BR112020020083A2 - Uso in vitro de fibras ocas, método in vitro para obtenção de sangue ou de um derivado de sangue e método in vitro para analisar o teor de vesículas extracelulares de um sangue ou amostra líquida derivada de sangue - Google Patents

Uso in vitro de fibras ocas, método in vitro para obtenção de sangue ou de um derivado de sangue e método in vitro para analisar o teor de vesículas extracelulares de um sangue ou amostra líquida derivada de sangue Download PDF

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Davide Zocco
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Abstract

uso in vitro de fibras ocas, método in vitro para obtenção de sangue ou de um derivado de sangue e método in vitro para analisar o teor de vesículas extracelulares de um sangue ou amostra líquida derivada de sangue. a presente invenção refere-se ao uso de fibras ocas tendo uma porosidade acima de 20 nm, em particular fibras ocas de poliéter sulfona, para empobrecer sangue e derivados de sangue a partir de vesículas extracelulares derivadas de sangue, em particular exossomas e exômeros, e a métodos de obtenção e análise de tais amostras empobrecidas.

Description

USO IN VITRO DE FIBRAS OCAS, MÉTODO IN VITRO PARA OBTENÇÃO DE SANGUE OU DE UM DERIVADO DE SANGUE E MÉTODO IN VITRO PARA ANALISAR O TEOR DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DE UM SANGUE OU
AMOSTRA LÍQUIDA DERIVADA DE SANGUE Campo da Invenção
[0001] A presente invenção refere-se ao uso de fibras ocas tendo uma porosidade acima de nm, em particular fibras ocas de poliéter sulfona, para empobrecer sangue e derivados de sangue a partir de vesículas extracelulares derivadas de sangue, em particular microvesículas e exossomas e exômeros, e a métodos de obtenção e análise de tais amostras empobrecidas. Fundamentos da Invenção
[0002] Vesículas extracelulares são entidades membranosas de 30 nm a 2 um de origem celular. Estas compreendem corpos apoptóticos (acima de 1 um), oncossomas (acima de 1 pm), microvesículas (200 nm a 1 um), exossomas (30 a 120 nm) e exômeros (em torno de nm) (Van Der Pol et al., Zhang et al.).
[0003] Fibras ocas (HF) são uma classe de barreiras semipermeáveis que são de uso em particular no campo de diálise (Ishihara et al.). Sua característica principal é sua porosidade, isto é, o diâmetro médio de poros e a distribuição de poros. No campo de medicina, são tipicamente usadas como filtros para hemodiálise, hemofiltração e plasmaferese.
[0004] Fibras ocas têm sido produzidas utilizando-se uma variedade de materiais incluindo celulose, éster de celulose, polissulfona, poliéter sulfona (PES), polimetilmetacrilato (PMMA), poliamida, polímeros contendo nitrogênio, vidro, sílica, acetato de celulose, fluoreto de polivinilideno (PVDF), poli(cloreto de vinila) (PVC), politetrafluoroetileno (PTFE), poliéster, cerâmica, poliimida, polieterimida, poliamida funcionalizada com polietilenoimina (Torlonº), poli(álcool vinílico) (PVA). (Seo-Hyun Pak et al.; Xing Yanga et al. Halin Zhu et al.; Amir Dashti et al.; Ze-Lin Qiu et al.; Li FS et al.; Labreche Y et al.; Zhang Y et al.; Higa M et al. Mock 2007).
[0005] O estado da técnica é carregado com exemplos de como sangue e derivados de sangue podem ser preparados para análise.
[0006] A preparação de derivados de sangue tipicamente sofre de ativação de plaquetas e células brancas do sangue e hemólise. A ativação de plaquetas, por exemplo, pode ser obtida pela simples agitação de um tubo de teste contendo uma amostra de sangue (Black et al.). Também, a presença de vesículas extracelulares de origem hematopoiética é um fator de confusão conhecido para o isolamento e análise molecular de vesículas extracelulares derivadas de parênquima e estroma, afetando a relação sinal-para-ruído da análise e a reprodutibilidade dos resultados. Estado da Técnica
[0007] As fibras ocas foram descritas no estado da técnica anterior em conexão com sua capacidade de reter vesículas, seja porque sua porosidade não permite a sua passagem (WO 2007/127848, WO 2001/082958) ou porque as fibras ocas foram quimicamente modificadas a fim de unir a vesículas (WO 2015/130956). Breve Descrição das Figuras
[0008] Figura 1 - Contagem de nanopartículas de plasma obtidas por centrifugação, por filtração através de um dispositivo HF de porosidade de 200 nm ou por filtração através de um dispositivo HF de porosidade de 20 nm.
[0009] Figura 2 - Quantidades de exossomas derivados de sangue medidos em amostras de plasma obtidas por filtração através de um dispositivo HF de 200 nm ou pelas cópias de gene BRAF de frequência alélica (cópias/ml) no plasma de três centrifugações de um paciente de melanoma metastático.
