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Verfahren zur Bestimmung der konzeptionsfreien Zeit. bei der Frau und Mittel zur Durchführung des Verfahrens
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Ei befruchtet werden, weil dann sowohl die Aufwucherung der Gebärmutterschleimhaut als auch die Er- höhung der Zervikalschleimviskosität unvollkommen sind und eine Eibefruchtung nicht verhindert werden kann. Oberhalb dieses Wertes führen Sekundärovulationen nicht mehr zu einer Befruchtung des Eies. Es kann angenommen werden, dass die oben angegebenen Werte von 2, 5 mg bzw. 3, 5 ing Pregnandiolglukuronid/Tag im Harn 0, 0015 mg bzw. 0, 0021 mg Progesteron/cm Blut entsprechen. Letztere Werte er- geben sich aus folgenden Überlegungen : Das Umwandlungsverhältnis Progesteron/Pregnandiol, bei z.
B. intramuskulärer Verabreichung von Progesteron, liegt zwischen 8-22go. Für den vorliegenden Zweck muss aber aus Sicherheitsgründen eher mit dem oberenwert, also mit einer Ausscheidung von rund 20P/o des Pro- gesterons in Form von Pregnandiol im Urin gerechnet werden. Unter der Voraussetzung eines 24stündigen Abbauzyklus von Progesteron in Pregnandiol (dieses erscheint im allgemeinen schon 24 h nach der Ovula- tion im Harn) und eines Körpergewichtes von 60 kg, entsprechend 5, 2 l Blut, ergibt sich jener genannte
Wert für die Progesteronkonzentration im Blut von mindestens 0, 0015 mg/cm, im Mittel 0, 0021 mg/cm3, entsprechend 2, 5 bzw. 3, 5 mg Pregnandiolglukuronid/Tag im Urin.
Die mittlere Normalausscheidung liegt bei 8 - 9 mg/Tag für Pregnandiolglukuronid, was einem Progesterongehalt von 0, 005 mg/cm Blut äquivalent ist.
Unter Zugrundelegung dieser Werte lässt sich wie gefunden wurde, die Funktionstüchtigkeit des Gelb- körpers und damit die konzeptionsfreie Zeit der Frau auf jeden Fall mit ausreichender Sicherheit nach- weisen, da die geringen aus dem Nebennierenrindenstoffwechsel stammenden (Umwandlung des Desoxy- corticosterons in Progesteron) sowie die schon präovulativ im ungeplatzten Follikel allfällig erzeugten
Mengen an Progesteron bzw. Pregnandiol und berücksichtigt sind.
Die Erfindung bezweckt nun die Schaffung eines Verfahrens zur Bestimmung der konzeptionsfreien
Zeit bei der Frau unter Ausnutzung der aufgefundenen Werte der Mindestkonzentration von Pregnandiol- glukuronid im Harn bzw. von Progesteron im Blut, bei welcher ein funktionstüchtiger Gelbkörper vorhan- den ist. Im Rahmen dieses Verfahrens soll mindestens ein aus dem Harn isoliertes Progesteron-Abbaupro- dukt mit einer Substanz zur Reaktion gebracht werden, die mit Steroiden oder glukuroniden Molekülen eine Farbreaktion liefert. Solche Reaktionen sind bereits bekannt ; besitzen jedoch den Nachteil, dass für deren Durchführung komplizierte Einrichtungen erforderlich sind, dass sie viel Zeit beanspruchen und gut geschultes Personal zur Voraussetzung haben.
Es ist deshalb Ziel der Erfindung, solche Verfahren zur Be- stimmung von Progesteron-Abbauprodukten im Harn so durchzubilden, dass ungeschulte Personen in kür- zester Zeit mit geringstem Aufwand in der Lage sind, festzustellen, ob im Harn bzw. im Blut die für die konzeptionsfreie Zeit der Frau typische Mindestmenge an Pregnandiolglukuronid bzw. Progesteron enthal- ten ist.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Bestimmung der konzeptionsfreien Zeit bei der Frau durch
Bestimmung der Höhe des Progesteronspiegels in der Weise, dass mindestens ein aus dem Harn isoliertes
Progesteron-Abbauprodukt mit einer Substanz in Reaktion gebracht wird, die mit steroiden oder glukuro- niden Molekülen eine Farbreaktion liefert, ist dementsprechend dadurch gekennzeichnet, dass die Emp- findlichkeitsschwelle der Reaktion auf einer oder mehreren der Verfahrensstufen, insbesondere durch
Steuerung des Extraktions- bzw. Adsorptions- und Fällungsgleichgewichtes bzw.
