JP2021519421A - 血球および血小板由来の細胞外小胞を困窮化させた血液または血液誘導体を得るための中空糸の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
細胞外小胞は細胞起源の30nm〜2μmの膜実在物である。これらは、アポトーシス小体(1μmより上)、オンコソーム(1μmより上)、微小小胞(200nm〜1μm)、エキソソーム(30〜120nm)およびエキソマー(約35nm)で構成される(Van Der Polら、Zhangら)。
血液誘導体の製造では、典型的には、血小板および白血球の活性化および溶血が問題となる。例えば、血小板は、血液サンプルの入った試験管を振盪するだけでその活性化が達成されてしまう(Blackら)。また、造血起源の細胞外小胞の存在は、実質由来および間質由来の細胞外小胞を単離し、分子分析するための既知の交絡因子であり、分析の信号対雑音の割合および結果の再現性に影響を与える。
中空糸は、そのポロシティが小胞を通過させない(WO2007127848、WO2001082958)、または中空糸が小胞と結合するように化学的に修飾されている(WO2015130956)かのいずれかを理由として、中空糸の有する小胞の保持能と関連して記載されている。
a)血液サンプルまたは血液由来の液体サンプルを、ポロシティが20nmよりも大きな中空糸フィルターを介する重力濾過に付し、それにより濾液を得、
b)工程a)において得られた濾液中の細胞外小胞の含量を分析する
ことを含む、方法が提供される。
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、中空糸はポリエーテルスルホン製中空糸からなる。
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、ポロシティは、約150nm、約200nm、約250nm、約300nm、約350nm、約400nm、約450nm、約500nm、およびこれらの数値を含むいずれのインターバルの群からも選択される。
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、中空糸は、約150〜約250nm、約150〜約300nm、約150〜約350nm、約150〜約400nm、約150〜約450nm、約150〜約500nm、約200〜約250nm、約200〜約300nm、約200〜約350nm、約200〜約400nm、約200〜約450nm、および約200〜約500nmからなる一群の範囲から選択されるポロシティを有する。
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、中空糸は200nmに等しいポロシティを有する。
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、血液由来の液体サンプルは血漿サンプルである。
すべての実施態様は組み合わされて、本発明の上記した態様の下にある、新たな実施態様を形成してもよい。
材料および方法
すべての患者は、午前中に採血を行うまで、夜中から空腹状態であった。血液は、CPD含有の血液バッグ(CompoFlow;Fresenius Kabi)に収集されるか、血漿用のK2−EDTA管(バクタイナー(VACUTAINER)(登録商標)、ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson)、パープルキャップ、REF367864、6.0ml)に収集されるかのいずれかであった。K2−EDTA管を、その後で5または6回、上下回転させ、垂直位置を維持し、さらなる処理に付すまで、室温(20〜25℃)で貯蔵した。
遠心分離による血漿の製造は、全血を1500gで20〜25℃にて10分間遠心分離に付すことで、採血から1時間以内に行われた。使い捨てパスツール(Pasteur)ピペット(Steroglass、REF:LPMW032653;5ml)を用いて血漿を集め、バッフィーコートの3〜4mm上で止めておくことでそれが再び懸濁するのを回避した。サンプルを脂質、胆汁(Itterum)または溶血の痕跡について目視でチェックした。血漿を15mLのファルコン(Falcon)管に集め、緩やかに反転させ、標識を付したクライオ管(カタログ番号:BSM535,Biosigma)にてアリコートに供し、−20℃で貯蔵した。
血漿を上記されるように遠心分離に付して製造し、200nmのポロシティの非HFのセルロース製フィルター(カタログ番号:190−9920;Nalgene)を介して濾過した。濾過した血漿を15mLのファルコン管に集め、2mLのマイクロ遠心管にてアリコートに供し、さらに使用するまで−20℃で貯蔵した。
