CN103468642A - 一种分离细胞培养基中外泌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种分离细胞培养基中外泌体（exosome）的方法，步骤为：收集新鲜的细胞培养基通过离心除去培养基中悬浮的细胞以及其他细胞碎片和杂质；然后将上清液移入浓缩管中浓缩，在浓缩后的培养基中加入Total Exosome Isolation（invitrogen）来最终提取外泌体。该方法可以方便的得到细胞培养基中的外泌体，且大大降低分离成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学与细胞生物学领域，具体属于一种分离细胞培养基中外泌体（exosome）的方法。
背景技术
外泌体（exosome）是由细胞内的多泡体（multivesicular body，MVB）与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约40-100nm的膜性囊泡。很多细胞均能分泌外泌体，如T细胞、B细胞、树突细胞、肥大细胞和肿瘤细胞等。外泌体中包含有多种蛋白质和RNA，在细胞之间起到传递信息和相互调控的作用，而这种传递信息的方式和相互调控的机制并不完全清楚，尤其是在肿瘤细胞之间：外泌体是否将癌细胞的特征信息传递到了癌旁组织，并通过所包含的蛋白促进其癌变？外泌体是否对肿瘤细胞的迁移、增殖以及浸润有影响？等等。
这些急待解决的问题都遇到了一个共同的瓶颈，那就是外泌体的提取与分离。在目前的研究中用到的外泌体的分离方法主要有两种：
第一种是超高速离心或者是密度梯度离心，这种方法有一个限制因素，那就是需要配备超高速离心机，而这种设备的价格是非常昂贵的，因此限制了一些中小型实验室对外泌体的研究。
第二种是利用试剂盒提取，这种方法也有缺点，采用这种方法时，收集的新鲜培养基，仅通过较低的离心力除去细胞及其碎片，然后就加入抽提试剂，孵育，然后离心，而离心得到的沉淀很可能因为混有细胞器以及一些其它细胞杂质而纯度不高，从而影响后续试验。而且培养基不经过浓缩就利用试剂盒抽提，对试剂盒的消耗也是很大的，如果要进行长期或大规模研究，这也将成为一个限制因素。
发明内容
针对上述技术的不足，本发明的目的在于寻找一种低成本高效率的方法来分离提取培养基中的外泌体。
为了实现本发明的目的，本发明提供的一种分离细胞培养基中外泌体的方法，具体步骤如下：
1）收集新鲜的细胞培养基于离心管中，4℃，300g离心15分钟，除去培养基中悬浮的细胞以及细胞碎片；该步骤中，若离心力过大则可能使未破裂的悬浮细胞破裂，导致细胞中的细胞器和其它杂质也进入培养基中，不利于第二步中对细胞器和其他杂质的除去，离心力为300g时最佳。
2）将步骤1）中离心过后的上清液移入新的离心管中，4℃，10000g离心30分钟，除去细胞器和其他杂质。
3）将步骤2）中离心后的上清液移入30KD的浓缩管中，4℃，3000g离心浓缩，将培养基浓缩至原体积的1/30至1/50；该步骤中，选用30KD浓缩管可以最大限度的截留不同尺寸的外泌体，同时也可以除去培养基中的血清蛋白。
4）将步骤3）中浓缩后的培养基与Total Exosome Isolation（invitrogen）以2︰1的体积比混合，震荡混匀后，4℃过夜孵育；然后将孵育后的混合液在4℃，10000g离心1小时，得到的沉淀即为外泌体。
本发明采用离心和试剂综合运用的方法，可以实现快速高效的提取细胞培养基中的外泌体，且本发明具有以下优点：
首先，避免了超高速离心机对实验的限制，本方法中用到的最高离心力仅为10000g，这在一般的生物实验室都可以达到。
其次，通过多次离心将细胞器以及细胞凋亡小体等干扰因素除去，使得接下来通过试剂盒提取得到的外泌体的纯度更高。
最后，通过浓缩管将培养基浓缩成较小的体积，这样可以相应的减少试剂的用量，这对于想要进行长期或大规模研究的实验室来说，无疑节省了一大笔费用。
附图说明
图1为分别利用超速离心和本发明所述方法进行外泌体分离后外泌体沉淀的对照图片。
图2为用Western blot的方法检测超速离心和本发明所述方法分离得到的外泌体的标志物CD63。
图3为用DiO(细胞膜绿色荧光探针)检测用本发明所述方法分离得到的外泌体的直径。
具体实施方式
