PL204525B1 - Związki chinazolinowe , ich zastosowanie oraz kompozycje farmaceutyczne zawierające te związki - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są związki chinazolinowe. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie tych związków. Dalszym przedmiotem wynalazku są kompozycje farmaceutyczne zawierające te związki.

Zainteresowanie medycznym zastosowaniem pochodnych chinazoliny rozpoczęło się we wczesnych latach pięćdziesiątych od wyjaśnienia budowy alkaloidu chinazoliny, 3-e-keto-gamma-(3-hydroksy-2-piperydylo)-propylo]-4-chinazolonu, pochodzącego z azjatyckiej rośliny o właściwościach przeciwmalarycznych. W wyniku poszukiwania innych środków przeciwmalarycznych, zsyntetyzowano różne podstawione chinazoliny. Szczególne znaczenie miała synteza pochodnej 2-metylo-3-o-tolilo-4-(3H)-chinazolonu. Ten związek, znany jako metakwalon, pomimo braku oddziaływania na pierwotniaki, wykazał skuteczne działanie nasenne.

Od tej pory badano czynność farmakologiczną chinazolonów i ich pochodnych. Obecnie wiadomo, że działają one nasennie, uspokajająco, przeciwbólowo, przeciwdrgawkowo, przeciwkaszlowo i przeciwzapalnie.

Poszczególne zastosowania pochodnych chinazolinowych przedstawiono w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych AP: nr 5,147,875, gdzie ujawniono czynność 2-(podstawiony fenyl)-4-oksochinazoliny jako leku rozszerzającego oskrzela; nr 3,723,432; nr 3,740,442 i nr 3,925,548, gdzie opisano grupę pochodnych typu 1-podstawnik-4-arylo-2(1H)-chinazolon, stosowanych jako środki przeciwzapalne. W europejskich opisach patentowych przedstawiono inne przykłady, a mianowicie: EP 0 056 637 B1 - grupa pochodnych 4(3H)-chinazolonu do leczenia nadciśnienia; EP 0 884 319 A1 kompozycje 4 - chinazolonu do leczenia zaburzeń w centralnym i obwodowym układzie nerwowym, o charakterze zwyrodnieniowym, oraz wywołanych przez środki psychotropowe, narkotyki i alkohol.

Chinazolony zaliczają się do rosnącej grupy środków do leczenia chorób związanych z rozrostem komórek, w tym raka. Przykładowo, w zgłoszeniu PCT pod nr WO 96/06616 opisano kompozycję farmaceutyczną zawierającą pochodną chinazolinową do zahamowania rozrostu miękkich komórek naczyniowych, a w zgłoszeniu PCT pod nr WO 96/19224 - komórek mezangialnych. W opisach patentowych Stanów Zjednoczonych AP nr 4,981,856; nr 5,081,124 i nr 5,280,027 ujawniono pochodne chinazolinowe działające jako inhibitory syntazy tymidylanowej, tj. enzymu katalizującego metylowanie monofosforanu dezoksyurydyny, prowadzące do wytwarzania monofosforanu tymidyny, potrzebnego do syntezy DNA. W opisach patentowych Stanów Zjednoczonych AP nr 5,747,498 i nr 5,773,476 przedstawiono pochodne tego rodzaju stosowane do leczenia nowotworów charakteryzujących się nadczynnością lub nieodpowiednią czynnością kinazowych receptorów tyrozyny. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych AP nr 5,037,829 ujawniono kompozycje chinazoliny z podstawieniem typu (1H-1-azolilometylo) do leczenia raka w komórkach nabłonkowych; w zgłoszeniu PCT pod nr WO 98/34613 - pochodne do wzmacniania ponownego unaczyniania i leczenia złośliwości; a w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych AP nr 5,187,167 - pochodne 4 - chinazolonu o czynności przeciwnowotworowej.

Innymi środkami do leczenia raka są alkaloidy taksanowe i vinca. Działają one na mikrokanaliki, znajdujące się w strukturze komórek. Mikrokanaliki są podstawowym elementem budowy wrzeciona mitotycznego, które jest odpowiedzialne za dostarczanie replikowanych kopii genomu do każdej z dwóch komórek potomnych powstających przy podziale komórki. Przyjmuje się, że uszkodzenie wrzeciona mitotycznego przez te leki powoduje zahamowanie podziału komórek rakowych i wywołuje ich śmierć. Ponieważ mikrokanaliki tworzą także inne rodzaje struktur komórkowych, jak ścieżki do transportu wewnątrzkomórkowego w procesach nerwowych, a oddziaływanie wspomnianych środków nie ogranicza się tylko do wrzecion mitotycznych, mamy do czynienia z efektami ubocznymi, które zmniejszają użyteczność leków.

Poprawa specyficzności działania środków stosowanych do leczenia raka jest bardzo istotna z powodu korzyści terapeutycznych możliwych do uzyskania przy ograniczeniu ubocznych efektów ich podawania. Znaczną poprawę w leczeniu raka uzyskiwano tradycyjnie w wyniku identyfikacji środków leczniczych o nowym mechanizmie działania. Dotyczy to nie tylko taksanów, ale także inhibitorów topoizomerazy I z grupy kamptotecyny. Z obu tych względów, mitotyczne kinezyny są interesującymi obiektami dla nowych środków przeciwrakowych.

Mitotyczne kinezyny są podstawowymi enzymami dla budowy i działania wrzeciona mitotycznego, ale nie stanowią w zasadzie części innych struktur mikrokanalikowych, jak np. w procesach nerwowych. Odgrywają one zasadniczą rolę we wszystkich fazach mitozy jako cząsteczkowe motory

PL 204 525 B1 przetwarzające energię, uwalnianą przez hydrolizę adenozynotrójfosforanu, w mechaniczną siłę, powodującą ukierunkowany ruch ładunków cząsteczkowych wzdłuż mikrokanalików. Katalityczna domena odpowiednia do wykonania tego zadania jest zwartą strukturą około 340 aminokwasów. W czasie mitozy, kinezyny porządkują mikrokanaliki w dwubiegunową strukturę, która jest wrzecionem mitotycznym. Kinezyny pośredniczą w ruchu chromosomów w mikrokanalikach wrzeciona, jak również w strukturalnych zmianach we wrzecionie, zachodzących w określonych fazach mitozy. Eksperymentalne zakłócenie działania mitotycznych kinezyn wywołuje nieodpowiednie uformowanie się lub dysfunkcję wrzeciona mitotycznego, czasem prowadzącą do zahamowania cyklu komórkowego i zagłady komórki.

Jedną ze zidentyfikowanych kinezyn mitotycznych jest KSP. KSP należy do ewolucyjnie zachowanej podrodziny kinezyn z napędami mikrokanalikowymi skierowanymi do bieguna dodatniego, które tworzą dwubiegunowe homotetramery złożone z antyrównoległych homodimerów. W czasie mitozy KSP wiąże się z mikrokanalikami wrzeciona mitotycznego.

Wstrzyknięcie przeciwciał dla KSP do komórek ludzkich zapobiega oddzielaniu się bieguna w czasie prometafazy, zwiększając przyrost wrzecion jednobiegunowych i powodując zahamowanie mitozy oraz wywołując śmierć komórek. W organizmach innych niż ludzkie, KSP i inne kinezyny powodują łączenie antyrównoległych mikrokanalików i przesuwanie się ich względem siebie, co prowadzi do rozdzielenia biegunów wrzeciona. KSP może również uczestniczyć w wydłużaniu wrzeciona w czasie anafazy B i ogniskowaniu się mikrokanalików na biegunie wrzeciona.

Ludzką KSP (zwaną także HsEg5) opisano w literaturze [Blangy i in., Cell, 83:1159-69 (1995); Whitehead i in., Arthritis Rheum., 39:1635-42 (1996); Galgio i in., J. Cell. Biol., 135:339-414 (1996); Blangy i in., J. Biol. Chem., 272:19418-24 (1997); Blangy i in., Cell Motil Cytoskeleton, 40:174-82 (1998); Whitehead i Rattner, J. Cell. Sci, 111: 2551-61 (1998); Kaiser i in., JBC 274:18925-31 (1999); GenBank accession numbers: X85137, NM004523 i U37426], a fragment genu KSP (TRIP5) opisano w [Lee i in., Mol Endocrinol., 9:243-54 (1995); GenBank accession number L40372]. Doniesiono takż e o homologach Xenopus KSP (Eg5) i Drosophila KLP61 F / KRP1 30.

Mitotyczne kinezyny są atrakcyjnymi obiektami dla odkrywania i rozwijania nowych mitotycznych chemoterapeutyków. W związku z tym celem wynalazku jest uzyskanie nowych związków użytecznych dla inhibicji mitotycznej kinezyny KSP.

Cel ten zrealizowano w rozwiązaniu według wynalazku przez uzyskanie i sprawdzenie działania związków chinazolinowych o wzorze:

lub ich soli akceptowalnych farmaceutycznie, w których grupa izopropylowa jest dołączona w konfiguracji R; R1 jest grupą benzylową, chlobenzylową, metylobenzylową, metoksybenzylową, cyjanobenzylową lub hydroksybenzylową; R2 jest chlorowcem lub grupą cyjanową; a R3 jest grupą fenylową, podstawioną metylem i/lub chlorowcem.

Szczególnie użyteczne są powyższe związki lub sole w postaci istotnie czystych optycznych izomerów R.

W korzystnym rozwiązaniu wynalazku R1 jest grupą benzylową .

W innym korzystnym rozwiązaniu R2 jest chlorem.

W dalszym korzystnym rozwią zaniu R1 jest grupą benzylową R2 jest chlorem, a R3 jest grupą 4-metylofenylową, przy czym szczególnie korzystne jest ich działanie w postaci istotnie czystych optycznych izomerów R.

Kolejnym przedmiotem wynalazku realizującym postawiony cel jest zastosowanie związków chinazolinowych o wzorze:

PL 204 525 B1

lub ich soli akceptowalnych farmaceutycznie, w których grupa izopropylowa jest dołączona w konfiguracji R; R1 jest grupą benzylową, chlobenzylową, metylobenzylową, metoksybenzylową, cyjanobenzylową lub hydroksybenzylową; R2 jest chlorowcem lub grupą cyjanową; a R3 jest grupą fenylową podstawioną metylem i/lub chlorowcem; korzystnie w postaci istotnie czystych optycznych izomerów R; jako środków farmaceutycznych.

Zastosowanie to dotyczy zwłaszcza środków farmaceutycznych przeznaczonych do leczenia chorób związanych z rozrostem komórek.

W korzystnym zastosowaniu środki farmaceutyczne przeznaczone są do leczenia raka, rozrostów, nawrotu zwężenia, przerostu serca, chorób układu immunologicznego lub zapaleń.