血漿は、一般に血液透析に使用される、20nmまたは200nmのポロシティの市販されているポリエーテルスルホン製中空糸装置(Plasmart 50;Medica Srl、Italy)の修飾バージョンを用いて得られた。該装置は、その長さを150mmから60mmに短くすることで修飾され、そうしてプライミングに必要とされる血液の容量を減らした。簡単に言えば、2つの側面の出口の1つを全血袋またはK2−EDTA管に接続する一方で、その装置の反対側の出口を空の袋に接続した。第3の側方出口を濾過された血漿を集めるための空の袋に接続した。血液袋を室温で少なくとも30分間放置し、使用前にゆっくりと混合した。
分析する前に、血漿サンプルを13000gで遠心分離に付し、分析に影響を及ぼす可能性のある大きな小胞を除去し、PBSでさらに1:10000に希釈した。NTAは、LM10ナノサイト(Nanosight)機器(Malvern, UK)を用い、カメラレベルを16に、スライダーシャッターを13000に設定して行われた。粒子濃度は、3回の独立した測定の平均として、計算された。
血漿サンプルを室温で解凍し、1μLのプロテアーゼ阻害剤のカクテル(1000X;シグマ(Sigma)カタログ番号:P−834)を各サンプルに加え、タンパク質バイオマーカーを保存した。血漿サンプルを室温(RT)で20分間にわたって1200gで遠心分離に付し、残りの赤血球と細胞破片を除去した。得られた上清を集め、リン酸緩衝液(PBS)と1:1の容量割合に希釈した。
遠心分離機を用いて得られた血漿および中空糸の濾過で得られた血漿を、さらに10000gにて室温で30分間遠心分離に付して微小小胞(MV)ペレットを得た。MVペレットを100μLのPBSに再び懸濁させてさらなる処理に付した。
Overall Exosome Immunocapture and RNA extraction kit from human biofluids and cell media(カタログ番号:HBM−RNA−BOF−20;HansaBioMed Life Sciences Ldt, Estonia)を用い、製造業者の指示に従って、MVペレットからRNAを抽出し、15mLの溶出緩衝液にて溶出した。5マイクロリットルの抽出したRNAをRNA6000 Pico Kit(カタログ番号:5067−1513;Agilent Technologies)にロードし、バイオアナライザー(Bioanalyzer)機器を操作し、RNAの電気泳動図を得た。
健康なドナー患者からの全血(10mL)に、商業供給者より購入した80μlのBRAFV600E−陽性腫瘍エクソソーム(5.5μl/μl、COLO1細胞株、HansaBioMed Life Sciences Ldt)をスパイクした。
各qPCR反応は、10μlの精製Exo−DNA、1xのSsoAdvanced Universal Probes Mastermix(Biorad;US)、0.625μlのプライマー(10μM)および0.3125μlの蛍光プローブ(10μM)を25μlの総容量で含んだ。次のプライマーおよびプローブを用いた:
a)BRAFWT FW:TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAG+T;
b)BRAFWT RW:TTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCA;
c)BRAFV600E FW:TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAG+A;
d)BRAFV600E RW:TTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCA
e)プローブ:5’−FAM CCGAAGGGGATC+CAGACAA+CTGTTCAAACTGCCTTCGG−3BHQ1−3
を用いた。
各液滴デジタルPCR反応は、10μlの精製Exo−DNA、2xのプローブ用のddPCR Supermix(カタログ番号:186301;Biorad)、20xのBRAF V600E用のMutation Detection Assay(アッセイID:dHsaMDV2010027;Biorad)および5μlのDNase不含水を含んだ。各反応を製造業者の指示に従ってロードし、次のddPCRプログラム:95℃で10分間、95℃で30秒間および56℃で1分間を40サイクル、つづいて4℃での最終保持工程を開始した。BRAF V600E遺伝子コピーおよび対立遺伝子頻度をQuantaSoft Software(Biorad)を用いて計算した。
脂質異常性指数は、製造業者の指示に従って、Cobas機器でSerum Index Gen.2キット(カタログ番号:05172179190;Roche)を用い、500μlの血漿より測定された。
図1は、遠心分離機、遠心分離機+200nmの非HFのセルロース製フィルター、200nmのポロシティまたは20nmのポロシティのポリエーテルスルホン製中空糸フィルターのいずれかを用い、全血より得られる血漿のナノ追跡分析(NTA)によるナノ粒子の総数を示す。
