WO2024225151A1 - 豆類由来組成物及びその製造方法並びにニワトリの砂肝由来組成物及びその製造方法 - Google Patents

豆類由来組成物及びその製造方法並びにニワトリの砂肝由来組成物及びその製造方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a composition derived from beans and a method for producing the same.
  • the present invention also relates to a composition derived from chicken gizzard and a method for producing the same.
  • innate immunity which recognizes and immediately eliminates foreign substances such as pathogens that have invaded the body
  • adaptive immunity in which lymphocytes such as T cells and B cells recognize information about the invading foreign substance and eliminate the specific foreign substance based on that information.
  • Innate immunity is a biological reaction in which cells of the innate immune system quickly recognize pathogens that have invaded the body and eliminate them. For this reason, innate immunity can be said to be a mechanism that is at the forefront of the body's defenses.
  • Immune cells such as macrophages are part of the innate immune system. Macrophages phagocytose and process pathogens such as bacteria.
  • Adaptive immunity is able to specifically identify and memorize pathogens that have invaded the body, allowing it to effectively eliminate the pathogen when it encounters the same pathogen, but it takes longer to respond than innate immunity.
  • Immunity activation is effective, for example, in strengthening or supporting immune defense against pathogens or viruses, and in preventing infectious diseases caused by pathogens or viruses. For this reason, ingredients that have immune activation effects and can be ingested on a daily basis are useful.
  • intestinal barrier function intestinal barrier function
  • the lamina limbal growth factor receptor (IL-12) is home to a large number of immune system cells, such as macrophages, dendritic cells, T cells, and B cells.
  • immune system cells such as macrophages, dendritic cells, T cells, and B cells.
  • transport proteins membrane transporters
  • These membrane transporters and tight junction structures are responsible for the intestinal barrier function that prevents the invasion of harmful substances and pathogens.
  • the intestinal barrier is damaged by aging, poor lifestyle, stress, etc.
  • enterobacteria present in the intestine and enterobacteria-derived components migrate into the body through intercellular spaces and stimulate immune cells to promote the release of inflammatory cytokines, inducing inflammation.
  • various pathologies caused by chronic inflammation are induced, such as inflammatory bowel disease in the intestine, nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) in the liver, symptoms caused by arteriosclerosis in blood vessels, and diabetes, lipid metabolism disorders, and autoimmune diseases in the systemic system.
  • NAFLD nonalcoholic fatty liver disease
  • disruptions to intestinal permeability due to environmental factors may promote the onset of food allergies.
  • Pyroglutamylleucine (pyroGlu-Leu) is a dipeptide containing pyroglutamic acid, which is a cyclized form of glutamic acid.
  • Non-Patent Document 1 describes that pyroglutamylleucine inhibited the induction of inducible nitric oxide synthase by inflammatory cytokines in rat hepatocytes.
  • beans such as soybeans have long been considered an important food source, being rich in nutrients such as protein.
  • Chicken gizzards are also attracting attention as a high-protein, low-fat, low-carbohydrate food.
  • the above-mentioned protein-rich foods are also useful as ingredients for health foods and the like that contain proteins and amino acids.
  • the present invention aims to provide a legume-derived composition that exhibits excellent effects in activating the immune system and improving intestinal barrier function.
  • the present invention also aims to provide a chicken gizzard-derived composition that exhibits excellent effects in activating the immune system and improving intestinal barrier function.
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above problems, and have found that a bean-derived composition containing a specific amount of pyroglutamyl-leucine or a salt thereof can be produced using beans as a raw material, and that the composition has the effect of activating the immune system and improving intestinal barrier function.
  • the present inventors have also found that a chicken gizzard-derived composition containing pyroglutamyl-leucine or a salt thereof can be produced using chicken gizzard as a raw material, and that the composition has the effect of activating the immune system and improving intestinal barrier function.
  • the present invention relates to the following legume-derived composition, chicken gizzard-derived composition, etc.
  • a legume-derived composition comprising pyroglutamylleucine or a salt thereof, the content of pyroglutamylleucine or a salt thereof per solid content being 0.1 to 100 ⁇ g/mg in terms of pyroglutamylleucine.
  • [4] The composition derived from beans described in any one of [1] to [3] above, wherein the beans are soybeans.
  • [5] The bean-derived composition according to any one of [2] to [4] above, wherein the bean-derived raw material is at least one selected from the group consisting of soybean okara, defatted soybeans, and soybean extracts.
  • [6] The legume-derived composition according to any one of [1] to [5] above, which satisfies the following (A) and/or (B).
  • (A) Contains daidzin, and the weight ratio of pyroglutamylleucine or a salt thereof (calculated as pyroglutamylleucine) to daidzin is 0.05 to 1,000.
  • An oral composition comprising the chicken gizzard-derived composition according to any one of [9] to [11] above.
  • composition for oral administration according to any one of [7], [8], and [12] to [15] above, which is a food or drink or an oral pharmaceutical.
  • a method for producing a bean-derived composition according to any one of [1] to [6] above the method comprising the steps of hydrolyzing a bean-derived raw material and heating the hydrolysate obtained in the hydrolysis step.
  • a method for producing a chicken gizzard-derived composition according to any one of [9] to [11] above the method comprising the steps of hydrolyzing chicken gizzard and heating the hydrolysate obtained in the hydrolysis step.
  • a method for producing a chicken gizzard-derived composition A method for producing a composition according to [17] or [18] above, wherein the hydrolysis is carried out using a protease.
  • the present invention it is possible to provide a legume-derived composition that exhibits excellent effects in activating the immune system and improving intestinal barrier function.
  • a chicken gizzard-derived composition that exhibits excellent effects in activating the immune system and improving intestinal barrier function.
  • FIG. 1A is a graph showing the results of investigating the effect of a soybean-derived hydrolysate (HSO) on the phagocytic activity of differentiated U937 cells (*: p ⁇ 0.05 vs. control).
  • FIG. 1B is a graph showing the results of investigating the effect of chicken gizzard hydrolysate (HCG) on the phagocytic activity of differentiated U937 cells (**: p ⁇ 0.01 vs. control).
  • FIG. 2A is a graph showing the results of investigating the effect of HSO on reactive oxygen species production in differentiated U937 cells (***: p ⁇ 0.001 vs. control).
  • FIG. 1A is a graph showing the results of investigating the effect of a soybean-derived hydrolysate (HSO) on the phagocytic activity of differentiated U937 cells (*: p ⁇ 0.05 vs. control).
  • FIG. 1B is a graph showing the results of investigating the effect of chicken gizzard hydrolysate
  • FIG. 3A is a graph showing the concentration (pg/mL) of MCP-1 in the culture supernatant of human peripheral blood mononuclear cells (hPBMC) treated with HSO (***: p ⁇ 0.001 vs. control).
  • FIG. 3B is a graph showing the IL-8 concentration (pg/mL) in the culture supernatant of hPBMC treated with HSO (***: p ⁇ 0.001 vs. control).
  • FIG. 3A is a graph showing the concentration (pg/mL) of MCP-1 in the culture supernatant of human peripheral blood mononuclear cells (hPBMC) treated with HSO (***: p ⁇ 0.001 vs. control).
  • hPBMC human peripheral blood mononuclear cells
  • FIG. 4A is a graph showing the effect of HSO on normalized TEER of differentiated Caco-2 cells treated with stimuli (LPS and IL-1 ⁇ ) for 24 and 48 hours (**: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 vs. stimulated control treated with stimuli for 24 hours, #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001 vs. stimulated control treated with stimuli for 48 hours).
  • FIG. 4B is a graph showing the effect of HCG on normalized TEER of differentiated Caco-2 cells treated with stimuli (LPS and IL-1 ⁇ ) for 24 and 48 hours (***: p ⁇ 0.001 vs. stimulated control treated with stimuli for 24 hours, ###: p ⁇ 0.001 vs.
  • FIG. 5A is a graph showing the effect of HSO on ZO-1 expression in differentiated Caco-2 cells (*: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 vs. stimulated control).
  • FIG. 5B is a graph showing the effect of HCG on ZO-1 expression in differentiated Caco-2 cells (***: p ⁇ 0.001 vs. stimulated control).
  • FIG. 5C is a graph showing the effect of HSO on the expression of claudin-3 in differentiated Caco-2 cells (*: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 vs. stimulated control).
  • FIG. 5D is a graph showing the effect of HCG on claudin-3 expression in differentiated Caco-2 cells (*: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 vs. stimulated control).
  • the legume-derived composition of the present invention contains pyroglutamyl-leucine or a salt thereof.
  • the chicken gizzard-derived composition of the present invention contains pyroglutamyl-leucine or a salt thereof.
  • the legume-derived composition and chicken gizzard-derived composition of the present invention are sometimes collectively referred to as the composition of the present invention.
  • Pyroglutamylleucine (Pyroglutamylleucine or its salt) Pyroglutamylleucine (pyroGlu-Leu) is a dipeptide formed by the binding of pyroglutamic acid (pyroGlu) and leucine (Leu). Pyroglutamic acid is a cyclic amino acid formed by intramolecular dehydration condensation of the ⁇ -carboxyl group and ⁇ -amino group of glutamic acid.
  • the peptide is represented by the N-terminus (amino terminus) on the left and the C-terminus (carboxyl terminus) on the right, according to the convention for peptide notation.
  • amino acids that make up pyroglutamylleucine may be in the D-, L-, or DL-form (racemic form), but the L-form is preferred.
  • L-form is preferred.
  • pyroglutamylleucine is prepared from natural proteins, all of the constituent amino acids are in the L-form.
  • the salt of pyroglutamylleucine is not particularly limited as long as it is a pharmacologically acceptable salt or a salt acceptable for food and beverages, and may be either an acidic salt or a basic salt.
  • acidic salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate, and phosphate; organic acid salts such as acetate, citrate, maleate, malate, oxalate, lactate, succinate, fumarate, and propionate.
  • Examples of basic salts include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; and alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt.
  • the salt of pyroglutamylleucine is preferably one that can be taken orally.
  • the salt of pyroglutamylleucine can be easily prepared by a person skilled in the art by any method known in the art.
  • the legume-derived composition of the present invention is made from legumes as a raw material, contains pyroglutamyl-leucine or a salt thereof, and has a pyroglutamyl-leucine or a salt thereof content of 0.1 to 100 ⁇ g/mg in terms of pyroglutamyl-leucine per solid content.
  • the pyroglutamylleucine or a salt thereof contained in the legume-derived composition of the present invention is usually derived from legume protein.
  • the above-mentioned beans are not particularly limited as long as they are the seeds of edible legumes, and examples thereof include soybeans, adzuki beans, chickpeas, lentils, peas, broad beans, lupins, mung beans, lima beans, cowpeas, bamboo beans, kidney beans, sand beans, green beans, cat beans, peanuts, and the like.
  • beans preferred are beans having a protein content of 20% by weight or more in the dried beans.
  • the more preferred legume is soybean.
  • the legume-derived composition of the present invention is preferably a hydrolysate of a legume-derived raw material.
  • the hydrolysate of the legume-derived raw material is preferably obtained by hydrolyzing proteins in the legume-derived raw material, and includes a hydrolysate of a protein derived from legumes (legume protein).
  • the pulse protein hydrolysate is usually a mixture of peptides, etc.
  • the pulse-derived composition preferably contains a pulse protein hydrolysate containing pyroglutamylleucine or a salt thereof.
  • the hydrolysate of a legume-derived raw material includes a hydrolysis-treated product of a legume-derived raw material obtained by hydrolyzing the legume-derived raw material, and a product obtained by hydrolyzing the legume-derived raw material and further treating it with heating, etc.
  • a product obtained by hydrolyzing and heating the legume-derived raw material is preferable, and a heated product of the hydrolysis-treated product of the raw material obtained by hydrolyzing the legume-derived raw material and then heating it is more preferable.
  • the above-mentioned bean-derived composition is preferably a hydrolysate obtained by treating a bean-derived raw material with a protease.
  • a form in which the above-mentioned bean-derived composition is a protease-treated product of a bean-derived raw material is one of the preferred embodiments of the present invention.
  • a heated product of the protease-treated product of the raw material obtained by heating the protease-treated product of the bean-derived raw material is more preferred.
  • the above-mentioned bean-derived raw material may be any raw material made from beans and containing bean protein, and examples of such raw materials include beans, processed beans, and bean extracts.
  • processed beans include beans from which at least a portion of the oil has been removed (defatted beans), soymilk residue (okara) obtained by squeezing soymilk from beans, beans made into a paste or slurry by adding a solvent (solventized bean paste), and ground beans.
  • the defatted beans may contain oil as long as at least a portion of the oil has been removed from the beans, but the oil content is preferably 5% by weight or less, and more preferably 1% by weight or less.
  • the method for preparing the defatted beans is not particularly limited, but can be prepared, for example, by squeezing the beans, extracting oil from the beans with a solvent, etc.
  • the extraction solvent for the oil is not particularly limited, but examples thereof include non-aqueous extraction solvents such as hydrocarbons such as pentane, hexane, heptane, octane, nonane, and decane. These may be used alone, or a mixed solvent (mixture) of two or more of them may be used.