[0010] Figura 3 - Quantidades de exossomas derivados de sangue medidos em amostras de plasma obtidas por filtração através de um filtro de celulose não-HF de porosidade de 200 nm.
[0011] Figura 4 - Eletroferograma de RNA pequeno de microvesículas presentes em amostras de plasma obtidas por filtração através de um dispositivo HF de 200 nm ou centrifugação.
[0012] Figura 5 - Níveis de mutação B8RAF/6%E (A) ou a razão de BRAF'SC0E vs, BRAFYWT (B) em exossomas de tumor espetados em sangue doador saudável conforme medido após centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de polissulfona de 200 nm.
[0013] Figura 6 - Quantidades de exossomas CD9 e TM9SF4-positivos medidos em amostras de plasma obtidas por filtração através de um dispositivo HF de 200 nm ou por centrifugação.
[0014] Figura 7 - Índice lipêmico de amostras de plasma de doador saudável após centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de porosidade de 200 nm.
[0015] Figura 8 - Níveis de cópias de mutação BRAFY6ººE (cópias/ml) em exossomas tumorais enriquecidos em plasma de doador saudável obtido por centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de porosidade de 200 nm.
[0016] Figura 9 - Índice lipêmico de amostras de plasma lipêmico antes e depois da centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de porosidade de 200 nm.
[0017] Figura 10 - Contagem de nanopartículas de plasma obtido a partir de sangue total utilizando uma centrífuga, um filtro HF de poliéter sulfona de porosidade de 200 nm ou porosidade de 500 nm.
[0018] Figura 11 - Quantidades de exossomas CD9-, CD45-, CD61- e CD235-positivos medidos em amostras de plasma obtidas por centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de 500 nm de porosidade.
[0019] Figura 12 - Níveis de cópias do gene do BRAF do tipo selvagem (cópias/ml) no plasma de pacientes com melanoma metastático obtidos por centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de 200 nm de porosidade.
[0020] Figura 13 - Frequência alélica de cópias do gene BRAF (cópias/ml) no plasma de pacientes com melanoma metastático obtidos por centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de 200 nm de porosidade.
[0021] Figura 14 - Quantidades de exossomas TM9SF4-positivos medidos em amostras de plasma enriquecidas com exossomas de tumor e obtidas por filtração através de um dispositivo HF de 200 nm ou por centrifugação. Descrição Detalhada da Invenção
[0022] Verificou-se, de modo surpreendente, que o uso de filtros de fibras ocas que têm uma porosidade acima de 20 nm por filtração por gravidade permite um empobrecimento a partir de vesículas extracelulares originárias de certos componentes sanguíneos e tendo um tamanho que é inferior à porosidade das fibras ocas.
[0023] Em um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido o uso in vitro de fibras ocas tendo uma porosidade acima de 20 nm para empobrecer, por filtração por gravidade, uma amostra líquida derivada de sangue ou sangue a partir de vesículas extracelulares, tais vesículas extracelulares tendo um tamanho que é inferior à porosidade das fibras ocas e originárias de componentes sanguíneos selecionados a partir do grupo consistindo em células sanguíneas vermelhas, células sanguíneas brancas, plaquetas e suas combinações.
[0024] Em um segundo aspecto da presente invenção, é fornecido um método in vitro para obtenção de sangue ou um derivado de sangue substancialmente empobrecido em vesículas extracelulares originárias de componentes sanguíneos selecionados a partir do grupo consistindo em células sanguíneas vermelhas, células sanguíneas brancas, plaquetas e qualquer combinação das mesmas, o método incluindo as etapas de filtração por gravidade de uma amostra líquida derivada de sangue ou sangue através de um filtro compreendendo fibras ocas tendo uma porosidade acima de 20 nm, obtendo-se, assim, sangue ou um derivado de sangue substancialmente empobrecido em vesículas extracelulares, tais vesículas extracelulares tendo um tamanho que é inferior à porosidade das fibras ocas.
[0025] Em um terceiro aspecto da presente invenção, é fornecido um método /n vitro para analisar o teor de vesículas extracelulares de um sangue ou amostra líquida derivada de sangue, tal método incluindo: a) filtração por gravidade do sangue ou da amostra líquida derivada de sangue através de um filtro de fibras ocas que tem uma porosidade acima de 20 nm, obtendo-se, assim, um filtrado, b) analisar o teor de vesículas extracelulares do filtrado obtido na etapa a).
[0026] O técnico no assunto saberá qual a análise a executar como realizá-la, dependendo das circunstâncias e da base de sua própria experiência e da literatura disponível no campo. Tal análise pode, por exemplo, ser dirigida à medição das quantidades de vesículas extracelulares que abrigam uma proteína particular em sua superfície utilizando um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) ou citometria de fluxo (FACS). Outras análises podem ser dirigidas na contagem do número de nanopartículas totais na amostra através de análise de nanorastreamento (NTA) ou medição da expressão gênica por reação de cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (GRT-PCR) ou sequenciamento de nova geração (NGS).