Cel wynalazku realizują również kompozycje farmaceutyczne, charakteryzujące się tym, że zawierają związki chinazolinowe o wzorze:

lub ich sole akceptowalne farmaceutycznie, w których grupa izopropylowa jest dołączona w konfiguracji R; R1 jest grupą benzylową, chlobenzylową, metylobenzylową, metoksybenzylową, cyjanobenzylową lub hydroksybenzylową; R2 jest chlorowcem lub grupą cyjanową; a R3 jest grupą fenylową podstawioną metylem i/lub chlorowcem; korzystnie w postaci istotnie czystych optycznych izomerów R; oraz nośniki.

W zakresie sposobów skriningu związków, które wiążą się do kinezyny KSP, na przykład związków, które wypierają lub konkurują z wiązaniem związków według wynalazku stosuje się łączenie znaczonego związku według wynalazku, kinezyny KSP i przynajmniej jednego związku konkurującego, a następnie określanie wiązania bioaktywnego środka kandydującego do kinezyny KSP.

Do skriningu modulatorów czynności kinezyny KSP stosuje się łączenie kompozycji według wynalazku, kinezyny KSP i przynajmniej jednego związku konkurującego, a następnie określanie wpływu bioaktywnego środka kandydującego na czynność kinezyny KSP.

Wynalazek jest dodatkowo objaśniony na rysunku, w którym:

fig. 1 przedstawia ogólny schemat syntezy kompozycji według wynalazku, fig. 2 - drogę syntezy pokrewnych chinazolinowych inhibitorów KSP, fig. 3 - drogę syntezy istotnie czystych pojedynczych enancjomerów, fig. 4 - drogę syntezy związków według wynalazku.

Wynalazek dotyczy zatem grupy nowych związków, opartych na podstawowej strukturze chinazolinowej, które są modulatorami mitotycznych kinezyn. Poprzez inhibicję lub modulację mitotycznych kinezyn, nie dotyczącą innych kinezyn (np. kinezyn transportowych), uzyskuje się specyficzną inhibicję rozrostu komórkowego. Wynalazek opiera się na odkryciu, że zakłócenie działania mitotycznej kinezyny powoduje wady rozwojowe lub dysfunkcje wrzecion mitotycznych, często prowadzące do zahamoPL 204 525 B1 wania cyklu komórkowego i śmierci komórek. Sposoby inhibowania ludzkiej kinezyny KSP obejmują zetknięcie inhibitora według wynalazku z kinezyną KSP, zwłaszcza ludzką także z fragmentami i odmianami KSP. Inhibicja może dotyczyć czynności kinezyny KSP w hydrolizie adenozynotrójfosforanu i/lub tworzeniu wrzeciona mitotycznego, powodującej uszkodzenie wrzecion mitotycznych. Uszkodzeniu mogą ulec także wrzeciona mejotyczne.

Głównym celem wynalazku było opracowanie nowych inhibitorów i modulatorów kinezyn mitotycznych, zwłaszcza KSP, przeznaczonych do leczenia zaburzeń związanych z rozrostem komórek. Zazwyczaj znaczną poprawę w leczeniu raka, który jest jednym z zaburzeń wynikających z rozrostu komórek, uzyskiwano dzięki identyfikacji środków leczniczych o nowych mechanizmach działania. Przykładami są nie tylko związki z grupy taksanów, oddziaływujące na powstawanie mikrokanalików, ale również inhibitory topoizomerazy I z grupy kamptotecyny. Opisane składy i sposoby mogą się różnić selektywnością i są korzystnie używane do leczenia chorób związanych z rozrostem komórek, w tym raka, rozrostów, nawrotu zwężenia, przerostu serca, zaburzeń odpornoś ci i zapalenia.

W opisanych zwią zkach chlorowiec oznacza fluor, chlor, brom lub jod. Korzystnie jest to fluor, chlor i brom.

Związki te zawierają środek asymetryczny, a zatem mogą tworzyć izomery (R)- lub (S)-. Czynne optycznie izomery (R)- można przygotować przy użyciu chiralnych syntetyków lub chiralnych odczynników, bądź rozdzielić konwencjonalnymi sposobami. Wynalazek obejmuje wszystkie postacie tautomeryczne.

Jeżeli potrzeba, izomery R- i S- można wydzielić znanymi sposobami, na przykład przez tworzenie diastereoizomerycznych soli lub kompleksów, które mogą być rozdzielone, przykładowo przez krystalizację; przez tworzenie pochodnych diastereoizomerycznych, które mogą być rozdzielone, przykładowo przez krystalizację, chromatografię gaz-ciecz lub cieczową selektywną reakcję jednego z enancjomerów ze specyficznym dla niego odczynnikiem, na przykł ad enzymatyczne utlenianie lub redukcję, a następnie separację zmodyfikowanych lub niezmodyfikowanych enancjomerów; albo chromatografię w układzie gaz-ciecz lub cieczową w środowisku chiralnym, na przykład na chiralnym podłożu, jak krzemionka z dołączonym chiralnym ligandem lub w obecności chiralnego rozpuszczalnika. Należy zdawać sobie sprawę z tego, że gdy pożądany enancjomer jest przetwarzany w inną chemiczną jednostkę przy użyciu jednego z opisanych sposobów separacji, to wymagany będzie następny etap dla uwolnienia pożądanej postaci enancjomerycznej. Alternatywnie, specyficzny enancjomer może być syntetyzowany w drodze asymetrycznej syntezy z udziałem czynnych optycznie odczynników, substratów, katalizatorów lub rozpuszczalników, lub przez konwersję w inną postać poprzez asymetryczną transformację. Przykład syntezy z czynnych optycznie materiałów wyjściowych pokazano na fig. 3.

Wynalazek obejmuje zastosowanie czystych enancjomerów i mieszanin enancjomerów, w tym mieszanin racemicznych, chociaż korzystnie stosuje się czysty optycznie enancjomer, zwłaszcza enancjomer R, w którym grupa i - propylowa jest dołączona do pierwszego atomu węgla w łańcuchu bocznym.

Kompozycje według wynalazku są syntetyzowane, jak podano niżej, przy użyciu znanych sposobów. Przykładowo, według opisu Ager i in., J. of Med. Chem. 20:379-386 (1977), chinazolony można otrzymać przez katalizowaną kwasami kondensację kwasów N-acyloantranilowych z pierwszorzędowymi aminami aromatycznymi. Inne procesy syntez przedstawiają opisy patentowe Stanów Zjednoczonych AP nr nr 5,783,577, 5,922,866 i 5,187,167.

Związki według wynalazku można otrzymać, jak pokazano na fig. 1 - 4.

Kompozycje według wynalazku znajdują wiele zastosowań. Na mitozę można wpływać w różny sposób; co oznacza, że można zwiększać albo zmniejszać czynność składnika na ścieżce mitotycznej. Innymi słowy, na mitozę można wpływać (np. przerwać) przez zakłócenie równowagi, w wyniku inhibowania lub aktywizowania niektórych składników. Podobnie można wpływać na mejozę.

W korzystnym rozwiązaniu kompozycje według wynalazku są stosowane do modulacji powstawania wrzeciona mitotycznego, powodując w ten sposób wydłużenie zahamowania cyklu komórkowego w czasie mitozy. „Modulacją określa się tu zmianę w tworzeniu się wrzeciona mitotycznego, związaną z jego zwiększaniem i zmniejszaniem. Pod określeniem tworzenie wrzeciona mitotycznego rozumie się porządkowanie mikrokanalików w dwubiegunowe struktury przez kinezyny mitotyczne. „Dysfunkcją wrzeciona mitotycznego” określa się zahamowanie mitotyczne i powstawanie wrzeciona jednobiegunowego.

PL 204 525 B1

Kompozycje według wynalazku są przydatne do wiązania i/lub modulowania czynności kinezyny mitotycznej, KSP. W korzystnym rozwiązaniu jest to ludzka KSP, chociaż można także stosować kinezyny KSP z innych organizmów. W tym kontekście, modulowanie oznacza zwiększanie lub zmniejszanie rozdziału biegunów wrzeciona, powodowanie nieodpowiedniego formowania, tj. wykrzywienia biegunów wrzeciona mitotycznego, lub jego morfologicznych zakłóceń. Dotyczy to również odmian i/lub fragmentów KSP. [patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych AP nr US 6,617,115 Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation and Methods of Diagnosing Cell Proliferation States; zgłoszenie patentowe z 22 października 1999 (US Serial nr 09/428,156)]. W zastosowaniach według wynalazku można użyć także innych kinezyn mitotycznych, ale ujawnione kompozycje są specyficzne dla KSP.

Celem określenia aktywności, KSP lub związek według wynalazku wiąże się w sposób uniemożliwiający dyfuzję z nierozpuszczalnym podłożem, w którym znajdują się wydzielone miejsca do nanoszenia próbek, (np. płytka do mikromiareczkowania, matryca itd.). Nierozpuszczalne podłoże może być wykonane z jakiegokolwiek materiału, do którego można dowiązać kompozycję. Daje się ono łatwo oddzielić od materiału rozpuszczalnego i jest kompatybilne dla ogólnego sposobu skriningu. Powierzchnia takich podłoży może być stała lub porowata, a kształt - dowolny. Przykładami odpowiednich podłoży nierozpuszczalnych są płytki do mikromiareczkowania, matryce, membrany i pastylki. Wykonuje się je zazwyczaj ze szkła, tworzyw sztucznych (np. polistyrenu), policukrów, nylonu lub nitrocelulozy, Teflonu™ itd. Płytki do mikromiareczkowania i matryce są szczególnie wygodne, ponieważ dają możliwość jednoczesnego prowadzenia dużej ilości testów, przy użyciu małych ilości odczynników i próbek. Szczególny sposób wiązania kompozycji nie ma istotnego znaczenia, o ile jest kompatybilny z odczynnikami oraz ogólnymi sposobami według wynalazku, utrzymuje aktywność kompozycji i zapewnia brak dyfuzji. Korzystne sposoby wiązania obejmują zastosowanie przeciwciał (które przestrzennie nie blokują pozycji wiązania ligandu lub aktywacyjnej sekwencji, gdy białko jest wiązane z podłożem), bezpośrednie wiązanie do lepkich lub jonowych podłoży, chemiczne sieciowanie, syntezę białka lub środka na podłożu, itd. Po związaniu białka lub środka, nadmiar niezwiązanego materiału usuwa się przez spłukiwanie. Obszary, na których znajdują się próbki, mogą być potem blokowane przez inkubację przy użyciu albuminy serum wołowego (BSA), kazeiny lub innego nieszkodliwego białka, bądź innej cząsteczki.

Działające antymitotycznie środki według wynalazku można stosować do modulowania czynności mitotycznej kinezyny, zwłaszcza KSP. Przy takim rozwiązaniu środki według wynalazku łączy się z KSP i oznacza czynność KSP. Aktywność kinezyn jest znana i skł ada się z jednej lub wielu czynności. Należy do nich możliwość wpływania na hydrolizę ATP, wiązanie mikrokanalików, przemieszczanie i polimeryzacja / depolimeryzacja (wpływy na dynamikę mikrokanalików), wiązanie do innych białek we wrzecionie, wiązanie do białek biorących udział w regulacji cyklu komórkowego, działanie jako substrat dla innych enzymów, jak kinazy lub proteazy, oraz czynności komórkowe specyficzne dla kinezyn, jak oddzielanie biegunów wrzeciona.

