WO2025199822A1 - 合成cDNA双链的方法及其应用 - Google Patents

合成cDNA双链的方法及其应用

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • RNA is reverse-transcribed into a single cDNA strand using a poly-T primer or random primers N6/N8, with the help of reverse transcriptase and dNTPs; the reverse transcription reaction takes 15 minutes to 1 hour.
  • RNase H and DNA polymerase are then added (or, alternatively, DNA polymerase is omitted, utilizing the DNA polymerase function of the reverse transcriptase in the system).
  • RNase H nicks the RNA in the DNA/RNA hybrid, and DNA polymerase then uses the nicked RNA strand as a primer to synthesize the double-stranded cDNA.
  • the resulting double-stranded cDNA is not complete DNA and contains a small amount of RNA sequence.
  • the reverse transcription process in existing spatiotemporal transcriptome construction also requires a two-step reaction to synthesize a double-stranded cDNA. Furthermore, the synthesis of the second strand requires the addition of additional reaction buffer and enzymes, resulting in low reaction efficiency and the resulting spatiotemporal transcriptome quality.
  • Existing spatiotemporal transcriptome construction methods are as follows: the poly A at the 3' end of the mRNA binds to the poly T position on the spatiotemporal chip for reverse transcription to synthesize the first strand of cDNA. The reverse transcriptase transcribes three additional C bases at the 3' end of the first strand of the cDNA.
  • a method for synthesizing a double-stranded cDNA comprising: performing a reverse transcription reaction on an mRNA template using a reverse transcription primer and a reverse transcription mixture to obtain a double-stranded cDNA; wherein the reverse transcription mixture comprises a reverse transcriptase having a template switching function, a template switching primer, and dNTPs; in the reverse transcription mixture, the final concentration of the reverse transcriptase is 5-20 U/ ⁇ L, the final concentration of the template switching primer is 2-12.5 ⁇ M, and the final concentration of the dNTPs is 1-10 mM.
  • the final concentration of reverse transcriptase is 8-12 U/ ⁇ L
  • the final concentration of template switching primer is 2.5-5 ⁇ M
  • the final concentration of dNTPs is 4-6 mM
  • the final concentration of reverse transcription primer is 0.5-5 ⁇ M
  • the reverse transcription mixture also includes: reverse transcription buffer and RNase inhibitor.
  • the template switching primer includes: a template switching primer whose first three nucleotides at the 3' end are NGG or NNN, wherein the nucleotides include ribonucleotides and deoxyribonucleotides, N is any one of the bases A, T, G, U or C, and the third nucleotide from the 3' end has a locked nucleic acid modification; preferably, the length of the template switching primer is 20-35 nt; preferably, the mRNA template is derived from tissues or cells.
  • the final concentration of reverse transcriptase is 8-12 U/ ⁇ L
  • the final concentration of template switching primer is 2.5-5 ⁇ M
  • the final concentration of dNTPs is 4-6 mM
  • the final concentration of reverse transcription primer is 0.5-5 ⁇ M
  • the reverse transcription mixture also includes: reverse transcription buffer and RNase inhibitor.
  • the reverse transcription reaction includes: synthesizing the first-chain cDNA from the mRNA template using a reverse transcription primer and a reverse transcriptase to obtain a first-chain cDNA product bound to a template-switching primer; and reversely synthesizing the second-chain cDNA from the first-chain cDNA product using a template-switching primer and a reverse transcriptase to obtain a double-stranded cDNA.
  • the dissociation includes alkaline lysis of the double-stranded cDNA and neutralization of the resulting lysate, wherein the lysate includes a free second-chain cDNA.
  • the reaction temperatures for the first-chain cDNA synthesis and the second-chain cDNA synthesis are each independently 42-50°C.
  • the template switching primer includes: a template switching primer whose first three nucleotides at the 3' end are NGG or NNN, wherein the nucleotides include ribonucleotides and deoxyribonucleotides, N is any one of the bases A, T, G, U or C, and the third nucleotide from the 3' end has a locked nucleic acid modification; preferably, the length of the template switching primer is 20-35 nt; preferably, the mRNA template is derived from tissues or cells.
  • a kit which comprises a reverse transcriptase with a template switching function, a template switching primer, a reverse transcription primer and dNTPs; wherein the working concentration of the reverse transcriptase is 5-20 U/ ⁇ L, the working concentration of the template switching primer is 2-12.5 ⁇ M, and the working concentration of the dNTPs is 1-10 mM; preferably, the working concentration of the reverse transcriptase is 8-12 U/ ⁇ L, the working concentration of the template switching primer is 2.5-5 ⁇ M, and the working concentration of the dNTPs is 4-6 mM; preferably, the working concentration of the reverse transcription primer is 0.5-5 ⁇ M; preferably, the kit further comprises: a reverse transcriptase; ...
  • the template switching primer includes: a template switching primer whose first three nucleotides at the 3' end are NGG or NNN, wherein the nucleotides include ribonucleotides and deoxyribonucleotides, N is any one of the bases A, T, G, U or C, and the third nucleotide from the 3' end has a locked nucleic acid modification; preferably, the length of the template switching primer is 20-35 nt; preferably, the mRNA template is derived from tissues or cells.
  • a method for constructing a transcriptome library comprises: reverse transcribing the test RNA using the above method to obtain a cDNA double strand; and constructing a fragmentation library of the cDNA double strand to obtain a transcriptome library.
  • the transcriptome library includes a single-cell transcriptome library.
  • the reverse transcription mixture of the present application is used to carry out the reverse transcription reaction.
  • the efficiency of the reverse transcription reaction is improved, and a cDNA double-stranded product can be obtained in a one-step reaction, which greatly shortens the reaction time of reverse transcription and improves the quality of the product cDNA double-strand.
  • FIG1 shows a schematic diagram of the process of constructing a spatiotemporal transcriptome in the prior art
  • FIG2 shows a schematic diagram of the principle of double-stranded cDNA synthesis of the present application
  • FIG3 shows a 2100 quality control graph of the cDNA fragment synthesized using the technical solution of the present application in Example 1 of the present application;
  • FIG4 shows a 2100 quality control graph of the cDNA fragment obtained using the prior art solution in Comparative Example 1 of the present application.
  • cDNA second strand The strand obtained by further PCR amplification using the first cDNA strand obtained by reverse transcription of mRNA as a template, also referred to as cDNA second strand in this application.
  • the reverse transcription reaction includes: using a reverse transcription primer and a reverse transcriptase to synthesize the first strand of cDNA from the mRNA template to obtain a first strand of cDNA product that is bound to a template switching primer; and using a template switching primer and a reverse transcriptase to reversely synthesize the second strand of cDNA from the first strand of cDNA product to obtain a double-stranded cDNA.
  • the reaction temperature of cDNA synthesis is 42-50° C. and the reaction time is 2-3 h.
  • the template switching primer includes: a template switching primer whose first three nucleotides at the 3' end are NGG or NNN, wherein the nucleotides include ribonucleotides and deoxyribonucleotides, N is any one of the bases A, T, G, U or C, and the third nucleotide from the 3' end has a locked nucleic acid modification; to improve the accuracy and efficiency of primer complementarity, in a preferred embodiment, the length of the template switching primer is 20-35 nt; preferably, the mRNA template is derived from tissues or cells.
  • locked nucleic acid is a modified RNA, a synthetic nucleic acid analog containing a bridged, bicyclic sugar moiety.