[0027] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, as fibras ocas compreendem fibras ocas de poliéter sulfona.
[0028] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, as fibras ocas consistem em fibras ocas de poliéter sulfona.
[0029] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, as fibras ocas compreendem um material escolhido a partir da lista de celulose, éster de celulose, polissulfona, poliéter sulfona (PES), polimetilmetacrilato (PMMA), poliamida, polímeros contendo nitrogênio, vidro, sílica, acetato de celulose, fluoreto de polivinilideno (PVDF), poli(cloreto de vinila) (PVC), politetrafluoroetileno (PTFE), poliéster, cerâmica, poliimida, polieterimida, imida de poliamida funcionalizada com polietilenoimina (Torlon9) e poli(álcoo! vinílico) (PVA).
[0030] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, as fibras ocas consistem em um material escolhido a partir da lista de celulose, éster de celulose, polissulfona, poliéter sulfona (PES), polimetilmetacrilato (PMMA), poliamida, polímeros contendo nitrogênio, vidro, sílica, acetato de celulose, fluoreto de polivinilideno (PVDF), poli(cloreto de vinila) (PVC), politetrafluoroetileno (PTFE), poliéster, cerâmica, poliimida, polieterimida, imida de poliamida funcionalizada com polietilenoimina (Torlon9) e poli(álcool vinílico) (PVA).
[0031] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, a porosidade é selecionada a partir da lista de acima de 20 nm, acima de 25 nm, acima de 30 nm, acima de 35 nm, acima de 40 nm, acima de 45 nm, acima de 50 nm, acima de 55 nm, acima de 60 nm, acima de 65 nm, acima de 70 nm, acima de 75 nm, acima de 80 nm, acima de 85 nm, acima de 90 nm, acima de 95 nm, acima de 100 nm, acima de 105 nm, acima de 110 nm, acima de 115 nm, acima de 120 nm, acima de 125 nm, acima de 130 nm, acima de 135 nm, acima de 140 nm, acima de 145 nm, acima de 150 nm, acima de 155 nm, acima de 160 nm, acima de 165 nm, acima de 170 nm, acima de 175 nm, acima de 180 nm, acima de 185 nm, acima de 190 nm, acima de 195 nm e acima de 200 nm.
[0032] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, a porosidade é abaixo de 500 nm.
[0033] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, a porosidade é selecionada a partir da lista de cerca de 150 nm, cerca de 200 nm, cerca de 250 nm, cerca de 300 nm, cerca de 350 nm, cerca de 400 nm, cerca de 450 nm, cerca de 500 nm e qualquer intervalo compreendendo estes valores.
[0034] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, a porosidade é selecionada a partir da lista de 150 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm, 500 nm e qualquer intervalo compreendendo estes valores.
[0035] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, as fibras ocas têm uma porosidade selecionada a partir do grupo de faixas consistindo em cerca de 150 a cerca de 250 nm, cerca de 150 a cerca de 300 nm, cerca de 150 a cerca de 350 nm, cerca de 150 a cerca de 400 nm, cerca de 150 a cerca de 450 nm, cerca de 150 a cerca de 500 nm, cerca de 200 a cerca de 250 nm, cerca de 200 a cerca de 300 nm, cerca de 200 a cerca de 350 nm, cerca de 200 a cerca de 400 nm, cerca de 200 a cerca de 450 nm e cerca de 200 à cerca de 500 nm.
[0036] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, as fibras ocas têm uma porosidade selecionada a partir do grupo de faixas consistindo em 150 a 250 nm, 150 a 300 nm, 150 a 350 nm, 150 a 400 nm, 150 a 450 nm, 150 a 500 nm, 200 a 250 nm, 200 a 300 nm, 200 a 350 nm, 200 a 400 nm, 200 a 450 nm e 200 a 500 nm.
[0037] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, as fibras ocas têm uma porosidade de cerca de 200 nm.
[0038] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, as fibras ocas têm uma porosidade igual a 200 nm.
[0039] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, a amostra líquida derivada de sangue é uma amostra de plasma.
[0040] Em uma realização, sob qualquer aspecto da presente invenção, as vesículas extracelulares são selecionadas a partir do grupo consistindo em microvesículas, exossomas, exômeros e suas combinações.
