PL203998B1

PL203998B1 - Nowy związek chinazolinowy, zastosowanie związku chinazolinowego, sposób jego otrzymywania i kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek chinazolinowy

Info

Publication number: PL203998B1
Application number: PL354891A
Authority: PL
Inventors: Jeffrey T. Finer; Gustave Bergnes; Bainian Feng; Whitney W. Smith; John C. Chabala
Original assignee: Cytokinetics Inc
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 2000-10-26
Publication date: 2009-11-30
Also published as: CA2388646C; AU2004218601A1; ES2263501T3; EP1686120A2; HUP0203430A3; JP4116332B2; BR0015110A; NO20021907L; IL149164A; JP2003048881A; MXPA02004162A; DE60028227T2; EP1226129A1; HUP0203430A2; ATE327224T1; KR20050049562A; EP1686120A3; KR20020062930A; IL149164A0; JP2003512461A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne chinazolinowe, zastosowanie związku chinazolinowego, sposób jego otrzymywania i kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek chinazolinowy. Nowe pochodne chinazolinowe są inhibitorami KSP, kinezyny uczestniczącej w mitozie. Inhibitory te stosuje się w leczeniu chorób związanych z rozrostem komórek, na przykład raka, rozrostów, nawrotu zwężenia, przerostu serca, zaburzeń odporności oraz chorobach zapalnych.

Zainteresowanie medycznym zastosowaniem pochodnych chinazoliny rozpoczęło się we wczesnych latach pięćdziesiątych od wyjaśnienia budowy alkaloidu chinazoliny, 3-[e-keto-gamma-(3-hydroksy-2-piperydylo)-propylo]-4-chinazolonu, pochodzącego z azjatyckiej rośliny o właściwościach przeciwmalarycznych. W wyniku poszukiwania innych środków przeciwmalarycznych, zsyntetyzowano różne podstawione chinazoliny.

Szczególne znaczenie miała synteza pochodnej 2-metylo-3-o-tolilo-4-(3H)-chinazolonu. Ten związek, znany jako metakwalon, pomimo braku oddziaływania na pierwotniaki, wykazał działanie nasenne.

Od tej pory badano aktywność farmakologiczną chinazolonów i ich pochodnych. Obecnie wiadomo, że związki te działają nasennie, uspokajająco, przeciwbólowo, przeciwdrgawkowo, przeciwkaszlowo i przeciwzapalnie.

Poszczególne zastosowania pochodnych chinazolinowych przedstawiono w opisach patentów amerykańskich: w patencie nr 5,147,875, w którym ujawniono 2-(podstawiony fenyl)-4-oksochinazoliny o aktywności rozszerzającej oskrzela; w patentach nr 3,723,432, nr 3,740,442 i nr 3,925,548, w których opisano klasę pochodnych typu 1-podstawnik-4-arylo-2(1H)-chinazolon, stosowanych jako środki przeciwzapalne. W europejskich opisach patentowych przedstawiono inne przykłady, a mianowicie: w EP 0 056 637 B1 - klasę pochodnych 4(3H)-chinazolonu do leczenia nadciśnienia; w EP 0 884 319 A1 kompozycję 4-chinazolonu do leczenia zaburzeń o charakterze zwyrodnieniowym, psychotropowym oraz wywołanych przez narkotyki i alkohol, występujących w centralnym i obwodowym układzie nerwowym.

Chinazolony zaliczają się do rosnącej grupy środków do leczenia chorób związanych z rozrostem komórek, w tym raka. Przykładowo, w zgłoszeniu PCT WO 96/06616 opisano kompozycję farmaceutyczną zawierającą pochodną chinazolinową odpowiednią do hamowania rozrostu komórek naczyniowych gładkich, a w zgłoszeniu PCT WO 96/19224 - komórek mezangialnych. W opisach patentowych amerykańskich nr 4,981,856, nr 5,081,124 i nr 5,280,027 ujawniono pochodne chinazolinowe będące inhibitorami syntazy tymidylanowej, tj. enzymu katalizującego metylowanie monofosforanu dezoksyurydyny, prowadzące do wytwarzania monofosforanu tymidyny, potrzebnego do syntezy DNA. W opisach patentowych amerykańskich nr 5,747,498 i nr 5,773,476 przedstawiono pochodne chinazolinonu stosowane do leczenia nowotworów charakteryzujących się nadczynnością lub nieodpowiednią aktywnością receptorów o aktywności kinazy tyrozynowej. W opisie patentowym amerykańskim nr 5,037,829 ujawniono kompozycje chinazoliny z podstawieniem typu (1H-1-azolilometylo)- do leczenia raka w komórkach nabłonkowych; w zgłoszeniu PCT WO 98/34613 - kompozycje zawierające pochodne chinazoliny odpowiednie do stymulowania ponownego unaczynienia oraz w leczeniu nowotworów złośliwych; a w opisie patentowym amerykańskim nr 5,187,167, przedstawiono pochodne 4-chinazolonu wykazujące działanie przeciwnowotworowe.

Innymi środkami stosowanymi w leczeniu raka są alkaloidy taksanowe (taksany) oraz alkaloidy winka. Wpływają one na aktywność mikrotubul, obecnych w wielu różnych strukturach komórkowych. Mikrotubule stanowią podstawowy element budujący wrzeciono mitotyczne, które jest odpowiedzialne za dostarczanie powielonych kopii genomu do każdej z dwóch komórek potomnych powstających przy podziale komórki. Przyjmuje się, że uszkodzenie wrzeciona mitotycznego przez wspomniane powyżej środki, powoduje zahamowanie podziału komórek rakowych i prowadzi do ich śmierci. Jednakże mikrotubule stanowią również budulec innych struktur komórkowych, np. drogi transportu wewnątrzkomórkowego w procesach przekaźnictwa nerwowego. Biorąc pod uwagę, że działanie wspomnianych środków nie ogranicza się tylko do wrzeciona mitotycznego, środki te mogą prowadzić do dotkliwych skutków ubocznych, które zmniejszają użyteczność tych środków jako leków.

Uzyskanie większej specyficzności działania środków stosowanych w leczeniu raka jest bardzo istotne, ze względu na możliwe do uzyskania działanie lecznicze, przy ograniczeniu skutków ubocznych ich przyjmowania. Zwykle znaczną poprawę w leczeniu raka uzyskiwano dzięki opracowaniu środków leczniczych o nowym mechanizmie działania. Dotyczy to nie tylko taksanów, ale także inhibitorów topoizomerazy I z klasy kamptotecyny. Z obu tych przyczyn, kinezyny uczestniczące w mitozie są interesującymi obiektami przy opracowywaniu nowych środków przeciwrakowych.

PL 203 998 B1

Kinezyny uczestniczące w mitozie są podstawowymi enzymami przy tworzeniu wrzeciona mitotycznego i od nich zależy funkcjonowanie wrzeciona, jednak kinezyny zasadniczo nie należą do innych struktur tworzonych przez mikrotubule, jakich np. procesy nerwowe. Kinezyny uczestniczące w mitozie odgrywają zasadniczą rolę we wszystkich fazach mitozy jako „motory molekularne”, przetwarzające energię uwalnianą w reakcji hydrolizy adenozynotrifosforanu w energię kinetyczną umożliwiającą ukierunkowane przenoszenie różnych cząstek wzdłuż mikrotubul. Domena katalityczna odpowiednia do wykonania tego zadania jest zwartą strukturą składającą się z około 340 reszt aminokwasowych. W trakcie mitozy, kinezyny budują z mikrotubul dwubiegunową strukturę, będącą wrzecionem mitotycznym. Kinezyny pośredniczą w ruchu chromosomów wzdłuż mikrotubul wrzeciona, jak również w strukturalnych zmianach wrzeciona, zachodzą cych w okreś lonych fazach mitozy. Eksperymentalne zakłócenie działania kinezyn uczestniczących w mitozie wywołuje niewłaściwe uformowanie lub dysfunkcję wrzeciona mitotycznego, czasem prowadzącą do zahamowania cyklu komórkowego i śmierci komórki.

Jedną ze zidentyfikowanych kinezyn uczestniczących w mitozie jest KSP. KSP należy do ewolucyjnie zachowanej podrodziny kinezyn, która obejmuje motory mikrotubularna skierowane w kierunku bieguna dodatniego, które łączą się w dwubiegunowe homotetramery złożone z antyrównoległych homodimerów. W trakcie mitozy KSP wiąże się z mikrotubulami wrzeciona mitotycznego. Wstrzyknięcie do komórek ludzkich przeciwciał skierowanych przeciwko KSP zapobiega rozdziałowi biegunów w czasie prometafazy, prowadząc do powstania wrzecion jednobiegunowych i powodując zahamowanie mitozy oraz indukując programowaną śmierć komórek. W organizmach innych niż ludzkie, KSP i, inne pokrewne, kinezyny tworzą wiązki przeciwrównoległych mikrotubul i umożliwiają przesuwanie tych mikrotubul względem siebie, co prowadzi do rozdzielenia biegunów wrzeciona. KSP może również pośredniczyć w wydłużaniu wrzeciona w czasie anafazy B i w zbieraniu się mikrotubul na biegunie wrzeciona.

Ludzkie KSP (zwane także HsEg5) zostało opisane w literaturze [Blangy i in., Cell, 83:1159-69 (1995); Whitehead i in., Arthritis Rheum., 39:1635-42 (1996); Galgio i in., J. Cell. Biol., 135:339-414 (1996); Blangy i in., J. Biol. Chem., 272:19418-24 (1997); Blangy i in., Cell Motil Cytoskeleton, 40:174-82 (1998); Whitehead i Rattner, J. Cell. Sci, 111: 2551-61 (1998); Kaiser i in., JBC 274:18925-31 (1999); GenBank numery dostępu: X85137, NM004523 i U37426], wyznaczono również fragment genu kodującego KSP (TRIP5) [Lee i in., Mol Endocrinol., 9:243-54 (1995); GenBank numer dostępu L40372]. Przedstawiono również w literaturze homologi KSP z Xenopus (Eg5) i Drosophila KLP61 F/KRP1 30.

Kinezyny uczestniczące w mitozie stanowią ciekawy element struktur komórkowych, który może być obiecujący przy opracowywaniu nowych chemoterapeutyków skierowanych na proces mitoz. W zwią zku z powyż szym, celem wynalazku jest uzyskanie kompozycji i sposobów zastosowania hamowania aktywności KSP, kinezyny biorącej udział w mitozie.

Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze 1a

w którym:

R1 oznacza benzyl; R2 oznacza etyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 2-fluorofenyl, R4 oznacza 2-dimetyloaminoetyl; R5-R8 oznaczają wodór; albo

PL 203 998 B1

R1 oznacza benzyl; R2 oznacza etyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 3-fluorofenyl; R4 oznacza 2-dimetyloaminoetyl; R5-R8 oznaczają wodór; albo

R1 oznacza benzyl; R2 oznacza etyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 4-fluorofenyl; R4 oznacza 2-dimetyloaminoetyl; R5-R8 oznaczają wodór; albo

R1 oznacza benzyl; R2 oznacza etyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 3-bromofenyl; R4 oznacza 2-dimetyloaminoetyl; R5-R8 oznaczają wodór; albo

R1 oznacza benzyl; R2 oznacza etyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 4-bromofenyl; R4 oznacza 2-dimetyloaminoetyl; R5-R8 oznaczają wodór; albo

R1 oznacza benzyl; R2 oznacza etyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 1-naftyl; R4 oznacza 2-dimetyloaminoetyl; R5-R8 oznaczają wodór; albo

R1 oznacza benzyl; R2 oznacza metyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 3-bromofenyl; R4 oznacza 2-dimetyloaminoetyl; R5-R8 oznaczają wodór; albo

R1 oznacza benzyl; R2 oznacza metyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 4-bromofenyl; R4 oznacza 2-dimetyloaminoetyl; R5-R8 oznaczają wodór; albo

R1 oznacza benzyl; R2 oznacza metyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 4-bromofenyl; R4 oznacza 2-aminoetyl; R5-R8 oznaczają wodór; albo

R1 oznacza benzyl; R2 oznacza etyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 4-bromofenyl; R4 oznacza 2-aminoetyl; R5-R8 oznaczają wodór; albo izomer R w którym R1 oznacza benzyl; R2 oznacza etyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 4-bromofenyl; R4 oznacza 2-dimetyloaminoetyl; R5-R8 oznaczają wodór; albo izomer R w którym R1 oznacza benzyl; R2 oznacza etyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 1-naftyl, R4 oznacza 2-dimetyloaminoetyl; R5-R8 oznaczają wodór; albo izomer R w którym R1 oznacza benzyl; R2 oznacza etyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 4-bromofenyl; R4 oznacza 2-dimetyloaminoetyl; R5-R8 oznaczają wodór; albo izomer R w którym R1 oznacza benzyl; R2 oznacza etyl; R2' oznacza wodór; R3 oznacza 4-bromofenyl; R4 oznacza 2-aminoetyl; R5, R6 i R8 oznaczają wodór, a R7 oznacza chlor, lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

W innej odmianie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku określonego powyżej do wytwarzania leku do leczenia chorób proliferacyjnych. Korzystnie choroby proliferacyjne obejmują rozrost, nawrót zwężenia, przerost serca, choroby immunologiczne lub zapalne. W innym korzystnym rozwiązaniu chorobą proliferacyjną jest nowotwór.

Kolejną odmianą wynalazku jest sposób otrzymywania związku określonego powyżej, który obejmuje etap, w którym doprowadza się do kontaktu związku o wzorze 1c

z odpowiednim związkiem o wzorze R3(CO)CI i wyodrę bnia się związek o wzorze 1a. Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja farmaceutyczna, która zawiera związek określony powyżej oraz fizjologicznie dopuszczalny nośnik.

W opisie przedstawiono równie ż sposoby leczenia chorób zwią zanych z rozrostem komórek, leczenia zaburzeń wynikających z aktywność kinezyny KSP oraz hamowania aktywności kinezyny KSP. W tych sposobach wykorzystuje się zwią zki wybrane z grupy opisane powyż ej.

Do chorób i zaburzeń podlegających leczeniu z użyciem związków według wynalazku należą rak, rozrosty, nawrót zwężenia, przerost serca, zaburzenia odporności i zapalenia.

PL 203 998 B1

Wynalazek obejmuje także zastosowanie związków do hamowania aktywności kinezyny KSP.

Ponadto wynalazek przedstawia sposoby poszukiwania związków, które wiążą się z kinezyną KSP, na przykład związków, które zastępują związki według wynalazku lub tworzą wiązanie z kinezyną KSP kompetycyjne względem związków według wynalazku. Sposoby te obejmują łączenie znakowanego związku według wynalazku z kinezyną KSP i przynajmniej jednym badanym związkiem oraz wyznaczanie wiązania badanego związku z kinezyną KSP.

W opisie przedstawiono również sposoby poszukiwania związków wpływających na aktywność kinezyny KSP. Sposoby te obejmują kontaktowanie kompozycji według wynalazku, kinezyny KSP i przynajmniej jednego badanego związku oraz następnie określanie wpływu badanego związku na aktywność kinezyny KSP.

Wynalazek jest dodatkowo objaśniony na rysunku, w którym:

fig. 1 przedstawia ogólny schemat syntezy pochodnych chinazolinowych według wynalazku, fig. 2 przedstawia sposób syntezy chinazolinowych inhibitorów KSP, fig. 3 przedstawia reprezentatywne wzory chemiczne chinazolinowych inhibitorów KSP, fig. 4 przedstawia sposób syntezy zasadniczo czystych poszczególnych enancjomerów oraz fig. 5 przedstawia sposób syntezy pewnych związków chinazolinowych: sulfonamidów (5a), karbaminianów (5b), moczników (5c) i amin (5d).

Przedmiotem wynalazku są nowe związki, oparte na podstawowej strukturze chinazolinowej, które wpływają na aktywność kinezyn biorących udział w mitozie. Związki te hamują aktywność lub w inny sposób zmieniają aktywność tylko tych kinezyn, które uczestniczą w mitozie, nie wpływając na aktywność innych kinezyn (np. kinezyn uczestniczących w transporcie). Dzięki temu uzyskuje się specyficzne zahamowanie proliferacji komórek. Wynalazek opiera się na odkryciu, że zakłócenie działania kinezyny biorącej udział w mitozie powoduje wady rozwojowe lub dysfunkcje wrzecion mitotycznych, często prowadzące do zahamowania cyklu komórkowego i śmierci komórek. Sposoby hamowania aktywności ludzkiej kinezyny KSP obejmują zetknięcie inhibitora według wynalazku z kinezyną KSP, zwłaszcza ludzką bądź z fragmentami i wariantami KSP. Hamowanie aktywności kinezyny obejmuje zarówno hamowanie hydrolizy ATP kinezyny KSP Hoeaina jak i hamowanie tworzenia wrzeciona mitotycznego, powodujące przerwanie wrzecion mitotycznych. Przerwaniu mogą ulegać także wrzeciona mejotyczne.

Wynalazek oparty jest także na opracowaniu inhibitorów i modulatorów kinezyn uczestniczących w mitozie, zwłaszcza KSP, do leczenia zaburzeń związanych z rozrostem komórek. Zazwyczaj znaczną poprawę w leczeniu raka, który jest jednym z zaburzeń wynikających z rozrostu komórek, uzyskiwano dzięki opracowaniu środków leczniczych o nowych mechanizmach działania. Przykładami są nie tylko związki z klasy taksanów, wpływające na powstawanie mikrotubul, ale również inhibitory topoizomerazy I z grupy kamptotecyny. Opisane kompozycje i sposoby mogą się różnić selektywnością i korzystnie są stosowane w leczeniu chorób związanych z rozrostem komórek, w tym raka, rozrostów, nawrotu zwężenia, przerostu serca, zaburzeń odporności i zapalenia.

Zgodnie z powyższym, przedmiotem wynalazku są sposoby wykorzystujące amidy chinazolinowe o wzorze 1a:

gdzie podstawniki R1-R8 zostały zdefiniowane powyżej.

PL 203 998 B1

Większość opisanych tutaj związków zawiera więcej niż jeden środek asymetrii (np. węgiel z podstawnikami R2 i R2'), które mogą powodować tworzenie enancjomerów, diastereoizomerów, oraz innych form stereoizomerycznych, zdefiniowanych zgodnie z klasyczną stereochemią jako (R)- lub (S)-. Zakres wynalazku obejmuje również wszystkie możliwe izomery, w tym mieszaniny racemiczne, postacie czyste optycznie i mieszaniny pośrednie. Izomery czynne optycznie (R)- i (S)- można przygotować przy użyciu chiralnych syntetyków lub chiralnych odczynników, bądź rozdzielić konwencjonalnymi sposobami. Jeżeli opisane związki zawierają podwójne wiązania olefinowe lub inne środki asymetrii geometrycznej, i o ile nie podano inaczej, przyjmuje się, że w ich skład wchodzą zarówno izomery geometryczne E, jak i Z. To samo dotyczy wszystkich postaci tautomerycznych.

Jeżeli występuje taka potrzeba, izomery R- i S- można oddzielić znanymi sposobami, na przykład przez tworzenie soli lub kompleksów diastereoizomerycznych, które mogą być rozdzielone, przykładowo przez krystalizację; przez tworzenie pochodnych diastereoizomerycznych, które mogą być rozdzielone, przykładowo przez krystalizację, chromatografię gaz-ciecz lub chromatografię cieczową selektywną reakcję jednego z enancjomerów ze specyficznym dla niego odczynnikiem, na przykład enzymatyczne utlenianie lub redukcję, a następnie separację zmodyfikowanych lub niezmodyfikowanych enancjomerów; albo stosując chromatografię w układzie gaz-ciecz lub chromatografię cieczową w środowisku chiralnym, na przykład na chiralnym podłożu, takim jak krzemionka z dołączonym chiralnym ligandem lub w obecności chiralnego rozpuszczalnika. Należy zdawać sobie sprawę że gdy pożądany enancjomer jest przetwarzany w inną chemiczną cząsteczkę przy użyciu jednego z opisanych sposobów separacji, to wymagany będzie następny etap w celu uwolnienia pożądanej postaci enancjomerycznej. Alternatywnie, specyficzny enancjomer może być syntetyzowany w drodze asymetrycznej syntezy z udziałem czynnych optycznie odczynników, substratów, katalizatorów lub rozpuszczalników, lub przez konwersję w inną postać poprzez asymetryczną transformację. Przykład syntezy z czynnych optycznie materiałów wyjściowych pokazano na fig. 4.

Kompozycje według wynalazku są syntetyzowane, jak podano niżej, przy użyciu znanych sposobów. Przykładowo, według pracy Ager i in., J. of Med. Chem. 20:379-386 (1977), chinazolony można otrzymać przez katalizowaną kwasami kondensację kwasów N-acyloantranilowych z pierwszorzędowymi aminami aromatycznymi. Inne procesy syntez przedstawiają opisy patentowe Stanów Zjednoczonych AP nr 5,783,577, 5,922,866 i 5,187,167.

Kompozycje według wynalazku można otrzymać, jak pokazano na rysunku, w tym na fig. 1, 2, 4 i 5.

Kompozycje według wynalazku znajdują wiele zastosowań. Zgodnie z wiedzą, specjalisty, proces mitozy może być modyfikowany w różny sposób, mianowicie przez zwiększenie albo zmniejszenie aktywności poszczególnych czynników w procesie mitozy. Innymi słowy, na mitozę można wpływać (np. przerwać proces mitozy) przez zakłócenie równowagi, w wyniku hamowania lub aktywizowania niektórych składników. Podobnie można wpływać na mejozę.