  • the addition of a methylene group between the 2'-O- and 4'-C positions "locks" the ribofuranose ring in a 3'-endo conformation. Due to the constraints of this bicyclic sugar backbone, LNA only forms A-type duplexes. Furthermore, LNA fully adheres to the Watson-Crick base pairing principle. Therefore, LNA:DNA hybrid duplexes can spontaneously form from sequence-complementary DNA and LNA, and studies have found that the annealing temperature of LNA:DNA hybrids is significantly higher than that of their DNA:DNA counterparts.
  • Spatiotemporal transcriptomics is a technology that studies the gene expression of organisms at different time points and spatial locations.
  • the process of reverse transcription and cDNA double-strand synthesis for library construction is related to the accuracy of subsequent spatiotemporal transcriptome analysis.
  • higher quality transcriptome samples can be obtained efficiently.
  • the final concentration of reverse transcriptase is 8-12U/ ⁇ L
  • the final concentration of template switching primer is 2.5-5 ⁇ M
  • the final concentration of dNTPs is 4-6mM
  • the final concentration of reverse transcription primer is 0.5-5 ⁇ M.
  • the final concentration of reverse transcriptase is 8-12U/ ⁇ L
  • the final concentration of template switching primer is 2.5-5 ⁇ M
  • the final concentration of dNTPs is 4-6mM
  • the final concentration of reverse transcription primer is 0.5-5 ⁇ M.
  • the reverse transcription mixture further comprises a reverse transcription buffer and an RNase inhibitor; the reverse transcription buffer comprises Tris-HCl, 75-100 mM KCl, 3-5 mM MgCl2, and 2.5-5 mM DTT at a final concentration of 50-100 mM in the reverse transcription buffer.
  • the reverse transcription mixture further comprises betaine, trehalose, Triton X-100, NP40, and NaCl.
  • the reverse transcription reaction includes: using a reverse transcription primer and a reverse transcriptase to synthesize the first chain of cDNA from the mRNA template to obtain a first chain of cDNA product bound to a template conversion primer; using a template conversion primer and a reverse transcriptase to reversely synthesize the second chain of cDNA from the first chain of cDNA product to obtain a double-stranded cDNA.
  • the reaction temperature of cDNA synthesis is 42-50°C, and the reaction time is 2-3h.
  • the dissociation includes alkaline lysis of the double-stranded cDNA and neutralization of the resulting lysate, which includes the free second-stranded cDNA.
  • the alkaline lysis includes potassium hydroxide at a final concentration of 0.08M-0.4M, and the neutralization includes Tris-HCl.
  • a kit which includes a reverse transcriptase with template switching function, a template switching primer, a reverse transcription primer and dNTPs;
  • the working concentration of the reverse transcriptase is 5-20 U/ ⁇ L
  • the working concentration of the template switching primer is 2-12.5 ⁇ M
  • the working concentration of the dNTPs is 1-10 mM
  • the working concentration of the reverse transcriptase is 8-12 U/ ⁇ L
  • the working concentration of the template switching primer is 2.5-5 ⁇ M
  • the working concentration of the dNTPs is 4-6 mM
  • the reverse transcriptase in this kit has reverse transcription, template switching, chain displacement and DNA-dependent DNA polymerase activities, and can complete the entire process of reverse transcription, mRNA template displacement and double-stranded cDNA synthesis using one cDNA chain as a template.
  • the reverse transcription mixture containing the above-mentioned components and relevant concentrations can generate double-stranded cDNA in only one step in the same reaction system, without the need to add any additional reaction components during the synthesis of the double-stranded cDNA, thereby greatly improving the synthesis efficiency of the double-stranded cDNA and more conveniently obtaining high-quality double-stranded cDNA products.
  • the kit also includes: reverse transcription buffer and RNase inhibitor; preferably, the working concentration of the reverse transcription primer is 0.5-5 ⁇ M; preferably, the reverse transcription buffer includes Tris-HCl, 75-100mM KCl, 3-5mM MgCl 2 and 2.5-5mM DTT with a final concentration of 50-100mM in the reverse transcription buffer; preferably, the kit also includes: betaine, trehalose, Triton X-100, NP40 and NaCl.
  • the template switching primer includes: a template switching primer whose first three nucleotides at the 3' end are NGG or NNN, wherein the nucleotides include ribonucleotides and deoxyribonucleotides, N is base A, Any one of T, G, U or C, the third nucleotide from the 3' end has a locked nucleic acid modification; to improve the accuracy and efficiency of primer complementation, in a preferred embodiment, the length of the template switching primer is 20-35 nt; preferably, the mRNA template is derived from tissues or cells.
  • a method for constructing a transcriptome library comprises: reverse transcribing the test RNA using the above-mentioned method to obtain a cDNA double strand; constructing a fragmentation library of the cDNA double strand to obtain a transcriptome library.
  • the transcriptome library comprises a single-cell transcriptome library, and preferably, the RNA to be detected is derived from a single-cell sample.
  • the double-stranded cDNA synthesis method of the present application is applicable to the construction of any RNA library. Depending on the fragment size of the sample, it can be selected whether to fragment the cDNA, including but not limited to physical shearing or chemical enzymatic shearing methods; and depending on the type of connector used to construct the library, it can be selected whether to end-repair the cDNA fragments before connecting the cDNA sequencing connector.
  • a sequencing method comprising: sequencing the spatiotemporal transcriptome library constructed by the above-mentioned method for constructing a spatiotemporal transcriptome library, or the transcriptome library obtained by the above-mentioned method, to obtain sequencing results.
  • Example 1 Construction of spatiotemporal transcriptome using the method of this application (as shown in FIG2 ))
  • the chip, RT oligo and permeabilization reagent were from the Stereo-seq transcriptome reagent set (catalog number: 201ST114), the fragmentation and PCR reagents were from the Stereo-seq library preparation kit (catalog number: 101KL114), the RT buffer and RT enzyme were purchased from BGI (catalog number: LS-EZ-E-00027Q), the RNase inhibitor was purchased from BGI (catalog number: 1000014382), and 25 mM dNTP was purchased from Shanghai Bioengineering (catalog number: B110045-0005).
  • the tissue used for constructing the spatiotemporal transcriptome was mouse brain tissue.
  • the tissue used for constructing the spatiotemporal transcriptome was mouse brain tissue.
  • Pre-cool methanol Add enough methanol to a slide box or 50 mL centrifuge tube to ensure that the methanol is sufficient to immerse all chips (you can place a regular slide in the container to check whether the volume of methanol is sufficient). Cover the container and pre-cool the methanol at -20°C for 5-30 minutes.