  • the extraction solvent for the oil component is preferably a hydrocarbon having 5 to 7 carbon atoms such as pentane, hexane, heptane, etc., more preferably a hydrocarbon having 6 carbon atoms such as n-hexane, cyclohexane, etc., and even more preferably n-hexane.
  • the ground beans may be in powder form or may be in the form of a paste due to the oils and fats contained in the beans.
  • the above-mentioned bean extract can be obtained by extracting beans or processed beans with a solvent.
  • the bean extract can be obtained by a normal extraction method used for extracting proteins contained in beans.
  • the extraction method can be appropriately set, and the extraction conditions are not particularly limited.
  • an extract obtained by extracting beans or processed beans with a solvent can be used as the bean extract.
  • the above-mentioned extract can be diluted with an appropriate solvent and used as the bean extract, or can be concentrated or dried to obtain a concentrate or dry product.
  • the concentrate or dry product can also be dissolved or suspended in a solvent and used.
  • the bean extract includes a bean extract containing proteins obtained by extracting beans or processed beans with a solvent, its concentrate, dry product, and dilutions thereof.
  • a protein-containing pulse extract is preferably obtained by a plurality of successive extraction steps. After extraction, it is preferred to remove residues (pulses or processed pulses after extraction) from the extract.
  • a concentration step may be carried out after the extraction step.
  • the beans In preparing the bean extract, the beans may be subjected to the extraction step as they are, or may be subjected to the extraction step after being crushed, cut, dried or defatted.
  • the bean extract may be an extract obtained by extracting beans as they are, or an extract obtained by extracting processed beans.
  • the bean extract may be, for example, an extract obtained by extracting ground beans (an extract of ground beans) or an extract obtained by extracting defatted beans (an extract of defatted beans).
  • the above-mentioned bean extract is preferably obtained by extracting proteins from defatted beans with a solvent and concentrating the obtained bean extract (extract) containing the proteins.
  • the above-mentioned protein extraction and extract concentration can be performed by a commonly used method.
  • the above-mentioned bean extract is preferably an extract extracted from ground beans or an extract extracted from defatted beans.
  • the extraction solvent for preparing the bean extract is not particularly limited as long as it can extract proteins contained in beans or processed beans.
  • the extraction solvent those usually used for extracting components contained in beans can be used.
  • the extraction solvent include water; monohydric alcohols having 1 to 5 carbon atoms, such as methanol, ethanol, propanol, and butanol; polyhydric alcohols having 2 to 5 carbon atoms, such as ethylene glycol, propylene glycol, 1,2-butylene glycol, 1,3-butylene glycol, 1,4-butylene glycol, 2,3-butylene glycol, and glycerin; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; linear and cyclic ethers such as tetrahydrofuran, ethyl ether, and diethyl ether; polyethers such as polyethylene glycol; and squalane.
  • a mixed solvent (mixture) of two or more types may be used alone, or a mixed solvent (mixture) of two or more types may be used.
  • the monohydric alcohol having 1 to 5 carbon atoms those having 1 to 4 carbon atoms are preferable, those having 2 to 4 carbon atoms are more preferable, and ethanol is even more preferable.
  • the polyhydric alcohol having 2 to 5 carbon atoms a dihydric or trihydric alcohol having 2 to 4 carbon atoms is preferred, a dihydric alcohol having 2 to 4 carbon atoms is more preferred, and 1,3-butylene glycol is even more preferred.
  • the extraction solvent is preferably an aqueous solvent, more preferably water, a monohydric alcohol having 1 to 5 carbon atoms, a polyhydric alcohol having 2 to 5 carbon atoms, or a mixed solvent of two or more of these, more preferably water, a monohydric alcohol having 2 to 4 carbon atoms or an aqueous solution thereof, or a dihydric alcohol having 2 to 4 carbon atoms or an aqueous solution thereof, still more preferably water, ethanol, an aqueous ethanol solution, 1,3-butylene glycol, or an aqueous 1,3-butylene glycol solution, and particularly preferably water, an aqueous ethanol solution, or an aqueous 1,3-butylene glycol solution.
  • the aqueous ethanol solution and the aqueous 1,3-butylene glycol solution have an ethanol or 1,3-butylene glycol concentration of 10 to 98% by volume, more preferably 30 to 90% by volume, and even more preferably 30 to 70% by volume.
  • the above-mentioned bean-derived raw materials are preferably soybean-derived raw materials such as soybean lees, defatted soybeans, soybean extracts, etc.
  • the soybean extracts can be obtained by extracting soybeans or processed soybeans (e.g., soybean lees, defatted soybeans, crushed soybeans, etc.) with a solvent.
  • the legume-derived raw material is at least one selected from the group consisting of soybean okara, defatted soybeans, and soybean extracts.
  • an extract of a processed soybean is preferred, and an extract of defatted soybeans obtained by extracting defatted soybeans with a solvent is more preferred.
  • the legume-derived raw material is preferably a protein-containing defatted soybean extract.
  • a hydrolysate of the soybean-derived raw material is preferred.
  • the soybean okara is a residue obtained after raw soybeans are heated by steaming, boiling, or the like, mashed, and pressed to extract soy milk.
  • the soybean okara may contain water or may be dried.
  • the soybean okara can be produced by a commonly used method.
  • the defatted soybeans may be soybeans from which at least a portion of the oil has been removed, and the oil content is preferably 5% by weight or less, more preferably 1% by weight or less.
  • the defatted soybeans can be produced by a commonly used method, preferably by fat extraction using hexane.
  • the solid content of the legume-derived composition is not particularly limited, but is preferably 95 to 100% by weight.
  • the solids content can be measured by a gravimetric method in accordance with the method for determining moisture and total solids content of AOAC 925.10-1925.
  • the content of pyroglutamyl-leucine or a salt thereof per solid content in the legume-derived composition is 0.1 to 100 ⁇ g/mg calculated as pyroglutamyl-leucine.
  • the content per solid content is preferably 0.5 ⁇ g/mg or more, more preferably 1 ⁇ g/mg or more, and the content per solid content is preferably 50 ⁇ g/mg or less, more preferably 25 ⁇ g/mg or less, and even more preferably 10 ⁇ g/mg or less.
  • the content of the pyroglutamyl leucine or a salt thereof per solid content is preferably 0.5 to 50 ⁇ g/mg, more preferably 0.5 to 25 ⁇ g/mg, and even more preferably 1 to 10 ⁇ g/mg, calculated as pyroglutamyl leucine.
  • the content of pyroglutamylleucine or a salt thereof can be quantified by a known method, for example, liquid chromatography mass spectrometry (LC/MS/MS).
  • the amount converted into pyroglutamylleucine or an expression similar thereto means, in the case of pyroglutamylleucine, the amount thereof, and, in the case of a salt of pyroglutamylleucine, means the value obtained by multiplying the number of moles of the salt by the molecular weight of pyroglutamylleucine.
  • the legume-derived composition usually contains legume-derived components such as peptides other than pyroglutamylleucine or a salt thereof. Furthermore, the legume-derived composition may contain components other than the legume-derived components (referred to as other components).
  • the legume-derived components include components contained in legumes and decomposition products of the components, etc. Specific examples include proteins, carbohydrates, lipids, minerals, vitamins, isoflavones, amino acids, etc.
  • the other components are not particularly limited, but may include the catalyst and solvent used in the hydrolysis of beans.
  • isoflavones examples include isoflavone glycosides such as daidzin, genistin, glycitin, and puerarin; and isoflavone aglycones such as daidzein, 6-hydroxydaidzein, dihydroxydaidzein, genistein, glycitein, biochanin A, formonetin, and coumestrol.
  • the pulse-derived composition preferably comprises daidzin and/or genistin.
  • Daidzin is the 7-O-glucoside of daidzein.
  • Genistin is the 7-O-glucoside of genistein.
  • the content of daidzin per solid content in the bean-derived composition is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 20 ⁇ g/mg.
  • the content per solid content is more preferably 0.1 to 10 ⁇ g/mg, and even more preferably 0.2 to 3 ⁇ g/mg.
  • the content of genistin per solid content in the legume-derived composition is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 20 ⁇ g/mg.
  • the content per solid content is more preferably 0.1 to 10 ⁇ g/mg, and even more preferably 0.2 to 3 ⁇ g/mg.
  • the above-mentioned daidzin and genistin contents can be quantified, for example, by liquid chromatography mass spectrometry (LC/MS/MS) in accordance with AOAC Official Method 2001.10 for measuring isoflavones in soybeans and certain foods containing soybeans.
  • LC/MS/MS liquid chromatography mass spectrometry
  • the above-mentioned bean-derived composition preferably has a weight ratio of pyroglutamylleucine or a salt thereof (calculated as pyroglutamylleucine) to daidzin of 0.05 to 1000.
  • the above weight ratio is more preferably 0.1 to 200, even more preferably 0.2 to 125, even more preferably 0.5 to 100, and particularly preferably 1 to 10.
  • the bean-derived composition preferably has a weight ratio of pyroglutamyl-leucine or a salt thereof (calculated as pyroglutamyl-leucine) to genistin of 0.4 to 1000.
  • the weight ratio is more preferably 0.1 to 200, even more preferably 0.2 to 125, even more preferably 0.5 to 100, and particularly preferably 1 to 10.
  • the above-mentioned bean-derived composition satisfies the following (A) and/or (B).
  • A) Contains daidzin, and the weight ratio of pyroglutamylleucine or a salt thereof (calculated as pyroglutamylleucine) to daidzin is 0.05 to 1,000.
  • B) It contains genistin, and the weight ratio of pyroglutamylleucine or a salt thereof (calculated as pyroglutamylleucine) to the genistin is 0.04 to 1,000.
  • the above-mentioned legume-derived composition is more preferably in a form that satisfies (A) and (B).
  • the total amount of protein, peptide, amino acid and salts thereof in the legume-derived composition can be measured by the Kjeldahl method.
  • the legume-derived composition preferably has a nitrogen content of 8 to 16% by weight based on 100% by weight of the solid content as measured by the Kjeldahl method.
  • the nitrogen content is more preferably 10 to 14% by weight.
  • the above nitrogen also includes nitrogen derived from pyroglutamylleucine or a salt thereof.
  • the legume-derived composition may contain salt, but the sodium content is preferably 5% by weight or less based on the solid content, more preferably 0 to 3% by weight, and particularly preferably 0 to 2% by weight.
  • the sodium content may be more than 0% by weight, or may be 0.01% by weight or more based on 100% by weight of the solid content.
  • the sodium content can be measured, for example, by spectrophotometry.
  • the form of the bean-derived composition is not particularly limited, and may be in any form, such as a solid such as a powder, a paste, or a liquid.
  • the method for producing the legume-derived composition of the present invention is not particularly limited, but it is preferable to produce the legume-derived composition by carrying out a step of hydrolyzing and heating a legume-derived raw material (hereinafter also referred to as a hydrolysis and heating step).
  • the above hydrolysis and heating step hydrolyzes and heats the protein in the legume-derived raw material. This allows efficient production of pyroglutamyl-leucine or a salt thereof.
  • a legume-derived composition containing pyroglutamyl-leucine or a salt thereof can be obtained.
  • the legume-derived composition is produced by performing a step of hydrolyzing a legume-derived raw material (hydrolysis step) and then a step of heating the hydrolysate obtained in the hydrolysis step (heating step).
  • hydrolysis step a step of hydrolyzing a legume-derived raw material
  • heating step a step of heating the hydrolysate obtained in the hydrolysis step.
  • the bean-derived raw material is preferably at least one selected from the group consisting of soybean okara, defatted soybeans, and soybean extracts, and more preferably an extract of defatted soybeans. If the bean-derived raw material has been subjected to a defatting step, it is preferred because, for example, hydrolysis by protease proceeds more efficiently.
  • the method for the hydrolysis is not particularly limited as long as it can hydrolyze the protein in the legume-derived raw material, and examples of the method include a method for hydrolyzing the protein using a catalyst such as an acid, a base, or a protease, and a method for hydrolyzing the protein by heat treatment.
  • a catalyst such as an acid, a base, or a protease
  • the hydrolysis method is preferably a method using a catalyst such as an acid, a base, or a protease, more preferably a method using a protease.
  • the acid that can be used in the above hydrolysis is not particularly limited, but examples thereof include inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, and sulfurous acid, and organic acids such as oxalic acid, citric acid, acetic acid, and formic acid.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, and sulfurous acid
  • organic acids such as oxalic acid, citric acid, acetic acid, and formic acid.
  • the base that can be used in the above hydrolysis is not particularly limited, but examples include hydroxides of alkali metal elements such as sodium hydroxide and potassium hydroxide.
  • proteases that can be used in the above hydrolysis are not particularly limited, and examples include bacterial proteases, fungal proteases, plant proteases, and animal proteases. Proteases can also be classified into neutral proteases, alkaline proteases, and acidic proteases depending on the pH range of their optimal activity.
