KR20140050465A - 다공성 중합체 모노리드 필터를 포함하는 체액으로부터 세포밖 소포를 분리하기 위한 장치 - Google Patents

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KR20140050465A
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박재성
김준호
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포항공과대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 체액으로부터 세포밖 소포를 분리하기 위한 장치에 대한 것으로서, 보다 구체적으로는 마이크로칩 상에 형성된 채널 및 채널에 연결된 다공성 중합체 모노리드 필터를 포함하는 장치에 대한 것이다. 본 발명의 장치는 비침습적인 방법으로 암 등 질병의 진단에 필요한 소포 내 핵산 정보를 얻는 데 이용할 수 있다. 본 발명의 장치를 이용하면 소량의 체액 샘플로부터 다량의 소포를 단시간 내에 분리, 정제할 수 있어 임상 진단에 이용하기 유리하다. 따라서 소포를 이용한 연구 및 암 등 질병의 진단에 중요하게 응용될 것으로 기대된다.

Description

다공성 중합체 모노리드 필터를 포함하는 체액으로부터 세포밖 소포를 분리하기 위한 장치{APPARATUS FOR ISOLATION OF EXTRACELLULAR VESICLES COMPRISING POROUS POLYMER MONOLITH MICROFILTER}
본 발명은 체액으로부터 세포밖 소포를 분리하기 위한 장치에 대한 것으로서, 보다 구체적으로는 마이크로칩 상에 형성된 채널 및 채널에 연결된 다공성 중합체 모노리드 필터를 포함하는 장치에 대한 것이다.
대다수의 암은 조기 진단시 전이를 억제하여 생존률을 크게 높일 수 있으나, 암과 관련된 요소가 워낙 다양하여 조기 진단이 쉽지 않다. 따라서 암을 조기 진단할 수 있는 바이오마커들에 대해 활발한 연구가 진행되고 있는데, 최근 주목받고 있는 것 중 하나가 암세포가 갖고 있는 RNA이다. 암세포의 RNA를 이용해 진단하기 위한 방법으로, 암조직을 절제하는 수술을 통해 암세포 자체를 분리하는 방법, 혈액 내 CTC(Circulating tumor cells)를 찾아 RNA를 분리하는 방법 등이 알려져 있다. 그러나 수술은 피검자에게 침습적이어서 시행하기가 쉽지 않으며, CTC를 찾는 방법은 109개의 혈액 세포당 1개의 세포만이 존재할 정도로 그 수가 매우 적어 유용성이 떨어진다.
대부분의 세포는 체액으로 세포 밖 소포(extracellular vesicle, EV)를 분비한다. 소포는 물질을 운반하는 운송체 역할을 한다. 소포 내에는 단백질, 지질, 아미노산 등이 포함되어 있는데, 이러한 물질들은 소포를 분비한 세포의 특성을 알 수 있는 중요한 증거가 된다는 것이 최근 밝혀져 진단에 있어서 소포의 중요성이 증가하고 있다. 특히 암세포의 경우는 암세포 전이 인자들을 포함하는 다량의 소포를 분비하는데, CTC에 비해 상대적으로 높은 농도로 혈액 내에 존재하므로, 진단에 이용하기가 보다 용이하다. 따라서, 암세포가 분비하는 소포를 활용한다면 인체에 비침습적인 방식으로 암을 조기에 진단할 수 있다.
소포는 크기가 매우 작으며 혈액 내에는 소포 외에도 수많은 미량의 물질 및 기타 혈구 세포가 존재하여 소포 내 포함된 암세포의 정보를 얻는 데 많은 어려움이 존재한다. 예를 들어 RNA 등 핵산을 분석하려면 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하게 되는데, 혈액 내에는 암세포의 소포 외에도 백혈구 등 혈구 세포에 함유된 DNA, 헤모글로빈에 포함된 색소 물질 등이 존재하여 암세포의 소포 내 핵산을 분석하기 위한 PCR을 진행하는데 방해가 된다. 이러한 방해 물질들을 제거하고 소포에서 유래된 정보만을 분리해 낼 수 있다면 소포를 암의 조기 진단에 이용하는 데 큰 도움이 될 것으로 예측된다.
그러나 체액 내 소포를 분리하기 위한 효율적이고 정확한 방법은 현재까지 개발되어 있지 않은 상황이다. 현재까지 개발된 소포 분리 방식 중 대표적인 것은 원심 분리기를 이용하는 방법인데, 이에 의하면 원심분리기의 밀도 차를 이용하여 일차적으로 체액 내 세포를 분리하고, 그 후 더 빠른 속도에서 원심분리를 수행하여 기타 미립자 및 수용액을 제거하게 된다. 그러나 이와 같은 방식은 단계가 복잡하여 노동력이 많이 투입되어야 하고 거대한 장비를 필요로 할 뿐 아니라, 필요로 하는 체액의 양이 많아 소량의 샘플만을 이용할 수 있는 실제 진단에 응용하는 것은 현실적으로 불가능하다. 또한 적어도 4시간 이상이 걸리므로, 신속함을 요구하는 임상 진단에는 적합한 방식이 아니다. 최근 소포 단백질에 붙는 항체를 마이크로 칩에 고정시켜 체액 내 소포를 걸러내는 시간을 크게 단축시킨 방법이 개발되었으나(발명의 명칭: Method for isolation of nucleic acid containing particles and extraction of nucleic acids thereform. 발명자: Skog et al. US20120142001), 이 기술 역시 세포를 제거하기 위한 원심분리 전 단계를 필요로 한다. 임상 진단에 널리 이용하려면 원심 분리 장비나 항체를 채널에 붙이는 복잡한 장치 등의 장비를 필요로 하지 않으면서 소량의 체액에서 소포를 분리할 수 있어야 한다.