Farbkompensation oder teilweise Farbadsorption so eingestellt wird. dass sie nur die Bestimmung eines solchen Hormonspiegels gestattet, der über einem Schwellenwert von mindestens 0, 0015 mg physiologisch äquivalentem Pro- gesteron/cms Blut oder über mindestens 2, 5 mg äquivalentem Pregnandiolglukuronid/Tag im Harn liegt.
Die Empfindlichkeitsschwelle irgendwelcher bekannter Verfahren zur Bestimmung des Pregnandiol- glukuronids bzw. des Progesterons lässt sich z. B. dadurch einfach einstellen, dass die Sichtbarkeit der Farb- reaktion bis zur vorgeschriebenen Grenze aufgehoben wird. Dies lässt sich wiederum dadurch erreichen, dass entweder durch beschränkte stöchiometrische Umsetzung nur so viel des reagierenden Stoffes in die
Farbreaktion aufgenommen wird, dass diese erst beim Schwellenwert infolge ihrer eigenen Empfindlich- keitsgrenze anspricht (z. B. Verwendung schlechter Lösungsmittel, damit nur ein Teil des reagierenden
Stoffes in Lösung geht). oder aber indem die Farbreaktion selbst durch chemisch oder physikalisch wirken- de Zusätze gehemmt wird.
Solche Zusätze können oxydierende oder reduzierende (bleichende) und auch komplexbildende Stoffe sein, die den entsprechenden Farbanteil maskieren, aber auch Adsorptions- oder
Fällungsmittel, die den Schwellenwert-Anteil in sich aufnehmen oder ausfällen, oder Komplementärfar- ben, die den Schwellenwert-Anteil kompensieren.
Die heute bekannten Verfahren zur Bestimmung von Progesteron im Blut bzw. seinen Abbauprodukten und speziell Pregnandiol im Harn sind für die Geburtenkontrolle praktisch unbrauchbar und eignen sich nur für klinisch-diagnostische Zwecke. Sie sind durchwegs umständlich, verlangen teure Apparaturen und hochqualifiziertes PersonaL Darüber hinaus liefern sie allesamt die Resultate mit so grosser Versp1ì. tung, dass an eine praktische Anwendung ohne bedeutende Modifikationen gar nicht zu denken ist. Das Verfahren
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nach der Erfindung vermeidet diese Nachteile. Da der Nachweis der empfängnisfreien Zeit keine quantita- tive Hormonbestimmung erfordert, sondern nur die Feststellung eines Minimal-Hormonspiegels in halb- quantitativer Weise, ist durch die Erfindung ein einfaches, rasch durchführbares Verfahren entwickelt worden.
Ein Mittel zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann nunmehr einfach so beschaffen sein, dass die erforderlichen Reagenzien in den zur einmaligen Ausführung der Reaktion dienenden Men- gen gebrauchsfertig abgepackt und zu einem Reagenziensatz in einer Packung vereinigt sind.
Die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird nachfolgend in einer für den Pregnandiol-
Pregnanolon-Komplex bevorzugten Ausführung rein beispielsweise beschrieben :
Beispiel : Der nach 8-10stündigem Schlaf anfallende Morgenharn, dessen Menge selten 700 cm3 übersteigt, wird nötigenfalls mit Wasser auf 700 cm3 eingestellt und mit Kochsalz abgesättigt.