  • Examples of bacterial proteases include Protease N, Protease NL, Protease S, Proleather (registered trademark) FG-F (all manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.); Protin NY, Protin P, Deskin, Depirase, Protin A, and Samoase (registered trademark) (all manufactured by Yamato Kasei Co., Ltd.); Bioprase (registered trademark) XL-416F, Bioprase (registered trademark) SP-4FG, and Bioprase (registered trademark) SP-15FG (all manufactured by Nagase ChemteX Corporation); Orientase (registered trademark) 90N, Nucleisin (registered trademark), Orientase (registered trademark) 10NL, and Orientase (registered trademark) 22BF (all manufactured by HI Corporation); Aroase (registered trademark) AP-10 (manufactured by Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.); Examples of actinomycet
  • Fungal proteases include, for example, Protease A, Protease M, Protease P, Umamizyme, Peptidase R, Neurase (registered trademark) A, and Neurase (registered trademark) F (all manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.); Sumizyme (registered trademark) AP, Sumizyme (registered trademark) LP, Sumizyme (registered trademark) MP, Sumizyme (registered trademark) FP, and Sumizyme (registered trademark) LPL (all manufactured by Shin Nippon Chemical Industry Co., Ltd.); Protin (registered trademark) FN (manufactured by Yamato Chemical Industry Co., Ltd.); Denapsin 2P, Denazyme (registered trademark) AP, and XP-415 (all manufactured by Nagase ChemteX Corporation); Orientase (registered trademark) 20A, Orientase (registered trademark) ONS, Tetolase (register
  • plant-derived proteases examples include pineapple-derived endopeptidase (Bromelain (registered trademark)), Papain W-40 (manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.); and food-grade refined papain (manufactured by Nagase ChemteX Corporation).
  • animal-derived proteases include pepsin, trypsin, and chymotrypsin.
  • the protease is preferably a protease having endopeptidase activity.
  • Preferred examples of proteases having endopeptidase activity include Protamex (registered trademark), Neutrase (registered trademark), Alcalase (registered trademark), Bromelain (registered trademark), and Sternzym BP 5200 (manufactured by Sternzym).
  • the hydrolysis and heating of the legume-derived raw material is carried out in the presence of a solvent.
  • the legume-derived raw material is mixed with a solvent as necessary, and the hydrolysis and heating steps are carried out.
  • the raw material can also be subjected to the hydrolysis and heating steps.
  • the solvent is preferably a solvent containing water, more preferably water, ethanol, or a mixed solvent of water and ethanol, and further preferably water.
  • the protein content in the legume-derived raw material is not particularly limited, but is preferably 60 to 100% by weight relative to 100% by weight of the solid content, more preferably 80% by weight or more and less than 100% by weight, and even more preferably 80% by weight or more and 99% by weight or less.
  • the protein content of the legume-derived raw materials can be measured by the Kjeldahl method in accordance with AOAC 984.13, which is the method for determining crude protein in feed powder.
  • the amount of protease used can be set according to the amount of protein in the legume-derived raw material, but for example, it is preferably 0.01 to 10 AU/g relative to the solid content of the raw material. More preferably, it is 0.1 to 1 AU/g.
  • the reaction temperature in the above hydrolysis can be set depending on the catalyst (acid, base, enzyme) used, etc., but is preferably 30 to 70° C., more preferably 50 to 60° C., and even more preferably 50 to 55° C.
  • a protease is used in the hydrolysis, it is preferable to carry out the hydrolysis at a temperature close to the optimum temperature of the protease used.
  • the reaction temperature is preferably, for example, 50 to 55° C.
  • the temperature is preferably 50 to 55° C.
  • the reaction time for the hydrolysis is not particularly limited, but is preferably 1 to 5 hours. More preferably, it is 3 to 5 hours.
  • the heating temperature is preferably 110 to 150° C., and more preferably 120 to 140° C.
  • the heating is preferably carried out at a pressure (gauge pressure) of 101 to 300 kPa, more preferably 180 to 220 kPa.
  • the heating time is not particularly limited, but is preferably 1 to 6 hours, and more preferably 2 to 4 hours.
  • the above hydrolysis and heating process produces a solution of protein hydrolysate containing pyroglutamyl-leucine or a salt thereof.
  • the solution obtained by the above hydrolysis and heating process contains pyroglutamyl-leucine or a salt thereof.
  • the solution can be used as the legume-derived composition of the present invention described above. If necessary, insoluble components, coarse particles, etc. may be removed from the solution. The solution may be subjected to treatments such as dilution, concentration, drying, etc.
  • the solution obtained by the above hydrolysis and heating process, its diluted solution, concentrate, dry product, etc. may be used as the legume-derived composition of the present invention described above.
  • the method for producing the bean-derived composition may include a purification step, a concentration step, a drying step, and the like, after the hydrolysis and heating steps.
  • the purification method in the purification step is not particularly limited, and examples thereof include filtration, decantation, centrifugation, etc. More specifically, the purification step includes removing insoluble components, coarse particles, etc. by filtration, etc.
  • the concentration method in the concentration step is not particularly limited, and examples thereof include vacuum concentration, heat concentration, ventilation concentration, freeze concentration, spray concentration, and the like.
  • the drying method in the drying step is not particularly limited, and examples thereof include sun drying, (hot) air drying, vacuum drying, ventilation drying, fluidized drying, spray drying, freeze drying, reduced pressure drying, infrared drying, and high frequency drying.
  • the chicken gizzard-derived composition of the present invention is not particularly limited as long as it is made from chicken gizzard and contains pyroglutamyl-leucine or a salt thereof.
  • the chicken gizzard-derived composition of the present invention is preferably a chicken gizzard hydrolysate.
  • the gizzard hydrolysate contains a hydrolysate of a protein (chicken gizzard protein) derived from chicken gizzard.
  • the chicken gizzard-derived composition is preferably a chicken gizzard protein hydrolysate containing pyroglutamyl-leucine or a salt thereof.
  • the pyroglutamyl-leucine or a salt thereof contained in the chicken gizzard-derived composition of the present invention is usually derived from chicken gizzard protein.
  • the chicken gizzard hydrolysate includes a chicken gizzard hydrolyzate obtained by hydrolyzing chicken gizzard, and a chicken gizzard hydrolyzed and further treated with heating or the like.
  • the chicken gizzard-derived composition of the present invention is preferably one obtained by hydrolyzing and heating chicken gizzard, and more preferably a heated chicken gizzard hydrolysate obtained by hydrolyzing chicken gizzard and heating the resulting hydrolysate.
  • Chicken gizzard means the gizzard of a chicken.
  • the content of pyroglutamylleucine or a salt thereof per solid content in the chicken gizzard-derived composition is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 100 ⁇ g/mg calculated as pyroglutamylleucine.
  • the content per solid content is more preferably 0.5 ⁇ g/mg or more, even more preferably 0.8 ⁇ g/mg or more, and particularly preferably 1 ⁇ g/mg or more.
  • the content per solid content is more preferably 50 ⁇ g/mg or less, even more preferably 25 ⁇ g/mg or less, and particularly preferably 10 ⁇ g/mg or less.
  • the content of the pyroglutamyl-leucine or a salt thereof per solid content is, in terms of pyroglutamyl-leucine, more preferably 0.5 to 50 ⁇ g/mg, even more preferably 0.8 to 25 ⁇ g/mg, and particularly preferably 1 to 10 ⁇ g/mg.
  • the chicken gizzard-derived composition is preferably a product obtained by hydrolyzing chicken gizzard by treating it with a protease.
  • a preferred embodiment of the present invention is one in which the chicken gizzard-derived composition is a protease-treated product of chicken gizzard.
  • a heated product of protease-treated chicken gizzard obtained by heating the protease-treated product of chicken gizzard is more preferred.
  • the form of the chicken gizzard-derived composition is not particularly limited, and may be any of a solid form such as a powder, a paste form, a liquid form, and the like.
  • the chicken gizzard-derived composition may contain a solvent such as water.
  • the solid content is not particularly limited, but is preferably 95 to 100% by weight.
  • Chicken gizzard protein hydrolysate is usually a mixture of peptides and the like.
  • the chicken gizzard-derived composition preferably contains chicken gizzard protein hydrolysate containing pyroglutamyl-leucine or a salt thereof.
  • the chicken gizzard-derived composition may contain other components other than peptides such as pyroglutamyl-leucine or a salt thereof.
  • the other components are not particularly limited, but include components derived from chicken gizzard, catalysts used in hydrolysis of chicken gizzard, and products such as amino acids produced in the hydrolysis reaction.
  • the components derived from the chicken gizzard include proteins, lipids, minerals, vitamins, etc.
  • the total amount of proteins, peptides, amino acids and salts thereof in the chicken gizzard-derived composition can be measured by the Kjeldahl method.
  • the chicken gizzard-derived composition preferably has a nitrogen content of 8 to 16% by weight based on 100% by weight of solid content as measured by the Kjeldahl method.
  • the nitrogen content is more preferably 10 to 14% by weight.
  • the above nitrogen also includes nitrogen derived from pyroglutamylleucine or a salt thereof.
  • the chicken gizzard-derived composition may contain taurine, and the content thereof is preferably 1 to 10 mg/g, more preferably 2 to 5 mg/g, based on the solid content.
  • the taurine can be measured by HPLC (UV detector) in accordance with AOAC 994.12.
  • the method for producing the chicken gizzard-derived composition of the present invention is not particularly limited, but it is preferable to produce it by carrying out a step of hydrolyzing and heating chicken gizzard (hereinafter also referred to as a hydrolysis and heating step). This allows the protein in the chicken gizzard to be hydrolyzed and heated, thereby efficiently producing pyroglutamylleucine or a salt thereof. In the hydrolysis and heating step, it is preferable to perform heating after hydrolysis.
  • the chicken gizzard-derived composition is preferably produced by performing a step of hydrolyzing chicken gizzard (hereinafter also referred to as a hydrolysis step) and a step of heating the hydrolysate obtained in the hydrolysis step (hereinafter also referred to as a heating step).
  • a hydrolysis step a step of hydrolyzing chicken gizzard
  • a heating step a step of heating the hydrolysate obtained in the hydrolysis step
  • hydrolysis method specific examples of proteases that can be used in the hydrolysis step, reaction temperature, and reaction time, preferred forms, and preferred ranges in the hydrolysis step of the above-mentioned method for producing a composition derived from chicken gizzard are the same as those in the hydrolysis step of the above-mentioned method for producing a composition derived from beans.
  • the form of the chicken gizzard raw material used in the above hydrolysis step is not particularly limited, but from the viewpoint of hydrolysis reactivity, for example, it is preferably in minced form. More preferably, it is in the form of minced gizzard suspended in water.
  • the protein content in the chicken gizzard used as the raw material in the hydrolysis step is not particularly limited, but is preferably 60 to 100% by weight relative to 100% by weight of the solid content, and more preferably 80% by weight or more and less than 100% by weight.
  • the protein content in chicken gizzard can be measured by the Kjeldahl method.
  • the amount of protease used can be set according to the amount of protein in the gizzard raw material, but for example, it is preferably 0.01 to 10 AU/g relative to the solid content of the raw material. More preferably, it is 0.1 to 1 AU/g.
  • Specific examples and preferred ranges of the heating temperature and heating time in the heating step of the method for producing the chicken gizzard-derived composition are the same as those in the heating step of the method for producing the legume-derived composition.
  • the method for producing the chicken gizzard-derived composition may include a purification step, a concentration step, a drying step, etc., after the heating step.
  • Specific examples and preferred forms of the purification method in the purification step, the concentration method in the concentration step, and the drying method in the drying step are the same as those in the method for producing a bean-derived composition.
  • the legume-derived composition and chicken gizzard-derived composition of the present invention are preferably compositions for oral administration.
  • the present invention also includes an oral composition containing the above-mentioned bean-derived composition.
  • An oral composition containing the chicken gizzard-derived composition also constitutes part of the present invention.
  • the oral composition containing the above-mentioned bean-derived composition and the oral composition containing the above-mentioned chicken gizzard-derived composition are sometimes collectively referred to as the oral composition of the present invention.
  • the oral composition containing the legume-derived composition of the present invention preferably contains a hydrolysate of a legume-derived raw material.
  • the content of the hydrolysate of a legume-derived raw material in the oral composition is not particularly limited and may be, for example, 2 to 100% by weight, preferably 4 to 100% by weight.
  • the content of pyroglutamylleucine or a salt thereof per solid content in the oral composition is not particularly limited, but is preferably the same as the content per solid content in the above-mentioned bean-derived composition.
  • the oral composition containing the chicken gizzard-derived composition of the present invention preferably contains a chicken gizzard hydrolysate.
  • the content of chicken gizzard hydrolysate in the composition for oral administration is not particularly limited and may be, for example, 2 to 100% by weight, preferably 4 to 100% by weight.
  • the content of pyroglutamylleucine or a salt thereof per solid content in the oral composition is not particularly limited, but is preferably the same as the content per solid content in the chicken gizzard-derived composition described above.
  • the oral composition containing the legume-derived composition preferably contains daidzin and/or genistin.
  • Daidzin and genistin may be derived from hydrolysates of legume-derived raw materials.
  • the content of daidzin per solid content in the oral composition containing the above-mentioned bean-derived composition is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 20 ⁇ g/mg.
  • the content per solid content is more preferably 0.1 to 10 ⁇ g/mg, and even more preferably 0.2 to 3 ⁇ g/mg.
