CN112055814A - 中空纤维用于获得源于血细胞和血小板的细胞外囊泡贫化的血液或血液衍生物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有孔隙为20nm以上的中空纤维特别是聚醚砜中空纤维用于使血液和血液衍生物贫化源于血液的细胞外囊泡特别是胞外体和外来体的用途，以及用于获得和分析这样的贫化的样品的方法。

Description

中空纤维用于获得源于血细胞和血小板的细胞外囊泡贫化的 血液或血液衍生物的用途
本发明涉及具有孔隙为20nm以上的中空纤维特别是聚醚砜中空纤维用于使血液和血液衍生物贫化源于血液的细胞外囊泡特别是微囊泡和胞外体和外来体(exomers)的用途，以及用于获得和分析这样的贫化的样品的方法。
背景技术
细胞外囊泡是细胞起源的30nm-2μm的膜性实体。这些包括凋亡小体(1μm以上)、肿瘤泌体(oncosomes)(1μm以上)、微囊泡(200nm-1μm)、胞外体(30-120nm)和外来体(约35nm)(Van Der Pol et al.,Zhang et al.)。
中空纤维(HF)是一类半渗透性屏障，其具有特别是在透析领域中的用途(Ishihara et al.)。它们的主要特征是它们的孔隙，即平均孔径和孔分布。在医学领域，它们通常用作用于血液透析、血液滤过和血浆置换的过滤器。
中空纤维使用多种材料生产，这些材料包括纤维素、纤维素酯、聚砜、聚醚砜(PES)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚酰胺、含氮聚合物、玻璃、二氧化硅、乙酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚(氯乙烯)(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酯、陶瓷、聚酰亚胺、聚醚酰亚胺、聚乙烯亚胺官能化的聚酰胺酰亚胺(TorlonTM)、聚(乙烯醇)(PVA)。(Seo-Hyun Pak etal.；Xing Yanga et al.Hailin Zhu et.Al；Amir Dashti et al.；Ze-Lin Qiu et al.；LiFS et al.；Labreche Y et al.；Zhang Y et al.；Higa M et al.,Mock 2007)。
本领域充满了如何可以制备血液和血液衍生物用于分析的实例。
血液衍生物的制备通常遭受血小板和白细胞的活化以及溶血。血小板的活化，例如可以仅仅通过摇动包含血液样品的试管测试来实现(Black et al.)。同样，造血起源的细胞外囊泡的存在是源于实质和基质的细胞外囊泡的分离和分子分析的已知混杂因素，影响分析的信噪比和结果的再现性。
现有技术
在现有技术中结合中空纤维保留囊泡的能力已经描述了中空纤维，因为其孔隙不允许它们通过(WO 2007127848，WO 2001082958)或是因为中空纤维为了结合囊泡已进行了化学改性(WO 2015130956)。
附图说明
图1-通过离心、通过穿过200nm孔隙的HF装置过滤或者通过穿过20nm孔隙的HF装置过滤而获得的血浆的纳米颗粒计数。
图2-在三种转移性黑色素瘤患者离心的血浆中通过等位基因频率BRAF基因拷贝(拷贝/mL)或通过穿过200nm HF装置过滤获得的血浆样品中测量的源于血液的胞外体的数量。
图3-通过穿过200nm孔隙的非HF纤维素过滤器过滤获得的血浆样品中测量的源于血液的胞外体的数量。
图4-通过穿过200nm HF装置过滤或离心获得的血浆样品中存在的微囊泡的小RNA电泳图。
图5-如在离心或穿过200nm聚醚砜HF装置过滤后测量的健康供体血液中掺入的肿瘤胞外体中的BRAFV600E突变的水平(A)或者BRAFV600E相对BRAFWT的比率(B)。
图6-通过穿过200nm HF装置过滤或通过离心获得的血浆样品中测量的CD9-和TM9SF4-阳性胞外体的数量。
图7–在离心或穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤后的健康供体血浆样品的高血脂(Lipemic)指数。
图8–通过离心或穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤获得的健康供体血浆中掺入的肿瘤胞外体中的BRAFV600E突变拷贝的水平(拷贝/mL)。