W korzystnym rozwiązaniu kompozycje według wynalazku są stosowane do oddziaływania na powstawanie wrzeciona mitotycznego, powodując w ten sposób dłuższe zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie mitozy. „Oddziaływanie lub wpływanie” określa tu wpływ na tworzenie wrzeciona mitotycznego, to jest hamowanie lub stymulację tworzenia wrzeciona. Pod określeniem „tworzenie wrzeciona mitotycznego” rozumie się łączenie mikrotubul w dwubiegunowe struktury przez kinezyny uczestniczące w mitozie. „Dysfunkcja wrzeciona mitotycznego” oznacza zatrzymanie procesu mitozy i powstawanie wrzeciona jednobiegunowego.

Kompozycje według wynalazku są odpowiednie do wiązania KSP, kinezyny uczestniczącej mitozie i/lub wpływania na jej aktywność. W korzystnym rozwiązaniu kinezyną jest ludzka KSP, chociaż mogą być stosowane kinezyny KSP pochodzące z innych organizmów. W tym kontekście, wpływanie na tworzenie wrzeciona mitotycznego oznacza zwiększanie lub zmniejszanie rozdziału biegunów wrzeciona, nieodpowiednie tworzenia, tj. zniekształcenie biegunów wrzeciona mitotycznego, lub jego wad morfologicznych. Dotyczy to również zastosowania do odmian i/lub fragmentów KSP. Patrz amerykańskie zgłoszenie patentowe „Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation and Methods of Diagnosing Cell Proliferation States”, z 12 października 1999 (US Serial nr 09/428,156). W zastosowaniach według wynalazku można wykorzystać także inne kinezyny mitotyczne, jednak korzystne są kompozycje specyficzne względem KSP.

Celem określenia aktywności, KSP lub związek według wynalazku unieruchamia się przez związanie w sposób uniemożliwiający dyfuzję z nierozpuszczalnym podłożem o wydzielonych miejsca do nanoszenia próbek, (np. w płytce mikrotitracyjnej, macierzach itd.). Nierozpuszczalne podłoże może być wykonane z dowolnego materiału, z którym kompozycja może być związana. Daje się ono

PL 203 998 B1 łatwo oddzielić od materiału rozpuszczalnego i może być stosowane w typowych sposobach przeszukiwania związków. Powierzchnia takich podłoży może być lita lub porowata, a kształt - dowolny. Przykładami odpowiednich podłoży nierozpuszczalnych są płytki mikrotitracyjne, macierze, membrany i perełki. Wykonuje się je zazwyczaj ze szkła, tworzyw sztucznych (np. polistyrenu), policukrów, nylonu lub nitrocelulozy, Teflonu™ itd. Płytki mikrotitracyjne i macierze są szczególnie wygodne, ponieważ dają możliwość jednoczesnego prowadzenia dużej ilości testów, przy użyciu małych ilości odczynników i próbek. Przeprowadzenie testu wiązania kompozycji nie ma istotnego znaczenia, o ile jest kompatybilne z odczynnikami i ogólnymi sposobami według wynalazku i utrzymuje aktywność kompozycji. Korzystne procedury wiązania obejmują zastosowanie przeciwciał (które nie blokują przestrzennie miejsc wiązania ligandu lub sekwencji aktywacyjnej, gdy białko jest wiązane z podłożem), bezpośrednie wiązanie z lepkimi lub jonowymi podłożami, sieciowanie chemiczne, syntezę białka lub środka na podłożu, itd. Po związaniu białka lub środka, nadmiar niezwiązanego materiału usuwa się przez spłukiwanie. Obszary, na które naniesiono próbki, mogą być następnie blokowane przez inkubację przy użyciu surowiczej albuminy bydlęcej (BSA), kazeiny lub innego nieszkodliwego białka, bądź innej cząsteczki.

Przeciwdziałające mitozie środki według wynalazku są stosowane do wpływania na aktywność kinezyny uczestniczącej w mitozie, zwłaszcza KSP. W takim rozwiązaniu środki według wynalazku łączy się z KSP i oznacza aktywność KSP. Aktywność kinezyn jest znana i obejmuje przynajmniej jedną z aktywności kinezyn. Aktywności kinezyn obejmują wpływanie na hydrolizę ATP, wiązanie mikrotubul, ślizganie się po układach mikrotubul oraz polimeryzację/depolimeryzację (wpływ na dynamikę mikrotubul), wiązanie z innymi białkami wrzeciona, wiązanie z białkami biorącymi udział w regulacji cyklu komórkowego, bycie substratem innych enzymów, takich jak kinazy lub proteazy oraz aktywności komórkowe specyficzne dla kinezyn, jak rozdzielanie biegunów wrzeciona.

Sposoby przeprowadzenia testów ruchliwości są dobrze znane [patrz np. Hall i in., (1996), Biophys. J. 71:3467-3476; Turner i in., 1996, Anal. Biochem. 242 (1):20-5; Gittes i in., 1996, Biophys. J. 70(1): 428-29; Shirakawa I in., 1995, J. Exp. Biol. 198:1809-15; Winkelmann i in., 1995, Biophys. J. 68:2444-53; Winkelmann i in., 1995, Biophys. J. 68:72S].

Można stosować także znane sposoby oznaczania aktywności hydrolitycznej ATPazy, korzystnie testy oparte na roztworze. Przykładowo opisano je w amerykańskim zgłoszeniu patentowym 09/314,464 z 18 maja 1999. Alternatywnie stosuje się sposoby konwencjonalne. Na przykład można oznaczać uwolnienie Pi z kinezyny. W jednym z korzystnych rozwiązań, do testu aktywności hydrolitycznej ATPazy wykorzystuje się 0,3 M PCA (kwas nadchlorowy) i odczynnik z zieleni malachitowej (8,27 mM molibdenian sodowy II, 0,33 mM szczawian zieleni malachitowej, oraz 0,8 mM Triton

Χ-100). W celu wykonania testu, 10 μΐ mieszaniny reakcyjnej zadaje się 90 μΐ 0,3 M PCA. Aby przeliczyć dane na mM uwolnionego nieorganicznego fosforanu stosuje się wzorce fosforanowe. Po zadaniu PCA wszystkich próbek i wzorców, do pozostałych studzienek na np. płytce mikrotitracyjnej dodaje się 100 μl odczynnika z zielenią malachitową. Mieszaninę pozostawia się na 10-15 minut, a następnie odczytuje absorbancję przy 650 nm. Jeżeli stosuje się wzorce fosforanowe, odczyty absorbancji można przetworzyć na mM Pi i wykreślić w funkcji czasu. Ponadto, jako do oznaczenia ATPazy można użyć lucyferazy.

Oznaczenie aktywności ATPazy domen kinezynowych może być również wykorzystane w celu monitorowania wpływu środków aktywnych. W jednym z rozwiązań, oznaczenie aktywności ATPazy kinezyny wykonuje się, gdy mikrotubule nie są obecne, w innym - w ich obecności. W powyższych testach można wykryć różne typy środków wpływających na aktywność kinezyny. W korzystnym rozwiązaniu wpływ środka na aktywność kinezyny jest niezależny od stężenia mikrotubul i ATP. W innym rozwiązaniu, wpływ środków na aktywność ATPazy kinezyny może być zwiększony w wyniku obniżenia stężeń ATP, mikrotubul lub obu.

Środki wpływające na aktywność biochemiczną KSP in vitro mogą być potem weryfikowane in vivo. Procedury poszukiwania dla takich środków in vivo obejmują testy dystrybucji cyklu komórkowego, żywotności komórek, lub obecności, morfologii, aktywności, dystrybucji lub ilości wrzecion mitotycznych. Sposoby monitorowania dystrybucji cyklu komórkowego w populacji komórek, na przykład przez cytometrię przepływową, są dobrze znane, podobnie jak sposoby określania żywotności komórek. Patrz na przykład amerykańskie zgłoszenie patentowe „Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation and Methods of Diagnosis Cell Proliferation States” z 22 października 1999, numer 09/428,156.

PL 203 998 B1

Dodatkowo znane są także mikroskopowe sposoby monitorowania tworzenia się i deformacji wrzeciona mitotycznego [patrz np. Whitehead i Rattner (1998), J. Cell. Sci. 11:2551-61; Galgio i in., (1996) J. Cell. Biol. 135:399-414].

Kompozycje według wynalazku hamują aktywność kinezyny KSP. Jedną z miar stopnia hamowania jest IC50, definiowane jako stężenie kompozycji, przy którym aktywność KSP jest zmniejszona o pięćdziesią t procent. Dla korzystnych kompozycji warto ś ci IC50 wynoszą poniż ej 1 mM, korzystniej poniżej 100 μΜ, jeszcze korzystniej - poniżej 10 μΜ, jeszcze bardziej korzystnie - poniżej 1 μΜ, szczególnie korzystnie - poniżej 100 nM, a najkorzystniej - poniżej 10 nM. Wartość tę oznacza się przy użyciu testu ATPazy.

Inną miarę hamowania stanowi Ki. Dla związków wykazujących IC50 poniżej 1 μΜ, Ki lub Kd definiuje się jako stałą szybkości dysocjacji przy wzajemnym oddziaływaniu chinazolinonu z KSP. Dla korzystnych kompozycji wartości Ki wynoszą poniżej 100 μΜ, korzystnie - poniżej 10 μΜ, zwłaszcza korzystnie - poniżej 1 μM, korzystniej - poniżej 100 nM, a najkorzystniej - poniżej 10 nM. Wartość K dla związku wyznacza się na podstawie wartości IC50 w oparciu o trzy założenia. Po pierwsze, tylko jedna cząsteczka związku wiąże się z enzymem i nie występuje wzajemne oddziaływanie. Po drugie, stężenia aktywnego enzymu i badanego związku są znane (tj. w preparatach nie występują znaczące ilości zanieczyszczeń lub postaci nieaktywne enzymów). Po trzecie, szybkość enzymatyczna kompleksu enzym - inhibitor wynosi zero. Szybkość (tj. stężenie związku) odpowiada zależności:

V = VmaxE0 (o + I_o + Kd)-V(E₀ + I_o + Kd)² - 4E I 2Eo gdzie V oznacza szybkość obserwowaną, Vmax jest szybkością enzymu wolnego, l0 - stężenie inhibitora, E0 - stężenie enzymu, Kd - stałą dysocjacji kompleksu enzym-inhibitor.

