare Schutzgruppen, wie dem Carbobenzoxyrest oder dem Tosylrest, blockiert werden, wobei die Schutzgruppen jedoch spätestens auf der Tetrapeptidstufe abgespalten werden müssen. Im Falle der Nitro- oder Tosylgruppe ist dies gut mit flüssigem HF/Anisol zu bewerkstelligen.
Das Gleiche gilt für einen intermediären Schutz der Amidgruppe durch den sauer abspaltbaren 4, 4'-Dimethoxybenzhydrylrest, der auch spätestens auf der Tetrapeptidstufe entweder mit Trifluoressigsäure/Anisol oder zusammen mit einer Guanidoschutzgruppe und/oder einer sauer abspaltbaren Aminogruppe mit HF/Anisol abgespalten wird.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen zeigen gegenüber den 6-Gly-, aber auch gegenüber den 6-D-Ala-Analogen im Ovulationstest und im Ascorbinsäuredepletionstest eine stärkere und längere Wirkung. Die überraschende orale Wirkung (Dosis 0, 01 bis 0, 2 mg/kg) der Verbindun-
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suffizienz die Ausschüttung des luteinisierenden und des follikelstimulierenden Hormons aus dem Hypophysenvorderlappen bewirken und werden deshalb zur Behandlung von weiblicher und männlicher Sterilität verwendet, soweit diese hypothalamisch-hypophysären Ursprungs ist. Eine weitere Anwendung der erfindungsgemäss erhältlichen Substanzen ist die Festlegung des Ovulationszeitpunktes bei der Frau. Kurz vor dem erwarteten Ovulationszeitpunkt kann durch Applikation der neuen Arzneimittel eine Ovulation sicher ausgelöst werden.
Das ist von Bedeutung für die Familienplanung sowohl nach der Methode Knaus-Ogino als auch für die künstliche Insemination.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen sind gelöst in physiologischer Kochsalzlösung intravenös, intramuskulär oder subcutan applizierbar, können intranasal in Form von Nasentropfen oder Nasenspray und auch oral angewendet werden.
Die bei verschiedenen Anwendungsarten bevorzugt angewendeten Dosierungen sind :
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<tb> intravenös <SEP> 20 <SEP> - <SEP> 1000 <SEP> ng/kg
<tb> subcutan <SEP> 20 <SEP> - <SEP> 2000 <SEP> ng/kg
<tb> intramuskulär <SEP> 20-10000 <SEP> ng/kg
<tb> intranasal <SEP> 100 <SEP> - <SEP> 50000 <SEP> ng/kg
<tb> peroral <SEP> 10000-200000 <SEP> ng/kg
<tb>
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:NO, Z-OH H---NH-Mbh NO.
ZNH-Mbh
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a) Z-Pro-Gly-NH-Mbh
Zu einer Lösung von 30, 5 g (0, 1 Mol) Z-Pro-Gly-NH2 und 24 g (0, 1 Mol) 4, 41-Dimethoxybenz- hydrol in 200 ml Eisessig gibt man 0, 5 ml konz. H2S04 und lässt einen Tag bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend wird mit 850 ml Wasser ein Öl ausgefällt, das im Laufe von 24 h kristallisiert. Die Substanz wird abfiltriert und in Essigester gelöst. Die Essigesterlösung wird zweimal mit gesättigter NaHCO3 -Lösung ausgeschüttelt, mit Na 2 S04 getrocknet und eingeengt. Der Rück-
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in Dimethylacetamid). b) H-Pro-Gly-NH-Mbh-HCl
45. g (84, 7 mMol) Z-Pro-Gly-NH-Mbh werden in Methanol katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben.
Ausbeute 33, 7 g (91, 5%), Schmp. 233OC. Eine Probe wurde zur Analyse
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Schmp. 236'C, [a]D = -24, 70 (c=l,13, 5 g HOBt in 200 ml Dimethylformamid gibt man bei 0 C 13 ml N-Äthylmorpholin und 22 g DCC. Man rührt 1 h bei 0 C und lässt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt, das Filtrat eingeengt und der Rückstand in Essigester aufgenommen. Die
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Essigesterphase wird mit gesättigter NaHCO , -Lösung, 2n H 2 SO 4, gesättigter NaHCO -Lösung und Wasser ausgeschüttelt, über Na 2 SO getrocknet und eingeengt. Mit Diisopropyläther wird die Substanz verrieben.
Zur weiteren Reinigung wird die Substanz in Essigester gelöst und über basisches AI 203 chromatographiert. Ausbeute 23, 05 g amorphe Substanz.
