CN105651995B - 检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V和CD63的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用 - Google Patents

检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V和CD63的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V和CD63的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用，从循环系统中分别分离出EC‑MVs、EPC‑MVs、EC‑EXs和EPC‑EXs。该方法突破了以往用单特异性抗体的方法且提取出来的细胞MVs和EXs比现有技术的特异性和敏感性高。此外，本发明利用纳米微粒追踪分析术(NTS)针对细胞MVs和EXs进行特异性抗体micro‑beads方法结合荧光量子点(Q‑dots)方法进行检测。该方法能快速，准确，客观分析复杂样本例如血液中EC‑MVs,EPC‑MVs,EC‑EXs和EPC‑EXs的水平，有传统分析方法例如流式所不具备的优势。因此，本发明为进一步研究MVs和EXs作为疾病的生物标记物提供了特异和敏感的方法。

Description

检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V和CD63的试剂在制备 检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中 的应用
技术领域
本发明涉及检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V和CD63 的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用，本方法具有目前最高的敏感性和特异性，属于医疗发明领域。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是细胞分泌释放的一类具有生物学活性的小囊泡。EVs可携带和传递母细胞的脂质，功能性蛋白质,信使RNAs(mRNAs)及微小RNAs(miRNAs)等物质进入靶细胞，调节靶细胞的基因表达和功能。由于技术水平和认识的限制，研究者最初提出EVs的概念时，仅仅把EVs当作是细胞的“垃圾袋”，让细胞摆脱一些无用蛋白垃圾。最近十多年的进一步研究发现，EVs所携带的“货物”具有重要的生物学意义，尤其是其所包含的miRNAs物质已经被证实会参与到疾病发生的过程。EVs可分为细胞膜微囊泡(microvesicles,MVs)和外泌体(Exosomes,EXs)两大类。二者的主要区别在于生成方式的不同。MVs是当细胞激活，损伤或者凋亡后直接从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为150nm-1000nm。 EXs是由细胞内的多泡小体与细胞膜融合后以外泌的形式释放到细胞外，直径约为40nm-150nm。此外，研究者也提出二者发挥的生物作用也可能不同。但由于目前缺乏有效的分离方法把二者分离出来，对它们的特性和功能做出准确的分析受到极大的限制。
内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)和血管内皮细胞(Endothelial Cells,ECs)是与血管系统直接相关的重要细胞，对于维持血管结构和功能的稳定，血管再生，组织修复和再生等具有重要的作用。已有研究证实，循环EPC水平下降和功能障碍与血管疾病的危险性高度相关。血管内皮细胞功能失调和损伤是导致血管病变的重要始动环节。临床研究发现，心血管疾病病人(包括动脉粥样硬化，脑卒中等)的循环内皮细胞(Circulating Endothelial cells,cECs)源的EVs(cEC-EVs)水平显著增高，并与治疗效果及疾病预后相关。与之相反的是，循环内皮祖细胞(Circulating EndothelialProgenitor Cells,cEPCs)源的EVs(cEPC-EVs)在血管疾病病人中的水平显著增高降低。这些研究表明CEC-EVs和 cEPC-EVs可作为潜在生物标记物用于疾病的预测，治疗效果的评估。最新研究发现EPC-EVs，通过携带某些与组织再生相关的蛋白，mRNAs 及miRNAs进入靶细胞调节基因表达和细胞功能，从而促进血管形成、骨骼肌再生、神经再生、减少心肌损伤、保护急性肾小管损伤、减少肺损伤等。因此，它们在血管损伤修复与再生过程中可能发挥着关键的作用。可是，传统方法很难在复杂样本中分选和检测特异性EVs，例如cEC-EVs和cEPC-EVs。因此，这方面的研究发展受到极大地限制。