Sposoby prowadzenia testów ruchliwości są dobrze znane [patrz np. Hall i in., (1996), Biophys. J. 71:3467-3476; Turner i in., 1996, Anal. Biochem. 242 (1):20-5; Gittes i in., 1996, Biophys. J. 70(1): 418-29; Shirakawa i in., 1995, J. Exp. Biol. 198: 1809-15; Winkelmann i in., 1995, Biophys. J. 68: 2444-53; Winkelmann i in., 1995, Biophys. J. 68: 72S].

Można stosować także znane sposoby oznaczania czynności hydrolitycznej ATPazy, korzystnie testy roztworowe. Przykładowo ujawniono je w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych AP nr US 6410254 - zgłoszenie nr 09/314,464 z 18 maja 1999. Alternatywnie stosuje się sposoby konwencjonalne. Na przykład można oznaczać uwolnienie Pi z kinezyny. W jednym z korzystnych rozwiązań, do testu aktywności hydrolitycznej ATPazy wykorzystuje się 0.3 M PCA (kwas nadchlorowy) i odczynnik z zieleni malachitowej (8.27 mM molibdenianu sodowego II, 0.33 mM szczawianu zieleni malachitowej, oraz 0.8 mM Triton X-1- 00). Dla wykonania testu, 10 μΐ mieszaniny reakcyjnej zadaje się 90 μΐ 0.3 M zimnego PCA. Stosuje się wzorce fosforanowe tak, że dane można przetworzyć na mM uwolnionego nieorganicznego fosforanu. Po zadaniu PCA wszystkich próbek i wzorców, dodaje się 100 μΐ odczynnika z zielenią malachitową do pozostałych studzienek na np. płytce do mikromiareczkowania. Mieszaninę pozostawia się na 10-15 minut, a następnie odczytuje absorbancję przy 650 nm. Jeżeli stosuje się wzorce fosforanowe, odczyty absorbancji można przetworzyć na mM Pi i wykreślić w funkcji czasu. Ponadto, jako test dla ATPazy można użyć oznaczenia lucyferazy.

Dla monitorowania wpływów środków modulujących można także użyć oznaczenia czynności ATPazy domen kinezynowych. W jednym z rozwiązań, oznaczenia ATPazy kinezyny wykonuje się

PL 204 525 B1 pod nieobecność mikrokanalików, w innym - w ich obecności. W powyższych testach można wykryć różne typy środków modulujących. W korzystnym rozwiązaniu wpływ środka modulującego jest niezależny od zawartości mikrokanalików i ATP. W innych rozwiązaniach - wpływ tych środków na ATPazę kinezynową można zmniejszać lub zwiększać przez zwiększanie stężeń ATP, mikrokanalików lub obu stężeń.

Środki modulujące aktywność biochemiczną KSP in vitro można potem skrinować in vivo. Sposoby dla takich środków in vivo obejmują testy dystrybucji cyklu komórkowego, żywotności komórek, lub obecności, morfologii, aktywności, dystrybucji lub ilości wrzecion mitotycznych. Sposoby monitorowania rozkładu cyklu komórkowego w populacji komórek, na przykład przez cytometrię przepływową są dobrze znane, podobnie jak sposoby określania żywotności komórek. Patrz na przykład opis patentowy Stanów Zjednoczonych AP nr US 6,617,115 Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation and Methods of Diagnosing Cell Proliferation States; zgłoszenie patentowe z 22 października 1999 (US Serial nr 09/428,156)].

Dodatkowo znane są także mikroskopowe sposoby monitorowania tworzenia się i deformacji wrzeciona mitotycznego [patrz np. Whitehead i Rattner (1998), J. Cell. Sci. 111: 2551-61; Galgio i in., (1996) J. Cell. Biol. 135: 399-414].

Kompozycje według wynalazku inhibują kinezynę KSP. Jedną z miar inhibicji jest IC50, definiowana jako stężenie kompozycji, przy którym aktywność KSP jest zmniejszona o pięćdziesiąt procent.

Dla korzystnych kompozycji wartości IC50 wynoszą poniżej 1 mM, bardziej korzystnie - poniżej

100 μΜ, zwłaszcza korzystnie - poniżej 10 μΜ, jeszcze bardziej korzystnie - poniżej 1 μΜ, szczególnie korzystnie - poniżej 100 nM, a najbardziej korzystnie - poniżej 10 nM. Wartość tę oznacza się przy użyciu testu ATPazy.

Inną miarę inhibicji stanowi Ki. Dla związków mających IC50 poniżej 1 μΜ, Ki lub Kd definiuje się jako stałą szybkości dysocjacji przy wzajemnym oddziaływaniu chinazolonu z KSP. Dla korzystnych kompozycji wartości Ki wynoszą poniżej 100 μΜ, bardziej korzystnie - poniżej 10 μΜ, zwłaszcza korzystnie - poniżej 1 μM, jeszcze bardziej korzystnie - poniżej 100 nM, a najbardziej korzystnie - poniżej 10 nM. Wartość K dla związku wyznacza się z wartości IC₅₀ w oparciu o trzy założenia. Po pierwsze, cząsteczka tylko jednego związku wiąże się do enzymu i nie istnieje współdziałanie. Po drugie, stężenia aktywnego enzymu i badanego związku są znane (tj. nie ma znaczących ilości zanieczyszczeń lub nieaktywnych postaci w preparatach). Po trzecie, szybkość enzymatyczna kompleksu enzym - inhibitor wynosi zero. Szybkość (tj. stężenie związku) odpowiada zależności:

^{V = V}max^E0 (E0 +10 + Kd) -j(E0 +I0 + Kd)² -4E0I0

I2E0 gdzie V oznacza obserwowaną szybkość, Vmax jest szybkością dla swobodnego enzymu, l0 stężeniem inhibitora, E0 - stężeniem enzymu, Kd - stałą dysocjacji kompleksu enzym-inhibitor.

Inną miarę inhibicji stanowi GI50, definiowana jako stężenie związku, które powoduje zmniejszenie prędkości wzrostu komórek o 50 procent. Dla korzystnych związków wartość GI50 wynosi poniżej 1 mM. Stopień korzystności rozwiązań jest funkcją ich wartości GI₅₀: dla bardziej korzystnych wartość ta jest niższa od 20 μΜ, zwłaszcza korzystnych - od 10 μΜ, jeszcze bardziej korzystnych - od 1 μΜ, szczególnie korzystnych - od 100 nM, a najbardziej korzystnych - wynosi poniżej 10 nM. Oznaczenie GI50 wykonuje się przy użyciu testu rozrostu komórki.

Kompozycje według wynalazku są używane do leczenia chorób związanych z rozrostem komórek. Stany chorobowe, jakie mogą być leczone przy użyciu podanych sposobów i kompozycji, obejmują m.in. raka (dyskusja w dalszej części opisu), dolegliwości autoimmunizacyjne, zapalenie stawów, odrzucenie przeszczepu, zapalenie jelit, rozrost w wyniku zabiegów medycznych, jak chirurgiczne, angioplastyczne itp. W niektórych przypadkach komórki mogą nie znajdować się w stanie nadmiernego rozrostu (stan nienormalny) i wymagać dalszego leczenia. Na przykład, w czasie gojenia ran, komórki mogą rozrastać się normalnie, ale może być wymagane wzmocnienie rozrostu. Podobnie, w zakresie uprawy roślin, komórki mogą znajdować się w stanie normalnym, ale modulacja rozrostu może być wymagana dla zwiększenia plonów przez bezpośrednie wspomaganie wzrostu albo przez inhibowanie wzrostu rośliny lub organizmu, który niekorzystnie oddziaływuje na urodzaj. Zatem w jednym z rozwiązań wynalazku, stosuje się działanie na komórki lub organizmy dotknięte lub zagrożone jednym z wymienionych stanów chorobowych.

PL 204 525 B1

Kompozycje i sposoby według wynalazku są uważane za szczególnie użyteczne do leczenia nowotworów, w tym guzów litych, jak rak skóry, piersi, mózgu, szyjki macicy, jąder itd. W szczególności, nie ograniczając zakresu wynalazku, dotyczy to nowotworów takich, jak: sercowe - mięsak (mięsak naczyniopochodny, włókniak mięsakowy, mięśniakomięsak prążkowany, tłuszczakomięsak), śluzak, mięśniak prążkowanokomórkowy, włókniak, tłuszczak i potworniak; płucne - rak oskrzeli (komórek łuskowych, niezróżnicowanych małych komórek, niezróżnicowanych dużych komórek, gruczołowy), rak pęcherzykowy (oskrzelikowy), gruczolak oskrzelowy, mięsak, chłoniak, hamartoma chrzęstniakowa, międzybłoniak; żołądkowo-jelitowe: przełyk (rak komórek łuskowych, gruczołowy, mięśniak gładki, chłoniak), żołądek (rak, chłoniak, mięśniak gładki), trzustka (gruczolak przewodowy, gruczolak wysepkowatokomórkowy, glukagonowy, wydzielający gastrynę, guzy rakowate), jelito cienkie (gruczolak, chłoniak, guzy rakowate, mięśniak Karposiego, mięśniak gładki, naczyniak krwionośny, tłuszczak, włókniako-nerwiak, włókniak), jelito grube (gruczolak, gruczolak cewkowy, gruczolak brodawkowaty, hamartoma, mięśniak gładki); przewód moczowo-płciowy: nerki (gruczolak, guz Wilmsa [nerczak niedojrzały], chłoniak, białaczka), pęcherz i cewka moczowa (rak komórek łuskowych, rak komórek przelotowych, gruczolak), prostata (gruczolak, mięsak), jądra (nasieniak, potworniak, rak zarodkowy, potworniak złośliwy, nabłoniak kosmówkowy złośliwy, mięsak, rak komórek śródmiąższowych, włókniak, gruczolakowłókniak, guzy gruczołowe, tłuszczak); wątrobowe: wątrobiak (rak komórek wątrobowych), rak dróg żółciowych, wątrobiak zarodkowy, naczyniakomięśniak; kości: mięsak pochodzenia kostnego, włókniakomięsak, histiocytoma włókniakowa złośliwa, chrzęstniakomięsak, mięsak Ewinga, chłoniak złośliwy, szpiczak mnogi, struniak złośliwy komórek olbrzymich, chrzęstniak łagodny, chrzęstniak zarodkowy, chrzęstniakośluzakowłókniak, kostniak kostninowy, guzy komórek olbrzymich; układu nerwowego: czaszka (kostniak, naczyniak krwionośny, ziarniniak, żółtak, choroba Pageta kości), opony (oponiak, oponiakomięsak, glejakowatość), mózg (gwiaździak, rdzeniak, glejak, wyściółczak, rozrodczak [szyszynczak], glejak wielopostaciowy, skąpodrzewiak, nerwiak, glejak siatkówki, guzy wrodzone), rdzeń kręgowy (włókniakonerwiak, oponiak, glejak, mięsak); ginekologiczne: macica (rak trzonu macicy), szyjka (rak szyjki macicy, dysplazja szyjki macicy), jajniki (rak jajników [torbielakogruczolak surowiczy, torbielakogruczolak śluzowy, rak nieokreślony], rak komórek osłonkowych warstwy ziarnistej pęcherzyka Graafa, guzy komórek Sertoli-Leydiga, rozrodczak, potworniak złośliwy), srom (rak komórek łuskowych, rak komórek śródnabłonkowych, gruczolak, włókniakomięsak, czerniak), pochwa (rak komórek jasnych, rak komórek łuskowych, mięśniakomięsak prążkowany zarodkowy), rak jajowodów; hematologiczne: krew (białaczka szpikowa [ostra i przewlekła], ostra białaczka limfoblastyczna, przewlekła białaczka limfocytowa, choroby mielorozrostowe, szpiczak mnogi, zespół mielodysplazji), choroba Hodgkina, chłoniak nieziarniczy [chłoniak złośliwy]; skóra: czerniak złośliwy, rak komórek podstawowych, rak komórek łuskowych, mięsak Karposiego, tłuszczak, naczyniak, włókniak skóry, bliznowce, łuszczyca; oraz nadnercza: nerwiak niedojrzały. W związku z tym określenie komórka rakowa odnosi się tu do komórek dotkniętych jednym z wyżej wymienionych stanów.