[0041] Todas as realizações podem ser combinadas para gerar novas modalidades sob qualquer um dos aspectos acima da invenção. Exemplos
[0042] A presente invenção é agora descrita por meio de exemplos não limitantes. Materiais e Métodos A) Coleta de sangue
[0043] Todos os pacientes têm estado jejuando desde a meia-noite antes da coleta de sangue na manhã. O sangue foi coletado em um saco de sangue contendo CPD (CompoFlow; Fresenius Kabi) ou coletado em tubos de K2-EDTA para plasma (VACUTAINERQ Becton Dickinson, tampa roxa, REF 367864, 6,0 ml). Os tubos de K2-EDTA foram subsequentemente invertidos 5 ou 6 vezes, mantidos em uma posição vertical e armazenados em temperatura ambiente (20-25º C) até processamento adicional. B) Preparação de plasma por centrífuga
[0044] A preparação de plasma por centrífuga foi realizada dentro de uma hora de coleta por centrifugação de sangue total a 1500 g durante 10 minutos a 20-25ºC. o plasma foi coletado utilizando uma pipeta Pasteur descartável (Steroglass, REF: LPMWO032653; 5 ml), evitando ressuspender o mesmo por interrupção de 3 à 4 mm acima da camada leucoplaquetária. As amostras foram visualmente verificadas quanto aos traços de lipídeos, biliar (Itterum) ou hemólise. O plasma foi coletado em tubos Falcon de 15 ml, suavemente invertidos e aliquotados em tubos criogênicos marcados (Cat. Num: nº BSM 535, Biosigma) e armazenados a -20ºC. C) Plasma obtido através de filtração de um filtro de celulose não-HF de porosidade de 200 nm
[0045] O plasma foi preparado por centrifugação conforme previamente descrito e filtrado através de um filtro de celulose não-HF de 200 nm de porosidade (Cat. Num: 190-9920; Nalgene). O plasma filtrado foi coletado em um tubo Falcon de 15 ml, aliquotado em tubos de microcentrífuga de 2 ml! e armazenado a -20ºC antes do uso posterior. D) Plasma obtido através de filtração de dispositivos de fibra oca de poliéter sulfona de 20/200 nm de porosidade
[0046] Plasma foi obtido utilizando-se versões modificadas de dispositivo de fibra oca de poliéter sulfona comercialmente disponível com porosidade de 20 nm ou 200 nm, comumente usada para hemodiálise (Plasmart 50; Medica Srl, Itália). O dispositivo foi modificado por redução de seu comprimento de 150 mm para 60 mm, abaixando assim o volume de sangue requerido para a preparação. Em resumo, uma das duas saídas laterais foi conectada ao saco de sangue total ou tubo de K2-EDTA, enquanto a saída no lado oposto do dispositivo foi conectada a um saco vazio. Uma terceira saída lateral foi conectada a um
Saco vazio para a coleta do plasma filtrado. A bolsa de sangue foi deixada em temperatura ambiente (RT) por pelo menos 30 minutos e suavemente misturada antes do uso.
[0047] Quarenta mililitros de sangue total foram filtrados através do dispositivo por filtração por gravidade e 15 ml (30%) de plasma foram coletados no saco lateral, transferidos para um tubo Falcon de 50 ml, aliquotados em tubos de microcentrífuga de 2 ml e armazenados a -20ºC. Sangue total e seus componentes celulares foram concentrados no retido, coletados no saco lateral e descartados. E) Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
[0048] Antes da análise, amostras de plasma foram centrifugadas a 13000 g para eliminar vesículas maiores que poderiam afetar a análise e adicionalmente diluídas em 1:10000 com PBS. A NTA foi realizada utilizando-se um instrumento nanovisual LM10 (Malvern, Reino Unido), que ajusta o nível da câmera em 16 e o obturador deslizante em 1300. A concentração de partículas foi calculada como média de três medições independentes. F) Quantificação de exossoma por ELISA
[0049] Amostras de plasma foram descongeladas em temperatura ambiente (RT) e 1 ul de coquetel inibidor de protease (1000X; Sigma Cat. Num: P-834) foi adicionado a cada amostra para preservar os biomarcadores de proteína.
[0050] Amostras de plasma foram centrifugadas a 1200 g durante 20 minutos em temperatura ambiente (RT) para eliminar células sanguíneas vermelhas residuais e detritos celulares. O sobrenadante resultante foi coletado e diluído em uma proporção volumétrica de 1:1 de tampão fosfato (PBS).