目前检测EVs的方法有蛋白质印迹、流式分析、电镜和新型的纳米微粒追踪分析术(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)。蛋白质印迹主要用于测定EVs表面蛋白的表达。电镜可以直观检测到 EVs的粒径尺寸，但其方法繁琐，需要通过干燥、固定以及冷冻等不同方式进行前处理，这对生物样本的结构会造成一定的破坏，从而最终影响观察的效果。流式分析是目前最常用的检测EVs的方法，但由于传统流式细胞仪针对的样本主要是细胞，散射光的检测极限通常是 300nm左右，这就导致其无法探测到300nm以下的EVs。NTA是近年来新兴的纳米级别测量技术之一，通过观察溶液中的颗粒运动轨迹分析溶液中颗粒的布朗运动，使用斯托克斯-爱因斯坦方程，能够快速准确的检测出颗粒的数量分布其所具备的状态。更重要的是，NTA特有的荧光系统，为分辨特异性EVs提供了极为方便的平台。目前有四种荧光波长可供使用，分别为405nm、488nm、532nm和635nm，搭配相应的滤光片，实现荧光样品的测量，再由NTA技术对其进行单独检测，免受复杂样本(如血清、尿液等)环境的影响。我们采用免疫微磁珠(microbeads)结合特异性分子表面标记法达到分离和分辨不同种类EVs的目的。荧光NTA的出现为研究EVs提供了技术条件，但目前国内外并无利用NTA针对EVs进行免疫磁珠法结合特异性分子表面标记检测的报道，也没有相关的试剂盒。
发明内容
本发明的目的提供检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V 和CD63的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用，本发明分离和纯化高纯度的MVs和EXs，有利于对它们进行内容物的分析和功能的研究。高敏感和高特异性的检测有利于准确的评估其在疾病状态下的水平变化。进一步的产业化开发可研制出相关的试剂盒。
本发明利用CD105和CD144作为ECs的分子标记，CD34和KDR 作为EPCs的分子标记，Annexin V作为MVs的普遍标记,CD63作为 EXs的普遍标记。一方面，通过分离提取循环系统的MVs及EXs，利用二种不同抗体磁珠分别分选cEC-MVs、cEPC-MV、cEC-EXs及 cEPC-EXs，可以用于之后的内容物(包含蛋白，mRNAs和miRNA)分析。另一方面，通过分离提取循环系统的MVs及EXs，利用抗体磁珠分选结合荧光量子点(Q-dots)NTA分析或者流式分析来检测 cEC-MVs、cEPC-MV、cEC-EXs及cEPC-EXs水平。本发明的检测方法比流式分析方法的敏感性提高了几十倍。
本发明的技术方案如下：
检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V和CD63的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用，利用CD105和CD144作为ECs的分子标记，CD34和KDR作为EPCs 的分子标记，Annexin V作为MVs的普遍标记,CD63作为EXs的普遍标记；所述检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡按以下步骤进行：
(一)细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs的分离提取:
a、抽取外周血液样品3-10ml置于抗凝管保存；用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)稀释2－4倍，进行离心得到上清液血浆；b:对上清液血浆再次进行离心分离，沉淀物为MVs，c:对步骤b的上清液血浆进行超速离心分离，沉淀物为EXs；
(二)对细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs进行特异性抗体标记及检测和分析有：
a、EC-MVs及EC-EXs分选：
1)用CD105和CD144作为ECs的分子标记，用PBS分别悬浮MVs 和EXs，加入生物素偶联的anti-human-CD105抗体,4℃孵育24小时；
2)将anti-biotin偶联的磁珠分别加入悬浮后的MVs和EXs样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠后得到 CD105+MV和CD105+EX悬浮液；
3)将所得的CD105+MV和CD105+EX悬浮液分别加入biotin偶联的anti-human-CD144抗体,4℃孵育24小时；
4)将anti-biotin偶联的磁珠分别加入上述3)的样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠得到 CD105+CD144+MV和CD105+CD144+EX悬浮液；
5)将CD105+CD144+MV悬浮液20000r/min离心120min，所得沉淀即为CD105+CD144+MVs(EC-MVs)，将CD105+CD144+EX悬浮液169000r/min超速离心6h,所得沉淀即为CD105+CD144+EXs (EC-EXs)；
6)利用常规质谱和RNAseq鉴定EC-MVs和EC-EXs所含的蛋白和 RNAs(mRNAs和miRNAs),利用常规蛋白质印迹和实时荧光定量PCR 分析EC-MVs和EC-EXs中特定蛋白和RNA的表达；
b、EPC-MVs及EPC-EXs分选：
1)用CD34和KDR作为EPCs的分子标记，用PBS分别悬浮MVs 和EXs，加入biotin偶联的anti-human-CD34抗体4℃孵育24小时；
2)将anti-biotin偶联的磁珠分别加入上述1)的悬浮MVs和EXs 样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠后得到CD34+MV和CD34+EX悬浮液；
3)将上述2)所得的CD34+MV和CD34+EX悬浮液分别加入biotin 偶联的anti-human-KDR抗体，4℃孵育24小时；