Inną miarę hamowania stanowi GI50, zdefiniowane jako stężenie związku, które powoduje zmniejszenie prędkości wzrostu komórek o 50 procent. Dla korzystnych związków wartość GI50 wynosi poniżej 1 mM. Stopień korzystności rozwiązań jest funkcją ich wartości GI₅₀: dla bardziej korzystnych wartość ta jest niższa od 20 μΜ, zwłaszcza korzystnych - od 10 μΜ, jeszcze bardziej korzystnych - od 1 μM, szczególnie korzystnych - od 100 nM, a najbardziej korzystnych - wynosi poniżej 10 nM. Oznaczenie GI50 wykonuje się przez oznaczenie stopnia proliferacji komórek.

Kompozycje według wynalazku są stosowane do wytwarzania leku do leczenia chorób związanych z rozrostem komórek. Stany chorobowe, jakie mogą być leczone przy użyciu podanych sposobów i kompozycji, obejmują m.in. nowotwór (dyskusja w dalszej części opisu), choroby autoimmunologiczne, zapalenie stawów, odrzucenie przeszczepu, zapalenie jelit, rozrost w wyniku zabiegów medycznych, obejmujących między innymi zabiegi chirurgiczne, angioplastykę itp. W niektórych przypadkach komórki mogą nie wykazywać nadmiernego lub zbyt małego rozrostu (stan nienormalny), lecz mimo to wymagać dalszego leczenia. Na przykład w czasie gojenia ran, komórki mogą rozrastać się „normalnie”, ale może być pożądana stymulacja rozrostu. Podobnie, w zakresie uprawy roślin, komórki mogą znajdować się w stanie „normalnym”, ale stymulacja proliferacji komórek może być wskazana w celu uzyskania zwiększenia plonów w wyniku bezpośredniego wspomagania wzrostu albo przez zahamowanie wzrostu rośliny lub organizmu, który niekorzystnie wpływa na urodzaj. Zatem w jednym z rozwiązań wynalazku, opisane tu związki stosuje w przypadku komórek lub organizmów, które są dotknięte lub zagrożone jednym z wymienionych zaburzeń lub stanów.

Kompozycje i sposoby według wynalazku są uważane za szczególnie użyteczne w leczeniu nowotworów, w tym guzów litych, takich jak nowotwory skóry, piersi, mózgu, szyjki macicy, jąder itd. W szczególności, nie ograniczając zakresu wynalazku, dotyczy to nowotworów takich, jak: serca mięsaka (mięsaka naczyniopochodnego, włókniaka mięsakowego, mięśniakomięsaka prążkowanego, tłuszczakomięsaka), śluzaka, mięśniaka prążkowano-komórkowego, włókniaka, tłuszczaka i potworniaka; płuc - nowotworu oskrzeli (komórek łuskowych, niezróżnicowanych komórek małych, niezróżnicowanych komórek dużych, nowotworu gruczołowego), nowotworu pęcherzyków (oskrzelików), gruczolaka oskrzelowego, mięsaka, chłoniaka, hamartomy chrzęstniakowej, międzybłoniaka; przewodu żołądkowo-jelitowego: nowotworu przełyku (nowotworu komórek łuskowych, nowotworu gruczołowego, mięśniaka gładkiego, chłoniaka), żołądka (raka, chłoniaka, mięśniaka gładkiego), trzustki (gruczolaka przewodowego, gruczolaka wysepkowatokomórkowego, glukagonowego, wydzielającego gastrynę, guzów rakowatych), jelita cienkiego (gruczolaka, chłoniaka, guzów rakowatych, mięśniaka Karposiego, mięśniaka gładkiego, naczyniaka krwionośnego, tłuszczaka, włókniako-nerwiaka, włókniaka),

PL 203 998 B1 jelita grubego (gruczolaka, gruczolaka cewkowego, gruczolaka brodawkowatego, hamartomy, mięśniaka gładkiego); przewodu moczowo-płciowego: nowotworu nerki (gruczolaka, guza Wilmsa [nerczaka niedojrzałego], chłoniaka, białaczki), pęcherza i cewki moczowej (raka komórek łuskowych, raka komórek przelotowych, gruczolaka), prostaty (gruczolaka, mięsaka), jąder (nasieniaka, potwomiaka, raka zarodkowego, potworniaka złośliwego, nabłoniaka kosmówkowego złośliwego, mięsaka, raka komórek śródmiąższowych, włókniaka, gruczolakowłókniaka, guzów gruczołowych, tłuszczaków); wątroby: wątrobiaka (nowotworu komórek wątrobowych), nowotworu dróg żółciowych, wątrobiaka zarodkowego, naczyniakomięśniaka; kości: mięsaka pochodzenia kostnego, włókniakomięsaka, histiocytomy włókniakowej złośliwej, chrzęstniakomięsaka, mięsaka Ewinga, chłoniaka złośliwego, szpiczaka mnogiego, struniaka złośliwego komórek olbrzymich, chrzęstniaka łagodnego, chrzęstniaka zarodkowego, chrzęstniakośluzakowłókniaka, kostniaka kostninowego, guzów komórek olbrzymich; układu nerwowego: nowotworu czaszki (kostniaka, naczyniaka układu krwionośnego, ziarniniaka, żółtaka, choroby Pageta kości), opon (oponiaka, oponiakomięsaka, glejakowatości), mózgu (gwiaździaka, rdzeniaka, glejaka, wyściółczaka, rozrodczaka [szyszynczaka], glejaka wielopostaciowego, skąpodrzewiaka, nerwiaka, glejaka siatkówki, guzów wrodzonych), rdzenia kręgowego (włókniakonerwiaka, oponiaka, glejaka, mięsaka); układu płciowego: nowotworu macicy (nowotworu trzonu macicy), nowotworu szyjki (nowotworu szyjki macicy, dysplazji szyjki macicy), nowotworu jajników (nowotworu jajników [torbielakogruczolaka surowiczego, torbielakogruczolaka śluzowego, nowotworu nieklasyfikowanego], nowotworu komórek osłonkowych warstwy ziarnistej pęcherzyka Graafa, guzów komórek Sertoli-Leydiga, rozrodczaka, potworniaka złośliwego), sromu (nowotworu komórek łuskowych, nowotworu komórek śródnabłonkowych, gruczolaka, włokniakomięsaka, czerniaka), pochwy (nowotworu komórek jasnych, nowotworu komórek łuskowych, mięśniakomięsaka prążkowanego zarodkowego), nowotworu jajowodów; nowotworów hematologicznych: krwi (białaczki szpikowej [ostrej i przewlekłej], ostrej białaczki limfoblastycznej, przewlekłej białaczki limfocytowej, chorób mielorozrostowych, szpiczaka mnogiego, zespołu mielodysplazji), choroby Hodgkina, chłoniaka nieziarniczego [chłoniaka złośliwego]; skóry: czerniaka złośliwego, nowotworu komórek podstawowych, nowotworu komórek łuskowych, mięsaka Karposiego, tłuszczaka, naczyniaka, włókniaka skóry, bliznowców, łuszczycy oraz nowotworów nadnercza: nerwiaka niedojrzałego. W związku z tym określenie „komórka nowotworowa” odnosi się tu do komórek dotkniętych jednym z wyżej wymienionych stanów.

Kompozycje według wynalazku podaje się do komórek. Pod określeniem „podaje się” rozumie się podawanie terapeutycznie skutecznej dawki środków przeciwdziałającej mitozie według wynalazku do komórki znajdującej się w hodowli lub w organizmie pacjenta. „Dawka skuteczna terapeutycznie oznacza dawkę, która prowadzi do oczekiwanych efektów. Dokładna wielkość dawki zależy od celu kuracji i można ją ustalić znanymi sposobami. Zgodnie ze stanem techniki konieczne jest dostosowanie wielkości dawki do trybu podawania układowego lub miejscowego, wieku, masy ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety, czasu podawania, wzajemnego oddziaływania leków oraz charakteru przypadku. Jako „komórki” określa się prawie wszystkie komórki, w których można zmieniać przebieg mitozy lub mejozy.

Określenie „pacjent” dotyczy zarówno ludzi, jak i zwierząt, zwłaszcza ssaków, i innych organizmów. Opisane sposoby dotyczą zatem leczenia ludzi, jak i praktyki weterynaryjnej. Korzystnie pacjent jest ssakiem, a najkorzystniej - człowiekiem.

Środki wpływające na proces mitozy mające pożądaną aktywność farmakologiczną można podawać w fizjologicznie akceptowalnym nośniku. Zależnie od sposobu podawania, można przygotowywać preparaty związków różnymi, niżej opisanymi sposobami. Stężenie środka czynnego terapeutycznie w preparacie może wynosić od 0,1 do 100% wagowych. Środki można stosować oddzielnie lub w kombinacji z innymi sposobami leczenia, jak np. naświetlanie lub inne chemoterapeutyki.

W korzystnym rozwiązaniu, kompozycje farmaceutyczne występują w postaci rozpuszczalnej w wodzie jako farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne kwasowe i zasadowe. Określenie „farmaceutycznie dopuszczalne addycyjne sole kwasowe” oznacza sole zachowujące biologiczną skuteczność wolnych kwasów i nie działające w jakikolwiek niepożądany sposób, utworzone z kwasów nieorganicznych, takich jak kwas solny, bromowodorowy, siarkowy, azotowy, fosforowy itp. bądź kwasów organicznych, takich jak kwas octowy, propionowy, glikolowy, pirogronowy, szczawiowy, maleinowy, malonowy, bursztynowy, mrówkowy, winowy, cytrynowy, benzoesowy, cynamonowy, migdałowy, metanosulfonowy, etanosulfonowy, p-toluenosulfonowy, salicylowy itp. „Farmaceutycznie akceptowalne addycyjne sole zasadowe” pochodzą od zasad nieorganicznych, takich jak zasady sodu, potasu, litu, amonowe, wapnia, magnezu, żelaza, cynku, miedzi, manganu, glinu itp. Korzystne są zwłaszcza

PL 203 998 B1 sole amonowe, potasowe, sodowe, wapniowe i magnezowe. Sole pochodzące od farmaceutycznie dopuszczalnych nietoksycznych zasad organicznych obejmują sole pierwszo-, drugo - i trzeciorzędowych amin, podstawionych amin, w tym występujących naturalnie, amin cyklicznych i zasadowych żywic jonowymiennych, takich jak izopropyloamina, trimetyloamina, dietyloamina, trietyloamina, tripropyloamina i etanoloamina.

Kompozycje farmaceutyczne można przygotowywać w różnych postaciach, jako granulki, tabletki, pigułki, czopki, kapsułki, zawiesiny, balsamy, lotiony itp. Do uzupełnienia składu dodaje się organiczne i nieorganiczne nośniki o czystości farmaceutycznej i/lub rozcieńczalniki odpowiednie do użytku doustnego lub miejscowego. Należą do nich ośrodki wodne, oleje roślinne i zwierzęce oraz tłuszcze. Jako składniki pomocnicze stosuje się środki stabilizujące, zwilżacze i emulgatory, sole zmieniające ciśnienie osmotyczne, bufory do regulacji pH i środki zwiększające penetrację skóry. Kompozycje mogą zawierać także jeden lub więcej spośród następujących składników: nośnik białkowy, jak albumina surowicza; bufory; wypełniacze, jak mikrokrystaliczna celuloza, laktoza, skrobia kukurydziana i inne skrobie; środki wiążące; słodziki i środki aromatyzujące; barwniki; oraz poliglikol etylenowy.