[0051] Resumidamente, 100 ul de plasma diluído foram incubados durante a noite a 4ºC em placas de 96 cavidades pré-revestidas com 0,1 ug/cavidade de anticorpo anti-CD9 (Cat. Num: HBM-CD9-100, HansaBioMed Life Sciences Ltd.), anticorpo anti-CD45 (Cat. Num: 610265, BD), anticorpo anti-CD61 (Cat. Num: 555752, BD); anticorpo anti-CD235 (Cat. Num: 555569, BD) e anticorpo anti-TM9SF4 (2 pg/ml). Após três lavagens com tampão de lavagem (PBS-Tween a 0,05%), as placas foram incubadas com anticorpo anti-CD9 biotinilado (Cat. Num: 558749, BD Pharmigen), incubadas durante 2 horas a 4ºC, lavadas três vezes com tampão de lavagem, incubadas durante 1 hora a 4ºC com anticorpo secundário conjugado de poli-HRP-estreptavidina (Cat. Num: 21140, Pierce) e lavadas três vezes com tampão de lavagem. A reação colorimétrica foi iniciada por adição de 100 ul de solução de substrato (TMBlue POD; solução de A e B 1:1, Pierce) à cada poço, incubação de 10 minutos no escuro em temperatura ambiente (RT) e interrompida por adição de 100 ul de solução de parada (ácido sulfúrico a 1 N). O adsorvente O/D é lido com um M1000 Tecan a 450 nm e os resultados foram expressos como relação de Sinal para Fundo (StB). G) Preparação de pellet de microvesícula
[0052] Plasma obtido por centrifugação e plasma filtrado com fibra oca foram adicionalmente centrifugados a 10000 g durante 30 minutos em temperatura ambiente (RT) para obter pellet de microvesícula (MV). O pellet de MV foi ressuspenso em 100 ul de PBS antes de processamento adicional. H) Extração de RNA pequeno a partir de pellets de MV e análise de eletroferograma
[0053] O RNA foi extraído a partir de pellets de MV utilizando-se o kit de extração de RNA de Imunocaptura de Exossoma Geral a partir de biofluidos humanos e meios celulares (Cat. Num: HBM-RNA-BOF-20; HansaBioMed Life Sciences Ltd., Estônia) e eluído em 15 ml de tampão de eluição de acordo com as instruções do fabricante. Cinco microlitros de RNA extraído foram carregados em um kit RNA 6000 Pico (Cat. Num: 5067-1513; Agilent Technologies) e executados em um instrumento Bioanalisador para obter um eletroferograma de RNA. I) Amostras de sangue enriquecidas com exossomas de tumor BRAFY5ººF- positivos e isolamento de DNA associado a exossoma
[0054] Dez mililitros de sangue total a partir de pacientes doadores saudáveis foram enriquecidos com 80 ml de exossomas de tumor BRAFY6ººE-positivos adquiridos a partir de um fornecedor comercial (5,5 ul/ul, linhagem celular COLO1, HansaBioMed Life Sciences Ltd.).
[0055] DNA associado com exossomas (Exo-DNA) de tumor enriquecido foi extraído e purificado utilizando-se um kit comercialmente disponível para a extração de DNA circulante (DNA de baixa entrada seleCTEVº; Exosomics Siena Spa, Itália). Resumidamente, os exossomas foram capturados a partir de plasma utilizando um peptídeo proprietário e peletizados após uma incubação de 2 horas. Os pellets de exossoma foram lisados com um tampão de lise proprietário e digeridos com proteinase K para liberar o DNA a partir de complexos proteicos. A amostra foi então suplementada com etanol, carregada em uma coluna de centrifugação de membrana de sílica e centrifugada a 10000 g durante 1 minuto. Após a centrifugação, o fluxo passante foi descartado. Duas etapas de lavagem foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante para obtenção de solventes contaminantes e inibidores derivados de plasma antes da eluição. O Exo-DNA foi eluído em 50 ml de tampão de eluição e armazenado a -20ºC antes do uso. Amplificação de genes BRAFY5ººº e BRAFYT por qPCR
[0056] Cada reação de qPCR incluiu 10 ml! de Exo-DNA purificado, 1X SsoAdvanced Universal Probes Mastermix (Biorad; US), 0,625 ul de primers (10 mM) e 0,3125 ul de sonda fluorescente (10 mM) em um volume total de 25 ul. Foram usados os seguintes primers e sondas: a) BRAF*?WT FW: TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAG+T; b) BRAF*WT RW: TTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCA; c) BRAFYSOE FW: TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAG+A; d) BRAFYS9ºE RW TTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCA e) Sonda: 5-FAM CCGAAGGGGATC+CAGACAA+CTGTTCAAACTGCCTTCGG-3BHQ1 -3
[0057] Após mistura cuidadosa, cada reação foi carregada em triplicata em uma placa de PCR de 96 poços e o seguinte programa de qPCR foi lançado: 95ºC para 3', 40 ciclos a 95ºC para 5" e 60ºC por 30", seguido por uma etapa de retenção final a 4ºC. Para calcular a porcentagem de BRAFY6º%E recuperado, a seguinte fórmula foi usada: = [[2 Ctentrada “Clisotamento) 1% . L) Detecção de cópias do gene BRAFY6ººE por PCR de gotícula digital
[0058] Cada reação de PCR de gotícula digital incluiu 10 ul de Exo-DNA Purificado, 2X de ddPCR Supermix for Probes (Cat. Num 186301; Biorad), 20X de ensaio de detecção de mutação para BRAFY60%E (ID de ensaio: dHsaMDV2010027; Biorad) e 5 ul de água livre de DNase. Cada reação foi carregada de acordo com as instruções do fabricante e o seguinte programa de ddPCR foi lançado: 95ºC por 10', 40 ciclos a 95ºC para 30" e 56ºC por 1', seguido por uma etapa de retenção final a 4ºC. Cópias de gene BRAFY5%E e frequências alélicas foram calculadas utilizando-se o software QuantaSoft (Biorad). M) Quantificação do índice lipêmico de amostras de plasma
[0059] O índice lipêmico foi medido a partir de 500 ul de plasma utilizando-se o kit de Índice de Soro Gen.2 em um instrumento Cobas, de acordo com as instruções do fabricante (Cat. Num. 05172179190; Roche). Exemplo 1 Dispositivo (HF) de fibra oca com poros de 200 nm separa eficientemente o plasma rico em nanopartículas do sangue
[0060] A Figura 1 ilustra a contagem nanopartículas com análise de nanorastreamento (NTA) de plasma obtido a partir de sangue total utilizando-se uma centrífuga, uma centrífuga acrescida de um filtro de celulose não-HF de 200 nm, um filtro de fibra oca de poliéter sulfona de porosidade de 200 nm ou porosidade de 20 nm.