Kompozycje według wynalazku wprowadza się do komórek. Pod określeniem wprowadzanie rozumie się podawanie terapeutycznie efektywnej dawki środków mitotycznych według wynalazku do komórki znajdującej się w hodowli lub u pacjenta. Terapeutycznie efektywna dawka oznacza dawkę, która daje oczekiwane efekty. Dokładna wielkość dawki zależy od celu kuracji i można ją ustalić znanymi sposobami. Może być przy tym konieczne uwzględnienie: podawania do układu lub stosowania miejscowego, wieku, masy ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety, czasu podawania, wzajemnego oddziaływania leków oraz charakteru przypadku. Jako komórki określa się prawie wszystkie komórki, w których moż na zmieniać przebieg mitozy lub mejozy.

Określenie pacjent dotyczy zarówno ludzi, jak i zwierząt, zwłaszcza ssaków, i innych organizmów. Opisane sposoby dotyczą zatem leczenia ludzi i praktyki weterynaryjnej. Korzystnie pacjent jest ssakiem, a najbardziej korzystnie - człowiekiem.

Środki mitotyczne mające pożądaną czynność farmakologiczną można podawać w fizjologicznie akceptowalnym nośniku. Zależnie od sposobu wprowadzania, związki można formułować różnymi, niżej opisanymi sposobami.

Stężenie środka czynnego terapeutycznie w formulacji może wynosić od 0.1 do 100% wagowo. Środki można stosować oddzielnie lub w kombinacji z innymi terapiami, jak np. naświetlanie lub inne chemoterapeutyki.

W korzystnym rozwiązaniu, kompozycje farmaceutyczne występują w postaci rozpuszczalnej w wodzie jako farmaceutycznie akceptowalne sole addycyjne kwasowe i zasadowe. Okreś lenie farmaceutycznie akceptowalne addycyjne sole kwasowe oznacza sole zachowujące biologiczną efekPL 204 525 B1 tywność wolnych kwasów i nie działające w jakikolwiek niepożądany sposób, utworzone z kwasów nieorganicznych, jak solny, bromowodorowy, siarkowy, azotowy, fosforowy itp., bądź kwasów organicznych, jak octowy, propionowy, glikolowy, pirogronowy, szczawiowy, maleinowy, malonowy, bursztynowy, fumarowy, winowy, cytrynowy, benzoesowy, cynamonowy, migdałowy, metanosulfonowy, etanosulfonowy, p-toluenosulfonowy, salicylowy itp. Farmaceutycznie akceptowalne addycyjne sole zasadowe pochodzą od zasad nieorganicznych, jak sole sodu, potasu, litu, amonu, wapnia, magnezu, żelaza, cynku, miedzi, manganu, glinu itp. Korzystne są zwłaszcza sole amonowe, potasowe, sodowe, wapniowe i magnezowe. Sole pochodzące od farmaceutycznie akceptowalnych nietoksycznych zasad organicznych obejmują sole pierwszo-, drugo - i trzeciorzędowych amin, podstawionych amin, w tym występujących naturalnie, amin cyklicznych i zasadowych żywic jonowymiennych, jak izopropyloamina, trimetyloamina, dietyloamina, trietyloamina, tripropyloamina i etanoloamina.

Kompozycje farmaceutyczne można przygotowywać w różnych formach, jako granulki, tabletki, pigułki, czopki, kapsułki, zawiesiny, balsamy, lotiony itp. Do uzupełnienia składu dodaje się organiczne i nieorganiczne nośniki o czystości farmaceutycznej i/lub rozcieńczalniki odpowiednie do użytku doustnego lub miejscowego. Należą do nich ośrodki wodne, oleje roślinne i zwierzęce oraz tłuszcze. Jako składniki pomocnicze stosuje się środki stabilizujące, zwilżacze i emulgatory, sole zmieniające ciśnienie osmotyczne, bufory do regulacji pH i środki zwiększające penetrację skóry. Kompozycje mogą zawierać także jeden lub więcej spośród następujących składników: nośniki białkowe, jak serum albuminy; bufory; wypełniacze, jak mikrokrystaliczna celuloza, laktoza, skrobia kukurydziana i inne skrobie; środki wiążące; słodziki i środki aromatyzujące; barwniki; oraz poliglikol etylenowy. Dodatki są znane ze stanu techniki i stosowane w różnych formulacjach.

Podawanie środków mitotycznych według wynalazku można wykonywać w różny sposób, a zwłaszcza doustnie, podskórnie, dożylnie, donosowo, przezskórnie, dootrzewnowo, domięśniowo, doopłucnowo, dopochwowo, doodbytniczo, lub dogałkowo. W niektórych przypadkach, na przykład w leczeniu ran i zapaleń, środki przeciwmitotyczne można nakładać bezpośrednio jako roztwór lub spray.

Aby wykorzystać środki według wynalazku do skriningu związków, które wiążą się do kinezyny KSP, najpierw wiąże się KSP do podłoża, a środek według wynalazku (który jest środkiem mitotycznym) dodaje się do testu. Alternatywnie, środek według wynalazku wiąże się do podłoża, a dodaje KSP. Do związków, wśród których można poszukiwać nowych środków wiążących, należą specyficzne przeciwciała, nie występujące w naturze środki wiążące zidentyfikowane przy skriningu bibliotek chemicznych, analogi peptydowe itd. Szczególnie interesujące są testy skrinowania kandydatów o niskiej toksyczności dla komórek ludzkich. Do tego celu stosuje się różne testy, jak testy wiązania białek znakowanych in vitro, testy mobilności elektroforetycznej, testy immunologiczne wiązania białkowego, testy funkcjonalności (testy fosforylacyjne itd.) itp.

Określenie wiązania środka mitotycznego do KSP można przeprowadzić różnymi sposobami. W korzystnym rozwiązaniu środek mitotyczny (związek według wynalazku) jest znakowany, na przykład cząsteczką fluorescencyjną lub radioaktywną a wiązanie oznacza się bezpośrednio. Można to wykonać przez dołączenie całości lub części KSP do stałego podłoża, dodanie znakowanego środka mitotycznego (na przykład związku według wynalazku, w którym przynajmniej jeden atom zastąpiono wykrywalnym izotopem), odmycie nadmiaru odczynnika, i oznaczenie ilości środka znakującego na stałym podłożu. Stosuje się znane etapy blokowania i odmywania.

Jako znakowany uważa się związek, który bezpośrednio lub pośrednio oznaczono znacznikiem dostarczającym wykrywalnego sygnału, np. radioizotopem, markerem fluorescencyjnym, enzymem, przeciwciałem, cząsteczkami takimi, jak magnetyczne, markery chemiluminescencyjne, lub cząsteczki wiążące się specyficznie itd. Do cząsteczek wiążących się specyficznie należą pary, jak biotyna i streptawidyna, digoksyna i antydigoksyna itd. Dla cząsteczek wiążących się specyficznie, cząsteczka komplementarna zwykle jest oznaczona cząsteczką wykrywalną znanymi sposobami. Znacznik może bezpośrednio lub pośrednio dawać wykrywalny sygnał.

W niektórych rozwiązaniach tylko jeden składnik jest znakowany. Na przykład, białka kinezynowe można oznakować w pozycji tyrozyny, używając izotopu jodu ¹²⁵l, lub fluoroforów. Alternatywnie, znakuje się więcej składników różnymi znacznikami; stosując np. izotop ¹²⁵l dla białek, a fluorofor - dla środków mitotycznych.

Środki według wynalazku można również wykorzystywać jako współzawodniczące w badaniach przesiewowych dla dodatkowych kandydatów na leki. Kandydujący środek bioaktywny lub kandydujący lek, albo ich gramatyczne równoważniki, oznaczają każdą cząsteczkę, np. białko, oligopeptyd,

PL 204 525 B1 małą cząsteczkę organiczną, polisacharyd, polinukleotyd itd., której bioaktywność jest poddawana badaniu. Mogą one być zdolne do bezpośredniej bądź pośredniej zmiany fenotypu rozrostu komórkowego lub ekspresji sekwencji rozrostu komórkowego, w tym sekwencji kwasów nukleinowych i sekwencji białek. W innych przypadkach, skrinuje się zmianę wiązania i/lub czynności białka rozrostu komórkowego. Przesiewy tego rodzaju wykonuje się w obecności lub pod nieobecność mikrokanalików. W przypadku skrinowania wiązania lub aktywności białka, korzystne rozwiązania wykluczają cząsteczki znane już z wiązania do danego białka, na przykład struktury polimerowe, jak mikrokanaliki, i źródła energii, jak ATP. Korzystne rozwiązania testów zawierają środki kandydujące, które nie wiążą białek rozrostu komórkowego w swoim natywnym stanie określanych jako środki egzogeniczne. W innym korzystnym rozwiązaniu środki egzogeniczne wykluczają przeciwciała dla KSP.

Środki kandydujące mogą należeć do wielu grup chemicznych, chociaż typowo są to cząsteczki organiczne, zwłaszcza małych związków organicznych o ciężarze cząsteczkowym od 100 do około 2500 daltonów (100-2500 x 10^-24 g). Środki te zawierają grupy funkcjonalne niezbędne do strukturalnej interakcji z białkami, zwłaszcza wiązania wodorowego i lipofilowego, a typowo zawierają przynajmniej grupę aminową karbonylową hydroksylową eterową lub karboksylową korzystnie przynajmniej dwie grupy funkcjonalne. Często w ich skład wchodzą cykliczne węglowe lub heterocykliczne struktury i/lub aromatyczne albo poliaromatyczne struktury podstawione przez jedną lub więcej powyższych grup funkcjonalnych. Środki tego typu często występują wśród biocząsteczek, jak peptydy, sacharydy, kwasy tłuszczowe, steroidy, puryny, pirymidyny, pochodne, analogi strukturalne, i ich kombinacje.