4)将anti-biotin偶联的磁珠分别加入上述3)的样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠得到CD34+KDR+ MV和CD34+KDR+EX悬浮液；
5)将所得的CD34+KDR+MV悬浮液20000r/min离心120min，沉淀即为CD105+CD144+MVs(EPC-MVs)，所得的CD34+KDR+EX悬浮液169000r/min超速离心6h,沉淀即为CD105+CD144+EXs (EPC-EXs)；
6)利用常规质谱和RNAseq鉴定EPC-MVs和EPC-EXs所含的蛋白和RNAs(mRNAs和miRNAs)；利用常规蛋白质印迹和实时荧光定量PCR 分析EPC-MVs和EPC-EXs中特定蛋白和RNA的表达。
c、EC-MVs及EC-EXs水平检测：
1)用CD105和CD144作为ECs的分子标记，Annexin V作为MVs 的普遍标记，CD105+MV及CD105+EX悬浮液的提取同上述EC-MVs 及EC-EXs分选；
2)将上述得到的CD105+MV及CD105+EX悬浮液分别与 anti-human-CD144或者anti-human-Annexin V抗体4℃孵育24小时；再分别与量子点(Qdots)655标记的CD144或者Annexin V二抗,室温孵育90min；
3)经过滤处理的PBS清洗后，所得的EC-MVs和EC-EXs进行NTA 分析；采用NanoSight NS300分析仪在405nm激光器下进行检测,记录60s内EC-MVs和EC-EXs的平均大小和浓度；
d、EPC-MVs及EPC-EXs水平检测：
1)CD34和KDR作为EPCs的分子标记,CD63作为EXs的普遍标记。CD34+MV及CD34+EX悬浮液的提取同上述EPC-MVs及EPC-EXs 分选；
2)将上述得到的CD34+MV及CD34+EX悬浮液与anti-human-KDR 或者anti-human-CD63抗体4℃孵育24小时；再分别与量子点(Qdots)655标记的KDR或者CD63二抗,室温孵育90min；
3)经过滤处理的PBS清洗后，所得的EPC-MVs及EPC-EXs进行 NTA分析；采用NanoSight NS300分析仪在405nm激光器下进行检测, 记录60s内EPC-MVs及EPC-EXs的平均大小和浓度。
细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs的分离提取中抽取外周血液样品 3-10ml置于抗凝管保存；用磷酸盐缓冲生理盐水PBS稀释3倍，混匀后用400r/min的转速离心，35分钟得到上清液血浆。
细胞膜微囊泡MVs分离提取，对上清液血浆再进行两次离心分离，第一次离心的转速2000r/min，20分钟，保存上清液进行第二次离心，第二次离心的转速20000r/min，120分钟，沉淀物为MVs。
外泌体EXs分离提取，对得到沉淀物为MVs的上清液血浆再进行离心分离，离心的转速169000r/min，6小时，离心后沉淀物为EXs。
本发明的方法能快速、准确、客观分析复杂样本血液中EC-MVs、 EPC-MVs、EC-EXs和EPC-EXs的水平，有传统分析方法例如流式所不具备的优势。因此，本发明为进一步研究MVs和EXs作为疾病的生物标记物提供了特异和敏感的方法。
附图说明
图1a、图1b分别为NTA测量CD105+MVs和CD105+EXs水平。
图2a、图2b分别为NTA测量CD34+MVs和CD34+EXs水平。
图3a、图3b分别为比较NTA和流式方法测MVs的水平。
图4为本发明的流程图。
具体实施方式
以下是本项目具体的实施案例，在下属应用中所用到的试剂和材料均可以通过市场购买渠道获得。本发明所用的PBS的PH为7.2。
本发明流程如图4所示，抽取3ml外周血，装于2ml含有质量浓度为3.3％柠檬酸钠的无菌管；加入6ml过滤处理的PBS；混匀后进行离心分离，分离条件：转速400r/min,35min,4℃；取最上层液体即为血浆；取1ml血浆进行离心分离，分离条件：转速2000r/min, 20min,4℃，用于移除血小板；取上清液进行离心分离，分离条件：转速20000r/min,120min,4℃，所得的沉淀用700μl过滤处理的 PBS悬浮做NTA用于分析cMVs总数；剩余的上清液进行离心分离，分离条件：169000r/min,6h,4℃,所得的沉淀用700μl过滤处理的PBS悬浮做NTA用于分析cEXs总数；在所得的cMVs和cEXs沉淀中分别加入10μl biotin偶联的anti-human-CD105抗体，混合后在 4℃孵育24小时；再分别加入10μl anti-biotin磁珠；将反应物置于磁性装置中24h，用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠后得到CD105+MVs 和CD105+EXs；再分别加入700μl过滤处理的PBS做NTA，分析CD105+ MVs和CD105+EXs中cMVs和cEXs所占的比例；将所得的CD105+MVs 和CD105+EXs均分为四份，再分别加入10μl的anti-human-CD144、 anti-human-KDR、anti-human-Annexin V和anti-human-CD63抗体 4℃孵育24小时；再分别与10μl的Qdots655标记的相应的二抗在室温孵育90min；加入700μl过滤处理的PBS做NTA。所得结果如图 1a、图1b的所示，CD105+MVs占总cMVs的24.3，CD105+EXs占总cEXs的21.8％。经过与不同抗体偶联的Qdots655孵育做荧光NTA 分析后，约22％的CD105+MVs共表达Annexin V,约10％的CD105+MVs 共表达CD144,均高于KDR或CD63；约20％的CD105+EXs共表达CD63, 约12％的CD105+EXs共表达CD144，均高于KDR或Annexin V。