图9–在离心或穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤之前和之后的高血脂血浆样品的高血脂指数。
图10-使用离心机、200nm孔隙或500nm孔隙的聚醚砜HF过滤器，从全血中获得的血浆的纳米颗粒计数。
图11-通过离心或穿过500nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤获得的血浆样品中测量的CD9-、CD45-、CD 61-和CD 235阳性胞外体的数量。
图12–通过离心或穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤获得的转移性黑色素瘤患者的血浆中的野生型BRAF基因拷贝的水平(拷贝/mL)。
图13–通过离心或穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤获得的转移性黑色素瘤患者的血浆中的BRAF基因拷贝(拷贝/mL)的等位基因频率。
图14–掺有肿瘤胞外体的血浆样品以及通过穿过200nm HF装置过滤或通过离心获得的血浆样品中测量的TM9SF4-阳性胞外体的数量。
具体实施方式
我们已经令人惊讶地发现，使用具有孔隙为20nm以上的中空纤维过滤器通过重力过滤允许贫化细胞外囊泡，所述细胞外囊泡起源于某些血液组分并且具有小于所述中空纤维的孔隙的尺寸。
在本发明的第一方面，提供了具有孔隙为20nm以上的中空纤维用于通过重力过滤使血液或源于血液的液体样品贫化细胞外囊泡的体外用途，这样的细胞外囊泡具有小于所述中空纤维的孔隙的尺寸并且起源于选自由红细胞、白细胞、血小板及其组合组成的组的血液组分。
在本发明的第二方面，提供了一种用于获得细胞外囊泡基本上贫化的血液或血液衍生物的体外方法，所述细胞外囊泡起源于选自由红细胞、白细胞、血小板及其任何组合组成的组的血液组分，所述方法包括以下步骤：穿过包括具有孔隙为20nm以上的中空纤维的过滤器重力过滤血液或源于血液的液体样品，从而获得细胞外囊泡基本上贫化的血液或血液衍生物，这样的细胞外囊泡具有小于所述中空纤维的孔隙的尺寸。
在本发明的第三方面，提供了一种分析血液或源于血液的液体样品的细胞外囊泡含量的体外方法，这样的方法包括：
a)穿过具有孔隙为20nm以上的中空纤维过滤器重力过滤所述血液或源于血液的液体样品，从而获得滤液，
b)分析在步骤a)中获得的所述滤液的细胞外囊泡含量。
技术人员将根据情况并且基于他自己的经验和本领域中的可用文献知道进行哪种分析和如何进行分析。这样的分析可以例如针对使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或流式细胞术(FACS)来测量在其表面上具有特定蛋白的细胞外囊泡的数量。其他分析可能针对经由纳米跟踪分析(NTA)来计数样品中的总纳米颗粒的数目或者通过定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)或下一代测序(NGS)测量基因表达。
在本发明的任何方面的实施方式中，中空纤维包括聚醚砜中空纤维。
在本发明的任何方面的实施方式中，中空纤维由聚醚砜中空纤维组成。
在本发明的任何方面的实施方式中，中空纤维包括选自以下的列表的材料：纤维素、纤维素酯、聚砜、聚醚砜(PES)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚酰胺、含氮聚合物、玻璃、二氧化硅、乙酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚(氯乙烯)(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酯、陶瓷、聚酰亚胺、聚醚酰亚胺、聚乙烯亚胺官能化的聚酰胺酰亚胺(TorlonTM)和聚(乙烯醇)(PVA)。
在本发明的任何方面的实施方式中，中空纤维由选自以下的列表的材料组成：纤维素、纤维素酯、聚砜、聚醚砜(PES)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚酰胺、含氮聚合物、玻璃、二氧化硅、乙酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚(氯乙烯)(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酯、陶瓷、聚酰亚胺、聚醚酰亚胺、聚乙烯亚胺官能化的聚酰胺酰亚胺(TorlonTM)和聚(乙烯醇)(PVA)。