본 발명자들은 비침습적이면서도 효율적으로 임상 진단에 응용할 수 있는 소포 분리 방법에 대해 연구하던 중, 필터를 이용하여 소포를 걸러낼 방법에 대한 아이디어를 얻었다. 이에 본 발명자들은 소포를 효과적으로 분리할 수 있는 마이크로 필터 시스템을 개발하고, 이 시스템을 이용하여 소포를 분리하여 암세포 진단 가능 여부를 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 다공성 중합체 모노리드 필터를 포함하는 체액으로부터 세포밖 소포를 분리하기 위한 장치, 상기 장치의 제조방법, 및 상기 장치를 이용하여 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 등을 제공함을 목적으로 한다. 그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 마이크로 칩 상에 형성된 유체가 흐를 수 있는 채널(channel);및
상기 채널과 연결된 다공성 중합체 모노리드 필터(porous polymer monolith filter);를 포함하는 체액으로부터 세포밖 소포(extracellular vesile)를 분리하기 위한 장치를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 마이크로 칩은 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate), 싸이클릭 올레핀 코폴리머(cyclic olefin copolymer), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리스티렌(polystyrene), 및 폴리다이메틸실록세인(polydimethylsiloxane)으로 이루어진 군으로부터 선택된 재질로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 폴리메틸 메타크릴레이트를 사용하여 완성하였으나, 싸이클릭 올레핀 코폴리머 등 열가소성 (themoplastic) 물질을 사용할 수도 있고, 기타 폴리스티렌 등의 수지를 사용할 수도 있다. 그러나 마이크로 칩의 재질은 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 채널은 2개의 채널이 교차하는 형태로 구성된 것을 특징으로 한다. 본 발명은 마이크로 칩 상에 2 개의 채널을 교차시켜 cross flow 채널을 이루도록 하고, 교차 부위에 한 개의 PPM 필터를 형성시켜 완성하였다. 그러나 채널의 형태과 PPM 필터의 개수는 변환 가능하고, 이에 제한되지 않는다. 일 예로, cross flow 가 아닌 한 개의 채널과 연결된 PPM 필터를 형성하는 것이 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 다공성 중합체 모노리드 필터는 2개 이상 연속적으로 배열된 것을 특징으로 한다. 이때 PPM 필터의 기공의 크기는 서로 같거나 다를 수 있다. 소포를 단계적으로 분리하기 위해 기공이 큰 PPM 필터를 먼저 통과하도록 배치하고, 그 후 기공이 보다 작은 PPM 필터를 연속적으로 배치하는 것도 가능하다. 그러나 필터의 개수 및 배치는 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 장치의 채널 표면에 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate) 또는 소포에 특이적으로 발현하는 단백질에 대한 항체가 부착된 것을 특징으로 한다. 글리시딜 메타크릴레이트는 채널 표면에 음전하를 형성하여 음전하를 띄는 소포가 필터로 흘러들어가기 전 채널에 흡착되는 것을 막는 역할을 한다. 한편 채널의 특정 부위의 표면에 소포에 붙는 항체인 CD9, CD63, CD81 등을 부착시키면 이 부위에 소포를 고정시키는 것이 가능하다. 이 경우 고정된 소포를 바로 PCR 및 ELIZA등의 응용 실험 진행에 이용할 수 있다. 그러나 본 발명의 장치에 부착시킬 수 있는 물질의 종류는 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 장치는 압력 및/또는 전기장을 원동력으로 하여 유체가 채널에 흐르도록 하는 것을 특징으로 한다. 압력은 펌프 등에 의해서 생성될 수 있다. 필터의 원동력으로 사용된 압력 및 전기장의 크기는 다양하게 조절 가능하다. 본 발명의 실시예에서는 압력을 원동력으로 한 장치, 전기장을 원동력으로 한 장치를 각각 제조하였지만, 압력과 전기장을 동시에 원동력으로 하여 소포를 분리하는 것도 가능하다. 일 예로, 압력을 이용하여 소포 및 작은 단백질 덩어리를 함께 추출한 후 필터를 통과한 용액을 동시에 전기장을 통해 소포와 단백질을 분리할 수도 있다. 압력을 원동력으로 하는 경우 다량의 소포를 분리할 수 있다는 장점이 있고, 전기장을 원동력으로 하는 경우 단백질 등 이물질이 많이 섞이지 않은 순도 높은 소포를 분리할 수 있는 장점이 있기 때문이다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 소포는 암세포로부터 유래된 것을 특징으로 한다. 암세포는 특히 많은 양의 소포를 분비하는 것으로 알려져 있다. 그러나 소포의 기원은 암세포에 제한되지 않고, 기타 세포에서 소포가 유래된 경우도 진단 등에 필요한 정보를 얻는 데에도 본 발명의 장치를 이용할 수 있다. 한편 본 발명에서 사용된 진단의 세포는 흑색종이지만 다른 암세포 및 백혈병 등 소포가 분비되는 대부분의 질병에 사용 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 다공성 중합체 모노리드 필터(porous polymer monolith filter)의 기공 크기는 100 nm ~ 5 um인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는 지름 500 nm 이하의 소포만을 언급하였지만, 종에 따라 혹은 질병의 차이에 따라 다른 크기의 소포를 분리할 수 있도록 기공의 크기를 다양하게 조절할 수 있다.
본 발명은
A) 마이크로칩 상에 채널 및 채널과 연결된 홈을 형성하는 단계;
B) 상기 채널을 통해 다공성 중합체 모노리드 필터 형성 용액을 주입하는 단계;및
C) 상기 A)단계에서 홈과 채널이 형성된 마이크로칩에 자외선을 조사하여 홈 부위와 다공성 중합체 모노리드 필터 형성 용액을 반응시키는 단계를 포함하는, 세포밖 소포(extracellular vesile)를 분리하기 위한 장치의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 B) 단계의 다공성 중합체 모노리드 필터 형성 용액(PPM prepolymer solution, 이하 PPM 필터 형성 용액)은 전체 용액 중량의 58%~68%에 해당하는 기공형성 용매(porogenic solvent)를 함유하는 것을 특징으로 한다. 그러나 기공형성 용매의 함량은 이에 제한되지 않는다. 기공형성 용매가 더 많이 함유된 PPM 필터 형성 용액을 사용하는 경우 기공이 더 큰 PPM 필터가 형성되므로, 분리하고자 하는 소포의 크기에 따라 기공 크기를 다양하게 구성하기 위해 기공형성 용매의 함량을 조절할 수 있을 것이다.
본 발명은
A) 제 1항의 장치를 이용하여 체액으로부터 세포 밖 소포를 분리하는 단계;및
B) 상기 소포로부터 핵산을 분리하여 분석하는 단계;를 포함하는, 제 1항의 장치를 이용하여 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 체액은 전혈(whole blood), 혈청, 복강액, 모유, 또는 소변인 것을 특징으로 한다. 그러나 체액의 종류는 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는 마우스 혈액을 사용하여 발명을 완성하였지만, 인간, 비-인간인 영장류, 랫드, 개, 고양이, 말 및 소 등에서 유래된 체액으로부터 소포를 분리하는 데 본 발명의 장치를 이용할 수 있다. 체액의 유래는 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 질병은 암인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 장치는 비침습적인 방법으로 암 등 질병의 진단에 필요한 소포 내 핵산 정보를 얻는 데 이용할 수 있다. 본 발명의 장치를 이용하면 소량의 체액 샘플로부터 다량의 소포를 단시간 내에 분리, 정제할 수 있어 임상 진단에 이용하기 유리하다. 따라서 소포를 이용한 연구 및 암 등 질병의 진단에 중요하게 응용될 것으로 기대된다.
도 1은 마이크로칩상에 cross flow 형태로 형성된 채널에 PPM 필터 형성 용액을 흘려 넣고, 중앙의 홈 부위에만 UV를 노출시켜 PPM 필터를 만드는 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 PPM 필터와 채널의 접합부위를 SEM 이미지를 통해 관찰한 결과이다.