Der Preg- nandiolkomplexwird durch Extraktion vom Urin wie folgt in einem einfachen Gerät isoliert : Die mit Koch- salz gesättigten 700 cm3 Harn werden durch eine feine Düse (max. 0, 6 mm Durchmesser ; Durchflussmen- ge max. 22 cm3/min) in frei fallendem Strahl aus etwa 4 cm Höhe in eine Lösungsmittelschicht abfliessen gelassen (Durchmesser der Schicht vorteilhaft nicht über 11 mm, Länge zirka 20 cm), welche aus zwei
Komponenten mit für den Pregnandiolkomplex verschiedenem Lösungsvermögen besteht, nämlich 9 cm3 einer Mischung von Butyl- und Amylalkohol im Volumenverhältnis 2 :
1 (der Pregnandiolkomplex ist in
Amylalkohol schlecht löslich ; durch entsprechendes Mischungsverhältnis kann ein Teil des Schwellenwert- anteiles des Pregnandiolglukuronides von mindestens 2,5 mg in der untersuchten Harnmenge schon in der
Extraktionsstufe nicht erfasst werden). Das Auswaschen des Extraktes erfolgt in gleicher Weise wie das Ex- trahieren, wobei als Waschflüssigkeit eine Mischung von 40 cm3 Wasser mit 5 cm3 eines Äther-Butylalko- hol-Gemisches (Volumenverhältnis 5 : 1) und 0, 05 g Ammoniak verwendet wurde. Durch Nachwaschen des Extraktes mit 35-40 cm3 gesättigter Kochsalzlösung wird der restliche Ammoniak entfernt und der
Extrakt weitgehend entwässert.
Zur Ausfällung des Pregnandiolglukuronides aus dem gereinigten Extrakt wird dieser in einem trockenen Gefäss mit 0, 3 g Silicagel von 0,2 bis l, 0 mm Korngrösse, das mit rund 25 mg Bariumacetat imprägniert ist, geschüttelt. Hiebei wird ein Teil des Pregnandiolglukuronides vom Silicagel adsorbiert, während ein anderer Teil als Barium-Pregnandiolglukuronid in der flüssigen Phase suspendiert wird.
Durch Umleeren der Flüssigkeit in ein zweites Gefäss wird die feine Suspension vom grobkörnigen Silicagel abgetrennt. (Je nach der Stärke der Imprägnierung des Silicagel mit Bariumacetat wird mehr oder weniger Barium-Pregnandiolglukuronid gefällt, so dass auch in der Fällungsstufe ein Teil des Schwellenwertanteiles von 2, 5 mg Pregnandiol in der untersuchten Harnmenge mcnt erfasst zu werden braucht.)
Nach dem Absitzenlassen der feinen Suspension von Barium-Pregnandiolglukuronid wird die überstehende Flüssigkeit entfernt, worauf der Niederschlag in 2, 5 cm3 Salzsäure, im Verhältnis 3 : 2 mit Wasser verdünnt, gelöst wird und der Lösung 0, 5 cm3 einer alkoholischen Lösung von 2 bis 3 mg Naphthoresorcin als Farbentwickler zugesetzt werden.
Zur Erhöhung der Haltbarkeit der alkoholischen Lösung des Farbentwicklers kann diese durch Kochen entlüftet und mit CO. gesättigt worden sein und zum Schutz gegen Oxydation einen Zusatz von Hydrochinon od. dgl. enthalten. Zwecks Farbentwicklung wird 1 min lang gekocht, wobei eine rotviolette Färbung entsteht.
Nach Abkühlung wird die Reaktionslösung mit 1, 5 cm3 Benzol, das 0, 012 mg Anilin-Fettgrün (CIBA) als Farbkompensator enthält, geschüttelt. Der dabei vom Benzol ausgezogene rotviolette Farbstoff wird vom Anilingrün so weit zu farblos komplementiert, dass nur eine den Schwellenwert von 2, 5 mg Pregnandiolglukuronid in der untersuchten Harnmenge übersteigende Menge an Pregnandiolglukuronid eine rotviolette Färbung erzeugen kann.
Eine rotviolette Färbung der Lösung ist die Indikation für die empfängnisfreie Zeit. Bleibt die Lösung grün, wasserklar oder gelb bis'bräunlich, so ist entweder gar keine oder eine ungenügende Gelbkörperaktivität und infolgedessen Empfängnisgefahr vorhanden. In diesem Fall wird die Analyse 2-3 Tage später wiederholt, bis die rotviolette Färbung erscheint. Normalerweise wird das Verfahren monatlich nur 1-2mal durchgeführt, wobei die erste Analyse bei 28-30tätigem Zyklus am 17.-18. Zyklustag durchzuführen ist. Die eigentliche Arbeitszeit zur Vornahme der Bestimmung beträgt etwa 15 min.