在本发明的任何方面的实施方式中，孔隙选自以下的列表：20nm以上、25nm以上、30nm以上、35nm以上、40nm以上、45nm以上、50nm以上、55nm以上、60nm以上、65nm以上、70nm以上、75nm以上、80nm以上、85nm以上、90nm以上、95nm以上、100nm以上、105nm以上、110nm以上、115nm以上、120nm以上、125nm以上、130nm以上、135nm以上、140nm以上、145nm以上、150nm以上、155nm以上、160nm以上、165nm以上、170nm以上、175nm以上、180nm以上、185nm以上、190nm以上、195nm以上和200nm以上。
在本发明的任何方面的实施方式中，孔隙为500nm以下。
在本发明的任何方面的实施方式中，孔隙选自以下的列表：约150nm、约200nm、约250nm、约300nm、约350nm、约400nm、约450nm、约500nm和包括这些值的任何区间。
在本发明的任何方面的实施方式中，孔隙选自以下的列表：150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm和包括这些值的任何区间。
在本发明的任何方面的实施方式中，中空纤维具有的孔隙选自由以下组成的范围的组：约150至约250nm、约150至约300nm、约150至约350nm、约150至约400nm、约150至约450nm、约150至约500nm、约200至约250nm、约200至约300nm、约200至约350nm、约200至约400nm、约200至约450nm和约200至约500nm。
在本发明的任何方面的实施方式中，中空纤维具有的孔隙选自由以下组成的范围的组：150至250nm、150至300nm、150至350nm、150至400nm、150至450nm、150至500nm、200至250nm、200至300nm、200至350nm、200至400nm、200至450nm和200至500nm。
在本发明的任何方面的实施方式中，中空纤维具有约200nm的孔隙。
在本发明的任何方面的实施方式中，中空纤维具有等于200nm的孔隙。
在本发明的任何方面的实施方式中，源于血液的液体样品是血浆样品。
在本发明的任何方面的实施方式中，细胞外囊泡选自由微囊泡、胞外体、外来体及其组合组成的组。
在本发明的任何上述方面下，所有实施方式可以组合以产生新的实施方式。
实施例
现在借助于非限制性实施例描述本发明。
材料和方法
A)血液收集
所有患者在早晨血液收集前从午夜开始已经禁食。将血液收集在包含CPD的血袋(CompoFlow；Fresenius Kabi)中或收集在K2-EDTA血浆试管(
Figure BDA0002710875970000061
BectonDickinson,紫盖,REF 367864,6.0ml)中。随后将K2-EDTA试管倒置5或6次，保持竖直位置，并且在室温(20-25℃)下储存，直到进一步加工。
B)通过离心机的血浆制备
通过离心机的血浆制备在收集后一小时内通过将1500g的全血在20-25℃下离心10分钟来进行。使用一次性巴斯德(Pasteur)吸管(Steroglass,REF:LPMW032653；5ml)收集血浆，通过在血沉棕黄层上方3-4mm停止避免使其再悬浮。目视检查样品的脂质、胆汁(Itterum)或溶血的痕迹。将血浆收集在15mL Falcon试管中，轻轻倒置，并在标记的冷冻试管(目录号：n°BSM 535,Biosigma)中等分，并且在-20℃下储存。
C)穿过200nm孔隙的非HF纤维素过滤器的过滤获得的血浆
将血浆如前所述通过离心制备，并且穿过200nm孔隙的非HF纤维素过滤器(目录号:190-9920；Nalgene)过滤。将过滤后的血浆收集在15mL Falcon试管中，等分于2mL微量离心管中，并且在进一步使用之前在-20℃下储存。
D)穿过20/200nm孔隙的聚醚砜中空纤维装置的过滤获得的血浆