Szczególnie korzystne są peptydy.

Środki kandydujące otrzymuje się z różnych źródeł, w tym bibliotek związków syntetycznych lub naturalnych. Przykładowo jest wiele dostępnych sposobów przypadkowych i kierowanych syntez szerokiego zakresu związków organicznych i biocząsteczek, w tym ekspresji dobranych losowo oligonukleotydów. Alternatywnie, dostępne lub łatwo wytwarzalne są biblioteki naturalnych związków w postaci ekstraktów bakteryjnych, grzybowych, roślinnych i zwierzęcych. Ponadto związki naturalne i syntetyczne można łatwo modyfikować znanymi sposobami chemicznymi, fizycznymi i biochemicznymi. Znane środki farmaceutyczne można poddawać sterowanym lub przypadkowym modyfikacjom chemicznym, jak acylowanie, alkilowanie, estryfikacja, amidyfikacja tak, aby otrzymać analogi strukturalne.

Konkurencyjne testy przesiewowe można prowadzić, łącząc KSP i kandydata w pierwszej próbce. Druga próbka zawiera środek mitotyczny, KSP i związek kandydacki. Wykonuje się to pod nieobecność mikrokanalików lub w ich obecności. Wiązanie środka kandydującego oznacza się dla obu próbek, a zmiana, bądź różnica pomiędzy dwiema próbkami, wskazuje obecność środka zdolnego do wiązania KSP i potencjalnego modulowania jego aktywności. Oznacza to, że jeżeli wiązanie kandydata w drugiej próbce jest różne od pierwszej próbki, to jest on zdolny do łączenia się z KSP.

W korzystnym rozwią zaniu, zdolność wią zania dla kandydata oznacza się przez konkurencyjne badanie wiązania. Przy takim rozwiązaniu, współzawodnik jest cząsteczką, o której wiadomo, że wiąże się z KSP, jak przeciwciało, peptyd, partner wiązania, ligand itd. W pewnych warunkach może występować konkurencyjne wiązanie, jak pomiędzy kandydatem i cząsteczką wiążącą, w którym cząsteczka wiążąca ruguje kandydata.

Środek kandydujący może być znaczony. W takim przypadku, kandydat lub współzawodnik, lub obydwie cząsteczki, są najpierw dołączane do KSP na okres wystarczający do związania, jeżeli ono zachodzi. Inkubacje wykonuje się w dowolnej temperaturze, jaka zapewnia optymalną aktywność, typowo od 4° do 40°C.

Okres inkubacji dobiera się optymalnie dla aktywności, bądź tak, aby uzyskać wysoką wydajność skriningu. Zwykle wystarczy od 0.1 do 1 godziny. Nadmiar odczynnika usuwa się lub spłukuje. Następnie dodaje się drugi składnik, a obecność lub nieobecność składnika znaczonego wskazuje na wiązanie.

W korzystnym rozwią zaniu, najpierw dodaje się konkurenta, a nastę pnie ś rodek kandydują cy. Rugowanie współzawodnika wskazuje, że kandydat dowiązał się do KSP, a zatem ma taką zdolność, i ewentualnie może też modulować aktywność KSP. W tym rozwiązaniu znakuje się któryś ze składników. Zatem, na przykład, jeżeli znakuje się współzawodnika, obecność znacznika w roztworze do przemywania wskazuje na jego rugowanie przez środek. Alternatywnie, jeżeli oznaczono kandydata, obecność znacznika na podłożu wskazuje na rugowanie.

W alternatywnym rozwią zaniu, najpierw wprowadza się kandydata, wykonuje inkubację i przemywanie, a potem dodaje współzawodnika. Brak wiązania przez konkurenta może wskazywać, że kandydat wiąże się do KSP z większym powinowactwem. W ten sposób, jeżeli oznakowano kanPL 204 525 B1 dydata, to obecność znacznika na podłożu, w połączeniu z brakiem wiązania przez konkurenta, może wskazywać na zdolność środka do wiązania KSP.

Istotne może być zidentyfikowanie pozycji wiązania KSP. Wykonuje się to różnymi sposobami. W jednym z rozwiązań, po stwierdzeniu związania KSP ze ś rodkiem mitotycznym, KSP dzieli się na fragmenty lub modyfikuje, po czym powtarza testy dla zidentyfikowania składników niezbędnych do związania.

Modulację testuje się przez skrining środków zdolnych do modulowania czynności KSP. Zawiera on etap łączenia kandydata z KSP, jak wyżej, i wyznaczania zmiany w biologicznej aktywności KSP. W tym rozwiązaniu, kandydat powinien zarówno wiązać się z KSP (chociaż nie musi to być konieczne), jak i zmieniać jej biologiczną lub biochemiczną aktywność. Sposoby obejmują skrining in vitro i in vivo komórek w celu stwierdzenia zmiany w rozkładzie cyklu komórkowego, żywotności komórek, lub obecności, morfologii, aktywności, rozkładu lub ilości wrzecion mitotycznych.

Alternatywnie, można zastosować skrining różnicowy dla identyfikacji kandydatów, wiążących się do natywnej KSP, a niezdolnych do wiązania się do zmodyfikowanej KSP.

W testach moż na użyć sprawdzianów pozytywnych i negatywnych. Korzystnie wszystkie próbki wzorcowe i badane testuje się trzykrotnie dla uzyskania wyników znaczących statystycznie. Inkubacja wszystkich próbek odbywa się przez okres czasu wystarczający dla wiązania środka do białka. Po inkubacji, wszystkie próbki przemywa się do odmycia niespecyficznie związanego materiału i oznacza ilość związanego, zwykle znaczonego środka. Na przykład, jeżeli używa się znacznika radioaktywnego, próbki zlicza się w liczniku scyntylacyjnym w celu wyznaczenia ilości związanego środka.

Do testów przesiewowych używa się wielu różnych odczynników. Są to sole, obojętne białka, np. albumina, detergenty itd., które są używane do uzyskania optymalnego wiązania białek i/lub redukcji interakcji niespecyficznych lub związanych z tłem. Można także stosować odczynniki poprawiające efektywność testu, jak inhibitory proteazy, inhibitory nukleazy, środki przeciw mikrobowe itd. Mieszanina składników może być dodawana w dowolnej kolejności, wymaganej dla zapewnienia wiązania.

Poniższe przykłady mają na celu dostarczenie pełniejszego opisu sposobu zastosowania opisanego wynalazku.

P r z y k ł a d y

Skróty i definicje

Poniższe skróty i określenia mają podane znaczenie:

Ac

BNB

Boc

Bu cCBZ

DBU

DCM

DCE

DEAD

DIC

DIEA

DMAP

DMF

DMSO

DVB

EEDQ

Et

Fmoc

GC

HATU

HMDS

HO Ac

HOBt

Me acetyl kwas 4-bromometylo-3-nitrobenzoesowy t-butyloksykarbonyl butyl cyklo karbobenzoksy = benzyloksykarbonyl diazobicyklo[5,4,0]undekan-7 dichlorometan = chlorek metylenu = CH2CI2 dichloroetylen dietyloazodikarboksylan diizopropylokarbodiimid

N,N-diizopropyloetyloamina

4-N,N-dimetyloaminopirydyna

N,N-dimetyloformamid dimetylosulfotlenek

1,4-diwinylobenzen

2-etoksy-1-etoksykarbonylo-1,2-dihydrochinolina etyl

9-fluorenylometoksykarbonyl chromatografia gazowa heksafluorofosforan 0-(7-azobenzotnazolilo-1)-1,1,3,3-tetrametyluronium heksametylodisilazan kwas octowy hydroksybenzotriazol metyl

PL 204 525 B1 mesyl

MTBE

NMO

PEG

Ph

PhOH

PfP

PPTS

Py

PyBroP rt sat stTBDMS

TES

TFA

THF

TMOF

TMS tosyl

Trt metanosulfonyl eter metylo-t-butylowy tlenek N-metylomorfoliny poliglikol etylenowy fenyl fenol pentafluorofenol p-toluenosulfonian pirydynium pirydyna heksafluorofosforan bromo-tris-pirolidyno-fosfonium temperatura pokojowa d = nasycony drugorzędowy trzeciorzędowy t-butylodimetylosylil trietylosilan kwas trifluorooctowy tetrahydrofuran trójmetyloortomrówczan ą; ametylosylil p-toluenosulfonyl trifenylometyl

P r z y k ł a d 1

Synteza związków

Ogólny schemat syntezy pokazano na fig. 1 i fig. 2.

Etap 1: Kwas N-butyryloantranilowy

Do kolby trójszyjnej 500 ml z okrągłym dnem, w której umieszczono termometr, wkraplacz i wydajne mieszadło, wprowadzono kwas antranilowy (1) (0.5 mola, 68.5 g) oraz dwumetyloformamid (250 ml). Do tego roztworu dodawano kroplami chlorek butyrylu (0.55 mola, 57.1 ml) z taką prędkością aby temperatura mieszaniny nie wzrosła powyżej 40°C. Zawiesinę mieszano intensywnie w temperaturze pokojowej przez przynajmniej dodatkowe 3 godziny. Następnie wlano ją do wody (2000 ml) i mieszano przez kolejną godzinę. Wytrącony produkt odfiltrowano, przemyto zimną wodą i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem nad P2O5, uzyskując związek 2 (67.3 g, 65%).

Etap 2: 2-propylo-3,1-[4H]benzoksazynon-4

Związek 2 (51.8 g, 0.25 mola) rozpuszczono w bezwodniku octowym (180 ml) w okrągłodennej kolbie 500 ml z mieszadłem, nasadką destylacyjną Claissena (z wlotem próżni) i termometrem. Kolbę umieszczono w łaźni olejowej i powoli ogrzewano do 170-180°C, intensywnie mieszając. Powstały kwas octowy powoli oddestylowano pod ciśnieniem atmosferycznym. Dla zachowania postępu transformacji, monitorowano temperaturę nasadki destylacyjnej. Następnie mieszaninę reakcyjną ostudzono do 60°C i nadmiar bezwodnika octowego usunięto przez destylację pod zmniejszonym ciśnieniem (ok. 2.666 kPa = 20 mm Hg). Pozostałość ostudzono i produkt przekrystalizowano. Po roztarciu na proszek z n-heksanem (75 ml) i przefiltrowaniu uzyskano 2-propylo-3,1-[4H]benzoksazynon-4 (3) (29.3 g, 62%). Powyższa procedura daje związek 3 o czystości wystarczającej do użycia bezpośrednio w następnym etapie.