Podawanie środków wpływających na proces mitozy według wynalazku można prowadzić w róż ny sposób, a zwł aszcza doustnie, podskórnie, doż ylnie, donosowo, przezskórnie, dootrzewnowo, domięśniowo, doopłucnowo, dopochwowo, doodbytniczo, lub dogałkowo. W niektórych przypadkach, na przykład w leczeniu ran i zapaleń, środki wpływające na proces mitozy można nakładać bezpośrednio jako roztwór lub spray.

Aby wykorzystać środki według wynalazku do skriningu związków, które wiążą się z kinezyną KSP, najpierw unieruchamia się KSP wiążąc ją z podłożem, a następnie w celu oznaczenia dodaje się środek według wynalazku (który jest środkiem wpływającym na proces mitozy). Alternatywnie, środek według wynalazku wiąże się z podłożem, a dodaje się KSP. Do związków, wśród których można poszukiwać nowych środków wiążących, należą specyficzne przeciwciała, nie występujące w naturze środki wiążące, zidentyfikowane przy przeszukiwaniu bibliotek chemicznych, analogi peptydowe itd. Szczególnie interesujące są testy przeszukiwania związków o niskiej toksyczności dla komórek ludzkich. Do tego celu stosuje się różne testy, jak testy in vitro wiązania białek znakowanych, testy ruchliwości elektroforetycznej, testy immunologiczne wiązania białek, testy oparte na aktywności (fosforylacja itd.) itp.

Określenie poziomu wiązania środka wpływającego na proces mitozy z KSP można przeprowadzić różnymi sposobami. W korzystnym rozwiązaniu środek wpływający na proces mitozy (związek według wynalazku) znakuje się, na przykład cząsteczką fluorescencyjną lub radioaktywną i wiązanie oznacza się bezpośrednio. Sposób ten obejmuje np. przyłączenie całości lub części KSP do stałego podłoża, dodanie znakowanego środka wpływającego na proces mitozy (na przykład związku według wynalazku, w którym przynajmniej jeden atom zastąpiono wykrywalnym izotopem), odmycie nadmiaru odczynnika i oznaczenie ilości środka znakującego związanego ze stałym podłożem. Stosuje się znane etapy blokowania i odmywania.

Za „znakowany” uważa się związek, który bezpośrednio lub pośrednio oznaczono znacznikiem dostarczającym wykrywalnego sygnału, np. radioizotopem, markerem fluorescencyjnym, enzymem, przeciwciałem, cząsteczkami takimi, jak cząsteczki magnetyczne, markery chemiluminescencyjne, lub cząsteczki wiążące się specyficznie itd. Do cząsteczek wiążących się specyficznie należą pary, jak biotyna i streptawidyna, digoksyna i antydigoksyna itd. Dla cząsteczek wiążących się specyficznie, cząsteczka komplementarna zwykle jest oznaczona cząsteczką wykrywalną znanymi sposobami. Znacznik może bezpośrednio lub pośrednio dawać wykrywalny sygnał.

W niektórych rozwiązaniach tylko jeden składnik jest znakowany. Na przykład, białko kinezyny można znakować w pozycji tyrozyny, używając izotopu ¹²⁵I, lub fluoroforów. Alternatywnie, znakuje się więcej składników różnymi znacznikami; stosując np. izotop ¹²⁵l dla białek, a fluorofor - dla środków wpływających na proces mitozy.

Środki według wynalazku można również wykorzystywać jako związki współzawodniczące w badaniach przesiewowych dla przy poszukiwaniu dalszych zwią zków skutecznych w leczeniu. „Związek potencjalnie użyteczny w leczeniu” lub „środek mogący zostać lekiem”, „przeszukiwane związki” lub też ich gramatyczne równoważniki, oznaczają każdą cząsteczkę, np. białko, oligopeptyd, małą cząsteczkę organiczną polisacharyd, polinukleotyd itd., której aktywność biologiczna jest poddawana badaniu. Związki te mogą być zdolne do bezpośredniej bądź pośredniej zmiany fenotypu proliferacji komórkowej lub ekspresji sekwencji rozrostu komórkowego, w tym sekwencji kwasów nukleinowych jak i sekwencji białek. W innych przypadkach, przeszukuje się zmianę poziomu wiązania i/lub

PL 203 998 B1 aktywności białek uczestniczących w proliferacji komórkowej. Przeszukiwanie tego rodzaju wykonuje się w obecności lub nieobecności mikrotubul. W przypadku przeszukiwania pod kątem poziomu wiązania lub aktywności białka, korzystne rozwiązania wykluczają cząsteczki, które są znane jako wiążące się z danym białkiem, na przykład struktury polimerowe, jak mikrotubule, i źródła energii, jak ATP. Korzystne rozwiązania testów zawierają przeszukiwane związki, które nie wiążą się z białkiem proliferacji komórkowej w jego natywnym endogenicznym stanie, określane tu jako środki „egzogeniczne”. W innym korzystnym rozwiązaniu środki egzogeniczne wykluczają również przeciwciała przeciwko KSP.

Środki przeszukiwane mogą należeć do wielu klas związków chemicznych, chociaż typowo są to cząsteczki organiczne, zwłaszcza małe związki organiczne o masie cząsteczkowej od 100 do 2500 daltonów. Środki te zawierają grupy funkcjonalne niezbędne do strukturalnego oddziaływania z białkami, zwłaszcza do tworzenia wiązania wodorowego i lipofilowego, a typowo zawierają zwykle przynajmniej grupę aminową, karbonylową, hydroksylową, eterową lub karboksylową, korzystnie przynajmniej dwie grupy funkcjonalne. Często w ich skład wchodzą cykliczne struktury węglowe lub heterocykliczne i/lub struktury aromatyczne lub poliaromatyczne podstawione przez jedną lub więcej grup funkcjonalnych. Środki tego typu często występują wśród cząsteczek biologicznych, jak peptydy, sacharydy, kwasy tłuszczowe, steroidy, puryny, pirymidyny, ich pochodne, analogi strukturalne i kombinacje. Szczególnie korzystne są peptydy.

Środki przeszukiwane otrzymuje się z różnych źródeł, w tym z bibliotek związków syntetycznych lub naturalnych. Przykładowo jest wiele dostępnych sposobów przypadkowych i kierowanych syntez szerokiego zakresu związków organicznych i biocząsteczek, w tym ekspresji dobranych losowo oligonukleotydów. Alternatywnie, dostępne lub łatwo wytwarzalne są biblioteki naturalnych związków w postaci ekstraktów bakteryjnych, grzybowych, roślinnych i zwierzęcych. Ponadto związki naturalne i syntetyczne można łatwo modyfikować znanymi sposobami chemicznymi, fizycznymi i biochemicznymi. Znane środki farmaceutyczne można poddawać sterowanym lub przypadkowym modyfikacjom chemicznym, jak acylowanie, alkilowanie, estryfikacja, amidyfikacja tak, aby otrzymać analogi strukturalne.

Przeszukiwanie oparte na testach współzawodnictwa związków można prowadzić, łącząc KSP i badany związek w pierwszej próbce, podczas gdy druga próbka zawiera środek wpływający na proces mitozy, KSP i związek badany. Doświadczenie prowadzi się pod nieobecność mikrotubul lub w ich obecności. Poziom wiązania środka kandydującego oznacza się w obu próbkach, a zmiana, bądź różnica pomiędzy dwiema próbkami wskazuje obecność środka zdolnego do wiązania KSP i potencjalnego modulowania jego aktywności. Oznacza to, że jeżeli poziom wiązania środka badanego w drugiej próbce jest różny niż w pierwszej próbce, to związek ten jest zdolny do wiązania się z KSP.

W korzystnym rozwiązaniu, zdolność wiązania dla kandydata oznacza się przez konkurencyjne badanie wiązania. Przy takim rozwiązaniu, współzawodnik jest cząsteczką o której wiadomo, że wiąże się z KSP, jak przeciwciało, peptyd, partner wiązania, ligand itd. W pewnych warunkach, może występować konkurencyjne wiązanie, jak pomiędzy kandydatem i cząsteczką wiążącą, w którym cząsteczka wiążąca przemieszcza kandydata.

Środek przeszukiwany może być znaczony. W takim przypadku, środek badany lub współzawodniczący, lub obydwie cząsteczki, są najpierw łączone z KSP przez okres wystarczający do związania, wiązanie jeżeli zachodzi. Inkubacje wykonuje się w dowolnej temperaturze, jaka zapewnia optymalną aktywność, typowo od 4° do 40°C.

Okres inkubacji dobiera się optymalnie dla aktywności, bądź tak, aby uzyskać wysoką wydajność przeszukiwania. Zwykle wystarczy od 0,1 do 1 godziny. Nadmiar odczynnika usuwa się lub spłukuje. Następnie dodaje się drugi składnik, a obecność lub nieobecność składnika znaczonego wskazuje na wystąpienie wiązania.

W korzystnym rozwiązaniu, najpierw dodaje się związek konkurujący, a następnie środek przeszukiwany. Zastąpienie związku konkurującego wskazuje, że badany związek związał się z KSP, a zatem ma zdolność wiązania z KSP i ewentualnie może wpływać na jego aktywność. W tym rozwiązaniu znakuje się dowolny ze składników. Zatem, na przykład, jeżeli znakuje się związek konkurujący, obecność znacznika w roztworze do przemywania wskazuje na jego wyparcie przez badany środek. Alternatywnie, jeżeli znakowany jest badany środek, obecność znacznika związanego z podłożem wskazuje na wyparcie związku.

W alternatywnym rozwiązaniu, najpierw wprowadza się związek badany, prowadzi się inkubację i przemywa, a następnie dodaje się związek konkurujący. Brak wiązania związku konkurującego może wskazywać, że związek badany wiąże się z KSP z większym powinowactwem. W ten sposób, znakowany

PL 203 998 B1 jest związek badany, to obecność znacznika związanego z podłożem, w połączeniu z brakiem wiązania związku konkurującego, może wskazywać na zdolność środka badanego do wiązania z KSP.

Może być istotne zidentyfikowanie pozycji wiązania KSP. Wykonuje się to różnymi sposobami. W jednym z rozwiązań, po stwierdzeniu zwi ązania KSP ze środkiem wpływającym na proces mitozy, KSP dzieli się na fragmenty lub modyfikuje, po czym powtarza testy w celu zidentyfikowania składników niezbędnych do wystąpienia wiązania.