도 3은 압력을 원동력으로 한 PPM 필터 방식에서 유체의 흐름에 따라 분리되는 소포와 단백질의 이동경로를 보여주는 그림이다. X 표시는 일시적으로 구멍을 막아 놓은 것을 의미한다.
도 4a의 상단 도는 60% 기공형성 용매를 함유하는 PPM 필터 형성 용액을 사용하여 만들어진 PPM 필터를 1 um 의 붉은 형광 bead가 통과하지 못하는 것을 보여주는 도이며, 하단 도는 초록색 100 nm bead가 필터를 잘 통과하는 모습을 보여주는 것이다. 도 4b는 기공형성 용매의 함량에 따라 예측되는 구멍의 크기를 나타낸 그래프이며, SEM 이미지는 66% 기공형성 용매를 함유하는 용액을 사용한 경우 5 um polystyrene bead가 구멍을 통과하지 못하고 표면에 남아 있는 모습을 보여주고 있다. 도 4c는 67% 기공형성 용매를 함유하는 용액 사용시 PPM 필터에 넓은 구멍이 생성된 것을 보여주는 사진이고, 도 4d는 58% 기공형성 용매를 함유한 용액 사용시 PPM 필터에 좁은 구멍이 형성된 것을 보여주는 사진이다.
도 5a는 필터를 통과시키기 전 혈액 내 세포를 보여주는 사진이고, 도 5b는 압력을 동력원으로 한 PPM 필터를 통과시킨 후에 혈액에서 세포가 제거된 모습을 보여주고 있다.
도 6a는 기공형성 용매의 함량에 따라 필터링 되는 용액의 양을 누적 그래프로 보여주고 있고, 도 6b는 필터 시간에 따른 용액의 통과속도를 보여주는 그래프이다.
도 7은 전기장의 변화에 따라 단백질인 BSA(Bovine Serum Albumin, 소 혈청 알부민)과 소포의 필터되는 정도를 측정한 그래프이다. 각각의 이동된 정도는 필터된 추출액의 농도를 주입된 샘플의 농도로 나누는 방식으로 계산하였다.
도 8은 전기장을 원동력으로 한 PPM 필터 방식에서 유체의 흐름 및 분리되는 소포와 단백질의 이동경로를 보여주는 그림이다. 1.5 cm의 전극 사이의 거리는 10V의 전위를 통해 6.7 V/cm의 전기장이 인가된다.
도 9a는 40배 희석된 혈액 (2.5% 용혈)과 비교해 압력의 방식과 전기장을 이용한 방식의 용혈 정도가 측정할 수 없을 만큼 적다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 9b는 DNA양 역시 추출된 용액들이 측정하기 힘들 만큼 작은 값을 가진다는 것을 보여준다.
도 10a는 초 원심 분리 방법을 통해 얻은 소포, 도 10b는 압력을 동력원으로 필터 된 소포, 도 10c는 전기장을 동력원으로 필터 된 소포의 모양을 각각 TEM으로 관찰한 사진이다.
도 11의 우측 도는 실험군(first antibody and secondary antibody 처리), 좌측 도는 비교군(secondary antibody만 처리)을 각각 확인한 도이다. 우측 도에는 세 가지의 밴드가 보이는데, 두 개는 혈액 내 존재하는 IgG가 나오는 것이고 나머지 하나는 CD9 소포 단백질의 양을 보여주고 있다. 우측 도에는 두 개의 IgG 밴드만이 보이는데, 이는 실험군내 CD9 밴드가 정확하다는 것을 보여준다.
도 12는 각각의 방식으로 분리한 소포의 단백질 대비 RNA의 함량을 보여주는 테이블이다. 괄호의 값은 6번의 실험을 통해 얻은 값의 오차 범위를 표현하고 있다.
도 13은 각각의 방식으로 분리한 소포의 melan-a marker의 밴드를 보여주는 사진이다. 위쪽의 밴드는 house-keeping gene인 Actin이고 일정하게 나타난다. 반면 아래쪽의 Melan A 암세포 marker는 필터된 방식과 초 원심 분리 방식에서 분리된 소포에서만 보여지고 있다.
도 14는 본 발명의 장치의 일 구현예의 도면이다. 10은 마이크로칩, 20은 채널, 30은 PPM 필터를 나타낸다.
실시예 1은 본 발명의 장치를 제조하는 방법에 관한 것이다.
실시예 2는 본 발명의 장치에 포함되는 PPM 필터의 기공 크기 결정에 대한 것이다.
실시예　3　및 4는 각각 본 발명의 장치에 압력을 원동력으로 이용하는 경우, 전기장을 원동력으로 이용하는 경우에 대한 것이다.
실시예 5 내지 7은 본 발명의 장치를 이용하여 얻은 소포의 양 및 정제된 정도를 용혈 정도, 샘플의 DNA 함량, 소포의 형태 등을 비교하여 장치가 효과적으로 소포를 분리하는지 여부를 확인한 것이다.
실시예 8은 본 발명의 장치를 암 진단에 활용한 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예1 . PPM ( porous polymer monolith ) 필터가 융합된 PMMA( polymethyl methacrylate) 마이크로 채널의 제조
1-1. PMMA 마이크로 채널의 제조
PMMA를 기본 재료로 하여 마이크로 채널을 제조하였다. PMMA는 내구성이 좋고 채널을 파기 쉬우며, 자외선(Ultraviolet, UV)투과도가 좋고 재질상 조화성이 좋아 마이크로 채널 제조에 사용하기 좋은 물질이다.
PMMA 판에 MICO CNC (TinyCNC-S, TinyRobo, Korea)를 사용하여 깊이 150 μm, 폭 500 μm diameter 가 되도록 X자 형태로 cross flow 채널을 파서 만들었다. 중앙에는 2.5 x 4.0 mm의 직경을 가진 네모난 홈이 두 개의 cross flow 채널 사이에 형성되도록 하여 PPM필터가 형성될 자리를 만들었다. 이렇게 채널과 홈이 형성된 PMMA 판을 100 % 에탄올에 씻고, 5 μl methyl methacrylate(Aldrich 사에서 구입)를 이용하여 커버 플레이트(cover plates)와 붙인 후 오븐에서 고정시켰다(1hr, 65 °C). 그 다음 23 gauge steel hypodermic needle segments를 PMMA 판의 네 귀퉁이에 파인 채널의 끝부분에 연결시킨 후, 다시 오븐에서 고정시켰다(2 hr, 65℃ ).