19, 2 g (40 mMol) oben gewonnener Substanz werden in 80 ml Dioxan gelöst. Dazu gibt man 16 ml Wasser und eine Spatelspitze Thymolphthalein. Unter Rühren lässt man In Natronlauge bis zur bleibenden Blaufärbung langsam zutropfen (Verbrauch 37, 7 ml). Nun wird neutralisiert, einge-
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e) H-Leu-Arg-Pro-Gly-NH,'2HF
6 g Z-Leu-Arg (NO.)-Pro-Gly-NH-Mbh und 12 ml Anisol werden mit 120 ml HF versetzt. Man rührt 1 h bei 0 C, zieht im Vakuum das HF ab und verteilt den Rückstand zwischen Wasser und Äther. Die ätherische Phase wird einmal mit Wasser ausgeschüttelt. Die vereinigten Wasserphasen werden mit Äther gewaschen und gefriergetrocknet.
Ausbeute 3, 35 g einer amorphen Substanz.
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f) H-D-Lys(Boc)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2#2HCl
Zu einer Lösung von 2, 4 g (5 mMol) H-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2#2HF und 675 mg HOBt in 5 ml Dimethylformamid gibt man bei 0 C 1, 3 ml N-Äthylmorpholin und 2, 8 g Z-D-Lys (Boc)-OTcp. Man lässt 3 h bei Raumtemperatur stehen, engt ein und verreibt den Rückstand zweimal mit gesättigter NaHCO 3-Lösung, löst in Methylenchlorid, trocknet über Na 2So4 und engt ein. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Ausbeute 3, 1 g (77%) amorphes Material.
Diese Substanz wird in Methanol katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Ausbeute 2, 67 g (74% bezogen auf Z-D-Lys (Boc)-OTcp) amorphes Material. Dünnschichtchromatographisch nicht einheitlich (verunreinigt durch 2 Nebenprodukte). g) H-Trp-Ser-Tyr-D-Lys (Boc)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2#2HCl
Zu einer Lösung von 2, 23 g (3,7 mMol) Z-Trp-Ser-Tyr-NH-NH2 in 25 ml Dimethylformamid gibt
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morpholin und 2, 67 g (3,7 mMOl) H-D-Lys(Boc)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 zu. Man lässt über Nacht im Kühlraum bei 4 C stehen, engt ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Es wird katalytisch hydriert und die Rohsubstanz an hydroxypropyliertem Dextrangel chromatographisch gereinigt.
Aus-
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in Wasser, filtriert von Unlöslichem und reinigt über Kunstharzionenaustauschern, enthaltend funktionelle Ammoniumgruppen, die an ein Styrol-Divinylbenzolcopolymeres gebunden sind, und Carboxymethylcellulose. Anschliessend wird noch über hydroxypropyliertes Dextrangel gereinigt. Aus-
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= -390 (c = 1, in Di-methylacetamid).
Beispiel 2 : a) Z-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 (MG 1125)
4, 51 g (7, 5mMol) Z-Trp-Ser-Tyr-NH-NH2 werden in 40 ml DMF/DMA (1 : 1) unter leichter
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morpholin (45 mMol) und eine Lösung von 4, 71 g (7,5 mMol) H-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5- - dihydrochlorid zu. Man rührt nun 1 Tag bei 0 bis 4 C, saugt den Niederschlag ab und versetzt das Filtrat mit 200 ml gesättigter NaCl-Lösung und 150 ml n-Butanol. Die Butanolphase wird zweimal mit 75 ml KHSO-Lösung und einmal mit 75 ml gesättigter NaHCO3-Lösung ausgeschüttelt und eingeengt. Der Rückstand wird mit Essigester verrieben.
Ausbeute : 7, 1 g ; Schmp. 131 bis 138 C.
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1 (c=l,b) H-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5-dihydrochlorid (MG 1064) 6, 8 g Z-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 werden unter Zugabe von etwas Dimethylformamid in Methanol gelöst und katalytisch hydriert (Pd/C). Nach 8 h wird der Katalysator abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird dreimal mit Wasser extrahiert, wobei mit Salzsäure jeweils auf PH 5 angesäuert wurde. Die vereinigten Wasserextrakte werden gefriergetrock-
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zu und rührt über Nacht. Anderntags wird wieder auf Hexapeptid geprüft. Die Reaktion ist nun meist vollständig. Nun gibt man 0,2 ml 80%iges Hydrazinhydrat zu und rührt 2 h bei Raumtemperatur.
Anschliessend wird der Niederschlag abgesaugt und das Filtrat zwischen 30 ml n-Butanol
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2n Essigsäure gelöst. Von Unlöslichem wird filtriert und das Filtrat an Kunstharzionenaustauschern, enthaltend funktionelle Ammoniumgruppen, die an ein Styrol-Divinylbenzolcopolymeres gebunden sind (Acetatform), in das Acetat umgewandelt. Das Eluat (Wasser oder stark verdünnte Essigsäure als Elutionsmittel) wird am Hochvakuum eingeengt oder besser gefriergetrocknet und anschliessend verteilungschromatographisch (Eisessig/n-Butanol/Wasser) an einer Sephadex 20-Säule (100 x 4 cm) gereinigt.
Ausbeute an gereinigtem Material : 430 mg.
Die Substanz enthält etwa 80% Peptidbase, zirka 10% Wasser und zirka 10% Essigsäure.
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