使用通常用于血液透析的具有20nm或200nm孔隙的可商购的聚醚砜中空纤维装置(Plasmart 50；Medica Srl,意大利)的修改版本获得血浆。通过将装置的长度从150mm减小到60mm，对装置进行了修改，从而降低了灌注所需的血液量。简而言之，两侧出口之一连接至全血袋或K2-EDTA试管，而装置的相对侧处的出口连接至空袋。第三横向出口连接至空袋用于收集过滤后的血浆。将血袋在室温下放置至少30分钟，并且在使用前轻轻混合。
穿过该装置通过重力过滤将四十毫升全血过滤，并将15mL(30％)血浆收集在横向袋中，转移到50mL Falcon试管中，等分于2mL微量离心管中并在-20℃下储存。全血及其细胞组分浓缩在渗余物中，收集在侧袋中并丢弃。
E)纳米颗粒跟踪分析(NTA)
分析之前，将血浆样品以13000g离心，以消除可能影响分析的较大囊泡，并用PBS以1:10000进一步稀释。使用LM10 Nanosight仪器(Malvern，英国)来进行NTA，将相机水平设置为16并且滑块快门设置为13000。颗粒浓度计算为三个独立测量的平均值。
F)通过ELISA的胞外体定量
将血浆样品在室温下解冻，并且将1μL蛋白酶抑制剂混合物(1000X；Sigma目录号：P-834)添加到每个样品中，以保存蛋白生物标记。将血浆样品在室温(RT)下以1200g离心20分钟，以消除残留的红细胞和细胞碎片。将所得上清液收集并且在体积比为1:1的磷酸盐缓冲液(PBS)中稀释。
简而言之，将100μl稀释的血浆在4℃下在96孔板中温育过夜，这些孔板预涂覆有0.1μg/孔的抗CD9抗体(目录号：HBM-CD9-100,HansaBioMed Life Sciences Ltd)、抗CD45抗体(目录号：610265,BD)、抗CD61抗体(目录号：555752,BD)、抗CD235抗体(目录号：555569,BD)和抗TM9SF4抗体(2μg/ml)。用洗涤缓冲液(PBS-Tween 0.05％)三次洗涤后，将板用生物素化的抗CD9抗体(目录号：558749,BD Pharmigen)温育，在4℃下温育2hr，用洗涤缓冲液洗涤三次，用匹配的多HRP-链霉抗生物素蛋白二抗(目录号：21140,Pierce)在4℃下温育一小时，并且用洗涤缓冲液洗涤三次。比色反应通过向每个孔中添加100μl底物溶液(TMBlue POD；1:1的溶液A和B，Pierce)开始，在黑暗中在室温下温育10分钟，并且通过添加100μl停止溶液(1N硫酸)来停止。用M1000 Tecan在450nm处读取O/D吸附量，并且结果表示为信号背景(StB)比。
G)微囊泡团粒的制备
将离心机获得的血浆和中空纤维过滤的血浆在室温下进一步以10000g离心30分钟，以获得微囊泡(MV)团粒。使MV团粒在进一步加工之前再悬浮于100μL的PBS中。
H)从MV团粒中提取小RNA以及电泳图分析
将RNA使用总体胞外体免疫捕获和RNA提取试剂盒(Overall ExosomeImmunocapture and RNA extraction kit)从人类生物流体和细胞培养基(目录号：HBM-RNA-BOF-20；HansaBioMed Life Sciences Ldt,爱沙尼亚(Estonia))中的MV团粒中提取，并且根据制造商的说明在15mL的洗脱缓冲液中洗脱。将五微升提取的RNA加载到RNA6000Pico试剂盒(目录号：5067-1513；Agilent Technologies)中，并且在Bioanalyzer仪器上运行以获得RNA电泳图。
I)用BRAFV600E-阳性肿瘤胞外体掺入血液样品以及与胞外体相关的DNA的分离。
从健康供体患者的十毫升全血掺有80μl从商业供应商购买的BRAFV600E-阳性肿瘤胞外体(5,5μl/μl，COLO1细胞系，HansaBioMed Life Sciences Ldt)。
使用用于循环DNA提取的可商购试剂盒(seleCTEVTM低输入DNA；Exosomics SienaSpa，意大利)提取和纯化来自掺入的肿瘤胞外体的胞外体相关的DNA(Exo-DNA)。简而言之，使用专有肽从血浆中捕获胞外体，并且在2小时的温育后使胞外体成团粒。将胞外体团粒用专有的裂解缓冲液裂解，并且用蛋白酶K消化以从蛋白质复合物中释放DNA。然后将样品补充有乙醇，加载到二氧化硅膜旋转柱上，并且以10000g离心1分钟。离心后，将流通物(flow-through)丢弃。根据制造商的说明进行了两个洗涤步骤，以在洗脱前除去污染性溶剂和源于血浆的抑制剂。在使用前，将Exo-DNA用50μl洗脱缓冲液洗脱并且在-20℃下储存。