Etap 3: 2-propylo-3-benzylochinazolon-4

Związek 3 (28.4 g, 0.15 mola) oraz benzyloaminę (17.5 ml, 0.16 mola) destylowano z zawracaniem w chloroformie (50 ml) w jednoszyjnej okrągłodennej kolbie 250 ml przez 6 godzin. Po całkowitym wchłonięciu związku 3, chloroform odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości dodano glikol etylenowy (100 ml) i tabletki NaOH (0.60 g), a w kolbie umieszczono nasadkę destylacyjną Claissena oraz mieszadło magnetyczne. Kolbę zanurzono w łaźni olejowej, ogrzano do temperatury łaźni 130 - 140°C (z intensywnym mieszaniem), którą utrzymywano przez 5 godzin, 30 usuwając powstającą wodę poprzez destylację. Po zakończeniu reakcji, przezroczysty roztwór ostudzono do temperatury pokojowej i pozostawiono na noc do wytrącenia produktu. pH zawiesiny ustawiono na 7-8, dodając 3% roztwór wodny HCI. Kryształy odsączono, przemyto zimną wodą i przekrystalizowano z izopropanolu (może być także aceton). Uzyskano związek 2-propylo-3-benzylochinazolon-4 (związek 4) (28.0 g, 67%).

PL 204 525 B1

Etap 4: 2-(1'-bromopropylo)-3-benzylochinazolon-4

Do trójszyjnej, okrągłodennej kolby 250 ml z termometrem, wkraplaczem i mieszadłem, wprowadzono związek 4 (27.8 g, 0.10 mola), bezwodny octan sodowy (10.0 g) i kwas octowy lodowaty (130 ml). Do powyższego roztworu dodawano kroplami brom (16.0 g, 0.10 mola) rozpuszczony w kwasie octowym (10 ml), w temperaturze 40°C przez 1-2 godzin. Wytrącony produkt, 2-(1'-bromopropylo)-3-benzylochinazolon-4 (5) odsączono, przemyto ciepłą wodą do usunięcia śladów kwasu octowego i spłukano niewielką ilością izopropanolu. Po wysuszeniu, otrzymano związek 5 (33.0 g, 92%).

Etap 5: 2-[1'-(N,N-dimetyloetylenodiamino)propylo]-3-benzylochinazolon-4

Związek 5 (10.7 g, 0.03 mola) i N,N-dimetyloetylenodiaminę (6.6 ml, 0.06 mola) rozpuszczono w alkoholu bezwodnym (60 ml) i ogrzewano z refluksem przez 6 godzin. Po zakończeniu reakcji, rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w dichlorometanie (150 ml) i przemyto 3% wodnym roztworem NaOH (ok. 10-20 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad MgSO4 i odparowano do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostały, oleisty produkt oczyszczono metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym z użyciem eluenta CHCl3 - MeOH - wodny roztwór NH3 w stosunku 90: 10: 0.1, uzyskując oczekiwany związek (5) w postaci 2-[1'-(N,N-dimetyloetylenodiamino)propylo]-3-benzylochinazolonu-4 (6.0 g, 55%).

Etap 6: 2-[1'-(N-4-fluorobenzoilo)-(N,N-dimetyloetylenodiamino)propylo]-3-benzylochinazolon-4 Przygotowano: podstawowy roztwór związku 5 (1.822 g, 5.0 mmoli) w CHCl3 (0.5 ml) o czystości do HPLC; podstawowy roztwór chlorku p-fluorobenzolu (160.2 mg, 1 mmol) w 1,2-dichloroetanie (2.0 ml) o czystości do HPLC, w kolbie miarowej 2.0 ml; oraz roztwór trójetyloaminy (2.0 ml, 0.5 mola) w tym samym odczynniku. Porcje po 100 μ l każ dego roztworu odpipetowano do szklanego naczynia reakcyjnego przy użyciu automatycznego dozownika cieczy Beckman Biomet 2000. Mieszaninę reakcyjną wstrząsano na wytrząsarce mechanicznej, poddawano działaniu ultradźwięków w płuczce z wodą , a nastę pnie inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę rozcień czono

CHCI₃ (300 μΐ), przemyto 5% wodnym roztworem NaHCO₃ i wodą. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią i uzyskano związek 6 z wydajnością 65%. Czystość produktu określono metodą chromatografii cieczowej z użyciem eluenta CH2CI2 - etanol - stężony wodny roztwór NH3 w stosunku 100: 10: 1.

P r z y k ł a d y 2 i 3

Synteza związków o strukturze amin

Większość odczynników nabyto w Aldrich Chemical Company, w tym - wszystkie rozpuszczalniki bezwodne w pojemnikach SureSeal®. Skróty oznaczają: DCM = dichlorometan; DIEA = N,N14

PL 204 525 B1

-diizopropyloetyloamina, DMF = N,N-dimetyloformamid; TES = trietylosilan; TFA = kwas trifluorooctowy. Syntezę matrycową prowadzono w zakręcanych szklanych fiolkach okrągłodennych o wymiarach 15 x 75 mm, umieszczonych w blokach aluminiowych do syntezy o wzorze 4x6, uszczelnionych gumową membraną wyłożoną teflonem. Dodawanie odczynników i ekstrakcje w środowisku wodnym prowadzono z użyciem pojedynczych lub wielokanałowych zestawów do pipetowania. Filtrację wykonywano przy użyciu bloków filtracyjnych 10 ml Whatman/Polyfiltronics 24. Do odparowywania lotnych substancji stosowano Labconco Vortex-Evaporator lub zdmuchiwanie azotem.

P r z y k ł a d 2 (synteza pojedynczego związku w fazie stałej)

Etap 1/ Żywicę 1,3-diaminopropanotritylową (Novabiochem, 1.2 mmol/g) (0.20 g, 0.24 mmola) odważono do zakręcanej fiolki i dodano 3 ml mieszaniny DMF i chloroformu w stosunku 1:1. Następnie dodano DIEA (0.130 ml, 0.72 mmola) i 2-(1'-bromopropylo)-3-benzylochinazolon-4) (z przykładu 1) (0.188 g, 0.48 mmola). Fiolkę zamknięto, ogrzano do 70°C i wstrząsano przez noc. Żywicę odsączono, przemyto (3 x DCM, 2 x MeOH, 1 x DCM, 2 x eter) i wysuszono w próżni. Pobrano porcję 27 mg żywicy i zadano mieszaniną TFA: TES:DCM w stosunku 5:5:90. Po 15 minutach odfiltrowano i odparowano, uzyskując 8 mg (wydajność 64%) pośredniego produktu chinazolinono-dwuaminowego. Analiza metodą LCMS (chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas) wykazała czystość > 80%.

Etap 2/ Żywicę z etapu 1 spęczniono z 3 ml DCM. Dodano DIEA (0.130 ml, 0.72 mmola) i bromek 4-bromobenzylowy (0.12 g, 0.48 mmola). Fiolkę zamknięto i wstrząsano przez noc. Analiza LCMS rozłożonej porcji wykazała, że stosunek substratu i produktu w mieszaninie wynosi około 1:1. Dodano ponownie takie same ilości DIEA i bromku 4-benzylowego, po czym wstrząsano w temperaturze 70°C przez 8 godzin. Żywicę odsączono, przemyto, jak wyżej i wysuszono w próżni.

Etap 3/ Żywicę z etapu 2 dwukrotnie po 30 minut wstrząsano z mieszaniną TFA:TFS:DCM w stosunku 5:5:90. Filtraty połączono i odparowano, uzyskując 140 mg pomarańczowego oleju. Materiał oczyszczono, stosując preparatywną HPLC z odwrotną fazą (gradient acetonitryl-woda) i otrzymano 27 mg (wydajność 17% dla 3 etapów) mono soli TFA.

P r z y k ł a d 3 (kombinowana synteza wielu związków)

Etap 1/ Żywice 1,2 - diaminoetanotritylową (Novabiochem, 0.95 mmol/g) (200 g, 1.9 mmola) oraz 1,3-diaminopropanotritylową (Novabiochem, 1.14 mmol.g) (2.0 g, 2.28 mmola) umieszczono oddzielnie w 10 ml fiolkach z polipropylenu (Bio-Rad). Do każdej z nich dodano 4 ml DMF, 4 ml chloroformu, 3 równoważniki DIEA (odpowiednio 1.0 ml i 1.2 ml) oraz 2 równoważniki 2-(1'-bromopropylo)-3-benzylochinazolinonu-4 (z przykładu 1) (odpowiednio 1.5 g i 1.8 g). Mieszaniny wstrząsano przez noc w temperaturze 70°C. Każdą z nich przemyto (3 x DCM, 2 x MeOH, 1 x DCM, 2 x eter) i wysuszono w próżni. Analiza rozłożonej porcji wykazała obecność odpowiedniej chinazolonodiaminy o czystości > 90%.

Etap 2/ Żywicę chinazolinoetylodiaminową (105 mg, 0.10 mmola) umieszczono w każdej z fiolek w 2 pierwszych rzędach matrycy, a żywicę chinazolinopropylodiaminową (88 mg, 0.10 mmola) - w 2 ostatnich rzędach matrycy. Do każdej fiolki dodano DIEA (0.131 ml, 0.75 mmola). Do każdej fiolki w pierwszych dwóch rzędach dodano inną aminę, i dodatki te powtórzono dla dwóch ostatnich rzędów. Blok reakcyjny wstrząsano przez noc w temperaturze 70°C. Ciecz z każdej fiolki usunięto przy użyciu wielokanałowego zestawu do pipetowania, po czym żywice przemyto (2 x DCM, 1 x MeOH, 1 x DCM) i wysuszono w próżni.

Etap 3/ Do każdej fiolki w matrycy dodano 2 ml roztworu TFA:TES:DCM w stosunku 10:5:85. Blok reakcyjny wytrząsano przez 45 minut, po czym mieszaniny przeniesiono do bloku filtracyjnego, odsączono i przemyto dwukrotnie 0.75 ml DCM. Roztwory odparowano, uzyskując oleje o barwie żółtej do pomarańczowej. Te gęste oleje dwukrotnie rozcierano z eterem, rozpuszczono w DCM i zadano 4 M roztworem HCI w dioksanie, aby uzyskać sole kwasu solnego (nieznana liczba soli na związek) jako jasnobrązowe do białych, proszkowe lub bezpostaciowe ciała stałe. Analiza LCMS wykazała ich czystość > 75%.

P r z y k ł a d y 4 - 6

Sześć racemicznych chinazolonów rozdzielono na enancjomery przy użyciu chromatografii chiralnej. Chromatografię chiralną trzech spośród tych związków opisano niżej:

PL 204 525 B1

P r z y k ł a d 4:

Kolumna - Chiralpak AD, 250 x 4.6 mm (Diacel Inc.). Próbka - 0.5 mg/ml w etanolu. Warunki 15 minut w 60% etanolu w heksanie, enancjomer 1 wymywany po 4.5 minuty, enancjomer 2 - po 4.9 minuty.