1-2. PPM 필터 형성 용액의 제조
glycidyl methacrylate(GMA) monomer를 1.8ml, ethylene glycol dimethacrylate(EGDMA), ethylene glycol dimethacrylate(EGDMA)를 1.3 ml, 2,2-dimethoxy-2-phenyl-acetophenone (DMPA)를 40 mg, hydroquinone을 10 mg, 메탄올을 4.3~6.6 ml (전체 부피 대비, 58% to 68%) 첨가하여 다공성 중합체 모노리드 필터 형성 용액을 제조하였다. 각각의 재료는 모두 Aldrich 사의 제품을 구입하여 사용하였다. 조합된 용액에서 산소를 제거하기 위해 2분 가량 질소를 주입하여 모두 제거하였다.
glycidyl methacrylate는 반응의 initiator 역할을 하는 물질로서 채널 판의 표면이 음전하를 띄게 하는데, 이를 통해 음전하를 가지는 소포가 채널 판의 표면에 흡착되는 것을 막아주는 작용을 한다. 또한 PMMA와 화학적으로 유사한 아크릴 기를 갖는 물질이므로, 합성 이후에 채널 벽면에 모노리드가 견고하게 결합될 수 있다. ethylene glycol dimethacrylate는 가교제(cross-linker) 역할을 하고, 2,2-dimethoxy-2-phenyl-acetophenone는 photo-initiator 역할을 하며, 메탄올은 기공형성 용매(porogenic solvent)로 사용되었다. hydroquinone은 중합 Initiator 역할을 하는데, UV의 노출에 의해 중합이 일어나는 동안 열 전달이나 중합부위의 확산에 의해 비특이적 중합이 일어나는 것을 막는 역할을 한다.
1-3. PPM 필터의 제조
1-1에서 제조된 채널 판에서, shadow mask를 사용하여 UV에 노출시켜 PPM 필터가 형성될 부위를 중앙의 폭 0.5 mm 부위로 제한하였다(도 1의 좌측 상단, 하단의 도 참조). 그 후 채널 판의 네 귀퉁이의 needle segments 에 Flexible plastic Tygon 튜브(Norton Performance Plastics, USA)(i.d.0.508mm)을 연결시키고, 이를 통해 1-2에서 제조한 PPM 필터형성 용액을 주입하였다. 그 다음 튜브를 묶어 산소의 유입을 막고, 365nm 파장의 UV light source (SUV 2010-S, UV Sources & Manufacturing Technology, Korea)에 노출시켰다(17 분). 중합반응이 완료된 후 에탄올과 물을 차례로 흘려주어 반응되지 않은 용액을 제거하였다. 완성된 채널은 즉시 사용하거나 물을 채운 상태로 보관되었다(도 1의 우측 도 참조).
도 2는 형성된 PPM 필터가 채널의 내강(lumen)과 명확한 경계선을 이루는 것을 보여준다.
실시예 2. PPM 필터의 다공도 확인
PPM필터의 다공도는 제조에 사용된 PPM 형성 용액의 조성 비율에 따라 달라지며, 특히 기공형성 용매의 비율이 필터의 구멍 크기에 직접적인 영향을 주는 것으로 알려져 있다. PPM 필터는 각각의 모노리드의 구슬형태가 그물 망 형태를 형성하여 다공성의 특징을 갖는다.
이와 같은 사실을 확인하기 위해 다양한 크기의 형광 polystyrene beads를 실시예 1에서 제조된 필터에 통과시킴으로 구멍의 크기를 파악하였다. 구멍의 사이즈 보다 큰 물질은 통과되지 않을 것이므로, collection channel로 통과된 다른 크기의 형광 polystyrene beads (Duke Scientific)의 유무를 통해 구멍의 크기를 예측하였다(도 4a).
도 3은 본 발명의 채널 시스템이 압력을 동력원으로 하는 경우의 모식도로서, 각각 sample의 주입구 및 배출구, collection 의 주입구 및 배출구를 표시하였다. 위 실험을 위해 sample channel (소포를 분리 할 샘플을 넣는 곳)의 주입구 부분에 syrange 펌프를 연결하고, 다양한 크기의 형광 polystyrene beads를 주입하여 공기를 제거한 후에 입구를 막았다. Collection channel (PPM 필터를 통과한 물질을 받는 채널)의 주입구에는 1 x PBS(phosphate buffer saline)을 넣어 역시 공기를 제거한 상태에서 배출구 쪽을 막았다. 이러한 상태에서 펌프로 1.0 μl/min (Harvard Apparatus)의 속도로 유체가 흐르도록 하자, 압력으로 인해 collection channel 에 필터 된 물질이 모아졌다. PBS를 한쪽 채널의 총 부피에 해당하는 18.5 ul 만큼 주입하여 채널 안에 있는 필터 된 물질을 추출하였다.
PPM 필터 형성 용액에서 기공 형성 용매 함량이 57% 이하로 떨어지는 경우 100 nm이하의 작은 기공을 만들었고, 그 함량이 70% 이상이 되는 경우 5 um 이상의 큰 기공을 형성함을 확인하였다.(도 4c, 4d).
도 4b는 PPM 필터 형성 용액을 구성하는 기공 형성 용매의 비율을 점차적으로 줄이면 매우 조밀한 모노리드 구슬의 조합을 가지는 필터가 형성되고 동시에 구멍의 크기가 작아지는 상관관계를 나타낸 그래프이다. 그림 내 사진은 66% 기공 형성 용매를 함유하는 용액을 사용하여 필터를 제조했을 때 5 um bead가 통과하지 못하는 그림을 보여준다.
실시예 3. PPM 필터 시스템을 통한 소포 분리-압력을 원동력으로 한 경우
도 3은 압력을 원동력으로 한 PPM 필터 시스템의 모식도이다. 이 시스템을 이용하여 혈액에서 소포를 분리하였다.
3-1. PPM 필터 시스템을 통한 소포 분리
위 실험을 위해 sample channel (소포를 분리 할 샘플을 넣는 곳)의 주입구 부분에 syrange 펌프를 연결하고, 다양한 크기의 형광 polystyrene beads를 주입하여 공기를 제거한 후에 입구를 막았다. Collection channel (PPM 필터를 통과한 물질을 받는 채널)의 주입구에는 1 x PBS(phosphate buffer saline)을 넣어 역시 공기를 제거한 상태에서 배출구 쪽을 막았다. 이러한 상태에서 펌프로 1.0 μl/min (Harvard Apparatus)의 속도로 유체가 흐르도록 하자, 압력으로 인해 collection channel 에 필터 된 물질이 모아졌다. PBS를 한쪽 채널의 총 부피에 해당하는 18.5 ul 만큼 주입하여 채널 안에 있는 필터 된 물질을 추출하였다. 추출된 양은 약 4 ul 정도였고, 시간은 40분이 소요되었다.
이때 PPM 필터는 500 nm 이상 크기를 가진 물질(백혈구, 적혈구)만을 제거하는 소극적 방식의 필터로 작용했다. 도 5에서 혈액을 PPM 필터 시스템을 통과시키자 세포밖 소포 및 그 외 작은 입자들이 분리되는 것을 확인할 수 있다. 도 5 우측 도에서 소포가 뭉치거나 파괴되지 않고 본래의 형태를 유지하고 있음을 알 수 있다.