  • the content of genistin per solid content in the oral composition containing the above-mentioned bean-derived composition is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 20 ⁇ g/mg.
  • the content per solid content is more preferably 0.1 to 10 ⁇ g/mg, and even more preferably 0.2 to 3 ⁇ g/mg.
  • the weight ratio of pyroglutamyl-leucine or a salt thereof (calculated as pyroglutamyl-leucine) to daidzin is preferably 0.05 to 1000.
  • the weight ratio is more preferably 0.1 to 200, even more preferably 0.2 to 125, even more preferably 0.5 to 100, and particularly preferably 1 to 10.
  • the weight ratio of daidzin to pyroglutamylleucine or a salt thereof (calculated as pyroglutamylleucine) is preferably 0.001 to 20.
  • the weight ratio is more preferably 0.005 to 10, even more preferably 0.008 to 5, even more preferably 0.01 to 2, and particularly preferably 0.1 to 1.
  • the weight ratio of pyroglutamyl-leucine or a salt thereof (calculated as pyroglutamyl-leucine) to genistin is preferably 0.04 to 1000.
  • the weight ratio is more preferably 0.1 to 200, even more preferably 0.2 to 125, even more preferably 0.5 to 100, and particularly preferably 1 to 10.
  • the weight ratio of genistin to pyroglutamyl-leucine or a salt thereof (calculated as pyroglutamyl-leucine) is preferably 0.001 to 25.
  • the weight ratio is more preferably 0.005 to 10, even more preferably 0.008 to 5, even more preferably 0.01 to 2, and particularly preferably 0.1 to 1.
  • An oral composition containing a bean-derived composition that satisfies the following (A) and/or (B) is one of the preferred embodiments of the present invention.
  • A Contains daidzin, and the weight ratio of pyroglutamylleucine or a salt thereof (calculated as pyroglutamylleucine) to daidzin is 0.05 to 1,000.
  • B It contains genistin, and the weight ratio of pyroglutamylleucine or a salt thereof (calculated as pyroglutamylleucine) to the genistin is 0.04 to 1,000.
  • the above oral composition is more preferably in a form that satisfies (A) and (B).
  • the legume-derived composition and chicken gizzard-derived composition of the present invention have immune stimulating activity.
  • the legume-derived composition and chicken gizzard-derived composition of the present invention preferably have an innate immune activating effect.
  • the composition of the present invention can be suitably used as an active ingredient for immune activation.
  • the composition of the present invention can be more suitably used as an active ingredient for innate immune activation.
  • the composition and oral composition of the present invention are preferably used to activate immunity, and more preferably used to activate innate immunity.
  • the composition and oral composition of the present invention are preferably used as a composition for activating natural immunity. Activation of innate immunity includes strengthening innate immunity and maintaining innate immunity.
  • innate immune system immune cells in the blood, such as macrophages and monocytes, play an important role. Improving macrophage function is effective in activating innate immunity. For example, improving macrophage function can enhance or maintain innate immunity. Macrophages have the ability to ingest foreign substances such as bacteria, viruses, dead cells, etc. (phagocytosis). Ingesting and destroying invading pathogens through phagocytosis is an important component of the innate immune response (Reference 1: Flannaghan RS, Jaumouille' V, Grinstein S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 2012; 7: 61-98).
  • the phagocytosed foreign matter is taken up by the macrophage into a food vacuole (phagosome).
  • the phagosome fuses with a lysosome to form a phagolysosome.
  • the taken up foreign matter is killed or decomposed in the phagolysosome.
  • reactive oxygen species ROS
  • ROS reactive oxygen species
  • reactive oxygen species produced by macrophages include superoxide anion (SO), hydrogen peroxide, and hydroxyl radical.
  • Cytokines secreted by macrophages are important mediators of immune signaling pathways and play a role in initiating and controlling immune responses.
  • Cytokines produced by macrophages include chemokines such as interleukin-8 (IL-8) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1, also known as CCL2).
  • chemokines such as interleukin-8 (IL-8) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1, also known as CCL2).
  • IL-8 interleukin-8
  • MCP-1 monocyte chemoattractant protein-1
  • IL-8 recruits and activates target cells such as neutrophils and macrophages to the site of infection by inducing an increase in intracellular calcium and a respiratory burst (Reference 2: Brechard S, Bueb JL, Tschirhart EJ. Interleukin-8 primes oxidative burst in neutrophil-like HL-60 through changes in cytosolic calcium. Cell Calcium. 2005 Jun;37(6):531-40).
  • target cells such as neutrophils and macrophages arrive at the site of infection
  • IL-8 also induces phagocytosis.
  • MCP-1 similarly attracts monocytes and macrophages to the site of infection.
  • macrophages have functions such as phagocytosis, release of cytokines, and production of reactive oxygen species.
  • the composition of the present invention has the effect of promoting phagocytosis by macrophages.
  • the composition of the present invention has the effect of promoting the release of cytokines by macrophages.
  • the composition of the present invention has the effect of promoting the production of reactive oxygen species by macrophages.
  • the composition of the present invention has the effect of improving the function of macrophages.
  • compositions of the invention can be used, for example, to improve macrophage function.
  • the compositions of the invention can be used, for example, to promote phagocytosis by macrophages, promote cytokine release by macrophages, or promote production of reactive oxygen species by macrophages.
  • the composition of the present invention can be preferably used to enhance or maintain innate immunity by improving macrophage function.
  • the improvement in macrophage function is preferably at least one selected from the group consisting of promotion of phagocytosis by macrophages, promotion of cytokine release by macrophages, and promotion of production of reactive oxygen species by macrophages.
  • the cytokine is preferably MCP-1 and/or IL-8. In one aspect, the cytokine is preferably IL-8.
  • the composition and oral composition of the present invention can be used to prevent or improve conditions or diseases for which immune activation is effective, and can be preferably used to prevent or improve conditions or diseases for which innate immune activation is effective.
  • Immune activation such as innate immune activation is effective for preventing or improving conditions or diseases such as infectious diseases, periodontal disease, and malignant tumors. This is because these conditions or diseases are more likely to develop due to a decrease in the function of the immune system.
  • Infectious diseases include infections caused by microorganisms such as viruses and bacteria, and examples of such infections include infectious enteritis caused by Vibrio cholerae, enterotoxigenic Escherichia coli, Shigella, Salmonella, viruses, influenza, cold syndrome, stomatitis, and the like.
  • the composition and oral composition of the present invention can be used to prevent or improve the above conditions or diseases.
  • prevention of a condition or disease includes preventing the onset of a condition or disease, delaying the onset of a condition or disease, reducing the incidence of a condition or disease, reducing the risk of onset of a condition or disease, and increasing a subject's resistance to a condition or disease.
  • Amelioration of a condition or disease includes recovering a subject from a condition or disease, alleviating symptoms of a condition or disease, improving symptoms of a condition or disease, delaying or preventing the progression of a condition or disease, and the like. Recovery includes at least partial recovery.
  • composition and oral composition of the present invention may be labeled with a function exhibited by immune activation such as natural immune activation.
  • a label is also called a functional label.
  • the above label is not particularly limited. Examples of such labels include “maintain immune function”, “maintain natural immune function”, “improve immune system response”, “improve natural immune system response”, “support immune health”, “strengthen immune defense”, “strengthen natural immune defense”, “support immune defense against pathogens”, “strengthen biological defense against pathogens”, “support initiation of appropriate immune system response”, “support initiation of appropriate natural immune system response”, “for those concerned about immune function”, “regulate the immune system”, and labels or functional labels that can be viewed as equivalent thereto.
  • composition and oral composition of the present invention may be labeled with one or more of the above-mentioned labels.
  • the composition and oral composition of the present invention are preferably foods and beverages to which one or more of the above-mentioned labels are attached.
  • the above-mentioned label may also be a label indicating that the composition is used to obtain the above-mentioned function.
  • the label may be attached to the composition itself, or to the container or packaging of the composition.
  • the legume-derived composition and chicken gizzard-derived composition of the present invention have the effect of improving intestinal barrier function.
  • the composition of the present invention can be used as an active ingredient for improving intestinal barrier function.
  • the compositions and oral compositions of the present invention are also preferably used to improve intestinal barrier function.
  • the composition and oral composition of the present invention are preferably used as a composition for improving intestinal barrier function. Improving the intestinal barrier function may also contribute to the prevention or amelioration of conditions or diseases associated with abnormalities in the intestinal barrier function.
  • the intestinal barrier function refers to a function of preventing the intrusion (permeation) of foreign substances (e.g., toxins such as endotoxins, inflammatory substances, undigested matter, etc.) from outside the intestinal epithelial cells (intestinal lumen) into the body.
  • the intestine includes the large intestine and the small intestine.
  • a state in which the intrusion of foreign substances from outside the intestinal epithelial cells into the body is promoted compared to a normal state is called a state in which the permeability of foreign substances in the intestinal epithelial cells is increased (enhanced).
  • Improvement of the intestinal barrier function means both suppressing the increase in the permeability of foreign substances in the intestinal epithelial cells and decreasing the permeability of foreign substances in the intestinal epithelial cells.
  • improvement of the intestinal barrier function is also used to mean suppressing the decrease in the intestinal barrier function and enhancing the decreased intestinal barrier function.
  • the intestinal barrier function is improved by promoting or maintaining the expression of tight junction proteins in the intestinal epithelial cells, or suppressing the decrease in their expression to regulate permeability.
  • the composition and oral composition of the present invention can be used to improve intestinal barrier function by promoting or maintaining expression of tight junction proteins in intestinal epithelial cells, or by suppressing the decrease in expression of tight junction proteins.
  • the tight junctions of intestinal epithelial cells are composed of tight junction proteins that are involved in the selective movement of solutes and organic molecules across the epithelium.
  • tight junction proteins include the claudin family (e.g., claudin-3, etc.) and ZO (zonula occludens) (e.g., ZO-1). It has been reported that a decrease in tight junction proteins leads to a decrease in the function of tight junctions.
  • the intestinal barrier function improving effect is demonstrated, for example, by an increase in the electrical resistance (transepithelial electric resistance (TEER)) of intestinal epithelial cells or by suppressing a decrease in TEER. Substances that increase the TEER or suppress a decrease in the TEER have the effect of normalizing or strengthening the intestinal barrier function.
  • the intestinal barrier function improving effect is also demonstrated by an increase in the expression level of tight junction protein in intestinal epithelial cells or suppression of a decrease in the expression level.
  • the intestinal barrier function improving effect is also demonstrated by a decrease in the amount of foreign matter that permeates from the intestinal side of intestinal epithelial cells to the inside of the body. Those skilled in the art can select a specific method for evaluating the effect of improving intestinal barrier function depending on the purpose.
  • a method for measuring TEER can be used that uses an intestinal permeability model using human intestinal epithelial cells (Caco-2 cells).
  • a method for investigating the expression of tight junction proteins can be used, using an intestinal permeability model using human intestinal epithelial cells (Caco-2 cells).
  • lipopolysaccharide (LPS) and interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ) are added to monolayer cultured Caco-2 cells to create a condition that can disrupt the intestinal barrier function in humans. If the addition of a test substance suppresses the decrease in TEER compared to the case where the substance is not added, the test substance can be evaluated as having an effect of improving the intestinal barrier function.
  • the test substance can be evaluated as having an effect of improving intestinal barrier function.
  • the composition of the present invention suppressed the decrease in TEER caused by the addition of LPS and IL-1 ⁇ in an intestinal permeability model using Caco-2, indicating that the composition of the present invention has an effect of improving the intestinal barrier function.
  • the expression levels of tight junction proteins ZO-1 and claudin-3 in Caco-2 cells were decreased by the addition of LPS and IL-1 ⁇ .
  • Pretreatment with the composition of the present invention suppressed the decrease in the expression levels of ZO-1 and claudin-3 caused by the addition of LPS and IL-1 ⁇ . Therefore, the composition of the present invention has the effect of promoting or maintaining the expression of tight junction proteins in intestinal epithelial cells, or suppressing the decrease in the expression of tight junction proteins, and can be used to improve intestinal barrier function.
  • the composition of the present invention can be used to promote the expression of tight junction proteins in intestinal epithelial cells. In one embodiment, the composition of the present invention can be used to improve intestinal barrier function by promoting or maintaining the expression of tight junction proteins in intestinal epithelial cells, or by inhibiting the decrease in the expression of tight junction proteins.
  • the tight junction protein is preferably ZO-1 and/or claudin-3.
  • composition and oral composition of the present invention have an effect of improving intestinal barrier function. Therefore, the composition and oral composition of the present invention are useful for preventing or improving conditions or diseases for which improvement of intestinal barrier function is effective in preventing or improving, for example, conditions or diseases associated with abnormalities in intestinal barrier function.
  • Abnormalities in intestinal barrier function include a decrease in intestinal barrier function.
  • Conditions or diseases associated with abnormalities in intestinal barrier function include conditions or diseases caused by abnormalities in intestinal barrier function, or conditions or diseases accompanied by abnormalities in intestinal barrier function.