通过qPCR扩增BRAFV600E和BRAFWT基因
每个qPCR反应在25μl的总体积下包括10μl的纯化Exo-DNA，1X SsoAdvancedUniversal Probes Mastermix(Biorad；美国)、0.625μl的引物(10μM)和0.3125μl的荧光探针(10μM)。使用了以下引物和探针：
a)BRAFWT FW：TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAG+T；
b)BRAFWT RW：TTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCA；
c)BRAFV600E FW：TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAG+A；
d)BRAFV600E RW TTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCA
e)探针：5’-FAMCCGAAGGGGATC+CAGACAA+CTGTTCAAACTGCCTTCGG-3BHQ1-3
仔细混合后，将每个反应一式三份加载在96孔PCR板上并且启动以下qPCR程序：95℃持续3'，40个95℃下持续5'’和60℃下持续30”的循环，接着是在4℃下的最终保持步骤。为了计算回收的BRAFV600E的％，使用以下公式：＝[2^(Ct 输入 –Ct 分离 )]％。
L)通过微滴式数字PCR(digital droplet PCR)检测BRAFV600E基因拷贝
每个微滴式数字PCR反应包括10μl纯化的Exo-DNA、2X的ddPCR Supermix forProbes(目录号186301；Biorad)、20X的BRAF V600E的突变检测测定(测定ID：dHsaMDV2010027；Biorad)和5μl的无DNase的水。根据制造商的说明加载每个反应，并且启动以下ddPCR程序：95℃持续10'，40个95℃下持续30”和56℃下持续1'的循环，接着是在4℃下的最终保持步骤。使用QuantaSoft软件(Biorad)计算BRAF V600E基因拷贝和等位基因频率。
M)血浆样品的高血脂指数的定量
根据制造商的说明(目录号05172179190；Roche)使用Cobas仪器上的Serum IndexGen.2试剂盒，从500ul血浆中测量高血脂指数。
实施例1：具有200nm孔的中空纤维(HF)装置有效地从血液中分离富纳米颗粒的血 浆
图1描绘了用纳米跟踪分析(NTA)血浆的纳米颗粒计数，该血浆使用离心机、离心机加200nm非HF纤维素过滤器、200nm孔隙或20nm孔隙的聚醚砜中空纤维过滤器从全血中获得。
因此示出，本发明的方法允许获得与离心机加非HF纤维素过滤器相似的纳米颗粒计数。
实施例2：从200nm HF过滤全血获得的血浆比离心机获得的血浆具有更少的源于 红细胞和白细胞的细胞外囊泡
图2描绘了使用以下从通过离心或穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤获得的健康供体血浆中捕获的细胞外囊泡的数量：抗CD9抗体(通用EV标记)、抗CD45抗体(通用白细胞标记)、抗CD61抗体(通用血小板标记)或抗CD235抗体(通用红细胞标记)。
因此示出，使用200nm孔隙的聚醚砜HF装置使样品贫化源于白细胞、红细胞和血小板的细胞外囊泡。
实施例3：截止200nm的非HF纤维素过滤器不会选择细胞外囊泡亚群
图3描绘了使用以下从通过离心或穿过200nm非HF纤维素过滤器过滤获得的血浆中捕获的细胞外囊泡的数量：抗CD9抗体(通用EV标记)、抗CD45抗体(通用白细胞标记)、抗CD61抗体(通用血小板标记)或抗CD235抗体(通用红细胞标记)。
因此示出，这样的过滤器不使样品贫化源于白细胞、红细胞和血小板的细胞外囊泡。
实施例4：200nm HF装置真正选择此尺寸以下的颗粒
图4描绘了在(A)通过离心全血获得的血浆样品和(B)通过穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤全血获得的血浆样品中获得的微囊泡的小RNA电泳图。