3-2. 필터 기공의 크기 결정
혈액 분리에 적합한 필터 기공의 크기를 결정하기 위해, 다양한 크기의 기공을 가지는 채널에서 유체의 흐름 정도를 확인하였다. 필터 기공의 크기가 너무 작으면 기공이 단시간에 막힐 것이기 때문에, 기공이 막힐 때까지 걸린 시간을 기준으로 하였다.
펌프 속도 1.0 μl/min에서 각각의 채널이 막히는데 걸리는 시간을 비교하였다. 더 이상의 부피 증가가 없는 경우 세포 등에 의해 구멍이 막혔다고 생각을 하였고 필터에 통과시킨 시간에 따른 필터 된 유체의 양을 도 6a에, 계산된 유체의 속도를 측정한 결과를 도 6b에 표시하였다. 먼저 기공형성 용매의 농도를 58%로 하여 중합된 필터(구멍 크기 100nm)인 채널에 통과시켰고, 결과는 파란색 선으로 표시하였다. 그 다음 기공형성 용매의 농도를 60%로 하여 중합된 필터(구멍 크기 500nm)인 채널에 통과시켰고, 결과는 빨간색 선으로 표시하였다. 그리고 기공형성 용매의 농도를 68%로 하여 중합 필터(구멍 크기 1μm)인 채널에 통과시켰고, 결과는 보라색 선으로 표시하였다. 커다란 기공(기공형성 용매의 농도를 >60% 로 중합하여 구멍 크기가 >500 nm인 필터)을 가진 필터의 경우 배출되는 유체의 속도에 변함 없이 물질이 분리되었지만 몇몇의 붉은 점이 관찰되어 세포(적혈구)가 빠져 나오는 것을 알 수 있었다. 그와 반대로 기공이 작은 경우에 다양한 세포에 의해 막히는 현상을 관찰 할 수 있었다. 최종적으로 60% 기공형성 용매를 사용하여 중합한 필터가 막힘 현상이 나타나기 전에 충분한 양이 필터 되는 것으로 확인되었다. 이 때 필터된 양은 4 μl 정도인데, PCR의 경우 일반적으로 100 nanoliter의 샘플만 있으면 유전적 특징을 확인할 수 있으므로, PCR 및 기타 다양한 진단 장비에 충분히 활용할 수 있는 양을 분리할 수 있을 것으로 예상하였다.
실시예 4. PPM 필터 시스템을 통한 소포 분리-전기장을 원동력으로 한 경우
세포 및 세포에서 유래한 소포는 음전하를 가진 인지질 때문에 전체적으로 음전하를 띈다. 단백질 및 그밖에 다른 물질들은 소포보다는 작은 음전하를 띈다. 이를 확인하여 PPM 필터 시스템에 응용하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
4-1. 소포의 음전하 확인
초원심 분리 방법을 이용하여 혈액에서 분리된 소포와 혈청 단백질 (BSA)의 제타 전위(zeta potential)를 DLS(Zetasizer 3000HSA, Malvern)로 측정해보니 각각 pH 7.5에서 -19.30 mV (+/- 0.08) and -13.20 mV (+/- 0.06)를 가졌다. 제타 전위는 전기장내에서 움직임과 직접적인 관련이 있기에 위 결과는 소포의 움직임이 단백질보다 우위에 있을 가능성이 크다는 것을 내포하는 것이다.
위 결과를 재확인하기 위해, 전기장 내에서 각각의 움직임을 확인해 보았다. 1 x TAE 버퍼용액에 각각 섞여 있는 Bovine Serum Albumin(40 mg/ml)과 세포밖 소포(400 g/ml)를 PPM 필터에서 3.3-10 V/cm의 전기장에 노출 시켰다. 도 7에서 알 수 있듯이, BSA와 소포는 같은 전위에서 다른 양이 추출 되었는데, 모든 전기장에서 소포의 양이 BSA보다 많이 추출되었다. 그러나 6.7 V/cm보다 높은 전기장에서는 전극 주위에 빠르게 가스 방울이 많이 생겨 유체의 흐름을 방해하였고 측정의 오차가 더욱 커져, 6.7 V/cm 이상의 전기장은 사용하지 않았다.
4-2. 전기장을 원동력으로 한 PPM 필터 시스템
4-1의 실험 결과를 바탕으로, 전기장을 이용하여 혈액에 많은 단백질과 세포로부터 소포를 분리하기 위한 시스템을 구성하였다.
25x TAE와 혈액을 1:24의 비율로 섞어주어 전체 용액이 1x TAE가 되도록 한 후에 직류전기영동을 해주었다. 이때 양쪽 채널의 유체는 막히는 현상을 방지하기 위해 2 μl/min으로 Cross flow 형태로 꾸준히 흘려 주었다. DC power supply (DRP-1001, Digital Electronics Co. Ltd., Korea)와 채널에 연결된 강철 바늘을 통해 혈액이 흐르는 부분과 필터 된 유체가 흐르는 부분의 전위차를 10 V (전기장은 6.25 V/cm)를 적용하였다. 이 시스템의 모식도는 도 8에 나타내었다. 2 시간 동안 약 240 μl의 혈액이 사용되었고, 실시예 3에서 제조한 압력을 동력원으로 사용하는 방식과 마찬가지로 어떠한 막힘 현상도 발견할 수 없었다.
실시예 5. 분리 방법이 효과적인지 여부 확인-적혈구 용혈 정도 및 DNA 함유 정도 확인
실시예 3에서 제조한 압력을 동력원으로 한 PPM 필터 시스템, 실시예 4에서 제조한 전기장을 동력원으로 한 PPM 필터 시스템이 효과적인지 여부를 확인하기 위해, 적혈구의 용혈 정도(hemolysis)와 DNA의 함유 정도를 확인하였다. 용혈 정도는 혈액 세포의 피해를 나타내는 일반적인 측정 방식이고, 세포가 부서졌을 경우 나오는 DNA 또한 적절한 힘이 가해졌는지에 관한 필요한 측정 방법이다. 백혈구가 파괴되어 크기와 상관없이 분리된다면 DNA가 필터 액체에 포함될 가능성이 높고, 적혈구가 파괴된다면 헤모글로빈이 용출되어 색이 변색 될 수 있다.
5-1. 용혈 정도 확인
마우스 혈액을 압력을 동력원으로 한 PPM 필터 시스템, 전기장을 동력원으로 한 PPM 필터 시스템에 각각 통과시켰다. 물로 40배로 희석한 혈액이 용혈 정도 2.5%의 값으로 가정하고, 각각의 시스템을 통과한 샘플을 희석하지 않고 그대로 사용하여 2.5%와 비교하였다. 도 9a에서 보이는 것처럼 압력에 의한 시스템, 전기장에 의한 시스템을 통과한 샘플 모두에서 혈액의 2.5%의 용혈 정도와 비교해 매우 적은 양이 관찰되었다. 이는 적혈구의 파괴가 거의 발생하지 않았다는 것을 의미한다.