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Abstract

提供了一种合成cDNA双链的方法及其应用。该方法包括：利用反转录引物和反转录混合液对mRNA模板进行反转录反应，得到cDNA双链；其中，反转录混合液包括具有模板转换功能的反转录酶、模板转换引物和dNTPs；在反转录混合液中，反转录酶的终浓度为5-20U/μL，模板转换引物的终浓度为2-12.5μM，dNTPs的终浓度为1-10mM。利用反转录混合液进行反转录反应，通过优化反转录反应体系中参与反应的dNTPs、模板转换引物及反转录酶的用量，提升了反转录反应的效率，能够实现一步反应即得到cDNA双链产物，大大缩短了反转录的反应时间，进而提升了产物cDNA双链的质量。

Description

合成cDNA双链的方法及其应用 技术领域
本发明涉及基因合成技术领域，具体而言，涉及一种合成cDNA双链的方法及其应用。
背景技术
现有技术中对于常规的cDNA双链合成主要通过如下方式：首先，用多聚T引物或者随机引物N6/N8，在反转录酶及dNTP的作用下将mRNA或者RNA反转录成cDNA一链；反转录反应时间15min～1h。然后，再加入RNaseH和DNA聚合酶(或者不加DNA聚合酶，利用体系中的反转录酶的DNA聚合酶功能)，RNaseH把DNA/RNA杂交链中的RNA切割出缺口，DNA聚合酶再以切割出的RNA链为引物合成出cDNA双链。合成的cDNA双链并不是完整的DNA，会有少量RNA序列。
现有的时空转录组构建过程中的反转录过程也需要两步反应才能合成cDNA双链；并且，合成第二链时还需要额外添加反应缓冲液和酶，使得反应效率和得到的时空转录组质量较低。现有的时空转录组的构建方法如下：mRNA的3’端多聚A结合到时空芯片上多聚T的位置进行反转录反应合成cDNA第一链；反转录酶会在cDNA第一链的3端多转录出3个C碱基，此时加入的带有3个G碱基的模板转换引物(template switch oligo，TSO)转换模板，反转录酶会继续以此引物为模板在cDNA一链的3端加上TSO序列；在合成cDNA第一链的芯片上加入双链合成试剂合成cDNA双链，包括DNA聚合酶和双链合成引物；通过碱裂解把合成的cDNA双链从芯片上解离下来，再用Tris-HCl中和碱。以接头1和TSO的序列为引物进行PCR扩增获得双链cDNA；把双链cDNA打断后加入接头2；用接头1和接头2的引物进行PCR扩增获得含有位置标签和mRNA序列的文库，可进行测序分析。
因而，如何提供一种操作简单、杂质较少的cDNA合成方法，对涉及反转录的相关技术应用发展十分重要。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种合成cDNA双链的方法及其应用，以解决现有技术中cDNA双链合成效率低、步骤多的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种合成cDNA双链的方法，该方法包括：利用反转录引物和反转录混合液对mRNA模板进行反转录反应，得到cDNA双链；其中，反转录混合液包括具有模板转换功能的反转录酶、模板转换引物和dNTPs；在反转录混合液中，反转录酶的终浓度为5-20U/μL，模板转换引物的终浓度为2-12.5μM，dNTPs的终浓度为1-10mM。
进一步地，反转录酶的终浓度为8-12U/μL，模板转换引物的终浓度为2.5-5μM，dNTPs的终浓度为4-6mM；优选地，反转录引物的终浓度为0.5-5μM；优选地，反转录混合液还包括：反转录缓冲液和RNA酶抑制剂。
进一步地，反转录反应包括：利用反转录引物和反转录酶对mRNA模板进行cDNA第一链的合成，得到与模板转换引物结合的cDNA第一链产物；利用模板转换引物和反转录酶反向对cDNA第一链产物进行cDNA第二链合成，得到cDNA双链；优选地，cDNA第一链合成和cDNA第二链合成的反应温度各自独立地为42-50℃。
进一步地，模板转换引物包括：3’端前3个核苷酸为NGG或NNN的模板转换引物，其中，核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，N为碱基A、T、G、U或C中的任意一种，3’端起的第3个核苷酸具有锁核酸修饰；优选地，模板转换引物的长度为20-35nt；优选地，mRNA模板来源于组织或细胞。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种构建时空转录组文库的方法，该方法包括：将mRNA模板与固定在时空芯片上反转录引物结合，加入反转录混合液，进行反转录反应，得到cDNA双链；将cDNA双链进行解离，得到游离的cDNA第二链；以游离的cDNA第二链作为模板进行PCR反应，得到游离的cDNA双链；将游离的cDNA双链进行片段化文库的构建，得到时空转录组文库；其中，反转录混合液中包括具有模板转换功能的反转录酶、模板转换引物和dNTPs；在反转录混合液中，反转录酶的终浓度为5-20U/μL，模板转换引物的终浓度为2-12.5μM，dNTPs的终浓度为1-10mM。
进一步地，反转录酶的终浓度为8-12U/μL，模板转换引物的终浓度为2.5-5μM，dNTPs的终浓度为4-6mM；优选地，反转录引物的终浓度为0.5-5μM；优选地，反转录混合液还包括：反转录缓冲液和RNA酶抑制剂。
进一步地，反转录反应包括：利用反转录引物和反转录酶对mRNA模板进行cDNA第一链的合成，得到与模板转换引物结合的cDNA第一链产物；利用模板转换引物和反转录酶反向对cDNA第一链产物进行cDNA第二链合成，得到cDNA双链；优选地，解离包括对cDNA双链进行碱裂解，对所得裂解液进行中和反应，裂解液中包括游离的cDNA第二链；优选地，cDNA第一链合成和cDNA第二链合成的反应温度各自独立地为42-50℃。
进一步地，模板转换引物包括：3’端前3个核苷酸为NGG或NNN的模板转换引物，其中，核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，N为碱基A、T、G、U或C中的任意一种，3’端起的第3个核苷酸具有锁核酸修饰；优选地，模板转换引物的长度为20-35nt；优选地，mRNA模板来源于组织或细胞。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括具有模板转换功能的反转录酶、模板转换引物、反转录引物和dNTPs；其中，反转录酶的工作浓度为5-20U/μL，模板转换引物的工作浓度为2-12.5μM，dNTPs的工作浓度为1-10mM；优选地，反转录酶的工作浓度为8-12U/μL，模板转换引物的工作浓度为2.5-5μM，dNTPs的工作浓度为4-6mM；优选地，反转录引物的工作浓度为0.5-5μM；优选地，试剂盒还包括：反转 录缓冲液和RNA酶抑制剂；优选地，模板转换引物包括：3’端前3个核苷酸为NGG或NNN的模板转换引物，其中，核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，N为碱基A、T、G、U或C中的任意一种，3’端起的第3个核苷酸具有锁核酸修饰；优选地，模板转换引物的长度为20-35nt；优选地，mRNA模板来源于组织或细胞。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种RT-qPCR的检测方法，该检测方法包括：利用上述的方法对待测RNA进行反转录，得到cDNA双链；以cDNA双链为模板，进行荧光PCR反应。
为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种构建转录组文库的方法，该方法包括：利用上述的方法对待测RNA进行反转录，得到cDNA双链；对cDNA双链进行片段化文库构建，得到转录组文库。
进一步地，转录组文库包括单细胞转录组文库。