かくして、本発明の方法は、遠心分離機+非HFセルロース製フィルターと同様の総数のナノ粒子を得ることができる旨を示している。
図2は、遠心分離によるか、あるいは抗CD9抗体(一般的なEVマーカー)、抗CD45抗体(一般的な白血球マーカー)、抗CD61抗体(一般的な血小板マーカー)、または抗CD235抗体(一般的な赤血球マーカー)を用いる、200nmのポロシティのポリエーテルスルホン製HF装置を介する濾過によるかのいずれかによって得られる、健康なドナーの血漿より捕捉される細胞外小胞の量を示す。
かくして、200nmのポロシティのポリエーテルスルホン製HF装置の使用が、サンプルにて、白血球、赤血球および血小板のいずれかより由来の細胞外小胞を困窮化させることが示される。
図3は、遠心分離によるか、あるいは抗CD9抗体(一般的なEVマーカー)、抗CD45抗体(一般的な白血球マーカー)、抗CD61抗体(一般的な血小板マーカー)、または抗CD235抗体(一般的な赤血球マーカー)を用いる、200nmの非HFのセルロース製フィルターを介する濾過によるかのいずれかによって得られる、血漿より捕捉される細胞外小胞の量を示す。
かくして、かかるフィルターは、サンプルにて、白血球、赤血球および血小板のいずれかより由来の細胞外小胞を困窮化させないことが示される。
図4は、(A)全血を遠心分離に付すことにより得られる血漿サンプル、および(B)全血を200nmのポロシティのポリエーテルスルホン製HF装置を介して濾過することにより得られる血漿サンプル、において得られる微小小胞の低分子RNA電気泳動図を示す。
これらのデータは、HF装置を介する濾過により得られる血漿には、遠心分離によって得られる血漿中に存在する特定の微小小胞が枯渇していることを示す。これらの微小小胞は文献から200nmより大きいことが知られており(Van der Polら)、かくして200nmのポロシティはこの大きさより下位にある粒子を真に選択する。
図5は、材料および方法において上記されるように、腫瘍エクソソームでスパイクされる、全血サンプルを遠心分離に付すか、または200nmのポリエーテルスルホン製HF装置を通して濾過するかのいずれかに付した後に測定される、かかる腫瘍エキソソーム中の、BRAFV600E変異のレベル(A)、またはBRAFV600EとBRAFWTの割合(B)を示す。
その上で、図5Bにおける違いは、BRAFWTを有する細胞外小胞における困窮化の結果として、本発明の方法がBRAFWTのレベルをどのように下げるかを強調する。
図6は、遠心分離によるか、あるいは抗CD9抗体(一般的なEVマーカー)、または抗TM9SF4抗体(糖分解スイッチを受けている腫瘍実質細胞と間質細胞の両方に由来するが(Lozuponeら、2009;Lozuponeら、2015)、活性化された造血細胞にも由来する(Paolilloら)エクソソーム上で発現する代謝マーカー)を用いる、200nmのポロシティのポリエーテルスルホン製HF装置を介する濾過によるかのいずれかによって得られる、健康なドナーの血漿より捕捉されるエクソソームの量を示す。
図7は、遠心分離に付すか、200nmのポロシティのポリエーテルスルホン製HF装置を通して濾過した後の健康なドナーの血液より得られる3つの血漿サンプルの脂質異常性指数を示す。結果は、HF濾過が、遠心分離操作と比べて、3つの血漿サンプルの全てで脂質異常性指数を減らすことを示す。この結果は、少なくとも一部では、トリグリセリドに富むカイロミクロン、すなわち直径が70nm〜1000nmの範囲にある小胞の減少によって説明され得る(De Haeneら)。
図8は、遠心分離に付すか、200nmのポロシティのポリエーテルスルホン製HF装置を通して濾過することで得られる健康なドナーの血漿にてスパイクされる腫瘍エクソソーム中のBRAFV600E変異コピーのレベル(コピー数/mL)を示す。結果は、より多くの変異コピーが遠心分離に付した血漿よりもHF濾過に付した血漿から回収されることを示す。この変異回収の改善は、同じ血漿サンプルのセットで観察される脂質異常性指数の減少が観察されることと相関する。
図9は、遠心分離に付すか、200nmのポロシティのポリエーテルスルホン製HF装置を通して濾過する前後の、3つの脂質異常性血漿サンプルの脂質異常性指数を示す。結果は、HF濾過が、遠心分離と比べて、3つすべての脂質異常性血漿サンプルの脂質異常性指数を低下させ、該装置のトリグリセリドに富むカイロミクロンのレベルを低下させる能力と一致することを示す。
図10は、遠心分離機、200nmのポロシティまたは500nmのポロシティのポリエーテルスルホン製フィルターのいずれかを用いて、全血から得られた血漿をナノ追跡分析(NTA)に供したナノ粒子の総数を示す。
かくして、500nmのポロシティを有するHFフィルターは、遠心分離機および200nmのポロシティを有するHFフィルターと比べて、同様のナノ粒子の総数を得ることができることが示される。予想通り、ナノ粒子の平均の大きさは、遠心分離機および200nmのポロシティを有するHFフィルターと比べて、500nmのHFフィルターでわずかに増加した。