Wpływ środka bada się przeszukując związki pod kątem właściwości wpływania na aktywność KSP. Procedura oznaczenia zawiera etap łączenia badanego związku z KSP, jak wyżej, i wyznaczania zmiany w biologicznej aktywności KSP. W tym rozwiązaniu, badany związek powinien zarówno wiązać się z KSP (chociaż nie musi to być konieczne), jak i zmieniać jego biologiczną lub biochemiczną aktywność. Sposoby obejmują przeszukiwanie komórek in vitro i in vivo w celu stwierdzenia zmian w dystrybucji cyklu komórkowego, żywotności komórek, lub obecności, morfologii, aktywności, dystrybucji lub ilości wrzecion mitotycznych.

Alternatywnie, można zastosować przeszukiwanie różnicujące, aby określić które z badanych związków wiążą się z natywnym KSP, a są niezdolne do wiązania ze zmodyfikowanym KSP.

W testach stosowane są kontrole pozytywne i negatywne. Korzystnie wszystkie oznaczenia dla próbek kontrolnych i badanych wykonuje się trzykrotnie w celu uzyskania wyników znaczących statystycznie. Inkubacja wszystkich próbek odbywa się przez okres wystarczający dla wiązania badanego środka z białkiem. Po inkubacji, wszystkie próbki przemywa się do odmycia niespecyficznie związanego materiału i oznacza ilość związanego, zwykle znaczonego środka. Na przykład, jeżeli używa się znacznika radioaktywnego, próbki zlicza się w liczniku scyntylacyjnym w celu wyznaczenia ilości związanego środka.

Do testów przesiewowych używa się wielu różnych odczynników. Są to sole, obojętne białka, np. albumina, detergenty itd., których zastosowanie ma na celu uzyskanie optymalnego wiązania białek i/lub ograniczenie oddziaływań niespecyficznych lub wpływu tła. Można także stosować odczynniki poprawiające skuteczność testu, jak inhibitory proteazy, inhibitory nukleazy, środki przeciwbakteryjne itd. Mieszanina składników może być dodawana w dowolnej kolejności, wymaganej dla zapewnienia wiązania.

Poniższe przykłady mają na celu dostarczenie pełniejszego opisu sposobu zastosowania opisanego wynalazku, jak również wyjaśnienie różnych jego aspektów. Nie ograniczają one w żaden sposób jego zakresu, gdyż ich charakter jest raczej ilustracyjny.

Przykłady

Skróty i definicje

Poniższe skróty i określenia mają podane znaczenie:

Ac = acetylo

BNB = kwas 4-bromoetylo-3-nitrobenzoesowy

Boc = t-butyloksykarbonyl

Bu = butyl c- = cyklo

CBZ = karbobenzoksy = benzyloksykarbonyl

DBU = diazobicyklo[5,4,0]undekan-7

DCM = dichlorometan = chlorek metylenu = CH2CI2

DCE = dichloroetylen

DEAD = dietyloazodikarboksylan

DIC = diizopropylokarbodiimid

DIEA = N,N-diizopropyloetyloamina

DMAP = 4-N,N-dimetyloaminopirydyna

DMF = N,N-dimetyloformamid

DMSO = dimetylosulfotlenek

DVB = 1,4-diwinylobenzen

EEDQ = 2-etoksy-1-etoksykarbonylo-1,2-dihydrochinolina

Et = etyl

Fmoc = 9-fluorenylometoksykarbonyl

GC = chromatografia gazowa

HATU = O-(7-azobenzotriazolilo-1)-1,1,3,3-tetrametyluroniumheksafluorofosforan

HMDS = heksametylodisilazan

PL 203 998 B1

HOAc = kwas octowy

HOBt = hydroksybenzotriazol

KSP = białko kinezyny wrzeciona lub Eg5

Me = metyl mesyl = metanosulfonyl

MTBE = eter metylo-t-butylowy

NMO = tlenek N-metylomorfoliny

PEG = poliglikol etylenowy

Ph = fenyl

PhOH = fenol

PfP = pentafluorofenol

PPTS = p-toluenosulfonian pirydyny

Py = pirydyna

PyBroP = bromo-tris-pirolidyno-fosfonium-heksafluorofosforan rt = temperatura pokojowa sat=d = nasycony s- = drugorzędowy t- = trzeciorzędowy

TBDMS = t-butylodimetylosylil

TES = trietylosilan

TFA = kwas trifluorooctowy

THF = tetrahydrofuran

TMOF = trójmetyloortomrówczan

TMS = trimetylosylil tosyl = p-toluenosulfonyl

Trt = trifenylometyl

P r z y k ł a d 1

Synteza związków

Ogólny schemat syntezy pokazano na fig. 1 i fig. 2.

Etap 1: Kwas N-butyryloantranilowy

Do kolby trójszyjnej 500 ml z okrągłym dnem, w której umieszczono termometr i wydajne mieszadło, wprowadzono kwas antranilowy (1) (0,5 mola, 68,5 g) oraz dimetyloformamid (250 ml). Do tego roztworu dodawano kroplami chlorek butyrylu (0,55 mola, 57,1 ml) z taką prędkością aby temperatura mieszaniny nie wzrosła powyżej 40°C. Zawiesinę mieszano intensywnie w temperaturze pokojowej przez przynajmniej dodatkowe 3 godziny. Następnie wlano ją do wody (2000 ml) i mieszano przez kolejną godzinę. Wytrącony produkt odfiltrowano, przemyto zimną wodą i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem nad P2O5, uzyskując związek 2 (67,3 g, 65%).

Etap 2: 2-propylo-3,1-[4h]benzoksazynon-4

Związek 2 (51,8 g, 0,25 mola) rozpuszczono w bezwodniku octowym (180 ml) w okrągłodennej kolbie 500 ml z mieszadłem, nasadką destylacyjną Claissena (z wlotem próżni) i termometrem. Kolbę umieszczono w łaźni olejowej i powoli ogrzewano do 170-180°C, intensywnie mieszając. Powstały kwas octowy powoli oddestylowano pod ciśnieniem atmosferycznym. Dla zachowania programu transformacji monitorowano temperaturę nasadki destylacyjnej. Następnie mieszaninę reakcyjną ostudzono do 60°C i nadmiar bezwodnika octowego usunięto przez destylację pod zmniejszonym ciśnieniem (ok. 20 mm Hg). Pozostałość ostudzono i produkt przekrystalizowano. Po roztarciu na proszek z n-heksanem (75 ml) i przefiltrowaniu uzyskano 2-propylo-3,1-[4H]benzoksazynon-4 (3) (29,3 g, 62%). Powyższa procedura daje związek 3 o czystości wystarczającej do użycia bezpośrednio w następnym etapie.

Etap 3: 2-propylo-3-benzylochinazolon-4

Związek 3 (28,4 g, 0,15 mola) oraz benzyloaminę (17,5 ml, 0,16 mola) destylowano z zawracaniem w chloroformie (50 ml) w jednoszyjnej okrągłodennej kolbie 250 ml przez 6 godzin. Po całkowitym wchłonięciu związku 3, chloroform odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Glikol etylenowy (100 ml) i tabletki NaOH (0,60 g) dodano do pozostałości i kolby z nasadką destylacyjną Claissena oraz mieszadłem. Kolbę zanurzono w łaźni olejowej, ogrzano do temperatury łaźni 130-140°C z intensywnym mieszaniem, którą utrzymywano przez 5 godzin, usuwając powstającą wodę poprzez destylację. Po zakończeniu reakcji przezroczysty roztwór ostudzono do temperatury pokojowej i pozostawiono na noc do wytrącenia produktu. pH zawiesiny ustawiono na 7-8, dodając 3% roztwór wodny

PL 203 998 B1

HCI. Kryształy odsączono, przemyto zimną wodą i przekrystalizowano z izopropanolu (może być także aceton). Uzyskano związek 2-propylo-3-benzylochinazolon-4 (związek 4) (28,0 g, 67%).

Etap 4: 2-(1'-bromopropylo)-3-benzylochinazolon-4

Do trójszyjnej, okrągłodennej kolby 250 ml z termometrem, wkraplaczem i mieszadłem, wprowadzono związek 4 (27,8 g, 0,10 mola), bezwodny octan sodowy (10,0 g) i kwas octowy lodowaty (130 ml). Do powyższego roztworu dodawano kroplami brom (16,0 g, 0,10 mola) rozpuszczony w kwasie octowym (10 ml), w temperaturze 40°C przez 1-2 godzin. Wytrącony produkt, 2-(1'-bromopropylo)-3-benzylochinazolon-4 (5) odsączono, przemyto wodą do usunięcia śladów kwasu octowego i spłukano niewielką ilością izopropanolu. Po wysuszeniu otrzymano związek 5 (33,0 g, 92%).

Etap 5: 2-[1'-(N,N-dimetyloetylenodiamino)propylo]-3-benzylochinazolon-4

Związek 5 (10,7 g, 0,03 mola) i N,N-dimetyloetylenodiaminę (6,6 ml, 0,06 mola) rozpuszczono w alkoholu bezwodnym (60 ml) i ogrzewano z refluksem przez 6 godzin. Po zakoń czeniu reakcji, rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w dichlorometanie (150 ml) i przemyto 3% wodnym roztworem NaOH (ok. 10-20 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad MgSO4 i odparowano do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostały oleisty produkt oczyszczono metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym z użyciem eluenta CHCl3:MeOH:wodny roztwór NH3 w stosunku 90:10:0,1, uzyskując oczekiwany związek (5) w postaci 2-[1'-(N,N-dimetyloetylenodiamino)propylo]-3-benzylochinazolonu-4 (6,0 g, 55%).

Etap 6: 2-[1'-(N-4-fluorobenzolo)-(N,N-dimetyloetylenodiamino)propylo]-3-benzylochinazolon-4 Przygotowano: podstawowy roztwór związku 5 (1,822 g, 5,0 mmoli) w CHCI3 (0,5 ml) o czystości do HPLC; podstawowy roztwór chlorku p-fluorobenzolu (160,2 mg, 1 mmol) w 1,2-dichloroetanie (2,0 ml) o czystości do HPLC, w kolbie miarowej 2,0 ml; oraz roztwór trietyloaminy (2,0 ml, 0,5 mola) w tym samym odczynniku. Porcje po 100 μ l każ dego roztworu odpipetowano do szklanego naczynia reakcyjnego przy użyciu automatycznego dozownika cieczy Beckman Biomet 2000. Mieszaninę reakcyjną wstrząsano na wytrząsarce mechanicznej, poddawano działaniu ultradźwięków w płuczce z wodą, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę rozcieńczono CHCI₃ (300 μΐ), przemyto 5% wodnym roztworem NaOH i wodą. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią i uzyskano związek 6 z wydajnością 65%. Czystość produktu określono metodą chromatografii cieczowej z użyciem eluenta CH2CI2:etanol:stężony wodny roztwór NH3 w stosunku 100:10:1.