[0061] Assim, é mostrado que o método da presente invenção permite a obtenção de uma contagem de nanopartículas similar à centrífuga acrescida de um filtro de celulose não-HF. Exemplo 2 Plasma obtido a partir da filtração HF de 200 nm de sangue total tem menos vesículas extracelulares derivadas de células sanguíneas vermelhas e brancas do que o plasma obtido por centrífuga
[0062] A Figura 2 ilustra as quantidades de vesículas extracelulares capturadas a partir de plasma doador saudável, obtidas seja por centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de 200 nm de porosidade, utilizando um anticorpo anti- CD9 (marcador EV genérico), um anticorpo anti-CD45 (marcador de células sanguíneas brancas genérico), um anticorpo anti-CD61 (marcador de plaquetas genérico) ou um anticorpo anti-CD235 (marcador de eritrócito genérico).
[0063] Assim, é mostrado que o uso de um dispositivo HF de poliéter sulfona de 200 nm de porosidade empobrecerá a amostra de vesículas extracelulares derivadas de células sanguíneas brancas, células sanguíneas vermelhas e plaquetas.
Exemplo 3 Um filtro de celulose não-HF de 200 nm cortado NÃO seleciona subpopulações de vesícula extracelular
[0064] A Figura 3 ilustra as quantidades de vesículas extracelulares capturadas de plasma obtidas por centrifugação ou filtração através de um filtro de celulose não-HF de 200 nm utilizando um anticorpo anti-CD9 (marcador EV genérico), um anticorpo anti-CD45
(marcador de células sanguíneas brancas genérica), um anticorpo anti-CD61 (marcador de plaquetas genérico) ou um anticorpo anti-CD235 (marcador de eritrócito genérico).
[0065] Assim, é mostrado que tal filtro não empobrece a amostra de vesículas extracelulares derivadas de células sanguíneas brancas, células sanguíneas vermelhas e plaquetas.
Exemplo 4 O dispositivo HF de 200 nm efetivamente seleciona partículas abaixo deste tamanho
[0066] A Figura 4 ilustra o eletroferograma de RNA pequeno de microvesículas obtidas em (A) uma amostra de plasma obtida por centrifugação de sangue total e (B) uma amostra de plasma obtida por filtração de sangue total através de um dispositivo de vidro de poliéter sulfona de 200 nm de porosidade.
[0067] Estes dados mostram que o plasma obtido por filtração através do dispositivo HF é esgotado de certas microvesículas que estão presentes no plasma obtido por centrifugação. Estas microvesículas são conhecidas na literatura por serem maiores do que 200 nm (Van der Pol et al.), portanto, a porosidade de 200 nm efetivamente seleciona partículas abaixo deste tamanho.
Exemplo 5 Exossomas de tumor BRAFY5ººE-positivo são recuperados de forma eficiente no plasma obtido a partir do sangue total após a filtração com um dispositivo HF de 200 nm
[0068] A Figura 5 ilustra os níveis de mutação BRAFY5º%E (A) ou a proporção de BRAFYS0%E vs, BRAFYT (B) em exossomas de tumor conforme medido após centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de 200 nm, de uma amostra de sangue total que foi reforçada com tais exossomas de tumor como descrito acima na seção Material e Métodos.
[0069] É mostrado que o método da presente invenção não altera significativamente os níveis de exossomas tumorais encontrados em uma amostra de plasma com relação ao método de centrifugação clássico.
[0070] Além disso, a diferença na Figura 5B destaca como o método da presente invenção reduz o nível de BRAFº'T como uma consequência do empobrecimento em vesículas extracelulares contendo BRAFYT, Exemplo 6
Filtração de HF com porosidade de 200 nm elimina o sinal falso positivo do marcador metabólico TM9SF4
[0071] A Figura 6 ilustra as quantidades de exossomas capturadas a partir de plasma de doador saudável obtidas por centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de 100 nm de porosidade de 200 nm, utilizando um anticorpo anti-CD9 (marcador EV genérico) ou um anticorpo anti-TM9SF4 (marcador metabólico expresso em exossomas derivados tanto de células parenquimais como de células estromais submetidas a comutação glicolítica (Lozupone et al. 2009; Lozupone et al. 2015), mas também de células hematopoiéticas ativadas (Paolillo et al.).