Die gesamte Durchführungsdauer einschliesslich Harnsammlung höchstens einige Stunden (gegenüber einigen Stunden Arbeitszeit und einigen Tagen Durchführungsdauer bei bekannten Verfahren zur Pregnandiolbestimmung).
Zur raschen und zuverlässigen Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens durch Laien können die Mittel, d. h. die notwendigen Chemikalien, Lösungsmittel, Reagenzien, Farbstoffe usw., als für je eine Bestimmung gebrauchsfertig dosierte Packungen zubereitet werden. Diese Packungen bestehen zweckmässig aus Ampullen, Röhrchen u. dgl. aus Glas oder Kunststoff sowie z. B. abgeschweissten Plastikschläuchen
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usw. Solche für je eine Bestimmung kombinierten Packungen ersparen nicht nur das lästige Abmessen der einzelnen Portionen, sondern gewährleisten auch eine grössere Haltbarkeit als z. B. immer wieder zu öffnende Flaschen.
Eine bevorzugte Form eines solchen Mittels bzw. einer Packungskombination zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens umfasst rein beispielsweise :
1. Ein Extraktionsmittel, bestehend aus 9 cm3 einer Mischung von Butyl-und Amylalkohol im Volumenverhältnis 2 : 1.
2. Eine Waschflüssigkeit für den Extrakt, bestehend aus 5 cm3 einer Mischung von Äther und Butylalkohol im Volumenverhältnis von 5 : 1 mit einem Zusatz von 0, 05 g Ammoniak.
3. Ein Fällungsmittel. bestehend aus 0,3 g Silicagel von 0, 2 bis l, 0 mm Korngrösse, mit etwa 25 mg Bariumacetat imprägniert.
4. Eine Säure, bestehend aus 2,5 cm3 von 3 Teilen Salzsäure und 2 Teilen Wasser.
5. Ein Farbentwickler, bestehend aus 2-3 mg Naphthoresorcin, gelöst in 0,5 cm3 Propylalkohol, der
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chinon zugesetzt wurde.
6. Ein Farbkompensationsmittel, bestehend aus 0,012 mg eines grünen Farbstoffes (Anilin-Fettgrün CIBA), gelöst in l, 5 cm3 Benzol.
Diese Mittel besitzen insgesamt ein Volumen von weniger als 20 ems, also nur einen geringen Bruch- teil des Volumens, der bisher z. B. zur Pregnandiolbestimmung benötigten Chemikalien.
Das Verfahren zur Bestimmung der konzeptionsfreien Zeit bei der Frau gemäss der Erfindung wurde von 128 Ehepaaren während einer Gesamtzeit von rund 63 Jahren praktisch angewendet. Die Ergebnisse zeigten, dass das Versagerrisiko dieser neuen Art der Geburtenregelung 8-10mal kleiner ist als bei den besten heute bekannten Verhütungsmitteln.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur. Bestimmung der konzeptionsfreien Zeit bei der Frau durch Bestimmung der Höhe des Progesteronspiegels in der Weise, dass mindestens ein aus dem Harn isoliertes Progesteron-Abbauprodukt mit einer Substanz in Reaktion gebracht wird, die mit steroiden oder glukuroniden Molekülen eine Farbreaktion liefert, dadurch gekennzeichnet, dass die Empfindlichkeitsschwelle der Reaktion auf einer oder mehreren der Verfahrensstufen, insbesondere durch Steuerung des Extraktions- bzw. Adsorptions- und Fällungsgleichgewichtes bzw.
Farbkompensation oder teilweise Farbstoffadsorption so eingestellt wird, dass sie nur die Bestimmung eines solchen Hormonspiegels gestattet, der über einem Schwellenwert von mindestens 0, 0015 mg physiologisch äquivalentem Progesteron/cm Blut oder über mindestens 2, 5 mg äquivalentem Pregnandiolglukuronid/Tag im Harn liegt.