P r z y k ł a d y 2 i 3

Synteza związków o ogólnej strukturze 1d

Większość odczynników nabyto w Aldrich Chemical Company, w tym - wszyskie rozpuszczalniki bezwodne w pojemnikach SureSeal®. Skróty oznaczają: DCM = dichlorometan; DIEA = N,N-diizopropyloetyloamina; DMF = N,N-dimetyloformamid; TES = trietylosilan; TFA = kwas trifluorooctowy. Syntezę matrycową prowadzono w zakręcanych szklanych fiolkach okrągłodennych o wymiarach 15 x 75 mm, umieszczonych w blokach aluminiowych do syntezy o wzorze 4 x 6, uszczelnionych gumową membraną wyłożoną teflonem. Dodawanie odczynników i ekstrakcje w środowisku wodnym prowadzono z użyciem pojedynczych lub wielokanałowych zestawów do pipetowania. Filtrację wykonywano przy użyciu

PL 203 998 B1 bloków filtracyjnych 10 ml Whatman/Polyfiltronics 24. Do odparowywania lotnych substancji stosowano Labconco Vortex-Evaporator lub zdmuchiwanie azotem.

P r z y k ł a d 2 (synteza pojedynczego związku w fazie stałej)

Etap 1) Żywicę 1,3-diaminopropanotritylową (Novabiochem, 1,2 mmol/g) (0,20 g, 0,24 mmola) odważono do zakręcanej fiolki i dodano 3 ml mieszaniny DMF i chloroformu w stosunku 1:1. Następnie dodano DIEA (0,130 ml, 0,72 mmola) i 2-(1'-bromopropylo)-3-benzylochinazolon-4) (z przykładu 1) (0,188 g, 0,48 mmola). Fiolkę zamknięto, ogrzano do 70°C i wstrząsano przez noc. Żywicę odsączono i przemyto (3 x DCM, 2 x MeOH, 1 x DCM, 2 x eter) i wysuszono w próż ni. Pobrano porcję 27 mg żywicy i zadano mieszaniną TFA:TES:DCM w stosunku 5:5:90. Po 15 minutach odfiltrowano i odparowano, uzyskując 8 mg (wydajność 64%) pośredniego produktu chinazolino-dwuaminowego. Analiza metodą LCMS wykazała czystość > 80%.

Etap 2) Żywicę z etapu 1 spęczniono z 3 ml DCM. Dodano DIEA (0,130 ml, 0,72 mmola) i bromek 4-bromobenzylowy (0,12 g, 0,48 mmola). Fiolkę zamknięto i wstrząsano przez noc. Analiza LCMS rozłożonej porcji wykazała, że stosunek substratu i produktu w mieszaninie wynosi około 1:1. Dodano ponownie takie same ilości DIEA i bromku 4-benzylowego, po czym wstrząsano w temperaturze 70°C przez 8 godzin. Żywicę odsączono, przemyto, jak wyżej i wysuszono w próżni.

Etap 3) Żywicę z etapu 2 dwukrotnie po 30 minut wstrząsano z mieszaniną TFA:TFS:DCM w stosunku 5:5:90. Filtraty po łączono i odparowano, uzyskują c 140 mg pomarańczowego oleju. Materiał oczyszczono, stosując preparatywną HPLC z odwrotną fazą (gradient acetonitryl-woda) i otrzymano 27 mg (wydajność 17% dla 3 etapów) mono soli TFA.

P r z y k ł a d 3 (kombinowana synteza wielu związków)

Etap 1) Żywice 1,2-diaminoetanotrityl (Novabiochem, 0,95 mmol/g) (200 g, 1,9 mmola) oraz 1,3-diaminopropanotrityl (Novabiochem, 1,14 mmol/g) (2,0 g, 2,28 mmola) umieszczono oddzielnie w 10 ml fiolkach z polipropylenu (Bio-Rad). Do każdej z nich dodano 4 ml DMF, 4 ml chloroformu, 3 równoważniki DIEA (odpowiednio 1,0 ml i 1,2 ml) oraz 2 równoważniki 2-(1'-bromopropylo)-3-benzylochinazolinonu-4 ( z przykładu 1) (odpowiednio 1,5 g i 1,8 g). Mieszaniny wstrząsano przez noc w temperaturze 70°C. Każdą z nich przemyto (3 x DCM, 2 x MeOH, 1 x DCM, 2 x eter) i wysuszono w próżni. Analiza oddzielonej porcji wykazała obecność odpowiedniej chinazolonodiaminy o czystości > 90%.

Etap 2) Żywicę chinazolinoetylodiaminową (105 mg, 0,10 mmola) umieszczono w każdej z fiolek w 2 pierwszych rzędach matrycy, a żywicę chinazolinopropylodiaminową (88 mg, 0,10 mmola) w 2 ostatnich rzędach matrycy. Do każdej fiolki dodano DIEA (0,131 ml, 0,75 mmola). Do każdej fiolki w pierwszych dwóch rzędach dodano inną aminę i dodatki te powtórzono dla dwóch ostatnich rzędów. Blok reakcyjny wstrząsano przez noc w temperaturze 70°C. Ciecz z każdej fiolki usunięto przy użyciu wielokanałowego zestawu do pipetowania, po czym żywice przemyto (2 x DCM, 1 x MeOH, 1 x DCM) i wysuszono w próż ni.

Etap 3) Do każdej fiolki w matrycy dodano 2 ml roztowu TFA:TES:DCM w stosunku 10:5:85. Blok reakcyjny wytrząsano przez 45 minut, po czym mieszaniny przeniesiono do bloku filtracyjnego, odsączono i przemyto dwukrotnie 0,75 ml DCM. Roztwory odparowano, uzyskując oleje o barwie żółtej do pomarańczowej. Te gęste oleje dwukrotnie rozcierano z eterem, rozpuszczono w DCM i zadano 4M roztworem HCI w dioksanie, aby uzyskać sole kwasu solnego (nieznana liczba soli na związek) jako jasnobrązowe do białych, proszkowe lub bezpostaciowe ciała stałe. Analiza LCMS wykazała ich czystość > 75%.

P r z y k ł a d y 4-6

Sześć racemicznych chinazolonów rozdzielono na enancjomery przy użyciu chromatografii chiralnej. Chromatografię chiralną trzech spośród tych związków opisano niżej:

P r z y k ł a d 4:

PL 203 998 B1

Kolumna - Chiralpak AD, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Próbka - 0,5 mg/ml w etanolu. Warunki - 15 minut w 60% etanolu w heksanie, enancjomer 1 wymywany przez 4,5 minuty, enancjomer 2 - 4,9 minuty.

P r z y k ł a d 5:

Kolumna Chiralcel OJ, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Próbka - 0,5 mg/ml w etanolu. Warunki - 15 minut w 10% etanolu w heksanie, enancjomer (R)-wymywany przez 8,4 minuty, enancjomer (S)-wymywany przez 9,6 minuty.

P r z y k ł a d 6:

Kolumna - Chiralpak AD, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Próbka - 0,5 mg/ml w etanolu. Warunki - 15 minut w 70% etanolu w heksanie, enancjomer 1 wymywany przez 6,5 minuty, enancjomer 2 - 8,8 minuty.

Poniższa tabela podaje aktywność IC50 racematu i enancjomerów trzech innych związków rozdzielonych, jak wyżej. We wszystkich trzech przypadkach, jeden z enacjomerów miał znacznie większy potencjał od drugiego. Niezależna synteza chiralna pokazała, że bardziej aktywny jest enancjomer R.

	IC50 (pM) Racemat	IC50 (pM) Enancjomer 1	IC50 (pM) Enancjomer 2
1	2	3	4
ę	σ	τΑ	0,06	0,28	0,03
	Α. Ν'	Ak
		. >*5 >< 1
		Wł
kAJ
θ	Λ	ΊΓ4	12,7	>>40	6,6
	k'	-Μ
		.cw₃ ^xfT 1
		1 ch₃
kAk

PL 203 998 B1

c.d. tabeli

1	2	3	4
% _/^CH’ Br	2,6	>>40	1,3

P r z y k ł a d y 7 i 8

Następujące dwa związki zsyntetyzowano jako pojedyncze enancjomery w sposób pokazany na fig. 4. Dane wskazują że bardziej aktywny jest enancjomer R.

Ki (μΜ)

Enancjomer S

Ki (μΜ)

Enancjomer R

<0,1

>0,5 <0,05

P r z y k ł a d 9

Rozdział chiralny przez rekrystalizację z kwasem winowym

Produkt pośredni A, uzyskany w przykładzie 1, można przetworzyć na produkt pośredni B, który po rozdziale, stanowi alternatywę dla pierwszych pięciu etapów pokazanych na fig. 4. Proces jest przedstawiony na poniższym schemacie:

PL 203 998 B1

Enancjomer R związku B można krystalizować selektywnie przez ogrzewanie mieszaniny B z 1,1 równoważników D - kwasu winowego w mieszaninie izopropanolu i metanolu, a następnie pozostawienie mieszaniny do uzyskania temperatury pokojowej.

P r z y k ł a d 9: X = Cl, R = H

Racemiczny produkt pośredni B (1,5 g), rozpuszczony w 100 ml wrzącego izopropanolu, zmieszano z 0,8 g D - kwasu winowego w 100 ml wrzącego metanolu. Mieszaninę pozostawiono do powolnego uzyskania temperatury pokojowej. Po pozostawieniu na noc, oddzielono osad przez odsączenie, przepłukano octanem etylu oraz heksanem, i wysuszono na powietrzu. Suchy materiał mieszano z nasyconym dwuwęglanem sodowym przez 30 minut, po czym ekstrahowano octanem etylu. Część organiczną wysuszono (MgSO4), odsączono i odparowano do suchości. Uzyskany przezroczysty olej ważył 345 mg. Czystość chiralną oceniono na > 95% przez konwersję części do amidu S Mosher i badanie produktu przez ¹H NMR. Niżej podane związki czyste enancjomerycznie przygotowano według pozostałych etapów z fig. 4, z materiału uzyskanego według opisanej procedury z użyciem odmian D - i L - kwasu winowego.