[0072] Mostra-se que os níveis de exossomas positivos TM9SF4 de plasma de doador saudável obtido com o método da presente invenção estão abaixo do limiar de diagnóstico (linha pontilhada) ajustado para detecção positiva. Inversamente, os níveis de exossomas positivos TM9SF4 de plasma de doador saudável obtido por centrifugação estão acima de tal limiar de diagnóstico, resultando em uma falsa detecção positiva. O resultado sugere que a filtração de HF reduz grandemente o efeito de confusão devido à ativação da célula sanguínea facilitando a detecção do biomarcador sobre os exossomas de células parenquimais e estromais. Exemplo 7 A filtração por HF do sangue reduz o índice lipêmico de plasma
[0073] A Figura 7 ilustra o índice lipêmico de três amostras de plasma obtidas a partir de sangue de doador saudável após centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de 200 nm de porosidade. Os resultados mostram que a filtração de HF reduz o índice lipêmico de todas as três amostras de plasma em comparação com a centrifugação. Este resultado pode ser, pelo menos em parte, explicado pela redução de quilomícrons ricos em triglicerídeo, vesículas que têm um diâmetro que varia de 70 nm a 1000 nm (De Haene et al.). Exemplo 8 Redução do índice lipêmico por filtração de HF aprimora a recuperação da mutação
[0074] A Figura 8 ilustra os níveis de cópias de mutação BRAFY5%%E (cópias/ml) em exossomas de tumor enriquecidos em plasma de doador saudável obtido por centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de 200 nm de porosidade. Os resultados mostram que mais cópias de mutação são recuperadas a partir de plasma filtrado por HF do que o plasma centrifugado. Esta recuperação aprimorada de mutação correlaciona-se com a redução observada do índice lipêmico observado no mesmo conjunto de amostras de plasma. Exemplo 9 Filtração por HF de amostras de plasma lipêmico reduz o seu índice lipêmico
[0075] A Figura 9 ilustra o índice lipêmico de três amostras de plasma lipêmico antes e após a centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de porosidade de 200 nm. Os resultados mostram que a filtração de HF reduz o índice lipêmico de todas as três amostras de plasma lipêmico em comparação com a centrifugação, consistente com a capacidade do dispositivo para reduzir os níveis de quilomícrons ricos em triglicerídeo. Exemplo 10 Dispositivo (HF) de fibra oca com poros de 500 nm separa eficientemente o plasma rico em nanopartículas do sangue
[0076] A Figura 10 ilustra a contagem de nanopartículas com análise de nanorastreamento (NTA) de plasma obtido a partir de sangue total utilizando uma centrífuga, um filtro de HF de poliéter sulfona de porosidade de 200 nm ou porosidade de 500 nm.
[0077] Assim, é mostrado que o filtro de HF com uma porosidade de 500 nm permite obter uma contagem de nanopartículas similares em comparação com a centrífuga e o filtro de HF com porosidade de 200 nm. Conforme esperado, a granulometria média foi ligeiramente aumentada por filtro de HF com 500 nm, em comparação com a centrífuga e o filtro de HF com porosidade de 200 nm. Exemplo 11 Plasma obtido a partir da filtração de HF de 500 nm de sangue integral possui vesículas extracelulares derivadas de células sanguíneas vermelhas e brancas do que o plasma obtido por centrífuga
[0078] A Figura 11 ilustra as quantidades de vesículas extracelulares capturadas a partir de plasma de doador saudável, obtidas por centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de 500 nm, utilizando um anticorpo anti-CD9 (marcador EV genérico), um anticorpo anti-CD45 (marcador de células sanguíneas brancas genérico), um anticorpo anti-CD61 (marcador de plaquetas genérico) ou um anticorpo anti-CD235 (marcador de eritrócito genérico).
[0079] Assim, é mostrado que o uso de um dispositivo HF de poliéter sulfona de 500 nm de porosidade empobrecerá a amostra de vesículas extracelulares derivadas de células sanguíneas brancas e células sanguíneas vermelhas, mas não teve efeito significativo sobre vesículas extracelulares derivadas de plaquetas.
Exemplo 12 Filtração de HF reduz os níveis do gene de BRAF do tipo selvagem no plasma de pacientes com melanoma metastático
[0080] A Figura 12 ilustra os níveis de cópias do gene BRAF do tipo selvagem (cópias/ml) no plasma de cinco pacientes com melanoma metastático obtidos por centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de porosidade de 200 nm. Os resultados mostram que 4 de cinco amostras de plasma obtidas com o dispositivo de HF tinham significativamente menos cópias do gene BRAF do que o obtido por centrifugação. Este resultado indica que a filtração de HF reduz os níveis de DNA do tipo selvagem no plasma de pacientes com câncer.