cMVs和cEXs总数水平检测方法同上：在所得的cMVs和cEXs沉淀中分别加入10μlbiotin偶联的anti-human-CD34抗体，混合后在4℃孵育24小时；再加入10μl anti-biotin磁珠；将反应物置于磁性装置中24h，用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠后得到CD34+MVs和 CD34+EXs；再分别加入700μl过滤处理的PBS做NTA，分析CD34+MVs 和CD34+EXs中cMVs和cEXs所占的比例；将所得的CD34+MVs和 CD34+EXs均分为四份，再分别加入10μl的anti-human-CD144、 anti-human-KDR、anti-human-Annexin V和anti-human-CD63抗体 4℃孵育24小时；再分别与10μl的Qdots655标记的相应的二抗在室温孵育90min；加入700μl过滤处理的PBS做NTA。所得结果如图 2a、图2b的所示，CD34+MVs占总cMVs的11.6，CD34+EXs占总cEXs的10.8％。经过与不同抗体偶联的Qdots655孵育做荧光NTA分析后，约10.6％的CD34+MVs共表达Annexin V，约5.1％的CD34+MVs 共表达KDR，均高于CD144或CD63；约11.2％的CD34+EXs共表达CD63，约8.5％的CD34+EXs共表达KDR,均高于CD144或Annexin V。
用荧光NTA和流式分析所得的MVs水平，用于比较这两种方法检测MVs的敏感性。所得结果如图3a、图3b的所示，用NTA分析所测得的cMVs浓度远高于用流式分析所测得的cMVs浓度，说明NTA方法的敏感性较流式方法高。
NTA检测方法:
NanoSight NS300(Malvern Instruments,United Kingdom)配备上405nm蓝紫光雷射二极体用于鉴定Qdots655标记的MVs和EXs。 100nm and 200nm的聚苯乙烯乳胶珠子用于对NanoSight NS300进行校正。
将稀释好的样品用注射器装好，打入样品分析装置。
打开NTA2.3软件，将相机水平设为10用于非荧光样品的检测，将相机水平调高至16用于荧光样品的检测。
打开相机，调节好焦距，开始分析样品。
流式检测方法：
1)将收集好的MVs沉淀与10μl PE-conjugated anti-CD105 or anti-CD34,及FITC-conjugated anti-goat CD63,or Annexin V,or anti-goat CD144 or KDR抗体孵育。阴性对照组则加入对应的IgG 非特异性抗体。孵育好之后，加入100μl的PBS于样品中，
2)BD Accuri C6流式仪(Accuri Cytometer,Ann Arbor,MI) 和CFlow PlusAnalysis软件用于做流式分析。
3)流式机器用200nm和1000nm的校准微球(Molecular Probes；Eugene,OR)校正。校正好后将样品至于流式分析探头内进行分析记录。

Claims (4)

1.检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V和CD63的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用，其特征在于：利用CD105和CD144作为ECs的分子标记，CD34和KDR作为EPCs的分子标记，Annexin V作为MVs的普遍标记,CD63作为EXs的普遍标记；所述检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡按以下步骤进行：
(一)细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs的分离提取:
a、抽取外周血液样品3-10ml置于抗凝管保存；用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)稀释2－4倍，进行离心得到上清液血浆；b:对上清液血浆再次进行离心分离，沉淀物为MVs，c:对步骤b的上清液血浆进行超速离心分离，沉淀物为EXs；
(二)对细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs进行特异性抗体标记及检测和分析有：
a、EC-MVs及EC-EXs分选：
1)用CD105和CD144作为ECs的分子标记，用PBS分别悬浮MVs和EXs，加入生物素偶联的anti-human-CD105抗体,4℃孵育24小时；
2)将anti-biotin偶联的磁珠分别加入悬浮后的MVs和EXs样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠后得到CD105+MV和CD105+EX悬浮液；
3)将所得的CD105+MV和CD105+EX悬浮液分别加入biotin偶联的anti-human-CD144抗体,4℃孵育24小时；