  • Examples of conditions or diseases associated with abnormalities in intestinal barrier function include inflammatory bowel disease, irritable bowel syndrome, systemic autoimmune diseases (rheumatoid arthritis, lupus erythematosus, etc.), allergies (food allergies, hay fever, etc.), lifestyle-related diseases (obesity, type 1 or type 2 diabetes, hypertension, hyperlipidemia, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), arteriosclerosis, etc.) (for example, Camilleri et al. t al. , Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 303: G775-G785, 2012; Mu et al. , Front. Immunol. , Vol. 8, Article 598, 2017; Bischoff et al. , BMC Gastroenterology 2014 14:189).
  • compositions and oral composition of the present invention have the effect of improving the intestinal condition by improving the intestinal barrier function. Therefore, the composition and oral composition of the present invention can regulate the intestinal condition by improving the intestinal barrier function, and are useful for preventing or improving the intestinal symptoms described above.
  • the composition and oral composition of the present invention can be used for intestinal regulation (e.g., for preventing or improving diarrhea, constipation, abdominal discomfort, etc.).
  • abnormalities in the intestinal barrier function are also associated with lifestyle-related diseases, etc.
  • Improving the intestinal barrier function is also effective in preventing or improving lifestyle-related diseases.
  • Symptoms of lifestyle-related diseases include abnormal glucose metabolism, abnormal lipid metabolism, increased body fat, increased visceral fat, increased abdominal fat, high blood pressure, arteriosclerosis, etc. Therefore, the composition and oral composition of the present invention can improve the intestinal barrier function, thereby contributing to the improvement of glucose metabolism, the improvement of lipid metabolism, the reduction or inhibition of the increase of fat such as body fat, visceral fat, and abdominal fat, the improvement of high blood pressure, the improvement of arteriosclerosis, etc.
  • Conditions or diseases associated with abnormalities in intestinal barrier function also include autism, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, arthritis, obesity-induced osteoarthritis, and asthma.
  • the composition and oral composition of the present invention can be used to prevent or improve a condition or disease associated with abnormalities in intestinal barrier function.
  • the composition and oral composition of the present invention may be a composition for preventing or improving a condition or disease associated with abnormalities in intestinal barrier function.
  • the condition or disease associated with abnormalities in intestinal barrier function may be diarrhea, constipation, abdominal discomfort, inflammatory bowel disease, irritable bowel syndrome, systemic autoimmune disease, allergy, lifestyle-related disease, autism, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, arthritis, obesity-induced osteoarthritis, or asthma.
  • composition and oral composition of the present invention may be labeled with a function exhibited by the intestinal barrier function improving effect.
  • a labeling is also called a functional labeling.
  • the above labeling is not particularly limited. Examples of such labels include “improves intestinal barrier function,” “suppresses the decline of intestinal barrier function,” “maintains the integrity of the intestinal barrier,” “suppresses the migration of bacteria from the intestinal tract to the entire body,” “suppresses the increase in intestinal permeability,” “maintains intestinal homeostasis,” “protects the intestinal barrier,” “suppresses the destruction of intestinal barrier function,” and “prevents gastrointestinal disorders,” as well as labels or functional labels that can be considered equivalent to these.
  • composition and oral composition of the present invention may be labeled as having an intestinal regulating effect as an effect based on the intestinal barrier function improving effect.
  • the intestinal regulating effect is not particularly limited as long as it is an intestinal regulating effect based on the improvement of the intestinal barrier function.
  • Examples of the above-mentioned intestinal regulating effect are "for those who tend to have constipation or diarrhea", “for those who are concerned about their stomach condition”, “for those who easily feel stomach discomfort”, “improves bowel movements”, “improves stool condition”, “improves bowel frequency”, “improves stool volume”, “cleans the stomach”, “regulates the stomach condition”, “regulates intestinal condition”, “improves stomach discomfort”, “relieves gas production”, “relieves abdominal distension”, “relieves stomach rumbling”, “regulates the intestines”, etc.
  • compositions and oral compositions of the present invention may be labeled with one or more of the above-mentioned labels.
  • the composition and oral composition of the present invention are preferably foods and beverages to which one or more of the above-mentioned indications are attached.
  • the above-mentioned indication may be an indication that the above-mentioned composition is used to obtain the above-mentioned function.
  • the indication may be attached to the composition itself, or to a container or packaging of the composition.
  • the oral composition of the present invention will be further described below.
  • the oral composition of the present invention can be used for either therapeutic (medical) or non-therapeutic (non-medical) purposes.
  • the oral composition of the present invention can be provided in the form of, for example, a food or drink, a medicine, a quasi-drug, a feed, etc., but is not limited thereto.
  • the oral composition of the present invention may itself be a food or drink, a medicine, a quasi-drug, a feed, etc., or may be a preparation or material such as an additive used therein.
  • the oral composition of the present invention can be provided in the form of an agent, for example, but is not limited to this form.
  • the agent can be provided as a composition as it is, or as a composition containing the agent.
  • the oral composition of the present invention can also be referred to as an immune activator.
  • the oral composition of the present invention can also be referred to as an immune activator or a natural immune activator.
  • the oral composition of the present invention can also be referred to as an intestinal barrier function improving agent.
  • the composition for oral administration of the present invention is preferably a food or beverage, an oral drug, or an oral quasi-drug, more preferably a food or beverage or an oral drug, and even more preferably a food or beverage.
  • the form of the oral composition of the present invention is not particularly limited, and may be any of a solid form (for example, powder, granules, tablet, etc.), a liquid form, a paste form, and the like.
  • the oral composition of the present invention contains the above-mentioned bean-derived composition or chicken gizzard-derived composition, and may further contain various diluents, acidulants, antioxidants, stabilizers, preservatives, flavorings, emulsifiers, colorants, seasonings, pH adjusters, nutritional enhancers, etc. that are permitted as additives to foods and beverages, pharmaceuticals, quasi-drugs, etc.
  • various foods and drinks can be made by blending the bean-derived composition or chicken gizzard-derived composition with ingredients that can be used in foods and drinks (e.g., food materials, food additives used as necessary, etc.).
  • the foods and drinks are not particularly limited, and examples include general foods and drinks, health foods, functional foods, foods for specified health uses, dietary supplements, and foods for the sick.
  • the above-mentioned health foods, functional foods, foods for specified health uses, dietary supplements, and foods for the sick can be used in various formulation forms, such as liquids, fine granules, tablets, granules, powders, capsules, chewable agents, dry syrups, and liquid diets.
  • pills and granules they can be in the form of conventional coatings, such as sugar-coated tablets, gelatin encapsulated tablets, enteric encapsulated tablets, film-coated tablets, etc., if necessary, and tablets can also be in the form of multi-layer tablets, such as double tablets.
  • the oral composition of the present invention When used as a pharmaceutical or quasi-drug, it can be mixed with a pharmacologically acceptable carrier, additives added as necessary, etc. to produce a pharmaceutical (pharmaceutical composition) or quasi-drug (quasi-drug composition) in various dosage forms.
  • a pharmacologically acceptable carrier such as any pharmacologically acceptable carriers that can be used in pharmaceuticals or quasi-drugs, and examples of such carriers, additives, etc. include one or more of excipients, binders, disintegrants, lubricants, antioxidants, colorants, etc.
  • Dosage forms for oral administration include, for example, liquids, tablets, powders, fine granules, granules, sugar-coated tablets, capsules, suspensions, emulsions, chewable tablets, etc.
  • the pharmaceutical may be a medicine for non-human animals.
  • the composition of the present invention may be blended with the feed.
  • Feed also includes feed additives.
  • feed include livestock feed for cows, pigs, chickens, sheep, horses, etc.; small animal feed for rabbits, rats, mice, etc.; and pet food for dogs, cats, small birds, etc.
  • the method of production is not particularly limited, and it can be produced by a general method using the composition of the present invention or a raw material containing the composition.
  • the oral composition of the present invention is preferably a liquid composition, and more preferably a beverage.
  • the beverage may be, for example, a functional beverage.
  • the form of the beverage is not particularly limited, and may be a packaged beverage.
  • the container for the packaged beverage is not particularly limited, and any container of any form and material may be used, and any commonly used container may be used, for example, metal containers such as aluminum cans and steel cans; resin containers such as PET bottles; paper containers such as paper cartons; glass containers such as glass bottles; and wooden containers such as barrels.
  • a packaged beverage is obtained by filling and sealing such a container with the beverage.
  • the subject to which the oral composition of the present invention is administered or ingested is preferably a human or a non-human animal, more preferably a human or a non-human mammal, and even more preferably a human.
  • subjects for which the oral composition of the present invention is administered are preferably subjects who require or desire immune activation, and more preferably subjects who require or desire innate immune activation. Suitable subjects include, for example, subjects with reduced function of the innate immune system, subjects who desire prevention or improvement of a condition or disease for which the above-mentioned immune activation or innate immune activation is effective for prevention or improvement, and subjects who require prevention or improvement of the condition or disease.
  • subjects for which the composition is administered include subjects (e.g., patients) who have the above-mentioned condition or disease.
  • the oral composition of the present invention can be used for subjects in a healthy state for the purpose of immune activation such as innate immune activation, or prevention of the above-mentioned condition or disease such as an infectious disease.
  • subjects who need or wish to improve intestinal barrier function are preferred as subjects to which the oral composition of the present invention is administered.
  • suitable subjects include, for example, subjects with impaired intestinal barrier function, subjects who wish to prevent or improve a condition or disease associated with the above-mentioned abnormality in intestinal barrier function, and subjects who need to prevent or improve such a condition or disease.
  • subjects to which the composition is administered include subjects (e.g., patients) who have a condition or disease associated with abnormality in intestinal barrier function.
  • the oral composition of the present invention can be used for subjects in a healthy state for the purpose of preventing a condition or disease associated with abnormality in intestinal barrier function.
  • the oral composition of the present invention is taken orally (orally administered).
  • the oral composition of the present invention is used to obtain, for example, an immune activation effect or an intestinal barrier function improving effect
  • the dosage is not particularly limited as long as it is an amount that obtains an immune activation effect or an intestinal barrier function improving effect, and may be appropriately set depending on the dosage form, administration method, subject weight, etc.
  • the intake amount of pyroglutamylleucine or a salt thereof is preferably 0.005 mg or more, more preferably 0.01 mg or more, even more preferably 0.05 mg or more, particularly preferably 0.1 mg or more, and preferably 200 mg or less, more preferably 100 mg or less, per day, calculated as pyroglutamylleucine.
  • the intake amount of pyroglutamylleucine or a salt thereof is preferably 0.005 to 200 mg, more preferably 0.005 to 100 mg, even more preferably 0.01 to 100 mg, even more preferably 0.05 to 100 mg, particularly preferably 0.1 to 100 mg, per day, calculated as pyroglutamylleucine.
  • the oral composition of the present invention it is preferable to administer or ingest the oral composition of the present invention, for example, once a day or in two or three divided doses, so that the intake amount of pyroglutamylleucine or a salt thereof falls within the above range.
  • the intake amount of pyroglutamylleucine or a salt thereof is preferably 0.01 mg or more, more preferably 0.05 mg or more, even more preferably 0.1 mg or more, and preferably 200 mg or less, more preferably 100 mg or less, per day, calculated as pyroglutamylleucine.
  • the intake amount of pyroglutamylleucine or a salt thereof is preferably 0.01 to 200 mg, more preferably 0.05 to 200 mg, even more preferably 0.1 to 200 mg, and particularly preferably 0.1 to 100 mg, per day, calculated as pyroglutamylleucine.
  • the intake amount of pyroglutamylleucine or a salt thereof is preferably 0.005 mg or more, more preferably 0.01 mg or more, even more preferably 0.05 mg or more, particularly preferably 0.1 mg or more, and preferably 200 mg or less, more preferably 100 mg or less, per day, in terms of pyroglutamylleucine.
  • the intake amount of pyroglutamylleucine or a salt thereof is preferably 0.005 to 200 mg, more preferably 0.01 to 200 mg, even more preferably 0.05 to 200 mg, even more preferably 0.05 to 200 mg, particularly preferably 0.1 to 100 mg, per day, in terms of pyroglutamylleucine.
  • the intake amount of the pyroglutamyl leucine or a salt thereof may be an intake amount per 60 kg of body weight per day.
  • the content of pyroglutamylleucine or a salt thereof in the oral composition of the present invention per adult per day is preferably 0.005 to 200 mg, more preferably 0.005 to 100 mg, even more preferably 0.01 to 100 mg, even more preferably 0.05 to 100 mg, and particularly preferably 0.1 to 100 mg, calculated as pyroglutamylleucine.
  • the oral composition of the present invention is preferably one that is ingested or administered continuously. By ingesting or administering the oral composition of the present invention continuously, it is expected that a greater effect can be obtained.
  • the oral composition of the present invention is preferably ingested or administered continuously for preferably one week or more, more preferably four weeks or more, and even more preferably eight weeks or more.
  • the oral composition of the present invention can be ingested as a food or drink, etc., and from the viewpoint of safety, it is considered that there are few problems with long-term ingestion, for example.
  • the present invention also encompasses the following immune activation methods and uses.