为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种测序的方法，该方法包括：将上述的构建时空转录组文库的方法所构建的时空转录组文库、或上述的方法得到的转录组文库进行上机测序，得到测序结果。
为了实现上述目的，根据本发明的第七个方面，提供了一种上述的试剂盒在cDNA双链合成中的应用。
应用本发明的技术方案，在进行cDNA合成的过程中，利用本申请的反转录混合液进行反转录反应，通过优化反转录反应体系中参与反应的dNTPs、模板转换引物及反转录酶的用量，提升了反转录反应的效率，能够实现一步反应即得到cDNA双链产物，大大缩短了反转录的反应时间，提升了产物cDNA双链的质量。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了现有技术中构建时空转录组的流程示意图；
图2示出了本申请cDNA双链合成的原理示意图；
图3示出了本申请实施例1中利用本申请的技术方案合成得到的cDNA片段的2100质检图；
图4示出了本申请对比例1中利用现有技术方案得到的cDNA片段的2100质检图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：
cDNA第一链：mRNA反转录获得的第一条cDNA链，本申请中也叫cDNA第一链。
cDNA第二链：以mRNA反转录获得的第一条cDNA链为模板，进一步PCR扩增获得的链，本申请中也叫cDNA第二链。
如背景技术，现有的cDNA双链合成需要两步反应才能完成，且在合成第二链cDNA时需要在反应前向体系内添加反应缓冲液和相关酶。可以看出，现有合成cDNA的技术存在合成效率较低，且存在污染的风险，所得到的cDNA双链可能存在部分杂质。因而，本申请欲提供一种能够高效合成cDNA双链的方法。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种合成cDNA双链的方法，该方法包括：利用反转录引物和反转录混合液对mRNA模板进行反转录，得到cDNA双链；其中，反转录混合液包括具有模板转换功能的反转录酶、模板转换引物和dNTPs；在反转录混合液中，反转录酶的终浓度为5-20U/μL，模板转换引物的终浓度为2-12.5μM，dNTPs的终浓度为1-10mM。
其中，本申请的反转录酶具有反转录、模板转换、链置换及DNA依赖的DNA聚合酶活性，能够完成反转录，mRNA模板置换及以cDNA一链为模板cDNA双链合成的全过程。且由于含有该种酶的反转录混合液于所有反应前一次加入，为控制cDNA双链合成过程的各反应均达到较完全反应的程度，需要对反转录混合液中的各组分进行较为精确的用量控制。在经过各种试验筛选过程中，得到本申请具有上述成分及相关浓度的反转录混合液。能够在同一反应体系中，仅一步生成得到cDNA双链，无需在第二链cDNA合成时再额外添加任何反应成分，进而大大提高了cDNA双链的合成效率，同时在较短时间内得到的cDNA双链的质量也高，能够为其他涉及到cDNA双链合成的技术提供一定的质量保证。
为了进一步稳定cDNA反应环境，提高cDNA合成效率，在一种优选的实施例中，反转录酶的终浓度为8-12U/μL，模板转换引物的终浓度为2.5-5μM，dNTPs的终浓度为4-6mM；反转录引物的终浓度为0.5-5μM。为进一步提高酶活性及提供pH值合适的酶反应环境，在一种优选的实施例中，上述反转录混合液还包括：反转录缓冲液和RNA酶抑制剂；反转录缓冲液包括在反转录缓冲液中的终浓度为50-100mM的Tris-HCl、75-100mM的KCl、3-5mM的MgCl2和2.5-5mM的DTT。此外，为了进一步稳定cDNA合成产物的活性，在一种优选的实施例中，反转录混合液还包括：甜菜碱、海藻糖、Triton X-100、NP40和NaCl。
本申请进行cDNA双链合成仅需要一步，无需在cDNA一链合成后再向反应体系内加入额外的反应成分，在一种优选的实施例中，如图2所示，反转录反应包括：利用反转录引物和反转录酶对mRNA模板进行cDNA第一链的合成，得到与模板转换引物结合的cDNA第一链产物；利用模板转换引物和反转录酶反向对cDNA第一链产物进行cDNA第二链合成，得到cDNA双链。本申请反转录得到cDNA一链后，无需额外加入DNA聚合酶和双链合成引物 完成对cDNA双链合成模板的置换。为进一步提高cDNA合成的效率，在一种优选的实施例中，cDNA合成的反应温度为42-50℃，反应时间为2-3h。
由于本申请利用的反转录酶具有模板转换、链置换的特性，其在进行cDNA一链合成时在cDNA的3’末端额外生成能够与模板转换引物互补的末端，在一种优选的实施例中，模板转换引物包括：3’端前3个核苷酸为NGG或NNN的模板转换引物，其中，核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，N为碱基A、T、G、U或C中的任意一种，3’端起的第3个核苷酸具有锁核酸修饰；为提高引物互补准确性及效率，在一种优选的实施例中，模板转换引物的长度为20-35nt；优选地，mRNA模板来源于组织或细胞。
其中，锁核酸(LNA)是一种经过修饰的RNA，是一种含有桥接双环糖基(bridged,bicyclic sugar moiety)的合成核酸类似物。在2'-O-和4'-C位之间添加的亚甲基基团将呋喃核糖环“锁定”为3'-内构象(3’-endo conformation)。由于这种双环糖骨架的限制，LNA只会形成A型双链体。此外，LNA完全遵守Watson-Crick的碱基配对原则。因此LNA：DNA杂交双链体可以由序列互补的DNA和LNA自发形成，并且研究发现，LNA：DNA杂交体与其对应的DNA：DNA相比，其退火温度会大幅度升高。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种构建时空转录组文库的方法，该方法包括：将mRNA模板与固定在时空芯片上反转录引物结合，加入反转录混合液，进行反转录反应，得到cDNA双链；将cDNA双链进行解离，得到游离的cDNA第二链；以游离的cDNA第二链作为模板进行PCR反应，得到游离的cDNA双链；将游离的cDNA双链进行片段化cDNA文库的构建，得到时空转录组文库；其中，反转录混合液中包括具有模板转换功能的反转录酶、模板转换引物和dNTPs；在反转录混合液中，反转录酶的终浓度为5-20U/μL，模板转换引物的终浓度为2-12.5μM，dNTPs的终浓度为1-10mM。
时空转录组是一种研究生物体在不同时间点和空间位置上基因表达的技术，其中反转录进行cDNA双链合成进行建库的过程关系着后续进行时空转录组分析的准确性，利用本申请的构建时空转录组的方法，能够高效地得到质量更高的转录组样本。
其中，本申请的反转录酶具有反转录、模板转换、链置换及DNA依赖的DNA聚合酶活性，能够完成反转录，mRNA模板置换及以cDNA一链为模板cDNA双链合成的全过程。且由于含有该种酶的反转录混合液于所有反应前一次加入，为控制cDNA双链合成过程的各反应均达到较完全反应的程度，需要对反转录混合液中的各组分进行较为精确的用量控制。在经过各种试验筛选过程中，得到本申请具有上述成分及相关浓度的反转录混合液。能够在同一反应体系中，仅一步生成得到cDNA双链，无需在第二链cDNA合成时再额外添加任何反应成分，进而大大提高了cDNA双链的合成效率，同时在较短时间内得到的cDNA双链的质量也高，能够为时空转录组分析提供一定的质量保证。
为了进一步的稳定cDNA反应环境，提高cDNA合成效率，在一种优选的实施例中，反转录酶的终浓度为8-12U/μL，模板转换引物的终浓度为2.5-5μM，dNTPs的终浓度为4-6mM；反转录引物的终浓度为0.5-5μM。为提高酶活性及提供pH值合适的酶反应环境，在一种优选 的实施例中，反转录混合液还包括：反转录缓冲液和RNA酶抑制剂；反转录缓冲液包括在反转录缓冲液中的终浓度为50-100mM的Tris-HCl、75-100mM的KCl、3-5mM的MgCl2和2.5-5mM的DTT。此外，为了稳定cDNA合成产物的活性，在一种优选的实施例中，反转录混合液还包括：甜菜碱、海藻糖、Triton X-100、NP40和NaCl。