P r z y k ł a d 5:

Kolumna Chiralcel OJ, 250 x 4.6 mm (Diacel Inc.). Próbka - 0.5 mg/ml w etanolu. Warunki 15 minut w 10% etanolu w heksanie, enancjomer (R)-wymywany po 8.4 minuty, enancjomer (S)- wymywany po 9.6 minuty.

P r z y k ł a d 6:

Kolumna - Chiralpak AD, 250 x 4.6 mm (Diacel Inc.). Próbka - 0.5 mg/ml w etanolu. Warunki - 15 minut w 70% etanolu w heksanie, enancjomer 1 wymywany po 6.5 minuty, enancjomer 2 - po 8.8 minuty.

Poniższa tabela podaje czynność IC50 racematu i enancjomerów trzech innych związków rozdzielonych, jak wyżej. We wszystkich trzech przypadkach, jeden z enacjomerów miał znacznie większy potencjał od drugiego. Niezależna synteza chiralna pokazała, że bardziej aktywny jest enancjomer R.

PL 204 525 B1

Następujące dwa związki zsyntetyzowano jako pojedyncze enancjomery w sposób pokazany na fig. 3. Dane wskazują że bardziej aktywny jest enancjomer R.

	Κι(μΜ)	Ki(pM)
	Enancjomer S	Enancjomer R
oQ cOę Sr	2	< 0.1
.9 θ^)^ΝΗί Br	>0.5	<0.05

PL 204 525 B1

P r z y k ł a d 9

Rozdział chiralny przez rekrystalizację z kwasem winowym

Produkt pośredni A, uzyskany w przykładzie 1, można przetworzyć na produkt pośredni B, który po rozdziale, stanowi alternatywę dla pierwszych pięciu etapów pokazanych na fig. 3. Proces jest przedstawiony na poniższym schemacie:

Enancjomer R związku B można krystalizować selektywnie przez ogrzewanie mieszaniny B z 1.1 równoważników D - kwasu winowego w mieszaninie izopropanolu i metanolu, a nastę pnie pozostawienie mieszaniny do uzyskania temperatury pokojowej.

P r z y k ł a d 9: X = Cl, R = H

Racemiczny produkt pośredni B (1.5 g), rozpuszczony w 100 ml wrzącego izopropanolu, zmieszano z 0.8 g D - kwasu winowego w 100 ml wrzącego metanolu. Mieszaninę pozostawiono do powolnego uzyskania temperatury pokojowej. Po pozostawieniu na noc, oddzielono osad przez odsączenie, przepłukano octanem etylu oraz heksanem, i wysuszono na powietrzu. Suchy materiał stały (0.8 g) rozpuszczono we wrzącej mieszaninie 50 ml izopropanolu i 50 ml metanolu, po czym pozostawiono do powolnego ostudzenia do temperatury pokojowej. Po pozostawieniu na noc, oddzielono osad przez odsączenie, przepłukano octanem etylu oraz heksanem, i wysuszono na powietrzu. Suchy materiał mieszano z nasyconym dwuwęglanem sodowym przez 30 minut, po czym ekstrahowano octanem etylu. Część organiczną wysuszono (MgSO4), odsączono i odparowano do suchości. Uzyskany przezroczysty olej ważył 345 mg. Czystość chiralną oceniono na > 95% przez konwersję części do amidu S - Mosher i badanie produktu przez ¹HNMR. Niżej podane enancjomerycznie czyste związki przygotowano według pozostałych etapów z fig. 3, z materiału uzyskanego według opisanej procedury z użyciem odmian D - i L - kwasu winowego.

	Racemat ICsofaM)	Izomer R IC50 (μΜ)	Izomer S IC50(mM)
°9 ΝΗ2 ch3	<0.05	<0.05	>0.5

P r z y k ł a d 10

Indukcja mitotycznego hamowania w populacji komórek poddanych działaniu chinazolinowego inhibitora KSP

W niżej opisany sposób wykonano analizę FACS (metoda fluorescencyjnego sortera komórek) w celu okreś lenia stadium cyklu komórkowego przez pomiar zawartoś ci DNA. Komórki Skov-3 (rak

PL 204 525 B1 jajnika ludzkiego) podzielono w stosunku 1:10 do posiania na płytkach 10 cm i hodowano do subkonfluencji z pożywką RPMI 1640 zawierającą 5% płodowego serum wołowego (FBS). Następnie komórki potraktowano 10 nM paclitaxel, 400 nM chinazolinonu 1, 200 nM chinazolinonu 2 lub 0.25% DMSO (vehiculum dla związków) przez 24 godziny. Z kolei komórki spłukano z płytek przy użyciu PBS zawierającego 5 mM EDTA, pastylkowano, przemyto jeden raz PBS zawierającym 1% FCS i umieszczono na noc w 85% etanolu w temperaturze 4°C. Przed analizą komórki spastylkowano, przemyto jednokrotnie i zabarwiono w roztworze 10 μg jodku propidium i 250 μg rybonukleazy (RNAza) A na mililitr w temperaturze 37°C przez pół godziny. Analizę cytometryczną w przepływie przeprowadzono na urządzeniu Becton-Dickinson FACScan, i przeanalizowano dane z 10,000 komórek dla próbki przy użyciu software Modfit.

Związki chinazolinowe, jak również znany środek antymitotyczny, paclitaxel, powodują przesunięcie w populacji komórek ze stadium cyklu komórkowego G0/G1 (zawartość 2n DNA) do stadium G2/M (zawartość 4n DNA). Stwierdzono, że inne związki tej samej klasy mają podobny wpływ.

Powstawanie jednobiegunowego wrzeciona mitotycznego po wprowadzeniu chinazolinowego inhibitora KSP.

Aby określić naturę akumulacji G2/M, ludzkie komórki nowotworowe Skov-3 (jajnikowe), HeLa (szyjkowe) i A549 (płucne) posiano na płytkach z 96 studzienkami przy gęstościach 4000 komórek na studzienkę (SKOV-3 i HeLa) lub 8000 komórek na studzienkę (A549), pozostawiając na 24 godziny do osadzenia, po czym podawano związki chinazolinowe w różnych stężeniach przez 24 godziny. Komórki zawieszono w 4% formaldehydzie i zabarwiono przeciwciałami antytubulinowymi (które potem wykrywano wtórnymi przeciwciałami znaczonymi fluorescencyjnie) i barwnikiem Hoechsta (który barwi DNA).

Inspekcja wizualna wykazała, że związki chinazolinowe powodują zahamowanie cyklu komórkowego w stadium prometafazy mitozy. DNA zagęścił się i zaczęło się powstawanie wrzeciona mitotycznego, ale powstrzymane komórki równomiernie wykazały jednobiegunowość wrzecion, wskazującą na występowanie zahamowania rozdzielania się biegunów wrzeciona. Mikroiniekcja przeciwciał dla KSP także powodowała zahamowanie mitozy, a powstrzymane komórki wykazywały jednobiegunowe wrzeciona.

Inhibicja rozrostu komórek w komórkach rakowych zadanych chinazolinowymi inhibitorami KSP

Komórki umieszczono na 96-studzienkowych płytkach przy gęstościach od 1000 do 2500 komórek na studzienkę (zależnie od rodzaju komórek) i pozostawiono do wzrostu przez 24 godziny. Następnie oddziaływano na nie lekami w różnych stężeniach przez 48 godzin. Czas dodawania związku określa się jako T0. Do określania ilości żyjących komórek po czasie T0 i komórek pozostałych po 48 godzinach działania związku, stosowano test oparty na tetrazolium, używając związku 3-(4,5-dimetylotiazolilo-2)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium (MTS) (I.S> opis patentowy nr 5,185,450) (patrz nr katalogowy produktów Promega # G3580, CellTiter 96® AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay). Ilość komórek pozostałych po 48 godzinach porównano z ilością komórek żyjących w czasie podawania leku, co pozwoliło obliczyć zahamowanie wzrostu.

Wzrost komórek po 48 godzinach w studzienkach kontrolnych, do których wprowadzono tylko vehikulum (0.25% DMSO) określa się jako wzrost 100% -owy i porównuje się do niego wzrost komórek poddanych działaniu związków. Chinazolinowe inhibitory KSP spowodowały inhibicję rozrostu komórek następujących ludzkich nowotworów: płuc (NCI-H460, A549), piersi (MDA-MB-231, MCF-7, MCF-7/ADR-RES), okrężnicy (HT29, HCT15), jajników (SKOV-3, OVCAR-3), białaczki (HL-60(TB), K-562), centralnego układu nerwowego (SF-268), nerek (A498), kostniakomięsaka (U2-OS) i szyjkowego (HeLa). Ponadto w przypadku nowotworów myszy (B16, czerniak) stwierdzono także zahamowanie wzrostu pod wpływem związków chinazolinowych.

Obliczono GI₅₀ przez sporządzenie wykresu zależności stężenia związku w μΜ i procentowego wzrostu komórek w studzienkach z dodanym związkiem. GI50 obliczone dla związku jest stężeniem, przy którym wzrost jest zahamowany w 50% w stosunku do odnośnika, tj. stężeniem, przy którym:

100 x [(leczone ₄₈ - T₀) / (kontrolne₄₈ - T₀)] = 50

Testy dla wszystkich stężeń związków wykonywano dwukrotnie, a odnośniki uśredniano z 12 studzienek. Bardzo podobny schemat z płytką 96-studzienkową i obliczaniem GI50 jest stosowany przez National Cancer Institute (patrz Monks i in., Natl. Cancer. Inst. 83: 757-766 (1991)). Różnica polega na tym, że NCI stosuje inną metodę zliczania komórek, bez użycia MTS.

PL 204 525 B1

Obliczanie IC50

W pomiarze IC50 dla aktywności kompozycji w stosunku do KSP wykorzystuje się test ATPazy. Stosuje się następujące roztwory: Roztwór 1 składający się z 3 mM soli potasowej fosfoenolopirogronianu (Sigma P-7127), 2 mM ATP (Sigma A- 3377), 1 mM IDTT (Sigma D-9779), 5 paclitaxel (Sigma T-7402), 10 ppm odpieniacza 289 (Sigma A-8436), 25 mM Pipes/KOH pH 6.8 (Sigma P6757), 2 mM MgCI2 (VWR JT400301), oraz 1 mM EGTA (Sigma E3889); Roztwór 2 zawierający 1 mM NADH (Sigma N8129), 0.2 mg/ml BSA (Sigma A7906), kinazę pirogronową 7U/ml, dehydrogenazę L-mleczanu 10 U/ml (Sigma P0294), 100 nM domeny napędowej KSP, 50 μg/ml mikrokanalików, 1 mM DTT (Sigma D9779), 5 μM paclitaxel (Sigma T-7402), 10 ppm odpieniacza 289 (Sigma A-8436), 25 mM Pipes/KOH pH 6.8 (Sigma P6757), 2 mM MgCI2 (VWR JT4003-01), oraz 1 mM EGTA (Sigma E3889). Dokonano seryjnych rozcieńczeń (8-12 podwójnych rozcieńczeń) kompozycji w 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania (Corning Costar 3695) przy użyciu Roztworu 1. Po rozcieńczeniu w każdej studzience było 50 μl roztworu 1. Reakcję zapoczątkowano dodatkiem 50 μl roztworu 2 do każdej studzienki, używając wielokanałowego zestawu do pipetowania. Płytkę przenoszono do czytnika absorbancji i dokonywano kilku odczytów absorbancji dla każdej studzienki przy 340 nm (sposób pracy - kinetic mode). Obserwowaną szybkość zmiany, która jest proporcjonalna do szybkości ATPazy, przedstawiono na wykresie w funkcji stężenia związku. Dla określenia standartowej wartości IC50 używano poniższego równania z czterema parametrami, rozwiązywanego przy zastosowaniu programu nieliniowego dopasowania (np. Grafit 4):

zakres y = -----------------------------+ tło + (x/IC50)^s gdzie y jest obserwowaną szybkością a x - stężeniem związku.