Exemplo 13 A filtração de HF aprimora a frequência alélica da mutação BRAFY6ººE no plasma de pacientes com melanoma metastático
[0081] A Figura 13 ilustra a frequência alélica da mutação de BRAFY6º%E no plasma de três pacientes com melanoma metastático obtidos por centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de porosidade de 200 nm. Os resultados mostram que a filtração por HF do plasma aprimora a frequência alélica de BRAFYSººE em cada amostra. Este resultado é consistente com a redução dos níveis de cópias do gene BRAF do tipo selvagem observada nestas amostras.
Exemplo 14 Filtração de HF com porosidade de 200 nm facilita a detecção de exossomas tumorais a partir de plasma
[0082] A Figura 14 ilustra as quantidades de exossomas de tumor capturados a partir de plasma obtido a partir de sangue enriquecido com exossoma de tumor ou por centrifugação ou filtração através de um dispositivo HF de poliéter sulfona de 200 nm de porosidade utilizando um anticorpo anti-TM9SF4, um marcador metabólico expresso em exossomas derivados tanto de células parenquimais como de células estromais que passam por um comutador glicolítico.
[0083] Mostra-se que os níveis de exossomas de tumor TM9SF4-positivos aumentam no plasma obtido a partir de sangue enriquecido com exossoma através de filtração com um dispositivo HF de poliéter sulfona de 200 nm de porosidade. Inversamente, nenhuma alteração nos níveis de inibidores de tumor TM9SF4-positivos é observada no plasma obtido a partir do sangue por centrifugação devido ao alto ruído de fundo gerado por vesículas derivadas de sangue. O resultado sugere que a filtração de HF reduz grandemente o efeito de confusão devido à ativação da célula sanguínea, facilitando a detecção do biomarcador sobre os receptores de tumor. Bibliografia
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Claims (15)

Reivindicações
1. USO IN VITRO DE FIBRAS OCAS caracterizado por ter uma porosidade acima de 20 nm para empobrecer, por filtração por gravidade, uma amostra líquida derivada de sangue ou sangue a partir de vesículas extracelulares, tais vesículas extracelulares tendo um tamanho que é inferior à porosidade das fibras ocas e originárias a partir de componentes sanguíneos selecionados a partir do grupo consistindo em células sanguíneas vermelhas, células sanguíneas brancas, plaquetas e suas combinações.
2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as fibras ocas compreenderem fibras ocas de poliéter sulfona.
3. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as fibras ocas consistirem em fibras ocas de poliéter sulfona.
4, USO, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por as vesículas extracelulares serem selecionadas a partir do grupo que consiste em microvesículas, exossomas, exômeros e suas combinações.
5. USO, de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por à porosidade das fibras ocas ser de cerca de 200 nm.
6. USO, de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por à porosidade das fibras ocas estar compreendida entre cerca de 150 e cerca de 500 nm.
7. USO, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado por a amostra líquida derivada de sangue ser uma amostra de plasma.
8. MÉTODO IN VITRO PARA OBTENÇÃO DE SANGUE OU DE UM DERIVADO DE SANGUE substancialmente empobrecido em vesículas extracelulares originárias de componentes sanguíneos selecionados a partir do grupo consistindo em células sanguíneas vermelhas, células sanguíneas brancas, plaquetas e qualquer combinação das mesmas, o método caracterizado por incluir as etapas de filtração por gravidade de uma amostra líquida derivada de sangue ou sangue através de um filtro compreendendo fibras ocas tendo uma porosidade acima de 20 nm, obtendo-se, assim, sangue ou um derivado de sangue substancialmente empobrecido em vesículas extracelulares, tais vesículas extracelulares tendo um tamanho que é inferior à porosidade das fibras ocas.
9. MÉTODO IN VITRO PARA ANALISAR O TEOR DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DE UM SANGUE OU AMOSTRA LÍQUIDA DERIVADA DE SANGUE, tal método caracterizado por incluir: a) filtração por gravidade de sangue ou da amostra líquida derivada de sangue através de um filtro de fibras ocas que tem uma porosidade acima de 20 nm, obtendo-se, assim, um filtrado; b) analisar o teor de vesículas extracelulares do filtrado obtido na etapa à).
10. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 8 a 9, caracterizado por as fibras ocas compreenderem fibras ocas de poliéter sulfona.
11. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 8 a 9, caracterizado por as fibras ocas consistirem em fibras ocas de poliéter sulfona.
12. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 8 a 11, caracterizado por as vesículas extracelulares serem selecionadas a partir do grupo que consiste em microvesículas, exossomas, exômeros e suas combinações.
13. — MÉTODO, de acordo com as reivindicações 8 a 12, caracterizado por a porosidade das fibras ocas ser de cerca de 200 nm.
14. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 8 a 12, caracterizado por a porosidade das fibras ocas estar compreendida entre cerca de 150 e cerca de 500 nm.
15. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 8 a 14, caracterizado por a amostra líquida derivada de sangue ser uma amostra de plasma.
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