这些数据示出，通过穿过HF装置过滤而获得的血浆是耗尽存在于通过离心获得的血浆中的某些微囊泡。这些微囊泡从文献中已知大于200nm(Van der Pol et al.)，因此200nm孔隙真正选择此尺寸以下的颗粒。
实施例5：用200nm HF装置过滤后，从全血获得的血浆中有效地回收BRAFV600E阳性 肿瘤胞外体
图5描绘了如在离心或穿过200nm聚醚砜HF装置过滤如以上在材料和方法中描述的已经掺有这样的肿瘤胞外体的全血后测量的肿瘤胞外体中的BRAFV600E突变的水平(A)或者BRAFV600E相对BRAFWT的比率(B)。
示出，相对于经典的离心方法，本发明的方法没有显著地改变血浆样品中发现的肿瘤胞外体的水平。
此外，图5B中的差异突出显示了本发明的方法如何由于BRAFWT(携带细胞外囊泡)的贫化而降低BRAFWT的水平。
实施例6：具有200nm孔隙的HF过滤消除代谢标记TM9SF4的假阳性信号
图6描绘了使用以下从通过离心或穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤获得的健康供体血浆中捕获的胞外体的数量：抗CD9抗体(通用EV标记)或抗TM9SF4抗体(源于经历糖酵解转换的肿瘤实质和基质细胞的胞外体上表达的代谢标记(Lozupone et al.2009；Lozupone et al.2015)而且还有源于活化的造血细胞的胞外体上表达的代谢标记(Paolillo et al))。
示出，来自用本发明的方法获得的健康供体血浆的TM9SF4阳性胞外体的水平低于为阳性检测设定的诊断阈值(虚线)。相反地，来自通过离心获得的健康供体血浆的TM9SF4阳性胞外体的水平为这样的诊断阈值以上，从而导致假阳性检测。结果表明，HF过滤大大降低了由于血细胞活化而引起的混杂效果，促进了对来自实质和基质细胞的胞外体上的生物标记检测。
实施例7：血液的HF过滤降低了血浆的高血脂指数
图7描绘了在离心或穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤后从健康供体血液中获得的三种血浆样品的高血脂指数。结果示出，与离心相比，HF过滤降低了所有三种血浆样品的高血脂指数。该结果可以至少部分地通过富甘油三酯的乳糜微粒(具有范围是从70nm至1000nm的直径的囊泡)的降低来解释(De Haene et al.)。
实施例8：通过HF过滤降低高血脂指数改进突变恢复
图8描绘了通过离心或穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤获得的健康供体血浆中掺入的肿瘤胞外体中的BRAFV600E突变拷贝的水平(拷贝/mL)。结果示出，从HF过滤的血浆比从离心的血浆恢复更多的突变拷贝。此改进的突变恢复与观察到的在同一组血浆样品中观察到的高血脂指数的降低相关。
实施例9：高血脂血浆样品的HF过滤降低了它们的高血脂指数
图9在离心或穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤之前和之后的三种高血脂血浆样品的高血脂指数。结果示出，与离心相比，HF过滤降低了所有三种高血脂血浆样品的高血脂指数，与该装置降低富甘油三酯的乳糜微粒水平的能力相符。
实施例10：具有500nm孔的中空纤维(HF)装置有效地从血液中分离富纳米颗粒的 血浆
图10描绘了用纳米跟踪分析(NTA)血浆的纳米颗粒计数，该血浆使用离心机、200nm孔隙或500nm孔隙的聚醚砜HF过滤器从全血中获得。
因此示出，与离心机和具有200nm孔隙的HF过滤器相比，具有500nm孔隙的HF过滤器允许获得相似的纳米颗粒计数。如所预期的，与离心机和具有200nm孔隙的HF过滤器相比，通过具有500nm的HF过滤器的平均纳米颗粒尺寸略有增加。
实施例11：从500nm HF过滤全血获得的血浆比离心机获得的血浆具有更少的源于 红细胞和白细胞的细胞外囊泡
图11描绘了使用以下从通过离心或穿过500nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤获得的健康供体血浆中捕获的细胞外囊泡的数量：抗CD9抗体(通用EV标记)、抗CD45抗体(通用白细胞标记)、抗CD61抗体(通用血小板标记)或抗CD235抗体(通用红细胞标记)。
因此示出，使用500nm孔隙的聚醚砜HF装置使样品贫化源于白细胞和红细胞的细胞外囊泡，但是对源于血小板的细胞外囊泡没有显著的影响。