Związki chinazolinowe hamują wzrost w różnych grupach komórek, w tym także (MCF-7/ADRRES, HCT1 5), rozwijających P-glikoproteinę (znaną także jako Multidrug Resistance lub MDR⁺), która przenosi odporność na inne chemoterapeutyki, jak paclitaxel. A zatem, chinazolinony są antymitotykami, które powstrzymują rozrost komórek, i nie są podatne na odporność spowodowaną nadekspresją MDR⁺ w komórkach lekoodpornych nowotworów.

Dla innych związków tej klasy także stwierdzono hamowanie rozrostu komórek, chociaż wartości GI50 zmieniają się. Wartości GI50 dla badanych związków chinazolinowych znajdowały się w zakresie od 200 nM do większych od najwyższych badanych stężeń. Oznacza to, że chociaż większość związków hamujących biochemicznie czynność KSP powstrzymuje rozrost komórek, to w niektórych przypadkach przy najwyższym badanym stężeniu (około 20 μM), wzrost ten był hamowany poniżej 50%. Wiele z tych związków ma wartości GI₅₀ niższe od 10 μM, a dla kilku wynoszą one mniej niż 1 μM. Związki działające przeciwrozrostowo, które skutecznie stosowano w praktyce klinicznej do leczenia raka (chemoterapeutyki raka) mają bardzo zróżnicowane wartości Gl50. Na przykład dla komórek A549 - GI₅₀ wynosi dla paklitakselu 4 nM, doksorubicyny 63 nM, 5-fluorouracilu 1 μM, a hydroksymocznika 500 μM (dane dostarczone przez National Cancer Institute, Developmental Therapeutic Program, http://dtp.nci.nih.gov/). A zatem, związki hamujące rozrost komórek można stosować w każdym stężeniu. Jednakże korzystne jest używanie związków, dla których wartości GI₅₀ są mniejsze od 1 nM, bardziej korzystnie - od 20 μM, a jeszcze bardziej korzystnie - od 10 μM. Wskazane jest dalsze obniżanie tych wartości do rzędu 1 μM. Dla niektórych związków chinazolinowych według wynalazku wartości GI50 wynoszą od mniej niż 200 nM do mniej niż 10 nM.

P r z y k ł a d 11

Samicom myszy ważącym około 20 g wszczepiono podskórnie przy użyciu trokaru fragmenty ludzkiego guza rakowego wyhodowanego podskórnie u mysiego żywiciela. Po uzyskaniu guza wielkości około 77 mg, zwierzęta dobrano w pary celem stworzenia grup leczonych i kontrolnych. W każdej grupie było 8 myszy z guzami, a każda była oznakowana na uchu i obserwowana indywidualnie w czasie eksperymentu. Wstępne dawki (10 ml/kg buforu cytrynianowego 66 mM o wartości pH 5.0 / 0.9% solanki / 10% Tween 80 preparatu każdego badanego związku o maksymalnym stężeniu 5 mg /ml) podawano pierwszego dnia po dobraniu w pary, w wymienionych ilościach i porcjach.

Myszy ważono dwa razy w tygodniu i tak samo często mierzono wielkość guzów przy pomocy cyrkli, począwszy od dnia 1. Z tych pomiarów wielkości guzów, wyliczano ich ciężar według znanego wzoru W² x L/2. Eksperyment zakończono, gdy w grupie kontrolnej uzyskano przeciętną wagę guza około 1 g. Po zakończeniu myszy zważono, uśmiercono i wycięto guzy. Guzy zważono, po czym obli20

PL 204 525 B1 czono przeciętną masę leczonego guza dla danej grupy. W tym modelu, wartość stosunku zmiany średniej masy leczonego guza do zmiany średniej masy guza dla próby porównawczej x 100% (ΔΪ / Δ^ odejmowano od 100% w celu określenia hamowania wzrostu guza (TGI) dla każdej grupy.

Niżej przedstawione związki (1-5) testowano opisaną metodą i uzyskano wyniki podane w tabelach A-D. Inne związki według wynalazku, badane tą metodą wykazały porównywalne aktywności.

Związek 1

Związek 2

Związek 3

Związek 4

Związek 5

PL 204 525 B1

Tabela A Heteroprzeszczep guza SKOV3
	Vehiculum	Związek 1	Taxol
Dawka i podawanie	5 x dziennie	80 mg/kg co 3 dzień x 4	20 mg/kg codziennie x 5
Sposób podawania	dożylnie	dożylnie	dootrzewnowo
Ilość myszy na początku	8	8	8
Końcowa masa guza (średnia + błąd standartowy)	904 ±126.5	554.3 ± 76.8	90.4 ± 36.0
Hamowanie wzrostu guza	-	41.5%	91.7%
Myszy z częściowym skurczem guza	0	0	4
Średni % skurczu guza	-	-	27.9%
Maksymalna strata wagi	brak	brak	16.5%
Umieralność	0	1	0

Tabela B Heteroprzeszczep guza SKOV3
	Vehiculum	Związek 2	Związek 3	Taxol
Dawka i podawanie	5 x dziennie	50 mg/kg co 3 dzień x 4	60 mg/kg codziennie x 5	20 mg/kg codziennie x 5
Sposób podawania	dożylnie	dożylnie	dożylnie	dootrzewnowo
Ilość myszy na początku	8	8	8	8
Końcowa masa guza (średnia ± błąd standartowy)	1506.3 ±227.1	340.8 ± 93.0	806.1 ± 163.8	55.9 + 29.4
Hamowanie wzrostu guza	-	81.5%	48.3%	99.7%
Myszy z częściowym skurczem guza	0	0	0	7
Średni % skurczu guza	-	-	-	43.5%
Maksymalna strata wagi	brak	brak	2.76%	7.49%
Umieralność	0	0	1	0

Tabela C Heteroprzeszczep guza SKOV3
	Vehiculum	Związek 4	Taxol
1	2	3	4
Dawka i podawanie	5 x dziennie	4 mg/kg co tydzień x 3	20 mg/kg codziennie x 5
Sposób podawania	dożylnie	dożylnie	dootrzewnowo
Ilość myszy na początku	8	8	8

PL 204 525 B1 cd. tabeli C

1	2	3	4
Końcowa masa guza (średnia ± błąd standartowy)	1191.1 ±239.6	726.9 ±147.2	90.6 ± 34.5
Hamowanie wzrostu guza	-	40.1%	87.1%
Myszy z częściowym skurczem guza	0	0	4
Średni % skurczu guza	-	-	44.4%
Maksymalna strata wagi	brak	0.02%	12.26%
Umieralność	1	1	1

Tabela D Heteroprzeszczep guza SKOV3
	Vehiculum	Związek 5	Taxol
Dawka i podawanie	5 x dziennie	25 mg/kg codziennie x5	20 mg/kg codziennie x 5
Sposób podawania	dożylnie	dożylnie	dootrzewnowo
Ilość myszy na początku	8	8	8
Końcowa masa guza (średnia ± błąd standartowy)	1230.4 ± 227.3	405.6 ± 124.8	379.0 ± 154.0
Hamowanie wzrostu guza	-	71.0%	73.0%
Myszy z częściowym skurczem guza	0	1	0
Średni % skurczu guza	-	56.3%	-
Maksymalna strata wagi	brak	brak	8.77%
Umieralność	0	0	0

Zastrzeżenia patentowe

Claims (10)

1. Związki chinazolinowe o wzorze:

lub ich sole akceptowalne farmaceutycznie, w których grupa izopropylowa jest dołączona w konfiguracji R; R1 jest grupą benzylową chlobenzylową, metylobenzylową, metoksybenzylową, cyjano-benzylową lub hydroksybenzylową; R2 jest chlorowcem lub grupą cyjanową; a R3 jest grupą fenylową podstawioną metylem i/lub chlorowcem.

PL 204 525 B1

2. Związki lub sole według zastrz. 1 w postaci istotnie czystych optycznych izomerów R.

3. Związki lub sole według zastrz. 1, znamienne tym, że R1 jest grupą benzylową.

4. Związki lub sole według zastrz. 1, znamienne tym, że R2 jest chlorem.

5. Związki lub sole według zastrz. 1, znamienne tym, że R1 jest grupą benzylową R2, jest chlorem, a R3 jest grupą 4-metylofenylową.

6. Związki lub sole według zastrz. 5 w postaci istotnie czystych optycznych izomerów R.

7. Zastosowanie związków chinazolinowych o wzorze:

lub ich soli akceptowalnych farmaceutycznie, w których grupa izopropylowa jest dołączona w konfiguracji R; R1 jest grupą benzylową, chlobenzylową, metylobenzylową, metoksybenzylową, cyjano-benzylową lub hydroksybenzylową; R2 jest chlorowcem lub grupą cyjanową; a R3 jest grupą fenylową podstawioną metylem i/lub chlorowcem; korzystnie w postaci istotnie czystych optycznych izomerów R; jako środków farmaceutycznych.

8. Zastosowanie według zastrz. 7 jako środków farmaceutycznych przeznaczonych do leczenia chorób związanych z rozrostem komórek.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że środki farmaceutyczne przeznaczone są do leczenia raka, rozrostów, nawrotu zwężenia, przerostu serca, chorób układu immunologicznego lub zapaleń.

10. Kompozycje farmaceutyczne, znamienne tym, że zawierają związki chinazolinowe o wzorze:

lub ich sole akceptowalne farmaceutycznie, w których grupa izopropylowa jest dołączona w konfiguracji R; R1 jest grupą benzylową, chlobenzylową, metylobenzylową, metoksybenzylową, cyjano-benzylową lub hydroksybenzylową; R2 jest chlorowcem lub grupą cyjanową; a R3 jest grupą fenylową podstawioną metylem i/lub chlorowcem; korzystnie w postaci istotnie czystych optycznych izomerów R; oraz nośniki.