本申请进行时空转录组构建的过程中cDNA双链合成仅需要一步，无需在cDNA一链合成后再向反应体系内加入额外的反应成分，在一种优选的实施例中，反转录反应包括：利用反转录引物和反转录酶对mRNA模板进行cDNA第一链的合成，得到与模板转换引物结合的cDNA第一链产物；利用模板转换引物和反转录酶反向对cDNA第一链产物进行cDNA第二链合成，得到cDNA双链。本申请反转录得到cDNA一链后，无需额外加入DNA聚合酶和双链合成引物完成对cDNA双链合成模板的置换。为进一步提高cDNA合成的效率，在一种优选的实施例中，cDNA合成的反应温度为42-50℃，反应时间为2-3h。
本申请时空转录组构建过程中，cDNA双链在芯片上完成合成，需将cDNA第二链从芯片上解离进行进一步的建库操作，在一种优选的实施例中，解离包括对cDNA双链进行碱裂解，对所得裂解液进行中和反应，裂解液中包括游离的cDNA第二链。在一种优选的实施例中，进行碱裂解的包括终浓度为0.08M-0.4M的氢氧化钾，进行中和的包括Tris-HCl。
由于本申请利用的反转录酶具有模板转换、链置换的特性，其在进行cDNA一链合成时在cDNA的3’末端额外生成能够与模板转换引物互补的末端，在一种优选的实施例中，模板转换引物包括：3’端前3个核苷酸为NGG或NNN的模板转换引物，其中，核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，N为碱基A、T、G、U或C中的任意一种，3’端起的第3个核苷酸具有锁核酸修饰；为提高引物互补准确性及效率，在一种优选的实施例中，模板转换引物的长度为20-35nt；优选地，mRNA模板来源于组织或细胞。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种试剂盒，试剂盒包括具有模板转换功能的反转录酶、模板转换引物、反转录引物和dNTPs；反转录酶的工作浓度为5-20U/μL，模板转换引物的工作浓度为2-12.5μM，dNTPs的工作浓度为1-10mM；在一种优选的实施例中，反转录酶的工作浓度为8-12U/μL，模板转换引物的工作浓度为2.5-5μM，dNTPs的工作浓度为4-6mM；本试剂盒中的反转录酶具有反转录、模板转换、链置换及DNA依赖的DNA聚合酶活性，能够完成反转录，mRNA模板置换及以cDNA一链为模板cDNA双链合成的全过程。且具有上述成分及相关浓度的反转录混合液，能够在同一反应体系中，仅一步生成得到cDNA双链，无需在第双链cDNA合成时再额外添加任何反应成分，进而大大提高了cDNA双链的合成效率，更为便利的得到质量较高的cDNA双链产物。
为了进一步的稳定cDNA反应环境，提高cDNA合成效率，在一种优选的实施例中，试剂盒还包括：反转录缓冲液和RNA酶抑制剂；优选地，反转录引物的工作浓度为0.5-5μM；优选地，反转录缓冲液包括在反转录缓冲液中的终浓度为50-100mM的Tris-HCl、75-100mM的KCl、3-5mM的MgCl2和2.5-5mM的DTT；优选地，试剂盒还包括：甜菜碱、海藻糖、Triton X-100、NP40和NaCl。在一种优选的实施例中，模板转换引物包括：3’端前3个核苷酸为NGG或NNN的模板转换引物，其中，核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，N为碱基A、 T、G、U或C中的任意一种，3’端起的第3个核苷酸具有锁核酸修饰；为提高引物互补准确性及效率，在一种优选的实施例中，模板转换引物的长度为20-35nt；优选地，mRNA模板来源于组织或细胞。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种RT-qPCR的检测方法，检测方法包括：利用上述的方法对待测RNA进行反转录，得到cDNA双链；以cDNA双链为模板，进行荧光PCR反应。
在本申请第五种典型的实施方式中，提供了一种构建转录组文库的方法，该方法包括：利用上述的方法对待测RNA进行反转录，得到cDNA双链；对cDNA双链进行片段化文库构建，得到转录组文库。
在一种优选的实施例中，转录组文库包括单细胞转录组文库，优选地，待测RNA来源于单细胞样品。
本申请的cDNA双链的合成方法适用于任何样本为RNA的文库的构建，可根据样本的片段大小选择是否对cDNA进行片段化处理，包括但不仅限于物理打断法或化学酶法打断法；根据构建文库的接头类型选择是否在cDNA进行测序接头连接前对cDNA片段进行末端修复。
在本申请第六种典型的实施方式中，提供了一种测序的方法，方法包括：将上述的构建时空转录组文库的方法所构建的时空转录组文库、或上述的方法得到的转录组文库进行上机测序，得到测序结果。
在本申请第七种典型的实施方式中，提供了一种上述试剂盒在cDNA双链合成中的应用。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例1(利用本申请(如图2所示)的方法进行时空转录组的构建)
以下流程中芯片，RT oligo和透化试剂来自于Stereo-seq转录组试剂套装(货号：201ST114)，打断及PCR试剂来自于Stereo-seq建库试剂盒(货号：101KL114)，RT buffer和RT酶购自于BGI(货号：LS-EZ-E-00027Q)，RNA酶抑制剂购自于BGI(货号：1000014382)，25mM dNTP购自于上海生工(货号：B110045-0005)。
进行时空转录组的构建的组织为小鼠脑组织。
1.组织贴片及固定
1.1从真空干燥铝箔袋中取出Stereo-seq芯片T载体，记录芯片背面的编号；
注意不要触碰芯片正面。室温放置复温1分钟。
1.2提前将PCR仪温度调节到37℃，热盖温度为42℃，放置PCR适配器平衡温度。
1.3预冷甲醇：在玻片盒或50mL离心管中加入足量甲醇，确保甲醇足够浸没过所有芯片(可将一张普通载玻片放入容器中，查看甲醇的体积是否足够)。盖上盖，-20℃将甲醇预冷5-30分钟。
1.4冷冻切片机上切取10微米的组织片并展平，将芯片正面对准组织进行贴片。
1.5快速将贴片的载体置于PCR适配器上37℃孵育5分钟烤干。
1.6将上一步烤干的芯片立即放于-20℃下预冷的甲醇中固定30分钟，确保甲醇浸没过所有芯片；
1.7固定好后，将玻片盒或50mL离心管转移到通风橱中；
1.8将载体从玻片盒或50mL离心管中取出，用无尘纸吸干载玻片背面和周围多余的甲醇，确保芯片间缝隙无液体残留；
1.9将载体竖立放在载玻片染色架上，在通风柜中通风4-6分钟，让甲醇充分挥发；
1.10甲醇挥发干后，肉眼可见组织变白，将载体转移至实验桌上。将垫圈与夹具组合成载具，把芯片固定到载具上形成手持载具。
2.组织透化
2.1提前配制2mL 0.01N HCl，准备好1×透化试剂工作液；用1mL新鲜配制的0.01NHCl将PR Enzyme(红盖，粉末状)溶解后，移液器吹打混匀，再用0.01N HCl将10×透化试剂储存液10μL稀释到100μL，标记为1×透化试剂工作液。
2.2提前将2个PCR仪(或1个PCR仪、1个金属浴)温度设置到37℃，热盖温度为42℃，其中一个PCR仪提前放置PCR适配器平衡温度。
2.3将手持载具放置于PCR适配器上，盖上PCR仪盖子，37℃复温3min，同时将1×透化试剂工作液置于PCR仪或者金属浴内，37℃复温3min；
2.4复温结束后，芯片一角加入1×透化试剂工作液，用量为100μL/芯片，用封板膜对手持载具进行封口，盖上PCR仪盖；
2.5 37℃下进行透化反应11分钟。
3.反转录(本申请的反转录过程)
3.1提前解冻RT buffer，25mM dNTP，RT oligo溶解后冰上放置；
3.2在等待透化期间，参考表1配制RT反应混合液，放置于冰上；
表1 RT反应混合液

3.3透化期间将另一PCR仪反应温度调节至42℃，热盖温度为47℃，放置另一个PCR适配器平衡温度；
3.4将透化完成的手持载具从PCR仪中取出；
3.5微微倾斜手持载具，倾斜角度小于20°，用移液器从芯片的一角吸掉透化试剂；