5-2. DNA 함량 확인
PPM 필터를 통해 분리된 소포 용액 내에 세포의 DNA가 존재하지 않는지 확인하기 위해 용액에 Lysis buffer를 주입하여 전부 용해 시켰다(Lysis buffer [50 mM Tris (pH 8.0), 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS, 250 μg/ml protease K] , 90분, 60℃). 그 다음 3 M potassium acetate를 용해된 샘플에 1:3의 비율로 첨가하였다. 이를 13,500 g에서 10분 동안 원심 분리한 후, 상층액만을 따라내어 0.3 ml chloroform 과 혼합하고 이 혼합액으로 다시 원심분리를 하였다(13,500 g, 10분). 상층액을 따라내어 버린 후, 원심분리된 물질을 100% ethanol과 혼합시키고 다시 원심분리를 하였다(13,500 g, 10 min). 상층액을 따라내어 버린 후, 가라앉은 펠렛을 20 μl 의 DI water에 희석하여 DNA 수용액을 얻었다.
spectrophotometer (Nanodrop SD2000, BioPrince)로 이 수용액의 DNA 함량을 측정한 결과, 압력을 이용한 PPM 필터 시스템을 통과한 샘플에서는 0.76 (+/- 0.10) ng/ml의 DNA가 검출되었고, 전기장을 이용한 PPM 필터 시스템을 통과한 샘플의 경우 1.08 (+/- 0.78) ng/ml의 DNA가 검출되었다. D1 water의 흡광도가 (0.56 +/- 0.10 ng/ml)이므로, 두 PPM 필터 시스템 모두 통과한 샘플에서 DNA가 거의 검출되지 않았다는 것을 알 수 있다(도 9b).
실시예 6. 전기장의 영향 확인-적혈구 용혈 정도 확인
압력을 동력원으로 한 필터 시스템의 경우 압력에 의해 세포, 소포 등이 파괴될 수 있다. 전기장을 동력원으로 하는 경우 압력보다 세포, 소포 등에 미치는 영향이 적으나, 이 경우에도 역시 전기장 자체가 열이나 전기에 의한 천공이나 용해를 일으킬 수 있다.
이론적으로 직류가 세포에 미칠 수 있는 피해는 |Vtm| = 1.5 |E| R로 표현 가능하다. Vtm, E 그리고 R은 각각 막 전위, 전기장, 물체의 반경을 말한다. 세포의 경우, 직류 전기장 6.7 V/cm는 1 μm 지름을 가지는 세포에 0.5 mV 막 전위를 일으키고, 그보다 작은 소포에는 더 작은 막 전위를 일으킨다. 따라서 기존에 세포의 분해나 천공이 1 V와 0.25V 이상에서 발견된다는 보고가 있기에 본 발명의 PPM 필터 시스템을 통과한 소포의 용액에 세포의 물질이 들어갈 가능성이 매우 적을 것으로 예상하였다.
필터를 통과한 혈액의 pH가 변화한다면 필터가 혈구 세포나 소포를 파괴하는 등의 영향을 미치는 것으로 유추할 수 있다. 이를 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
PPM 필터 시스템을 통과시키기 전의 마우스 혈액의 pH는 7.0이었다. PPM 필터 시스템을 통과시킨 마우스 혈액 샘플을 2시간 동안 전기영동을 한 후 pH를 측정하자 7.5로 나타났다. 이렇게 pH 변화가 적었다는 사실은 본 발명의 PPM 필터 시스템이 혈액에 전체적으로 큰 변화를 유발하지 않음을 의미한다.
실시예 7. 분리된 소포의 특징 비교
압력을 동력원으로 한 PPM 필터 시스템, 전기장을 동력원으로 한 PPM 필터 시스템, 종래의 초 원심 분리 방법을 이용해 각각 분리된 소포의 특징을 서로 비교하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
7-1. 소포의 분리
압력을 동력원으로 한 PPM 필터 시스템은 실시예 3의 방법대로 준비하였고, 전기장을 동력원으로 한 PPM 필터 시스템은 실시예 4의 방법대로 준비하였다. 각각의 시스템에 마우스 혈액을 주입하여 소포를 분리하였다.
종래기술인 초원심 방법을 이용하여 소포를 분리하는 방법은 다음과 같이 수행하였다. 마우스 심장에서 분리된 혈액에 EDTA를 5mM 농도로 넣어 혈액의 응고를 막은 후, 800g에서 원심분리를 10분 동안 진행하고 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액의 부피에 9배의 부피를 가진 PBS (EDTA 5mM)를 통해 희석해 준 후 20분 동안 3,000 g에서 원심분리를 다시 해 주었다. 상층액을 분리하여 다시 100,000 g 에서 2 시간 동안 초 원심 분리해 준 후 상층액을 따라내어 버리고, 가라앉은 펠렛을 PBS에 희석하여 다시 한번 100,000 g 에서 2 시간 동안 초 원심 분리하여 단백질을 최대한 제거하였다.
7-2. 분리된 소포의 양 및 형태 비교
TEM(Transmission electron microscopy)을 이용하여 소포의 존재를 확인하고 모양을 비교하였다. 도 10a는 초 원심 분리방법으로 분리된 샘플의 TEM 사진인데, 많은 양의 소포가 함유되어 있지만 소포가 뭉치는 현상이 발견되고 일부 소포는 파괴되어 모양이 변형된 것을 관찰할 수 있었다. 도 10b는 압력을 원동력으로 한 PPM 필터 시스템을 통과한 샘플의 TEM 사진인데, 초 원심 분리 방법으로 분리한 경우보다 함유된 소포의 양이 적고 단백질이 약간 포함되어 있지만 전혀 형태가 망가지지 않은 지름 150 nm크기의 소포를 함유하고 있는 것을 알 수 있다. 도 10c는 전기장을 원동력으로 한 PPM 필터 시스템을 통과한 샘플의 TEM 사진인데, 이 경우도 도 10b와 유사하게 나타났다.
7-3. 소포에 특이적인 단백질의 정량적 비교
분리된 소포의 순도가 높은지 간접적으로 확인하는 방법으로서, 분리된 샘플 내에 소포에 특이적인 단백질인 CD9의 함량을 확인하는 방법이 있다. 이를 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
25 μl의 혈액에서 7-1에 기술된 3가지 방법을 이용하여 소포를 분리하고, TCA(Trichloroacetic acid solution, Aldrich) (6.1N)과 10 : 1로 섞어주어 모든 단백질 및 소포를 가라앉혔다. 10분 동안 13,500 g 에서 원심분리 후 가라앉은 펠렛을 동일한 양의 전기영동 loading buffer(50mM Tris-HCl/2% SDS/0.1% bromophenol blue/10% glycerol)에 넣고, 단백질을 변성시키기 위해 100 ℃에서 10분 동안 가열하였다. 그 다음 샘플을 절반의 양으로 나눠 12% resolving gel의 실험 군 well (gel의 loading 구멍) 하나와 대조군 well 하나에 각각 주입해 주었다. SDS PAGE (120 V, 1 hour 30 min)를 이용하여 크기별로 물질이 분리되도록 하고, 390 mA에서 2 hour(4 ℃) 동안 PVDF membrane 으로 단백질을 옮겨 주었다. 실험군의 경우 0.1 μg/ml CD9 primary antibody (BD Biosciences, NA/LE Rat Anti-Mouse)를 blocking solution (0.3% BSA / 0.1% tween20 /TBS)으로 하여 희석하였고, 대조군에는 blocking solution 만을 처리하여 사용하였다.