以下具体实施例是为了进一步阐述本发明，而不用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体试验条件和试验方法的按照常规条件或制造厂商所建议的条件实施。
本发明所使用的各种器材和试剂均为本领域所熟知的产品，可市售获得。
实施例1
将处于对数生长期的肠癌细胞DLD1接种于三个直径为10cm的细胞培养皿中，每皿7×105个细胞，在37℃，5%的CO2的条件下用不含抗生素的RPMI1640+10%FBS培养液培养，待其生长到融合度为90%时，换成新的不含抗生素的RPMI1640+10%FBS细胞培养基，每皿10mL，培养24小时后，将三个皿的培养基约30mL分别收集到两个50mL的离心管中，然后分别编号A和B，A采用超速离心的方法分离外泌体，同时B采用本发明所述的方法分离外泌体。
本发明方法：步骤如下：
1）收集新鲜的细胞培养基于离心管中，4℃，300g离心15分钟，除去培养基中悬浮的细胞以及细胞碎片。
2）将步骤1）中离心过后的上清液移入新的离心管中，4℃，10000g离心30分钟，除去细胞器和其他杂质。
3）将步骤2）中离心后的上清液移入30KD的浓缩管中，4℃，3000g离心浓缩，将培养基浓缩至原体积的1/30至1/50。
4）将步骤3）中浓缩后的培养基与Total Exosome Isolation（invitrogen）以2︰1的体积比混合，震荡混匀后，4℃过夜孵育；然后将孵育后的混合液在4℃，10000g离心1小时，得到的沉淀即为外泌体。
结果如图1所示，A为通过超速离心分离得到的外泌体，B为用本发明所述方法的分离得到的外泌体。两者通过直观的方法可以看出，本发明所提供的方法分离出的外泌体较多。
实施例2
用例1中分离得到的外泌体进行western blot试验检测外泌体中的标志性蛋白CD63。
（1）在上述分离得到的外泌体中加入适量含有PMSF的膜蛋白提取液，4℃孵育30min后在液氮中反复冻融三次，使其充分裂解。
（2）利用BCA法测定裂解物中的蛋白浓度，确保每个样品的蛋白总量相同，然后加入5×上样缓冲液，100℃变性5min，进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，将蛋白通过湿转法转印至PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉封闭2h。
（3）封闭结束后，用TBST缓冲液洗去封闭液，加入CD63的抗体，4℃孵育过夜。次日，用TBST洗去一抗后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2小时，然后用TBST缓冲液洗去二抗，加入ECL化学发光试剂后进行成像分析。
结果如图2所示，样品1为超速离心法分离得到的外泌体，样品2为本发明所述方法分离得到的外泌体。可见本方法与超速离心分离得到的外泌体在生物学特性上没有区别。
实施例3
通过荧光显微镜观察用本发明方法分离得到的外泌体。
（1）将实施例一中分离得到的外泌体用适量PBS重新悬起，加入DiO(细胞膜绿色荧光探针)，染色约10分钟，使得外泌体标记上绿色荧光。
（2）10000g离心1小时，弃去上清液加入PBS洗去未结合的探针分子。
（3）重复（2）中的步骤一次。
（4）将分离得到的外泌体用PBS重新悬起，将此悬液涂抹到载玻片上，待其干燥后封片，在荧光显微镜下观察。
结果如图3所示分离得到的外泌体被染上绿色，并且外泌体的直径也与文献报道相符。
Claims (1)
1.一种分离细胞培养基中外泌体的方法，其特征在于，步骤为：
1）收集新鲜的细胞培养基于离心管中，4℃，300g离心15分钟，除去培养基中悬浮的细胞以及细胞碎片；
2）将步骤1）中离心过后的上清液移入新的离心管中，4℃，10000g离心30分钟，除去细胞器和其他杂质；
3）将步骤2）中离心后的上清液移入30KD的浓缩管中，4℃，3000g离心浓缩，将培养基浓缩至原体积的1/30至1/50；
4）将步骤3）中浓缩后的培养基与invitrogen公司生产的Total Exosome Isolation以2︰1的体积比混合，震荡混匀后，4℃过夜孵育；然后将孵育后的混合液在4℃、10000g离心1小时，得到外泌体。
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