注意：撕开封板膜时不能按压夹具卡扣两侧上部，避免载体松落。
3.6加入PR Rinse Buffer溶液100μL；
3.7微微倾斜手持载具，倾斜角度小于20°，用移液器在芯片一角吸弃PR Rinse Buffer溶液，保持芯片湿润；
注意：避免芯片完全干燥。
3.8取出配制好的RT反应混合液吹打混匀后瞬时离心，在芯片一角加入RT反应混合液，确保RT反应混合液均匀覆盖全芯片；其中，芯片上负载有反转录引物由如SEQ ID NO:1所示的TTGTCTTCCTAAGACNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV组成，其中N为ATCG中的任意一种，V为T之外的其他三种核苷酸。
3.9使用封板膜将手持载具封口，放置于45℃PCR仪的PCR适配器上，盖上PCR仪盖子，反应2小时。
4.二链洗脱
4.1提前将一个PCR仪反应温度调节至70℃，热盖温度为75℃，放置一个PCR适配器平衡温度。
4.2用无酶水将8M KOH稀释至0.1M，涡旋混合均匀，瞬时离心，待用；
4.3反转录反应结束后，PCR仪中取出手持载具，微微倾斜手持载具，倾斜角度小于20°，用移液器在芯片一角吸弃反转录反应溶液；
4.4向芯片上加入100μL 0.1M KOH，确保KOH均匀覆盖全芯片；
4.5使用封板膜将手持载具封口，放置于70℃PCR仪的PCR适配器上，盖上PCR仪盖子，反应20分钟；
4.6将反应结束的手持载具从PCR仪中取出，微微倾斜手持载具，倾斜角度小于20°，用移液器从芯片一角吸出KOH溶液，转移至一个1.5mL管子中，再加入4μL 1M Tris-HCl(pH6.8)，移液器吹打混合均匀，分装到两个PCR管分别进行PCR反应。
5.PCR及纯化
5.1按照表2配制PCR Mix体系；
表2 PCR Mix
5.2震荡混匀，瞬时离心后置于PCR仪中，参照如下表3中的反应程序进行扩增。
表3 PCR扩增程序
5.3将上述PCR产物和室温平衡好的磁珠按照1：0.6混合(120μL PCR产物、72μL磁珠)，震荡混匀后室温孵育10min；
5.4将离心管瞬时离心后置于磁力架上，静置3-5min，至液体澄清后用移液器小心吸取上清并弃掉；
5.5将离心管保持在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，通过旋转磁力架上的离心管来漂洗磁珠。静置30s，小心吸取并丢弃上清；
5.6重复一次步骤5.5；
5.7尽量吸干管内液体。若有少量液体残留在管壁，可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干；
5.8室温下静置3-5min风干磁珠，直至磁珠表面无反光、无开裂；
5.9加100μL的TE buffer进行回溶，震荡混匀后室温静置5min，瞬时离心后置于磁力架上静置3min，待液体澄清后将上清转移到1.5mL离心管内。
5.10取1μL纯化的cDNA产物进行qubit定量后，用2100检测片段分布(如图3所示)，cDNA片段主带约1.2kb，与现有流程cDNA片段分布一致。
6.cDNA打断
6.1提前将一个PCR仪反应温度调节至55℃，热盖温度为60℃。
6.2将5.9的纯化后的cDNA混匀后取20ng至一新的PCR管中，补水至15μL。
6.3取9μL TE buffer加入1μL TME稀释10倍，涡旋混合均匀，瞬时离心，待用。
6.4配制表格4的TME打断混合液，涡旋混合均匀，瞬时离心：
表4 TME打断混合液
6.5涡旋混合均匀TME打断混合液，瞬时离心后放置于55℃PCR仪上，盖上PCR仪盖子，反应10分钟。
6.6反应结束后，取出PCR管，加入5μL的stop buffer，涡旋混匀后室温放置5min。
7.PCR及纯化
7.1按照表格5配制PCR Mix体系；
表5 PCR Mix

7.2震荡混匀，瞬时离心后置于PCR仪中，参照如下表6反应程序进行扩增。
表6 PCR扩增程序
7.3将上述PCR产物和室温平衡好的磁珠按照1：0.55混合(100μL PCR产物、55μL磁珠)，震荡混匀后室温孵育5min；
7.4将离心管瞬时离心后置于磁力架上，静置3-5min，至液体澄清后用移液器小心吸取上清转移到一新的离心管中；
7.5在上清中加入15μL磁珠，震荡混匀后室温孵育5min；
7.6将离心管瞬时离心后置于磁力架上，静置3-5min，至液体澄清后用移液器小心吸取上清并弃掉；
7.7将离心管保持在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，通过旋转磁力架上的离心管来漂洗磁珠。静置30s，小心吸取并丢弃上清；
7.8重复一次步骤7.7；
7.9尽量吸干管内液体。若有少量液体残留在管壁，可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干；
7.10室温下静置1-2min风干磁珠，直至磁珠表面无反光、无开裂；
7.11加20μL的TE buffer进行回溶，震荡混匀后室温静置5min，瞬时离心后置于磁力架上静置3min，待液体澄清后将上清转移到1.5mL离心管内。
7.12取1μL纯化的产物进行qubit定量后，用于高通量测序。
对比例1(分别利用现有技术(如图1所示)的方法进行时空转录组的构建)
以下流程中芯片，RT oligo和透化试剂等来自于Stereo-seq转录组试剂套装(货号：201ST114)，打断及PCR试剂来自于Stereo-seq建库试剂盒(货号：101KL114)，RT buffer和RT酶购自于BGI(货号：LS-EZ-E-00027Q)，RNA酶抑制剂购自于BGI(货号：1000014382)，25mM dNTP购自于上海生工(货号：B110045-0005)。
进行时空转录组的构建的组织为小鼠脑组织。
1.组织贴片及固定
1.1从真空干燥铝箔袋中取出Stereo-seq芯片T载体，记录芯片背面的编号；
注意不要触碰芯片正面。室温放置复温1分钟。
1.2提前将PCR仪温度调节到37℃，热盖温度为42℃，放置PCR适配器平衡温度。
1.3预冷甲醇：在玻片盒或50mL离心管中加入足量甲醇，确保甲醇足够浸没过所有芯片(可将一张普通载玻片放入容器中，查看甲醇的体积是否足够)。盖上盖，-20℃将甲醇预冷5-30分钟。
1.4冷冻切片机上切取10微米的组织片并展平，将芯片正面对准组织进行贴片。
1.5快速将贴片的载体置于PCR适配器上37℃孵育5分钟烤干。
1.6将上一步烤干的芯片立即放于-20℃下预冷的甲醇中固定30分钟，确保甲醇浸没过所有芯片；
1.7固定好后，将玻片盒或50mL离心管转移到通风橱中；
1.8将载体从玻片盒或50mL离心管中取出，用无尘纸吸干载玻片背面和周围多余的甲醇，确保芯片间缝隙无液体残留；
1.9将载体竖立放在载玻片染色架上，在通风柜中通风4-6分钟，让甲醇充分挥发；
1.10甲醇挥发干后，肉眼可见组织变白，将载体转移至实验桌上。将垫圈与夹具组合成载具，把芯片固定到载具上形成手持载具。
2.组织透化
2.1提前配制2mL 0.01N HCl，准备好1×透化试剂工作液；用1mL新鲜配制的0.01NHCl将PR Enzyme(红盖，粉末状)溶解后，移液器吹打混匀，再用0.01N HCl将10×透化试剂储存液10μL稀释到100μL，标记为1×透化试剂工作液。
2.2提前将2个PCR仪(或1个PCR仪、1个金属浴)温度设置到37℃，热盖温度为42℃，其中一个PCR仪提前放置PCR适配器平衡温度。
2.3将手持载具放置于PCR适配器上，盖上PCR仪盖子，37℃复温3min，同时将1×透化试剂工作液置于PCR仪或者金属浴内，37℃复温3min；
2.4复温结束后，芯片一角加入1×透化试剂工作液，用量为100μL/芯片，用封板膜对手持载具进行封口，盖上PCR仪盖；
2.5 37℃下进行透化反应11分钟。
3.反转录(现有时空转录组技术中的反转录过程，其中的试剂均来自于Stereo-seq转录组试剂套装(货号：201ST114))。