압력을 원동력으로 한 PPM 필터 시스템을 통과한 샘플의 경우, 다량의 CD9 뿐 아니라 기타 혈청 단백질을 다량 함유하고 있는 것으로 확인되었다. 반면 전기장을 원동력으로 한 PPM 필터 시스템을 통과한 샘플의 경우 함유된 CD9의 양 자체는 압력을 원동력으로 한 경우보다 적었지만, 상대적으로 혈청 단백질보다 CD9가 훨씬 많이 포함되어 있음을 알 수 있었다(도 11). 이는 전기장을 원동력으로 한 경우에 분리된 소포의 순도가 더 높으나, 압력을 원동력으로 한 경우에 더 많은 양의 소포를 분리할 수 있음을 의미한다. 따라서 압력을 원동력으로 한 PPM 필터 시스템은 양적인 측면에서, 전기장을 원동력으로 한 PPM 필터 시스템은 질적인 측면에서 강점이 있는 것으로 보았다.
7-4. RNA 함량 비교
혈액 안에 존재하는 자유로운 RNA는 순환하는 RNase의 존재 때문에 반감기가 매우 짧으므로, 필터를 통과한 샘플에 포함된 RNA는 소포에서 유래된 RNA일 가능성이 높다. 따라서 혈액에서 분리된 용액의 단백질 함량과 분리된 RNA의 양의 비율을 비교하면 필터의 성능을 간접적으로 확인할 수 있다. 이를 위해 하기의 실험을 수행하였다.
25 μl의 혈액에서 7-1에 기술된 3가지 방법을 이용하여 소포를 분리하고, 0.8 ml의 Tryzol (Life Technologies)을 넣어 5분 동안 소포 막을 용해시켜 주었다. 그 후 0.2 ml 의 chloroform 용액을 넣어 RNA와 다른 물질(단백질, DNA)의 층을 분리해 주었다(5분, 4℃). 13,500 g에서 10 분 동안 원심분리하여 완벽하게 층을 분리시킨 후에, 상층액(RNA 층)에 IPA(isopropyl alcohol)를 같은 부피로 넣어 RNA를 침전시켰다(20분, -20 ℃). 다시 13,500 g 에서 10 분 동안 원심 분리하고 상층액을 따라내어 버렸다. 펠렛을 75% ethanol에 희석한 후 13,500 g 에서 10 분 동안 다시 원심분리를 수행하여 RNA를 침전시켰다. ethanol을 따라내고 5분 이상 상온에서 건조한 후, 펠렛을 DI water 에 희석하였다. 이렇게 얻은 RNA 수용액을 spectrophotometer (Nanodrop SD2000, BioPrince)로 관찰하여 RNA 양을 측정하였다.
압력을 원동력으로 한 경우는 다량의 RNA를 함유하고 있었으나 단백질 함량도 높아 소포의 순도가 낮은 것으로 볼 수 있었다. 반면 전기장을 원동력으로 한 경우는 RNA 함량이 단백질 함량에 비해 상대적으로 높았으며, 초 원심 분리 방법으로 소포를 분리한 경우와 유사한 값을 나타내었다. 이와 같은 결과는 실시예 7-3에서 확인한 것과 일맥 상통하는 것으로서, 압력을 원동력으로 한 PPM 필터 시스템은 양적인 측면에서, 전기장을 원동력으로 한 PPM 필터 시스템은 질적인 측면에서 강점이 있는 것으로 해석 가능했다. 이 결과는 동전기상(electrokinetic) 효과가 혈액과 같은 복잡한 유체 내에서 선별적으로 단백질을 제거하는 역할을 할 수 있다는 것을 보여주었다.
실시예 8. 분리된 소포를 이용한 진단
Melan A는 정상 세포에서도 발현하지만 melanoma tumor cell에 특히나 많이 발현되는 진단 marker이다. 필터 된 소포가 진단에 활용가능한지 확인하기 위해 암세포를 투여한 생쥐의 혈액을 필터 하여 melan A의 존재가 있는지 확인해 보았다.
6주령 마우스(C57BL6/j mice)의 측면 부위에 2 x 106개의 B16BL6 (mouse melanoma tumor cell)를 피하 주사하고 3 주 동안 증식되기를 기다렸다. 3주 후 심장에서 혈액을 분리하고, 분리된 혈액에 EDTA를 5mM 농도로 넣어 응고를 억제한 후 이를 이용하여 소포 분리 실험을 진행하였다. 대조군으로 사용한 정상 마우스는 암세포의 주입 없이 바로 심장에서 혈액을 채취하였다.
압력을 원동력으로 한 PPM 필터 시스템은 펌프를 이용하여 1.0 μl/min의 일정한 유속으로 샘플을 흘려 넣어 채널이 막힐 때까지 필터를 통과시켰다.
전기장을 원동력으로 한 PPM 필터 시스템은 25x TAE를 혈액과 1:24의 비율로 섞어주어 전체 용액이 1x TAE가 되도록 한 후에 직류전기영동을 해주었다. 이때 양쪽 채널의 유체는 채널이 막히는 현상을 방지하기 위해 2 μl/min으로 꾸준히 흘려 주었다. DC power supply (DRP-1001, Digital Electronics Co. Ltd., Korea)와 채널에 연결된 강철 바늘을 통해 혈액이 흐르는 부분과 필터를 통과한 유체가 흐르는 부분의 전위차를 10 V (전기장은 6.25 V/cm )로 유지해 주었다.
초 원심 방법을 이용하여 소포를 분리하기 위해서, 마우스 심장에서 분리된 혈액에 EDTA를 5mM 농도로 넣어 혈액의 응고를 막은 후 800g 에서 원심분리를 10분 동안 진행하고 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액의 부피에 9배의 부피를 가진 PBS (EDTA 5mM)를 통해 희석해 준 후, 20분 동안 3,000 g에서 원심분리를 다시 해 주었다. 상층액을 분리해 버린 후, 100,000 g 에서 2 시간 동안 초 원심 분리하고, 다시 상층 액을 버리고 가라앉은 펠렛을 PBS에 희석하여 100,000 g 에서 2 시간 동안 초 원심 분리해 주어 단백질을 최대한 분리해 제거하였다.