  • a method for activating immunity comprising administering a bean-derived composition to a subject, the bean-derived composition containing pyroglutamyl-leucine or a salt thereof, and a content of pyroglutamyl-leucine or a salt thereof per solid content of the composition being 0.1 to 100 ⁇ g/mg in terms of pyroglutamyl-leucine.
  • a method for activating immunity comprising administering to a subject a composition derived from chicken gizzard containing pyroglutamylleucine or a salt thereof.
  • Non-therapeutic is a concept that does not include medical procedures, i.e., surgery, treatment, or diagnosis.
  • the compositions of the present invention can be administered (or ingested) to a subject to activate the subject's immunity.
  • compositions of the present invention can be used to improve macrophage function.
  • the compositions of the present invention can be used to activate the immunity, for example, by promoting phagocytosis by macrophages, promoting cytokine release by macrophages, or promoting production of reactive oxygen species by macrophages.
  • the composition of the present invention may be administered in an amount that provides an immune activation effect, i.e., an effective amount, and is not particularly limited.
  • an effective amount i.e., an effective amount
  • the composition of the present invention is administered orally.
  • the above-mentioned composition, subject (subject to be administered), administration method, dosage, and preferred aspects thereof are the same as those of the composition of the present invention described above.
  • the immune activation is preferably the activation of innate immunity.
  • the composition of the present invention can be used to prevent or improve conditions or diseases such as the above-mentioned infections, periodontal disease, and malignant tumors.
  • the present invention also includes a method for preventing or improving the above-mentioned conditions or diseases, in which the composition of the present invention is administered to a subject.
  • the above-mentioned composition, subject (administration subject), administration method, dosage, and preferred aspects thereof are the same as those for the composition of the present invention described above.
  • the present invention also includes the following methods and uses for improving intestinal barrier function.
  • a method for improving intestinal barrier function comprising administering to a subject a legume-derived composition which contains pyroglutamylleucine or a salt thereof and has a pyroglutamylleucine or salt thereof content of 0.1 to 100 ⁇ g/mg calculated as pyroglutamylleucine per solid content.
  • a method for improving intestinal barrier function comprising administering to a subject a composition derived from chicken gizzard containing pyroglutamylleucine or a salt thereof.
  • composition of the present invention can be administered (or ingested) to a subject to improve the intestinal barrier function of the subject.
  • composition of the present invention can be used to promote or maintain the expression of tight junction proteins in intestinal epithelial cells, or to suppress the decrease in the expression of tight junction proteins.
  • the composition of the present invention can be used to improve the intestinal barrier function, for example, by promoting or maintaining the expression of tight junction proteins in intestinal epithelial cells, suppressing the decrease in the expression of tight junction proteins, maintaining TEER, or suppressing the decrease in TEER.
  • the dosage of the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an amount that can obtain the effect of improving the intestinal barrier function, i.e., an effective amount, and it is preferable to administer, for example, the amount described above.
  • the composition of the present invention is administered orally.
  • the above-mentioned composition, subject (subject to be administered), administration method, dosage, and their preferred aspects, etc. are the same as those for the composition of the present invention described above.
  • the composition of the present invention can be used to prevent or ameliorate conditions or diseases associated with abnormalities in the intestinal barrier function described above.
  • the present invention also encompasses a method for preventing or improving a condition or disease associated with abnormality in intestinal barrier function, comprising administering the composition of the present invention to a subject. Pyroglutamylleucine or a salt thereof, the subject (subject for administration), the administration method, the dosage, and preferred aspects thereof are the same as those of the composition for improving intestinal barrier function described above.
  • the present invention also includes use of the composition of the present invention in the manufacture of a composition for immune activation; and use of the composition of the present invention in the manufacture of a composition for improving intestinal barrier function.
  • the composition for immune activation, the composition for improving intestinal barrier function, and preferred aspects thereof are the same as the composition of the present invention and preferred aspects thereof described above.
  • the composition of the present invention can be used for producing foods and beverages, pharmaceuticals, quasi-drugs, and the like that are used for immune activation.
  • the present invention also includes the above-mentioned legume-derived composition of the present invention, which is used for immune activation.
  • the present invention further includes a chicken gizzard-derived composition containing pyroglutamylleucine or a salt thereof, which is used for immune activation.
  • the composition of the present invention can be used for producing foods and beverages, pharmaceuticals, quasi-drugs, and the like that are used for improving intestinal barrier function.
  • the present invention also encompasses the above-mentioned legume-derived composition of the present invention, which is used for improving intestinal barrier function.
  • the present invention further encompasses a chicken gizzard-derived composition containing pyroglutamylleucine or a salt thereof, which is used for improving intestinal barrier function.
  • the preferred embodiments of the composition of the present invention for the above uses are also as described above.
  • a numerical range expressed by a lower limit and an upper limit includes the lower limit and the upper limit.
  • a range expressed by "1 to 2" means 1 or more and 2 or less, including 1 and 2.
  • the upper limit and the lower limit may be in any combination. All academic and patent literature cited herein is hereby incorporated by reference.
  • Example 1 Preparation of hydrolysate of soybean raw material
  • Soy protein isolate (Jebsen & Jessen, GS5100) was used as the soy raw material. Endopeptidase was added to the mixture obtained by suspending the soybean raw material in warm water, and hydrolysis was carried out by enzymatic treatment for several hours. The solution containing the obtained hydrolyzate was heated under pressure at a high temperature of 100°C or higher for several hours. The heated solution was passed through a sieve to remove large particles, and then post-treatment such as filtration, concentration, and spray drying were carried out to obtain the hydrolyzate of the soybean raw material as a powder.
  • compositions (A) and (B) The above preparation method was carried out twice to obtain different batches of hydrolysates of soybean raw materials (compositions (A) and (B)).
  • the contents of pyroglutamyl-leucine (pEL), daidzin and genistin per solid content in the obtained hydrolysates of soybean raw materials were measured by LC-MS/MS. These contents and the weight ratios of pyroglutamyl-leucine to daidzin or genistin are shown in Table 1.
  • the measurement conditions for LC-MS/MS are as follows. Equipment used: A combination of LC (Agilent 1290, manufactured by Agilent Technologies) and a time-of-flight spectrometer (TripleTOF TM 5600 system, manufactured by AB Sciex). LC column: Eclipse plus C18, 18 ⁇ m, 2.1 ⁇ 50 mm (Agilent Technologies, Inc.) Sample injection volume: 5 ⁇ L Column temperature: room temperature
  • Example 2 Preparation of Chicken Gizzard Hydrolysate
  • Fresh chicken gizzards were finely minced and suspended in warm water to obtain a mixture, to which endopeptidase (alkaline protease) was added and subjected to enzymatic treatment for several hours to carry out hydrolysis.
  • the resulting solution containing the hydrolysate was heated at a high temperature of 100°C or higher for several hours.
  • the heated solution was passed through a sieve to remove large particles, and then subjected to post-treatments such as filtration, concentration, and spray drying to obtain chicken gizzard hydrolysate as a powder.
  • the pyroglutamylleucine content per solid content in the obtained chicken gizzard hydrolysate was measured by LC-MS/MS under the above conditions and was found to be 2.1 ⁇ g/mg.
  • Example 3 The immune effects of the hydrolysate of soybean raw material obtained in Example 1 (Composition (A)) (hereinafter also referred to as HSO) and the chicken gizzard hydrolysate obtained in Example 2 (hereinafter also referred to as HCG) were examined using an in vitro immune assay.
  • Composition (A) Composition (A)
  • HCG chicken gizzard hydrolysate obtained in Example 2
  • U937 cell line was obtained from ATCC.
  • Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) was purchased from Sigma-Aldrich.
  • pHrodo TM Red E. coli Bioparticles TM (Invitrogen TM ) were purchased from Thermo Fisher Scientific.
  • U937 cells are a cell line exhibiting monocyte morphology. U937 cells were differentiated into macrophages and subjected to phagocytosis assay. U937 cells were cultured in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (hereinafter also referred to as differentiation medium) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin. U937 cells were differentiated in 6-well plates with 10 ng/mL PMA for 24 hours, then the medium was refreshed and differentiated for another 24 hours. The differentiated U937 cells were replated in 96-well plates at a density of 5 x 10 4 cells/well and used for HSO or HCG treatment.
  • RPMI Roswell Park Memorial Institute
  • HSO or HCG treatment differentiated U937 cells were cultured in differentiation medium containing HSO or HCG.
  • differentiation media with HSO concentrations of 0.1 mg/mL and 1 mg/mL were used.
  • HCG treatment a differentiation medium with an HCG concentration of 1.5 mg/mL was used.
  • Cells were treated with HSO or HCG for 24 hours and incubated with pHrodo TM Red E. coli Bioparticles TM for an additional 2 hours.
  • ROS Cellular Reactive Oxygen Species
  • hPBMCs Human peripheral blood mononuclear cells
  • RPMI 1640 medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin.
  • the cells were seeded in 96-well plates at a density of 2 ⁇ 10 5 cells/well and treated with HSO or HCG.
  • HSO treatment RPMI 1640 medium with an HSO concentration of 1 mg/mL was used.
  • Cells treated with 2 ⁇ g/mL LPS served as a positive control.
  • cell culture supernatants were collected and subjected to inflammatory cytokine/chemokine analysis using the LEGENDplex Multi-Analyte Flow Assay Kit (BioLegend). Multiplex assays were performed according to the manufacturer's protocol. Data were analyzed using BioLegend's LEGENDplex Data Analysis Software.
  • Figure 1A is a graph showing the effect of HSO on the phagocytic activity of differentiated U937 cells
  • Figure 1B is a graph showing the effect of HCG on the phagocytic activity of differentiated U937 cells.
  • the "mean fluorescence intensity" on the vertical axis of FIG. 1A indicates the mean fluorescence intensity of pHrodo Red-positive cells.
  • Period (%) of pHrodo Red-positive cells indicates the percentage of pHrodo Red-positive cells relative to the total cells.
  • a higher value on the vertical axis of the graph shown in FIG. 1A indicates that the phagocytic activity of U937 cells is more promoted.
  • a higher value on the vertical axis of the graph shown in FIG. 1B indicates that the phagocytic activity of U937 cells is more promoted.
  • HSO and HCG promoted the phagocytosis of differentiated U937 cells, as characterized by an increased percentage of pHrodo Red-positive cells and elevated mean fluorescence intensity (MFI) levels.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • FIG. 2A is a graph showing the effect of HSO on ROS production in differentiated U937 cells
  • 2A and 2B show the relative amounts of ROS in the culture supernatants after HSO or HCG treatment.
  • Figures 3A and 3B show the results of investigating the effect of HSO on cytokine secretion from hPBMC.
  • Figure 3A is a graph showing the MCP-1 concentration (pg/mL) in the culture supernatant of hPBMC treated with HSO.
  • HSO promoted the secretion of MCP-1 and IL-8 by hPBMC.
  • HSO and HCG could enhance the phagocytic activity of differentiated U937 macrophages.
  • HSO also promoted chemokine expression in hPBMCs to support immune responses.
  • HSO and HCG could enhance innate immunity by improving the response of infiltrating immune cells.
  • Example 4 The effects of HSO obtained in Example 1 and HCG obtained in Example 2 on the intestinal barrier function were examined using an in vitro inflammatory bowel disease (IBD) model.
  • IBD in vitro inflammatory bowel disease
  • Caco-2 cell line was obtained from ATCC.
  • Collagen I, Rat Tail, ZO-1 monoclonal antibody, Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa 647, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa 568, and Goat anti-Mouse IgG (H+L) Alexa 568 were purchased from Thermo Fisher Scientific.
  • Claudin-3 monoclonal antibody and recombinant human IL-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ) were purchased from Cell Signaling Technology and R&D Systems, respectively.
  • Transwell® 0.4 ⁇ m Pore Polyester Membrane was purchased from Corning.
  • Lipopolysaccharide (LPS) derived from S. typhimurium was obtained from Sigma-Aldrich.
  • Caco-2 cell culture Caco-2 cells were maintained in MEM medium supplemented with 20% FBS, 1 ⁇ NEAA (non-essential amino acids) and 1 mM sodium pyruvate. In the experiments, cells were plated on collagen I-coated Transwell inserts or 96-well plates. were seeded at a density of 5 x 104 cells/well and differentiated for 21 days. During the first week of differentiation, half of the medium was replaced with a medium supplemented with 20% FBS, and during the following weeks, half of the medium was replaced with a medium supplemented with 10% FBS. A complete medium change was performed with medium supplemented with 100% ethanol. Medium was changed every other day. Caco-2 cells were considered differentiated at the end of the 21-day differentiation period.
  • HSO HSO or HCG treatment
  • HSO HSO concentrations of 1 mg/mL, 2 mg/mL, and 5 mg/mL
  • HCG HCG concentrations of 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, and 5 mg/mL
  • 10 ⁇ g/mL LPS and 10 ng/mL IL-1 ⁇ were added directly to the top chamber of the Transwell or 96-well plates and cells were cultured for 24-48 hours.
  • Caco-2 cells were treated with stimulants (LPS and IL-1 ⁇ ) in the presence of HSO or HCG for 24 to 48 hours.
  • stimulants LPS and IL-1 ⁇
  • Wells to which stimuli (LPS and IL-1 ⁇ ) and HSO and HCG were not added were used as unstimulated controls.