3.1按华大Stereo-seq转录组试剂套装(货号：201ST114)准备好RT reagent，RT Additive和RT oligo，溶解后冰上放置；
3.2在等待透化期间，参考表7配制RT反应混合液，放置于冰上；
表7现有技术中的RT反应混合液(RT Mix)
3.3透化期间将另一PCR仪反应温度调节至42℃，热盖温度为47℃，放置另一个PCR适配器平衡温度；
3.4将透化完成的手持载具从PCR仪中取出；
3.5微微倾斜手持载具，倾斜角度小于20°，用移液器从芯片的一角吸掉透化试剂；
注意：撕开封板膜时不能按压夹具卡扣两侧上部，避免载体松落。
3.6加入PR Rinse Buffer溶液100μL；
3.7微微倾斜手持载具，倾斜角度小于20°，用移液器在芯片一角吸弃PR Rinse Buffer溶液，保持芯片湿润；
注意：避免芯片完全干燥。
3.8取出配制好的RT Mix吹打混匀后瞬时离心，在芯片一角加入RT Mix，确保RT Mix均匀覆盖全芯片；其中，芯片上负载有反转录引物与实施例1相同。
3.9使用封板膜将手持载具封口，放置于42℃PCR仪的PCR适配器上，盖上PCR仪盖子，反应3小时。
4.组织去除
4.1准备试剂；
表8：
注意：如果观察到buffer中有白色沉淀析出，可放于55℃溶解，再恢复至室温。
4.2提前将另一个PCR仪反应温度调节至55℃，PCR仪热盖温度为60℃，放置PCR适配器平衡温度；
表9：
4.3将手持载具从PCR仪(42℃)中取出；
4.4微微倾斜手持载具，用移液器吸弃芯片表面的RT Mix；
4.5加入TR Buffer(用量为400μL/孔)，然后放置于PCR仪(55℃)的PCR适配器上反应10min；注意：此步反应时可提前配制cDNA Release Mix。
4.6微微倾斜手持载具，用移液器吸弃TR Buffer。注意：如组织移除不干净，加入400μL0.1×SSC，用移液器轻轻吸打，除去芯片上组织，然后微微倾斜手持载具，用移液器吸弃0.1×SSC试剂。
5.cDNA释放与回收
5.1按照表10配制cDNA Release Mix，室温放置；
5.2加入cDNA Release Mix(用量为400μL/孔)；
5.3用封板膜对手持载具进行封口，防止挥发，放置于PCR仪(55℃)的PCR适配器上反应3h或以上(如表10)，最长不超过18h，将cDNA一链进行洗脱；
表10 cDNA Release Mix
表11：
5.4反应结束后，将反应孔内液体完全回收到新的1.5mL离心管内；
5.5加入Nuclease Free Water清洗反应孔芯片(用量为100μL/孔)，并收集到同一个1.5mL离心管内。
6.cDNA纯化与扩增
6.1 cDNA纯化；
a.cDNA回收液如果观察到有白色沉淀析出，可放于55℃溶解，恢复至室温后进行纯化，提前30min取出磁珠，37℃平衡(此步骤的平衡温度仅适用于VAHTSTM DNA Clean Beads)；
b.1.0×磁珠cDNA纯化步骤：
1)将上一步回收液(450-490μL)与室温平衡好的磁珠按照1：1混合，震荡混匀，室温孵育10min；
2)瞬时离心后，将离心管放在磁力架上静置3min；
3)待液体澄清后，用移液器小心去除上清；(如果管盖上有泡沫，吸弃泡沫)；
4)将离心管保持在磁力架上，加入1mL 80％乙醇(使用新鲜配制并平衡至室温的80％乙醇)，旋转磁力架上的离心管，待磁珠全部吸附到靠磁力架一侧的管壁，再次旋离心管，让磁珠重新吸附到另一侧来漂洗磁珠。静置30s，小心吸取并丢弃上清。移液器吸头应在远离磁力架的管壁上操作，请勿吸打、搅动磁珠；(如果管盖上有泡沫，建议用80％乙醇清洗干净)。
5)重复一次步骤4；
6)将离心管保持在磁力架上，室温风干5-8min，直至磁珠表面无反光、无开裂；
7)先加22μL Nuclease Free Water回溶，震荡混匀后室温静置5min，瞬时离心，磁力架静置3-5min，直至液体变澄清；
8)将上清(～21μL cDNA)转移到新的0.2mL PCR管中；
9)再将22μL Nuclease Free Water加入步骤7磁珠中二次回溶，震荡混匀后室温静置5min，瞬时离心，磁力架静置3-5min，直至液体变澄清；
10)将上清(～21μL cDNA)转移至步骤9所示的PCR管中，合并总体积42μL；如果上述回收样品不足42μL，用Nuclease Free Water补足。
6.2 cDNA扩增；
a.按照表12配制PCR Mix，共100μL；(试剂均来自于Stereo-seq转录组试剂套装(BGI，货号：201ST114))。
表12 PCR Mix
b.瞬时离心，按照表13的PCR程序进行扩增：
表13 PCR扩增程序(反应体系100μL)
c.取1μL PCR产物进行qubit定量，并记录浓度；
d.对PCR产物进行1.0×磁珠纯化；
1)将PCR产物(100μL)与室温平衡好的磁珠按照1：1混合，震荡混匀，室温孵育10min；
2)瞬时离心后，将PCR管放在磁力架上静置3min，待液体澄清后去除上清；
3)将离心管保持在磁力架上，加入200μL 80％乙醇漂洗(新鲜配制并平衡至室温的80％乙醇)。通过旋转磁力架上的离心管来漂洗磁珠。静置30s，小心吸取并丢弃上清。移液器吸头应在远离磁力架的管壁上操作，请勿吸打、搅动磁珠；
4)重复一次步骤3；
5)将离心管保持在磁力架上，打开盖子，室温风干5-8min，直至磁珠表面无反光、无开裂；
6)加42μL的TE回溶，震荡混匀后室温静置5min，瞬时离心，磁力架静置3-5min，待液体澄清后将上清(～40μL)转移到新的1.5mL离心管中。(此步骤可停止，样本-20℃保存)；
7)取1μL纯化的cDNA产物进行qubit定量后，用2100检测片段分布，如图4所示。
7.cDNA打断
7.1提前将一个PCR仪反应温度调节至55℃，热盖温度为60℃。
7.2将5.9的纯化后的cDNA混匀后取20ng至一新的PCR管中，补水至15μL。
7.3取9μL TE buffer加入1μL TME稀释10倍，涡旋混合均匀，瞬时离心，待用。
7.4配制表格14的TME打断混合液，涡旋混合均匀，瞬时离心：
表14 TME打断混合液
7.5涡旋混合均匀TME打断混合液，瞬时离心后放置于55℃PCR仪上，盖上PCR仪盖子，反应10分钟。
7.6反应结束后，取出PCR管，加入5μL的stop buffer，涡旋混匀后室温放置5min。
8.PCR及纯化
8.1按照表格15配制PCR Mix体系；
表15 PCR Mix
8.2震荡混匀，瞬时离心后置于PCR仪中，参照如下表16反应程序进行扩增。
表16 PCR扩增程序
8.3将上述PCR产物和室温平衡好的磁珠按照1：0.55混合(100μL PCR产物、55μL磁珠)，震荡混匀后室温孵育5min；
8.4将离心管瞬时离心后置于磁力架上，静置3-5min，至液体澄清后用移液器小心吸取上清转移到一新的离心管中；
8.5在上清中加入15μL磁珠，震荡混匀后室温孵育5min；
8.6将离心管瞬时离心后置于磁力架上，静置3-5min，至液体澄清后用移液器小心吸取上清并弃掉；
8.7将离心管保持在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，通过旋转磁力架上的离心管来漂洗磁珠。静置30s，小心吸取并丢弃上清；
8.8重复一次步骤8.7；
8.9尽量吸干管内液体。若有少量液体残留在管壁，可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干；
8.10室温下静置1-2min风干磁珠，直至磁珠表面无反光、无开裂；
8.11加20μL的TE buffer进行回溶，震荡混匀后室温静置5min，瞬时离心后置于磁力架上静置3min，待液体澄清后将上清转移到1.5mL离心管内。
8.12取1μL纯化的产物进行qubit定量后，用于高通量测序。
实施例2-6及对比例2-5除“3.反转录”中的dNTPs、模板转换引物、反转录酶的取值不同外，其他步骤均与实施例1相同(具体见表18)。
实验检测：