図11は、遠心分離によるか、あるいは抗CD9抗体(遺伝的EVマーカー)、抗CD45抗体(遺伝的白血球マーカー)、抗CD61抗体(遺伝的血小板マーカー)、または抗CD235抗体(遺伝的赤血球マーカー)を用いる500nmのポロシティのポリエーテルスルホン製HF装置を介する濾過によるか、のいずれかによって得られる健康なドナーの血漿より捕捉される細胞外小胞の量を示す。
このように、500nmのポロシティのポリエーテルスルホン製HF装置の使用は、サンプルにて、白血球および赤血球のいずれかより由来の細胞外小胞を困窮化させるが、血小板由来の細胞外小胞については有意な効果のなかったことが分かる。
図12は、遠心分離によるか、または200nmのポロシティのHF装置を通して濾過することによって得られる、5人の転移性黒色腫患者の血漿中の野生型BRAF遺伝子コピーのレベル(コピー数/mL)を示す。結果は、HF装置を用いて得られた5人の血漿サンプルの中の4つが、遠心分離によって得られるものよりもBRAF遺伝子コピー数が有意に少なかったことを示す。この結果はHF濾過ががん患者の血漿中の野生型DNAのレベルを減少させることを示す。
図13は、遠心分離によるか、または200nmのポロシティのポリエーテルスルホン製HF装置を通して濾過することによって得られる、3人の転移性黒色腫患者の血漿中のBRAFV600E変異の対立遺伝子頻度を示す。結果は血漿のHF濾過が各サンプルにおいてBRAFV600Eの対立遺伝子頻度を改善することを示す。この結果はこれらのサンプルにおいて観察される野生型BRAF遺伝子コピーのレベルの減少と一致する。
図14は、遠心分離によるか、あるいは抗TM9SF4抗体(糖分解スイッチを受けている腫瘍実質細胞と間質細胞の両方に由来するエキソソーム上で発現する代謝マーカー)を用いる200nmのポロシティのポリエーテルスルホン製HF装置を通して濾過するかのいずれかによって、腫瘍エキソソームをスパイクした血液より得られる血漿より捕捉される腫瘍エクソソームの量を示す。
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Claims (15)
- 血液サンプルまたは血液由来の液体サンプルを重力濾過に付すことにより細胞外小胞を困窮化させるための、ポロシティが20nmよりも大きな中空糸のインビトロでの使用であって、かかる細胞外小胞が、中空糸のポロシティよりも下位の大きさを有し、赤血球、白血球、血小板およびその組み合わせからなる群より選択される血液成分を起源とする、中空糸のインビトロにおける使用。
- 中空糸がポリエーテルスルホン製中空糸を含む、請求項1に記載の使用。
- 中空糸がポリエーテルスルホン製中空糸から構成される、請求項1に記載の使用。
- 細胞外小胞が、微小小胞、エクソソーム、エキソマー、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜3に記載の使用。
- 中空糸が約200nmのポロシティを有する、請求項1〜4に記載の使用。
- 中空糸が約150〜約500nmのポロシティを含む、請求項1〜4に記載の使用。
- 血液由来の液体サンプルが血漿サンプルである、請求項1〜6に記載の使用。
- 赤血球、白血球、血小板、およびそのいずれかの組み合わせからなる群より選択される血液成分を起源とする、細胞外小胞を実質的に困窮化させる血液または血液誘導体を得るためのインビトロでの方法であって、血液サンプルまたは血液由来の液体サンプルをポロシティが20nmよりも大きな中空糸を含むフィルターを介して重力濾過に付す工程、それにより細胞外小胞を実質的に困窮化させた血液または血液誘導体を得る工程を含め、かかる細胞外小胞が該中空糸のポロシティよりも下位にある大きさを有する、インビトロでの方法。
- 血液サンプルまたは血液由来の液体サンプルの細胞外小胞の含量をインビトロにて分析する方法であって、
a)血液サンプルまたは血液由来の液体サンプルを、ポロシティが20nmよりも大きな中空糸フィルターを介する重力濾過に付し、それにより濾液を得、
b)工程a)において得られた濾液中の細胞外小胞の含量を分析する
ことを含む、方法。 - 中空糸がポリエーテルスルホン製中空糸を含む、請求項8〜9に記載の方法。
- 中空糸がポリエーテルスルホン製中空糸から構成される、請求項8〜9に記載の使用。
- 細胞外小胞が、微小小胞、エクソソーム、エキソマー、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項8〜11に記載の方法。
- 中空糸が約200nmのポロシティを有する、請求項8〜12に記載の方法。
- 中空糸が約150〜約500nmのポロシティを含む、請求項8〜12に記載の方法。
- 血液由来の液体サンプルが血漿サンプルである、請求項8〜14に記載の方法。
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