25 μl의 혈액에서 7-1에 기술된 3가지 방법을 이용하여 소포를 분리하고, 0.8 ml의 Tryzol (Life Technologies)을 넣어 5분 동안 소포 막을 용해시켜 주었다. 그 후 0.2 ml 의 chloroform 용액을 넣어 RNA와 다른 물질(단백질, DNA)의 층을 분리해 주었다(5분, 4℃). 13,500 g에서 10 분 동안 원심분리하여 완벽하게 층을 분리시킨 후에, 상층액(RNA 층)에 IPA(isopropyl alcohol)를 같은 부피로 넣어 RNA를 침전시켰다(20분, -20 ℃). 다시 13,500 g 에서 10 분 동안 원심 분리하고 상층액을 따라내어 버렸다. 펠렛을 75% ethanol에 희석한 후 13,500 g 에서 10 분 동안 다시 원심분리를 수행하여 RNA를 침전시켰다. ethanol을 따라내고 5분 이상 상온에서 건조한 후, 펠렛을 DI water 에 희석하였다. 이렇게 얻은 RNA 수용액을 spectrophotometer (Nanodrop SD2000, BioPrince)로 관찰하여 RNA 양을 측정하였다. ETBR(Ethidium Bromide)염색으로 확인하였다. 양성대조군(배아줄기세포)과 같은 양의 RNA가 사용되었는지 확인하기 위해 항상 발현(Housekeeping gene)되는 유전자인 Actin의 RNA를 같이 확인하였다.
분리된 RNA로 RT-PCR을 수행하였다. reverse transcription kit (Promega, GoScript)와 poly A primer 이용해 cDNA를 얻고, polymerase chain reaction kit (Promega, GoTaq)와 특정 유전자의 primer를 이용해 다수의 DNA로 증폭 후 1.5 % 아가로스 젤에서 30분 동안 120 v로 전기 영동 해주었다. 이때 사용한 Melan A 의 forward primer의 서열은 5’-CGCTCCTATGTCACTGCTGA-3’(서열번호 1)이고, reverse primer의 서열은 5’-GGTGATCAGGGCTCTCACAT-3’(서열번호 2)이다. house keeping gene인 β-actin의 forward primer 서열은 5’-GAGGGAAATCGT GCGTGA-3’(서열번호 3)이고, reverse primer 서열은 5’- CCAAGAAGGAAGGCTGG AA-3’(서열번호 4)이다. PCR 온도 조건은 90℃에서 5 분 동안 반응시킨 후, 순서대로 90℃, 50℃, 72℃에서 각각 30 초씩 40 싸이클을 수행하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다.
도 13에서와 같이, 압력을 동력원으로 한 PPM 필터 시스템과 전기장을 동력원으로 한 PPM 필터 시스템에서 모두 melan A 밴드가 나타났다. 초 원심 분리 방법을 이용한 경우도 마찬가지였다. 그러나 다양한 단백질 및 세포가 포함된 대조군의 혈액에서는 Melan-A 밴드가 거의 보이지 않았다. 이 결과를 통해 압력을 동력원으로 한 PPM 필터 시스템과 전기장을 동력원으로 한 PPM 필터 시스템은 초원심 분리방법과 동일한 수준으로 암세포와 관련된 유전자를 이 장치를 통해 분리 가능하고 PCR을 통해 증명 가능함을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> APPARATUS FOR ISOLATION OF EXTRACELLULAR VESICLES COMPRISING POROUS POLYMER MONOLITH MICROFILTER <130> PB12-10942 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Melan A forward primer <400> 1 cgctcctatg tcactgctga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Melan A reverse primer <400> 2 ggtgatcagg gctctcacat 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin forward primer <400> 3 gagggaaatc gtgcgtga 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin reverse primer <400> 4 ccaagaagga aggctggaa 19

Claims (14)

  1. 마이크로 칩 상에 형성된 유체가 흐를 수 있는 채널(channel);및
    상기 채널과 연결된 다공성 중합체 모노리드 필터(porous polymer monolith filter);를 포함하는 체액으로부터 세포밖 소포(extracellular vesile)를 분리하기 위한 장치.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 마이크로 칩은 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate), 싸이클릭 올레핀 코폴리머(cyclic olefin copolymer), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리스티렌(polystyrene), 및 폴리다이메틸실록세인(polydimethylsiloxane)으로 이루어진 군으로부터 선택된 재질로 이루어지는 것을 특징으로 하는 체액으로부터 세포밖 소포(extracellular vesile)를 분리하기 위한 장치.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 채널은 2개의 채널이 교차하는 형태로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 체액으로부터 세포밖 소포(extracellular vesile)를 분리하기 위한 장치.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 다공성 중합체 모노리드 필터는 2개 이상 연속적으로 배열된 것을 특징으로 하는 체액으로부터 세포밖 소포(extracellular vesile)를 분리하기 위한 장치.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 다공성 중합체 모노리드 필터는 기공의 크기가 서로 다른 것을 특징으로 하는 체액으로부터 세포밖 소포(extracellular vesile)를 분리하기 위한 장치.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 채널은 표면에 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate) 또는 소포에 특이적으로 발현하는 단백질에 대한 항체가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 체액으로부터 세포밖 소포(extracellular vesile)를 분리하기 위한 장치.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 채널에 유체가 흐를 수 있도록 압력 및/또는 전기장 발생기가 더 구비되는 것을 특징으로 하는 체액으로부터 세포밖 소포(extracellular vesile)를 분리하기 위한 장치.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 세포밖 소포는 암세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는 체액으로부터 세포밖 소포(extracellular vesile)를 분리하기 위한 장치.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 다공성 중합체 모노리드 필터(porous polymer monolith filter)의 기공 크기는 100nm ~ 5 um 인 것을 특징으로 하는 체액으로부터 세포밖 소포(extracellular vesile)를 분리하기 위한 장치.
  10. A) 마이크로칩 상에 채널 및 채널과 연결된 홈을 형성하는 단계;
    B) 상기 채널을 통해 다공성 중합체 모노리드 필터 형성 용액을 주입하는 단계;및
    C) 상기 A)단계에서 홈과 채널이 형성된 마이크로칩에 자외선을 조사하여 홈 부위와 다공성 중합체 모노리드 필터 형성 용액을 반응시키는 단계;를 포함하는 세포밖 소포(extracellular vesile)를 분리하기 위한 장치의 제조 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 B)단계의 다공성 중합체 모노리드 필터 형성 용액은 전체 용액 중량의 58%~68%에 해당하는 기공형성 용매(porous solvent)를 함유하는 것을 특징으로 하는 세포밖 소포(extracellular vesile)를 분리하기 위한 장치의 제조 방법.
  12. A) 제 1항의 장치를 이용하여 체액으로부터 세포밖 소포를 분리하는 단계;및
    B) 상기 세포밖 소포로부터 핵산을 분리하여 분석하는 단계;를 포함하는 제 1항의 장치를 이용하여 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 체액은 전혈(whole blood), 혈청, 복강액, 모유, 또는 소변인 것을 특징으로 하는 제 1항의 장치를 이용하여 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 질병은 암인 것을 특징으로 하는 제 1항의 장치를 이용하여 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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