对实施例1-7和对比例1-5构建的时空转录组的单个细胞的基因检出数进行检测，具体结果见表17和18。其中，Bin200 Median MID(K)、Bin20 Median Gene和Bin200 Median Gene(K)分别代表不同bin下的MID和基因中位数，基因数越高，说明实验过程中捕获到的基因越多，也就是文库质量越好。这三者存在正相关性。
表17本申请实施例1与对比例1中的时空转录组流程的效果对比
表18本申请实施例2-7与对比例2-5中的时空转录组流程的效果对比

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：在进行cDNA合成的过程中，利用本申请的反转录混合液进行反转录反应，通过优化反转录反应体系中参与反应的dNTPs、模板转换引物及反转录酶的用量，提升了反转录反应的效率，能够实现一步反应即得到cDNA双链产物，大大缩短了反转录的反应时间，提升了产物cDNA的质量。并在需要进行cDNA双链合成的时空转录组、常规RNA转录组、单细胞转录组等技术中提升建库质量，提高时空转录组的单个细胞的基因检出数，进而得到更为准确的测序结果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

  1. 一种合成cDNA双链的方法，其特征在于，所述方法包括：
    利用反转录引物和反转录混合液对mRNA模板进行反转录反应，得到所述cDNA双链；
    其中，所述反转录混合液包括具有模板转换功能的反转录酶、模板转换引物和dNTPs；
    在所述反转录混合液中，所述反转录酶的终浓度为5-20U/μL，所述模板转换引物的终浓度为2-12.5μM，所述dNTPs的终浓度为1-10mM。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反转录酶的终浓度为8-12U/μL，所述模板转换引物的终浓度为2.5-5μM，所述dNTPs的终浓度为4-6mM；
    优选地，所述反转录引物的终浓度为0.5-5μM；
    优选地，所述反转录混合液还包括：反转录缓冲液和RNA酶抑制剂。
  3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述反转录反应包括：
    利用所述反转录引物和所述反转录酶对所述mRNA模板进行cDNA第一链的合成，得到与所述模板转换引物结合的cDNA第一链产物；
    利用所述模板转换引物和所述反转录酶反向对所述cDNA第一链产物进行cDNA第二链合成，得到所述cDNA双链；
    优选地，所述cDNA第一链合成和所述cDNA第二链合成的反应温度各自独立地为42-50℃。
  4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述模板转换引物包括：3’端前3个核苷酸为NGG或NNN的模板转换引物，其中，所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，所述N为碱基A、T、G、U或C中的任意一种，所述3’端起的第3个核苷酸具有锁核酸修饰；
    优选地，所述模板转换引物的长度为20-35nt；
    优选地，mRNA模板来源于组织或细胞。
  5. 一种构建时空转录组文库的方法，其特征在于，所述方法包括：
    将mRNA模板与固定在时空芯片上反转录引物结合，加入反转录混合液，进行反转录反应，得到cDNA双链；
    将所述cDNA双链进行解离，得到游离的cDNA第二链；
    以所述游离的cDNA第二链作为模板进行PCR反应，得到游离的cDNA双链；
    将所述游离的cDNA双链进行片段化文库的构建，得到所述时空转录组文库；
    其中，所述反转录混合液中包括具有模板转换功能的反转录酶、模板转换引物和dNTPs；
    在所述反转录混合液中，所述反转录酶的终浓度为5-20U/μL，所述模板转换引物的终浓度为2-12.5μM，所述dNTPs的终浓度为1-10mM。
  6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反转录酶的终浓度为8-12U/μL，所述模板转换引物的终浓度为2.5-5μM，所述dNTPs的终浓度为4-6mM；
    优选地，所述反转录引物的终浓度为0.5-5μM；
    优选地，所述反转录混合液还包括：反转录缓冲液和RNA酶抑制剂。
  7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述反转录反应包括：
    所述反转录引物与所述mRNA模板结合，进行cDNA第一链的反转录反应，得到与所述模板转换引物结合的cDNA第一链产物；
    所述模板转换引物和所述反转录酶反向对所述cDNA第一链产物进行cDNA第二链合成，得到所述cDNA双链；
    优选地，所述解离包括对所述cDNA双链进行碱裂解，对所得裂解液进行中和反应，所述裂解液中包括游离的cDNA第二链；
    优选地，所述cDNA第一链合成和所述cDNA第二链合成的反应温度各自独立地为42-50℃。
  8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述模板转换引物包括：3’端前3个核苷酸为NGG或NNN的模板转换引物，其中，所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，所述N为碱基A、T、U、G或C中的任意一种，所述3’端起的第3个核苷酸具有锁核酸修饰；
    优选地，所述模板转换引物的长度为20-35nt；
    优选地，mRNA模板来源于组织或细胞。
  9. 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括具有模板转换功能的反转录酶、模板转换引物、反转录引物和dNTPs；
    其中，所述反转录酶的工作浓度为5-20U/μL，所述模板转换引物的工作浓度为2-12.5μM，所述dNTPs的工作浓度为1-10mM；
    优选地，所述反转录酶的工作浓度为8-12U/μL，所述模板转换引物的工作浓度为2.5-5μM，所述dNTPs的工作浓度为4-6mM；
    优选地，所述反转录引物的工作浓度为0.5-5μM；
    优选地，所述试剂盒还包括：反转录缓冲液和RNA酶抑制剂；
    优选地，所述模板转换引物包括：3’端前3个核苷酸为NGG或NNN的模板转换引物，其中，所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，所述N为碱基A、T、G、U或C中的任意一种，所述3’端起第3个核苷酸具有锁核酸修饰；
    优选地，所述模板转换引物的长度为20-35nt；
    优选地，mRNA模板来源于组织或细胞。
  10. 一种RT-qPCR的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
    利用权利要求1至4中任一项所述的方法对待测RNA进行反转录，得到cDNA双链；
    以所述cDNA双链为模板，进行荧光PCR反应。
  11. 一种构建转录组文库的方法，其特征在于，所述方法包括：
    利用权利要求1至4中任一项所述的方法对待测RNA进行反转录，得到cDNA双链；
    对所述cDNA双链进行片段化文库构建，得到所述转录组文库。
  12. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述转录组文库包括单细胞转录组文库。
  13. 一种测序的方法，其特征在于，所述方法包括：
    将权利要求5-8中任一项所述的构建时空转录组文库的方法所构建的时空转录组文库、或权利要求11或12所述的方法得到的转录组文库进行上机测序，得到测序结果。
  14. 权利要求9所述的试剂盒在cDNA双链合成中的应用。
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