	Racemiczny IC50 (pM)	Izomer R IC50 (pM)	Izomer S IC50 (pM)
oO V CH₃	<0,05	<0,05	>0,5

Indukcja zatrzymania procesu mitozy w populacji komórek poddanych działaniu chinazolinowego inhibitora KSP

W niżej opisany sposób wykonano analizę FACS w celu określenia stadium cyklu komórkowego przez pomiar zawartości DNA. Komórki Skov-3 (nowotworu jajnika ludzkiego) podzielono w stosunku 1:10 do wysiania na płytkach 10 cm i hodowano do uzyskania subkonfluencji w pożywce RPMI 1640 zawierającej 5% płodowego serum wołowego (FBS). Następnie komórki potraktowano 10 nM paklitakselu, 400 nM chinazolinonu i 1, 200 nM chinazolinonu 2 lub 0,25% DMSO (vehiculum związków) przez 24 godziny. Następnie komórki spłukano z płytek przy użyciu PBS zawierającego 5 mM EDTA, osadzono, przemyto jeden raz PBS zawierającym 1% FCS i umieszczono na noc w 85% etanolu w temperaturze 4°C. Przed analizą komórki osadzono, przemyto jednokrotnie i zabarwiono w roztworze 10 μg jodku propidyny i 250 μg rybonukleazy (RNAza) A na mililitr w temperaturze 37°C przez pół godziny. Analizę cytometrii przepływowej przeprowadzono korzystając z urządzenia Becton-Dickinson FACScan i przeanalizowano dane z 10,000 komórek na próbkę przy użyciu oprogramowania Modfit.

Związki chinazolinowe, jak również znany środek hamujący proces mitozy, paklitaksel, powodują przesunięcie w populacji komórek ze stadium cyklu komórkowego G0/G1 (zawartość 2n DNA) do stadium G2/M (zawartość 4n DNA). Stwierdzono, że inne związki tej samej klasy mają podobny wpływ.

Powstawanie jednobiegunowego wrzeciona mitotycznego po wprowadzeniu chinazolinowego inhibitora KSP

PL 203 998 B1

Aby scharakteryzować akumulację G2/M, ludzkie komórki nowotworowe Skov-3 (nowotworu jajnika), HeLa (nowotworu szyjki macicy) i A549 (nowotworu płuc) wysiano na płytkach z 96 studzienkami przy gęstościach 4000 komórek na studzienkę (SKOV-3 i HeLa) lub 8000 komórek na studzienkę (A549), pozostawiając na 24 godziny do osadzenia, po czym podawano związki chinazolinowe w róż nych stężeniach przez 24 godziny. Komórki zawieszono w 4% formaldehydzie i zabarwiono przeciwciałami przeciwko tubulinie (które następnie wykrywano wtórnymi przeciwciałami znaczonymi fluorescencyjnie) i barwnikiem Hoechsta (który barwi DNA).

Ocena wizualna wykazała, że związki chinazolinowe powodują zahamowanie cyklu komórkowego w stadium prometafazy mitozy. DNA uległ zagęszczeniu i rozpoczęło się powstawanie wrzeciona mitotycznego, ale wszystkie komórki, których cykl mitotyczny został zahamowany, wykazały jednobiegunowość wrzecion, wskazującą na zatrzymanie rozdzielania się biegunów wrzeciona. Mikroiniekcja przeciwciał przeciwko KSP także powodowała zahamowanie mitozy, a komórki poddane działaniu przeciwciał produkowały wrzeciona jednobiegunowe.

Hamowanie rozrostu komórek w komórkach rakowych po podaniu chinazolinowych inhibitorów KSP

Komórki umieszczono na 96-cio studzienkowych płytkach przy gęstościach od 1000 do 2500 komórek na studzienkę (zależnie od rodzaju komórek) i pozostawiono do uzyskania przylegania przez 24 godziny. Następnie wprowadzano do studzienek leki w różnych stężeniach i inkubowano przez 48 godzin. Moment dodania związku określa się jako T0. Do określenia ilości żyjących komórek w czasie T0 i komórek pozostałych po 48 godzinach działania związku stosowano test oparty na tetrazolium, używając związku 3-(4,5-dimetylotiazollilo-2)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium (MTS) (I.S> opis patentowy nr 5,185,450) (patrz nr katalogowy produktów Promega # G3580, CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay). Ilość komórek pozostałych po 48 godzinach porównano z ilością komórek żyjących w momencie podawania leku, co pozwoliło obliczyć zahamowanie wzrostu.

Wzrost komórek po 48 godzinach w studzienkach kontrolnych, do których wprowadzono tylko vehikulum (0,25% DMSO) określano jako wzrost 100%-owy i do tych wartości porównuje się wzrost komórek poddanych działaniu związków. Chinazolinowe inhibitory KSP spowodowały zahamowanie rozrostu komórek następujących ludzkich nowotworów: nowotworu płuc (NCI-H460, A549), sutka (MDA-MB-231, MCF-7, MCF-7/ADR-RES), okrężnicy (HT29, HCT15), jajników (SKOV-3, OVCAR-3), białaczki (HL-60(TB), K-562), nowotworu centralnego układu nerwowego (SF-268), nerek (A498), kostniakomięsaka (U2-OS) i nowotworu szyjki macicy (HeLa). Ponadto w przypadku nowotworowej mysiej linii komórkowej (B16, czerniak) stwierdzono także zahamowanie wzrostu pod wpływem związków chinazolinowych.

Obliczono GI₅₀ przez sporządzenie wykresu zależności stężenia związku w μΜ od procentowego wzrostu komórek w studzienkach z dodanym związkiem. Obliczono GI50 dla związku, będące stężeniem, przy którym wzrost jest zahamowany w 50% w stosunku do kontroli, tj. stężeniem, przy którym:

100 x [(leczone48 - T0) / (kontrolne48 - T0)] = 50

Badano wszystkie stężenia związków w dwóch potwórzeniach, a kontrole uśredniano z 12 studzienek. Bardzo podobny układ płytki 96-cio studzienkowej i obliczania GI50 stosowany jest przez National Cancer Institute (patrz Monks i in., Natl. Cancer. Inst. 83:757-766 (1991)). Różnica polega na tym, że NCI stosuje inną metodę zliczania komórek, bez użycia MTS.

Obliczanie wartości IC50

Pomiar wartości IC50 aktywności kompozycji w stosunku do KSP prowadzi się na podstawie oznaczenia aktywności ATPazy. Stosuje się następujące roztwory: Roztwór 1 składający się z 3 mM soli potasowej fosfoenolopirogronianu (Sigma P-7127), 2 mM ATP (Sigma A-3377), 1 mM IDTT (Sigma D-9779), 5 μM paklitakselu (Sigma T-7402), 10 ppm odpieniacza (Sigma A-8436), 25 mM Pipes/KOH pH 6,8 (Sigma P6757), 2 mM MgCI2 (VWR JT400301), oraz 1 mM EGTA (Sigma E3889); Roztwór 2 zawierający 1 mM NADH (Sigma N8129), 0,2 mg/ml BSA (Sigma A7906), kinazę pirogronową 7 U/ml, dehydrogenazę L-mleczanu 10 U/ml (Sigma P0294), 100 nM domeny motorycznej KSP, 50 μg/ml mikrotubul, 1 mM DTT (Sigma D9779), 5 μM paklitakselu (Sigma T-7402), 10 ppm odpieniacza 289 (Sigma A-8436), 25 mM Pipes/KOH pH 6,8 (Sigma P6757), 2 mM MgCI2 (VWR JT4003-01), oraz 1 mM EGTA (Sigma E3889). Wykonano serię rozcieńczeń (8-12 podwójnych rozcieńczeń) kompozycji w 96-cio studzienkowej płytce mikrotitracyjnej (Corning Costar 3695) przy użyciu Roztworu 1. Po rozcieńczeniu w każdej studzience było 50 μl roztworu 1. Reakcję zapoczątkowano dodatkiem 50 μl roztworu 2 do każdej studzienki, używając wielokanałowego zestawu do pipetowania. Płytkę przenoszono

PL 203 998 B1 do czytnika absorbancji i dokonywano kilku odczytów absorbancji dla każdej studzienki przy 340 nm (sposób pracy - tryb kinetyczny). Obserwowaną szybkość zmiany, która jest proporcjonalna do aktywności ATPazy, przedstawiono na wykresie w funkcji stężenia związku. W celu określenia standardowej wartości IC50 używano poniższego równania z czterema parametrami, rozwiązywanego przy zastosowaniu programu nieliniowego dopasowania (np. Grafit 4):

zakres _y =---+ _tł0

gdzie y jest obserwowaną szybkością, a x - stężeniem związku.

Związki chinazolinowe wykazują hamowanie wzrostu w różnych liniach komórkowych, w tym także (MCF-7/ADR-RES, HCT1 5), które wytwarzają glikoproteinę P (znane także jako wielolekooporne lub MDR⁺), która przenosi odporność na inne chemoterapeutyki, jak paklitaksel. A zatem, chinazolinony są środkami przeciwdziałającymi mitozie, które powstrzymują rozrost komórek i nie są podatne na oporność spowodowaną nadekspresją MDR⁺ w komórkach lekoopornych nowotworów.

Dla innych związków tej klasy także stwierdzono hamowanie rozrostu komórek, chociaż wartości GI50 są różne. Wartości GI50 dla badanych związków chinazolinowych są w zakresie od 200 nM do wyższych od najwyższych badanych stężeń. Oznacza to, że chociaż większość związków hamujących biochemicznie aktywność KSP powstrzymuje rozrost komórek, w niektórych przypadkach przy najwyższym badanym stężeniu (około 20 μΜ), wzrost ten był hamowany poniżej 50%. Wiele z tych związków wykazuje wartości GI₅₀ poniżej 10 μM, a kilka poniżej 1 μM. Związki przeciwdziałające rozrostowi, które skutecznie stosowano w praktyce klinicznej do leczenia raka (chemoterapeutyki raka) mają bardzo zróżnicowane wartości GI50. Na przykład w przypadku komórek A549 - GI50 paklitakselu wynosi 4 nM, doksorubicyny 63 nM, 5-fluorouracylu 1 μM, a hydroksymocznika 500 μM (dane dostarczone przez National Cancer Institute, Developmental Therapeutic Program, http://dtp.nci.nih.qov/). A zatem, związki hamujące rozrost komórek można stosować w każdym stężeniu. Jednakże korzystne jest używanie związków, dla których wartości GI₅₀ są mniejsze od 1 nM, korzystniej, niższe niż 20 μM, a jeszcze korzystniej niższe niż 10 μM. Wskazane jest dalsze obniżanie tych wartości do rzędu 1 μM. Dla niektórych związków chinazolinowych według wynalazku wartości GI50 wynoszą od mniej niż 200 nM do mniej niż 10 nM.

Claims

1. Związek o wzorze 1a

V\ r₃

Wzór 1 a w którym:

PL 203 998 B1

2. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia chorób proliferacyjnych.

3. Zastosowanie związku według zastrz. 2, zamienne tym, że choroby proliferacyjne obejmują rozrost, nawrót zwężenia, przerost serca, choroby immunologiczne lub zapalne.

4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że chorobą proliferacyjną jest nowotwór.

5. Sposób otrzymywania związku określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym doprowadza się do kontaktu zwią zku o wzorze 1c z odpowiednim związkiem o wzorze R3(CO)CI i wyodrę bnia się związek o wzorze 1a.

6. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera związek określony w zastrz. 1 oraz fizjologicznie dopuszczalny nośnik.