实施例12：HF过滤降低了转移性黑色素瘤患者的血浆中的野生型BRAF基因的水平
图12描绘了通过离心或穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤获得的五种转移性黑色素瘤患者的血浆中的野生型BRAF基因拷贝的水平(拷贝/mL)。结果示出，用HF装置获得的五种血浆样品中的4种具有的BRAF基因拷贝显著少于通过离心获得的哪些。此结果指示，HF过滤降低了癌症患者的血浆中的野生型DNA的水平。
实施例13：HF过滤改进了转移性黑色素瘤患者的血浆中的BRAFV600E突变的等位基 因频率
图13描绘了通过离心或穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤获得的三种转移性黑色素瘤患者的血浆中的BRAFV600E突变的等位基因频率。结果示出，血浆的HF过滤改进了每种样品中的BRAFV600E的等位基因频率。该结果与在这些样品中观察到的野生型BRAF基因拷贝水平的降低一致。
实施例14：具有200nm孔隙的HF过滤促进了从血浆中检测肿瘤胞外体
图14描绘了使用以下从肿瘤胞外体掺入的血液通过离心或穿过200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤获得的血浆中捕获的肿瘤胞外体的数量：抗TM9SF4抗体(源于经历糖酵解转换的肿瘤实质和基质细胞的胞外体上表达的代谢标记)。
示出，TM9SF4阳性肿瘤胞外体的水平在从肿瘤胞外体掺入的血液通过用200nm孔隙的聚醚砜HF装置过滤获得的血浆中增加。相反地，由于通过源于血液的囊泡产生的高背景噪声，在从血液通过离心获得的血浆中未观察到TM9SF4阳性肿瘤胞外体的水平的变化。结果表明，HF过滤大大降低了由于血细胞活化而引起的混杂效果，促进了对肿瘤胞外体上的生物标记检测。
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Claims (15)

1.具有孔隙为20nm以上的中空纤维用于通过重力过滤使血液或源于血液的液体样品贫化细胞外囊泡的体外用途，这样的细胞外囊泡具有小于所述中空纤维的孔隙的尺寸并且起源于选自由红细胞、白细胞、血小板及其组合组成的组的血液组分。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述中空纤维包括聚醚砜中空纤维。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述中空纤维由聚醚砜中空纤维组成。
4.根据权利要求1-3所述的用途，其中，所述细胞外囊泡选自由微囊泡、胞外体、外来体及其组合组成的组。
5.根据权利要求1-4所述的用途，其中，所述中空纤维的孔隙为约200nm。
6.根据权利要求1-4所述的用途，其中，所述中空纤维的孔隙包括在约150与约500nm之间。
7.根据权利要求1-6所述的用途，其中，所述源于血液的液体样品是血浆样品。
8.一种用于获得细胞外囊泡基本上贫化的血液或血液衍生物的体外方法，所述细胞外囊泡起源于选自由红细胞、白细胞、血小板及其任何组合组成的组的血液组分，所述方法包括以下步骤：穿过包括具有孔隙为20nm以上的中空纤维的过滤器重力过滤血液或源于血液的液体样品，从而获得细胞外囊泡基本上贫化的血液或血液衍生物，这样的细胞外囊泡具有小于所述中空纤维的孔隙的尺寸。
9.一种分析血液或源于血液的液体样品的细胞外囊泡含量的体外方法，这样的方法包括
a)穿过具有孔隙为20nm以上的中空纤维过滤器重力过滤所述血液或源于血液的液体样品，从而获得滤液；
b)分析在步骤a)中获得的所述滤液的细胞外囊泡含量。
10.根据权利要求8-9所述的方法，其中，所述中空纤维包括聚醚砜中空纤维。
11.根据权利要求8-9所述的方法，其中，所述中空纤维由聚醚砜中空纤维组成。
12.根据权利要求8-11所述的方法，其中，所述细胞外囊泡选自由微囊泡、胞外体、外来体及其组合组成的组。
13.根据权利要求8-12所述的方法，其中，所述中空纤维的孔隙为约200nm。
14.根据权利要求8-12所述的方法，其中，所述中空纤维的孔隙包括在约150与约500nm之间。
15.根据权利要求8-14所述的方法，其中，所述源于血液的液体样品是血浆样品。
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