  • Wells to which stimuli were added but not HSO and HCG were added were used as stimulated controls.
  • Dexamethasone was used as a positive control.
  • cells were cultured for 24 to 48 hours in a medium containing stimuli and dexamethasone (dexamethasone concentration 100 ⁇ M).
  • TEER Transepithelial Electrical Resistance
  • HSO HSO
  • HCG HCG (0 h (Baseline)
  • stimulants LPS and IL-1 ⁇
  • TEER Reported [R Cells ( ⁇ ) - R Blank ( ⁇ )] x insert surface area (cm 2 )
  • R Cells ( ⁇ ) is the electrical resistance value of a well containing cells
  • R Blank ( ⁇ ) is the electrical resistance value of a well not containing cells (blank).
  • the insert surface area is the surface area of the well in which the cells are cultured.) In Example 4, the insert surface area was 0.33 cm2 .
  • the calculated TEER Reported was normalized twice to obtain normalized TEER as follows: First, it was normalized to the Baseline TEER Reported for all time points (0 hours (before pretreatment with HSO or HCG), 24 hours or 48 hours after treatment with stimulants), and then it was normalized to the no-stimulation control at that time point (no-stimulation control (no stimulant added) after 24 hours or 48 hours of incubation).
  • the Baseline TEER Reported is the reported TEER value (TEER Reported ) at 0 hours before pretreatment with HSO or HCG.
  • normalization refers to division by the mean value. For example, normalization to Baseline TEER Reported at a given time point was performed by dividing the average of the calculated TEER Reported values at that time point by the average Baseline TEER Reported .
  • Caco-2 cells were differentiated and treated in 96-well plates as described above. At the end of the treatment period, cells were washed with PBS, fixed with 4% PFA, and permeabilized with 0.1% Triton X-100. Cells were blocked with 1% BSA in PBS for 1 h at room temperature and then incubated with primary antibodies ZO-1 or claudin-3 overnight at 4°C. After washing with PBS, cells were incubated with secondary antibodies for 1 h. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) was incubated with secondary antibodies to visualize cell nuclei. Cells were washed three times with PBS and imaged with ImageXpress Pico (Molecular Devices). Images were processed and analyzed using Cell Reporter Xpress software (Molecular Devices, Inc.). The fluorescence intensity of each tight junction protein staining was normalized to the number of DAPI-positive cells within the field view and expressed as the percentage of positive cells.
  • FIG. 4A is a graph showing the effect of HSO on normalized TEER of differentiated Caco-2 cells treated with stimuli (LPS and IL-1 ⁇ ) for 24 and 48 hours.
  • FIG. 4B is a graph showing the effect of HCG on normalized TEER of differentiated Caco-2 cells treated with stimuli (LPS and IL-1 ⁇ ) for 24 and 48 hours.
  • Unstimulated control cells had a higher TEER than cells treated with IL-1 ⁇ and LPS. Stimulation with IL-1 ⁇ and LPS disrupted barrier formation in differentiated Caco-2 cells, resulting in a decrease in TEER measurements compared to unstimulated controls. The decrease in TEER was attenuated by pretreatment with HSO or HCG, and the effect was maintained up to 48 hours after stimulation.
  • 5A is a graph showing the effect of HSO on the expression of ZO-1 in differentiated Caco-2 cells
  • FIG. 5B is a graph showing the effect of HCG on the expression of ZO-1 in differentiated Caco-2 cells
  • FIG. 5C is a graph showing the effect of HSO on the expression of claudin-3 in differentiated Caco-2 cells
  • FIG. 5D is a graph showing the effect of HCG on the expression of claudin-3 in differentiated Caco-2 cells.
  • HSO and HCG have the effect of improving intestinal barrier function.
  • HSO and HCG can restore the integrity of the intestinal barrier by preventing the decrease in TEER and maintaining the expression of tight junction proteins under chronic inflammatory conditions.

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Abstract

本発明は、免疫の活性化及び腸管バリア機能の改善において優れた効果を発揮する豆類由来組成物及びニワトリの砂肝由来組成物を提供することを目的とする。 本発明は、ピログルタミルロイシン又はその塩を含み、ピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量が、ピログルタミルロイシン換算で０．１～１００μｇ／ｍｇである、豆類由来組成物に関する。

Description

豆類由来組成物及びその製造方法並びにニワトリの砂肝由来組成物及びその製造方法
本発明は、豆類由来組成物及びその製造方法等に関する。また、本発明は、ニワトリの砂肝由来組成物及びその製造方法等に関する。
免疫には、体内に侵入した病原体等の異物を認識してただちに排除する自然免疫と、侵入した異物の情報をＴ細胞やＢ細胞等のリンパ球が認識し、その情報に基づいて特定の異物を排除する獲得免疫がある。自然免疫は、自然免疫系の細胞が、体内に侵入した病原体をいち早く認識し、それを排除する生体反応である。このため自然免疫は、生体防御の最前線に位置している仕組みともいえる。マクロファージ等の免疫細胞は、自然免疫系の一部である。マクロファージは、細菌等の病原体を貪食して処理する。獲得免疫では、体内に侵入した病原体等を特異的に見分け、それを記憶することで、同じ病原体等に出会ったときに効果的に病原体等を排除することができるが、自然免疫に比べると応答までにかかる時間が長い。
免疫の活性化は、例えば、病原菌又はウイルスに対する免疫防御の強化又はサポート、及び、病原菌又はウイルスによる感染症の予防に有効である。このため、免疫活性化作用を有し、日常的に摂取可能な成分は有用である。
また、近年、腸の健康に関する意識が高まっており、腸の健康関連の機能性食品も多数販売されている。腸の機能としては、栄養素の吸収機能と、有害物質の侵入（透過）を防ぐバリア機能（腸管バリア機能）とが主である。その中で、腸管バリア機能が加齢とともに増加する慢性炎症疾患と非常に関わりがあることが明らかとなってきた。
腸管上皮の下の粘膜固有層には、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞のような免疫系の細胞が多数存在している。通常、腸管上皮における水、イオン及び有機分子の輸送は、腸管上皮細胞の頂端部細胞膜に存在する種々の輸送タンパク質（膜輸送体）及び隣接する細胞間のタイトジャンクションによって厳密に制御されている。これらの膜輸送体やタイトジャンクション構造等が、有害物質及び病原体の侵入を防ぐ腸管バリア機能を担っている。しかし、加齢、生活の不摂生、ストレス等によって腸管バリアが傷害されて腸管透過性が上昇すると、腸内に存在する腸内細菌や、ＬＰＳなどの腸内細菌由来成分が、細胞間隙を介して生体内へ移行し、免疫細胞を刺激するなどして炎症性サイトカインの放出を促し、炎症を誘発する。その結果、腸では炎症性腸疾患、肝臓では非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、血管では動脈硬化に起因する症状、全身性では糖尿病、脂質代謝異常、自己免疫疾患など慢性炎症に起因する様々な病態が誘発されると考えられている。また、環境要因（例えば、感染症、ストレス）による腸管透過性の乱れが食物アレルギーの発症を促進すると推測される。
上記のように、腸管バリア機能の低下は様々な疾患等の原因となり得る。このような観点から、腸管バリア機能を改善できる物質の探索が試みられている。
ピログルタミルロイシン（ｐｙｒｏＧｌｕ－Ｌｅｕ）は、グルタミン酸が環化したピログルタミン酸を含むジペプチドである。非特許文献１には、ピログルタミルロイシンがラットの肝細胞で、炎症性サイトカインによる誘導性一酸化窒素合成酵素の誘導を阻害したことが記載されている。
ところで、大豆等の豆類は、タンパク質等の栄養素を豊富に含む食品として古くから重要な食糧とされてきた。
また、ニワトリの砂肝も高タンパク質、低脂肪、低糖質の食品として着目されている。
上記のようなタンパク質を豊富に含む食品は、タンパク質やアミノ酸を含む健康食品等の原料としても有用である。
Ｏｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｉｔｒｉｃ　Ｏｘｉｄｅ　４４（２０１５）８１－８７
本発明は、免疫の活性化及び腸管バリア機能の改善において優れた効果を発揮する豆類由来組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、免疫の活性化及び腸管バリア機能の改善において優れた効果を発揮するニワトリの砂肝由来組成物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、豆類を原料に使用して、ピログルタミルロイシン又はその塩を特定量含む豆類由来組成物を製造することができること、該組成物が、免疫を活性化する作用及び腸管バリア機能を改善する作用を有することを見出した。また、本発明者らは、ニワトリの砂肝を原料に使用して、ピログルタミルロイシン又はその塩を含むニワトリの砂肝由来組成物を製造することができること、該組成物が、免疫を活性化する作用及び腸管バリア機能を改善する作用を有することを見出した。
本発明は、以下の豆類由来組成物、ニワトリの砂肝由来組成物等に関する。
〔１〕ピログルタミルロイシン又はその塩を含み、ピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量が、ピログルタミルロイシン換算で０．１～１００μｇ／ｍｇである、豆類由来組成物。
〔２〕上記豆類由来組成物が、豆類由来原料の加水分解物である、上記〔１〕に記載の豆類由来組成物。
〔３〕上記豆類由来組成物が、豆類由来原料のプロテアーゼ処理物である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の豆類由来組成物。
〔４〕上記豆類が、大豆である、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の豆類由来組成物。
〔５〕上記豆類由来原料が、大豆オカラ、脱脂大豆及び大豆抽出物からなる群より選択される少なくとも１種である、上記〔２〕～〔４〕のいずれかに記載の豆類由来組成物。
〔６〕上記豆類由来組成物は、下記の（Ａ）及び／又は（Ｂ）を満たすものである、上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の豆類由来組成物。
（Ａ）ダイジンを含み、上記ダイジンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０５～１０００である。
（Ｂ）ゲニスチンを含み、上記ゲニスチンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０４～１０００である。
〔７〕上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の豆類由来組成物を含む、経口用組成物。
〔８〕上記経口用組成物は、下記の（Ａ）及び／又は（Ｂ）を満たすものである、上記〔７〕に記載の組成物。
（Ａ）ダイジンを含み、上記ダイジンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０５～１０００である。
（Ｂ）ゲニスチンを含み、上記ゲニスチンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０４～１０００である。