4)将anti-biotin偶联的磁珠分别加入上述3)的样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠得到CD105+CD144+MV和CD105+CD144+EX悬浮液；
5)将CD105+CD144+MV悬浮液20000r/min离心120min，所得沉淀即为CD105+CD144+MVs(EC-MVs)，将CD105+CD144+EX悬浮液169000r/min超速离心6h,所得沉淀即为CD105+CD144+EXs(EC-EXs)；
6)利用常规质谱和RNAseq鉴定EC-MVs和EC-EXs所含的蛋白、mRNAs和miRNAs,利用常规蛋白质印迹和实时荧光定量PCR分析EC-MVs和EC-EXs中特定蛋白和RNA的表达；
b、EPC-MVs及EPC-EXs分选：
1)用CD34和KDR作为EPCs的分子标记，用PBS分别悬浮MVs和EXs，加入biotin偶联的anti-human-CD34抗体4℃孵育24小时；
2)将anti-biotin偶联的磁珠分别加入上述1)的悬浮MVs和EXs样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠后得到CD34+MV和CD34+EX悬浮液；
3)将上述2)所得的CD34+MV和CD34+EX悬浮液分别加入biotin偶联的anti-human-KDR抗体，4℃孵育24小时；
4)将anti-biotin偶联的磁珠分别加入上述3)的样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠得到CD34+KDR+MV和CD34+KDR+EX悬浮液；
5)将所得的CD34+KDR+MV悬浮液20000r/min离心120min，沉淀即为CD105+CD144+MVs(EPC-MVs)，所得的CD34+KDR+EX悬浮液169000r/min超速离心6h,沉淀即为CD105+CD144+EXs(EPC-EXs)；
6)利用常规质谱和RNAseq鉴定EPC-MVs和EPC-EXs所含的蛋白、mRNAs、miRNAs；利用常规蛋白质印迹和实时荧光定量PCR分析EPC-MVs和EPC-EXs中特定蛋白和RNA的表达；
c、EC-MVs及EC-EXs水平检测：
1)用CD105和CD144作为ECs的分子标记，Annexin V作为MVs的普遍标记，CD105+MV及CD105+EX悬浮液的提取同上述EC-MVs及EC-EXs分选；
2)将上述得到的CD105+MV及CD105+EX悬浮液分别与anti-human-CD144或者anti-human-Annexin V抗体4℃孵育24小时；再分别与量子点(Qdots)655标记的CD144或者Annexin V二抗,室温孵育90min；
3)经过滤处理的PBS清洗后，所得的EC-MVs和EC-EXs进行NTA分析；采用NanoSightNS300分析仪在405nm激光器下进行检测,记录60s内EC-MVs和EC-EXs的平均大小和浓度；
d、EPC-MVs及EPC-EXs水平检测：
1)CD34和KDR作为EPCs的分子标记,CD63作为EXs的普遍标记，CD34+MV及CD34+EX悬浮液的提取同上述EPC-MVs及EPC-EXs分选；
2)将上述得到的CD34+MV及CD34+EX悬浮液与anti-human-KDR或者anti-human-CD63抗体4℃孵育24小时；再分别与量子点(Qdots)655标记的KDR或者CD63二抗,室温孵育90min；
3)经过滤处理的PBS清洗后，所得的EPC-MVs及EPC-EXs进行NTA分析；采用NanoSightNS300分析仪在405nm激光器下进行检测,记录60s内EPC-MVs及EPC-EXs的平均大小和浓度。
2.根据权利要求1所述的检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V和CD63的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用，其特征在于：细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs的分离提取中抽取外周血液样品3-10ml置于抗凝管保存；用磷酸盐缓冲生理盐水PBS稀释3倍，混匀后用400r/min的转速离心，35分钟得到上清液血浆。
3.根据权利要求2所述的检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V和CD63的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用，其特征在于：细胞膜微囊泡MVs分离提取，对上清液血浆再进行两次离心分离，第一次离心的转速2000r/min，20分钟，保存上清液进行第二次离心，第二次离心的转速20000r/min，120分钟，沉淀物为MVs。
4.根据权利要求3所述的检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V和CD63的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用，其特征在于：外泌体EXs分离提取，对得到沉淀物为MVs的上清液血浆再进行离心分离，离心的转速169000r/min，6小时，离心后沉淀物为EXs。
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