〔９〕ピログルタミルロイシン又はその塩を含む、ニワトリの砂肝由来組成物。
〔１０〕上記ピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量が、ピログルタミルロイシン換算で０．１～１００μｇ／ｍｇである、上記〔９〕に記載のニワトリの砂肝由来組成物。
〔１１〕上記ニワトリの砂肝由来組成物が、ニワトリの砂肝のプロテアーゼ処理物である、上記〔９〕又は〔１０〕に記載のニワトリの砂肝由来組成物。
〔１２〕上記〔９〕～〔１１〕のいずれかに記載のニワトリの砂肝由来組成物を含む、経口用組成物。
〔１３〕上記経口用組成物は、免疫活性化のために使用される、上記〔７〕、〔８〕又は〔１２〕に記載の経口用組成物。
〔１４〕上記経口用組成物は、自然免疫活性化のために使用される、上記〔７〕、〔８〕又は〔１２〕に記載の経口用組成物。
〔１５〕上記経口用組成物は、腸管バリア機能改善のために使用される、上記〔７〕、〔８〕又は〔１２〕に記載の経口用組成物。
〔１６〕上記経口用組成物は、飲食品又は経口用医薬品である、上記〔７〕、〔８〕及び〔１２〕～〔１５〕のいずれかに記載の経口用組成物。
〔１７〕上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の豆類由来組成物を製造する方法であって、該製造方法は、豆類由来原料を加水分解する工程と、該加水分解工程で得られた加水分解物を加熱する工程とを有する、豆類由来組成物の製造方法。
〔１８〕上記〔９〕～〔１１〕のいずれかに記載のニワトリの砂肝由来組成物を製造する方法であって、該製造方法は、ニワトリの砂肝を加水分解する工程と、該加水分解工程で得られた加水分解物を加熱する工程とを有する、ニワトリの砂肝由来組成物の製造方法。
〔１９〕上記加水分解は、プロテアーゼを用いて行う、上記〔１７〕又は〔１８〕に記載の組成物の製造方法。
本発明によれば、免疫の活性化及び腸管バリア機能の改善において優れた効果を発揮する豆類由来組成物を提供することができる。また、本発明によれば、免疫の活性化及び腸管バリア機能の改善において優れた効果を発揮するニワトリの砂肝由来組成物を提供することができる。
図１Ａは、分化したＵ９３７細胞の貪食活性への大豆由来原料の加水分解物（ＨＳＯ）の効果を調べた結果を示すグラフである（＊：ｐ＜０．０５、コントロールに対して）。 図１Ｂは、分化したＵ９３７細胞の貪食活性へのニワトリの砂肝加水分解物（ＨＣＧ）の効果を調べた結果を示すグラフである（＊＊：ｐ＜０．０１、コントロールに対して）。 図２Ａは、分化したＵ９３７細胞における活性酸素種産生に対するＨＳＯの効果を調べた結果を示すグラフである（＊＊＊：ｐ＜０．００１、コントロールに対して）。 図２Ｂは、分化したＵ９３７細胞における活性酸素種産生に対するＨＣＧの効果を調べた結果を示すグラフである（＊＊＊：ｐ＜０．００１、コントロールに対して）。 図３Ａは、ＨＳＯで処理したヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）の培養上清中のＭＣＰ－１の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである（＊＊＊：ｐ＜０．００１、コントロールに対して）。 図３Ｂは、ＨＳＯで処理したｈＰＢＭＣの培養上清中のＩＬ－８濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである（＊＊＊：ｐ＜０．００１、コントロールに対して）。 図４Ａは、刺激剤（ＬＰＳ及びＩＬ－１β）で２４時間及び４８時間処理した分化したＣａｃｏ－２細胞の正規化ＴＥＥＲへのＨＳＯの効果を示すグラフである（＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、刺激剤処理２４時間の刺激ありコントロールに対して、＃：ｐ＜０．０５、＃＃：ｐ＜０．０１、＃＃＃：ｐ＜０．００１、刺激剤処理４８時間の刺激ありコントロールに対して）。 図４Ｂは、刺激剤（ＬＰＳ及びＩＬ－１β）で２４時間及び４８時間処理した分化したＣａｃｏ－２細胞の正規化ＴＥＥＲへのＨＣＧの効果を示すグラフである（＊＊＊：ｐ＜０．００１、刺激剤処理２４時間の刺激ありコントロールに対して、＃＃＃：ｐ＜０．００１、刺激剤処理４８時間の刺激ありコントロールに対して）。 図５Ａは、分化したＣａｃｏ－２細胞におけるＺＯ－１の発現へのＨＳＯの効果を示すグラフである（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、刺激ありコントロールに対して）。 図５Ｂは、分化したＣａｃｏ－２細胞におけるＺＯ－１の発現へのＨＣＧの効果を示すグラフである（＊＊＊：ｐ＜０．００１、刺激ありコントロールに対して）。 図５Ｃは、分化したＣａｃｏ－２細胞におけるクローディン－３の発現へのＨＳＯの効果を示すグラフである（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、刺激ありコントロールに対して）。 図５Ｄは、分化したＣａｃｏ－２細胞におけるクローディン－３の発現へのＨＣＧの効果を示すグラフである（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、刺激ありコントロールに対して）。
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
本発明の豆類由来組成物は、ピログルタミルロイシン又はその塩を含むものである。本発明のニワトリの砂肝由来組成物は、ピログルタミルロイシン又はその塩を含むものである。
本明細書中、本発明の豆類由来組成物及びニワトリの砂肝由来組成物を、まとめて本発明の組成物ということもある。
（ピログルタミルロイシン又はその塩）
ピログルタミルロイシン（ｐｙｒｏＧｌｕ－Ｌｅｕ）は、ピログルタミン酸（ｐｙｒｏＧｌｕ）とロイシン（Ｌｅｕ）が結合したジペプチドである。ピログルタミン酸は、グルタミン酸のγカルボキシル基とαアミノ基が分子内脱水縮合した環状アミノ酸である。本明細書におけるペプチドは、ペプチド表記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
ピログルタミルロイシンを構成するアミノ酸は、Ｄ体、Ｌ体、ＤＬ体（ラセミ体）のいずれであってもよいが、Ｌ体が好ましい。ピログルタミルロイシンを天然タンパク質から調製する場合、構成アミノ酸は全てＬ体になる。
ピログルタミルロイシンの塩としては、薬理学的に許容される塩又は飲食品に許容される塩であれば特に限定されず、酸性塩及び塩基性塩のいずれであってもよい。酸性塩として、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。塩基性塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。ピログルタミルロイシンの塩は、経口摂取可能なものが好ましい。ピログルタミルロイシンの塩は、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に調製され得る。
（豆類由来組成物）
本発明の豆類由来組成物は、豆類を原料とするものであって、ピログルタミルロイシン又はその塩を含み、ピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量が、ピログルタミルロイシン換算で０．１～１００μｇ／ｍｇである。
本発明の豆類由来組成物に含まれるピログルタミルロイシン又はその塩は、通常、豆類タンパク質に由来する。
上記豆類としては、可食のマメ科植物の種子であれば特に制限されないが、例えば、大豆、小豆、ヒヨコマメ、レンズマメ、エンドウ、ソラマメ、ハウチワマメ、緑豆、ライマメ、ササゲ、タケアズキ、インゲンマメ、サンドマメ、サヤインゲン、ハナマメ、ラッカセイ等が挙げられる。
豆類として好ましくは、乾燥させた豆におけるタンパク質の含有割合が２０重量％以上の豆である。
豆類として更に好ましくは大豆である。
本発明の豆類由来組成物は、豆類由来原料の加水分解物であることが好ましい。
上記豆類由来原料の加水分解物は、豆類由来原料から、当該原料中のタンパク質を加水分解して得られるものであることが好ましい。上記豆類由来原料の加水分解物は、豆類に由来するタンパク質（豆類タンパク質）の加水分解物を含むものである。
豆類タンパク質加水分解物は、通常、ペプチド等の混合物である。上記豆類由来組成物は、ピログルタミルロイシン又はその塩を含む豆類タンパク質加水分解物を含むことが好ましい。
豆類由来原料の加水分解物には、豆類由来原料を加水分解して得られる豆類由来原料の加水分解処理物、豆類由来原料を加水分解し、さらに加熱等の処理を行ったものが含まれる。上記豆類由来組成物として、豆類由来原料を加水分解及び加熱して得られるものが好ましく、豆類由来原料を加水分解し、次いで加熱して得られる、当該原料の加水分解処理物の加熱物がより好ましい。
上記豆類由来組成物は、豆類由来原料をプロテアーゼ処理して得られる加水分解物であることが好ましい。上記豆類由来組成物が豆類由来原料のプロテアーゼ処理物である形態は、本発明の好ましい実施形態の１つである。本発明の豆類由来組成物として、豆類由来原料のプロテアーゼ処理物を加熱して得られる、当該原料のプロテアーゼ処理物の加熱物がより好ましい。
上記豆類由来原料は、豆類を原料とし豆類タンパク質を含有するものであればよく、豆類、豆類処理物、豆類抽出物等が挙げられる。豆類処理物として、豆類の油分の少なくとも一部を除去したもの（豆類の脱脂物）、豆類から豆乳をしぼったしぼりかす（オカラ）、豆類に溶媒を加えてペースト又はスラリー状にしたもの（豆類の加溶媒ペースト）、豆類の粉砕物等が挙げられる。
上記豆類の脱脂物は、豆類から油分の少なくとも一部を除去したものであれば、油分を含んでいてもよいが、油の含有量は、５重量％以下であることが好ましく、１重量％以下であることがより好ましい。
上記豆類の脱脂物の調製方法は特に制限されないが、例えば、豆類を圧搾する方法、豆類から溶媒で油分を抽出する方法等により調製することができる。上記油分の抽出溶媒としては特に制限されないが、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン等の炭化水素等の非水系抽出溶媒が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせた混合溶媒（混合液）を用いてもよい。
上記油分の抽出溶媒として好ましくはペンタン、ヘキサン、ヘプタン等の炭素数５～７の炭化水素であり、より好ましくはｎ－ヘキサン、シクロヘキサン等の炭素数６の炭化水素であり、更に好ましくはｎ－ヘキサンである。
上記豆類の粉砕物は、粉末状であっても、豆類に含まれる油脂によりペースト状となっていてもよい。
上記豆類抽出物は、豆類又は豆類処理物を溶媒で抽出することで得ることができる。豆類抽出物は、豆類に含まれるタンパク質の抽出に用いられる通常の抽出方法により得ることができる。抽出方法は適宜設定することができ、抽出条件も特に限定されない。本発明においては、豆類又は豆類処理物を溶媒で抽出して得られた抽出液を豆類抽出物として用いることができる。また、上記抽出液を適切な溶媒で希釈して豆類抽出物として用いてもよく、濃縮又は乾燥を行って、濃縮物又は乾燥物としてもよい。また、濃縮物又は乾燥物を、溶媒に溶解させて又は懸濁させて用いることもできる。豆類抽出物には、豆類又は豆類処理物を溶媒で抽出して得られるタンパク質を含む豆類抽出液、その濃縮物、乾燥物、これらの希釈物が含まれる。
例えば、タンパク質を含有する豆類抽出物は、複数の連続的な抽出作業工程によって得ることが好ましい。抽出後には、残渣（抽出後の豆類又は豆類処理物）を抽出液から除去することが好ましい。
上記豆類抽出物の調製において、抽出工程の後に濃縮工程を行ってもよい。
豆類抽出物の調製において、豆類はそのまま抽出工程に付されてもよく、粉砕、切断、乾燥又は脱脂された後に抽出工程に付されてもよい。本発明において豆類抽出物は、豆類をそのまま抽出した抽出物であってよいが、豆類処理物から抽出した抽出物であってもよい。豆類抽出物は、例えば、豆類の粉砕物から抽出した抽出物（豆類粉砕物の抽出物）又は豆類の脱脂物を抽出した抽出物（豆類の脱脂物の抽出物）であってよい。
上記豆類抽出物は、豆類の脱脂物から溶媒でタンパク質を抽出し、得られたタンパク質を含有する豆類抽出物（抽出液）を濃縮して得ることが好ましい。上記のタンパク質の抽出、抽出物の濃縮は通常用いられる方法により行うことができる。
上記豆類抽出物として好ましくは、豆類の粉砕物から抽出した抽出物、豆類の脱脂物から抽出した抽出物である。
また、豆類抽出物を調製するための抽出溶媒としては、豆類又は豆類処理物に含まれるタンパク質を抽出できれば特に限定されるものではない。
抽出溶媒としては、豆類に含まれる成分の抽出に通常用いられるものを使用することができる。抽出溶媒として、例えば水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の炭素数１～５の１価アルコール；エチレングリコール、プロピレングリコール、１，２－ブチレングリコール、１，３－ブチレングリコール、１，４－ブチレングリコール、２，３－ブチレングリコール、グリセリン等の炭素数２～５の多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル；テトラヒドロフラン、エチルエーテル、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル；ポリエチレングリコール等のポリエーテル；スクワラン等が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせた混合溶媒（混合液）を用いてもよい。炭素数１～５の１価アルコールとして、炭素数１～４のものが好ましく、炭素数２～４のものがより好ましく、エタノールがさらに好ましい。炭素数２～５の多価アルコールとして、炭素数２～４の２価又は３価のアルコールが好ましく、炭素数２～４の２価のアルコールがより好ましく、１，３－ブチレングリコールがさらに好ましい。中でも、抽出溶媒として好ましくは水系溶媒であり、水、炭素数１～５の１価アルコール、炭素数２～５の多価アルコール、これらの２種以上の混合溶媒がより好ましく、水、炭素数２～４の１価アルコール又はその水溶液、炭素数２～４の２価アルコール又はその水溶液が更に好ましく、水、エタノール、エタノール水溶液、１，３－ブチレングリコール、１，３－ブチレングリコール水溶液が一層好ましく、水、エタノール水溶液又は１，３－ブチレングリコール水溶液が特に好ましい。一態様において、エタノール水溶液及び１，３－ブチレングリコール水溶液は、エタノール又は１，３－ブチレングリコール濃度が１０～９８体積％が好ましく、３０～９０体積％がより好ましく、３０～７０体積％がさらに好ましい。
上記豆類由来原料として好ましくは、大豆オカラ、脱脂大豆、大豆抽出物等の大豆由来原料である。大豆抽出物は、大豆又は大豆処理物（例えば、大豆オカラ、脱脂大豆、粉砕大豆等）を溶媒で抽出して得ることができる。
上記豆類由来原料が、大豆オカラ、脱脂大豆及び大豆抽出物からなる群より選択される少なくとも１種である形態は、本発明の好ましい実施形態の１つである。大豆抽出物として、大豆処理物の抽出物が好ましく、脱脂大豆を溶媒で抽出して得られる脱脂大豆の抽出物がより好ましい。豆類由来原料は、タンパク質を含有する脱脂大豆の抽出物であることが好ましい。豆類由来組成物として、上記大豆由来原料の加水分解物が好ましい。
上記大豆オカラは、原料大豆を蒸煮やボイル等によって加熱した後にすり潰し、圧搾して豆乳を搾り出した後の残渣である。大豆オカラは、水分を含むものであっても、乾燥させたものであってもよい。
上記大豆オカラは、通常用いられる方法により製造することができる。
上記脱脂大豆は、大豆中の油分の少なくとも一部を除去したものであればよいが、油の含有量は、５重量％以下であることが好ましい。より好ましくは１重量％以下である。
上記脱脂大豆は、通常用いられる方法により製造することができる。好ましくは、脱脂大豆は、ヘキサンを用いた脂肪抽出によって製造されたものである。
上記豆類由来組成物における固形分含有量は特に制限されないが、９５～１００重量％であることが好ましい。
上記固形分含有量は、ＡＯＡＣ　９２５．１０－１９２５の水分及び全固形分の測定方法に準拠した重量法により測定することができる。
上記豆類由来組成物におけるピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量は、ピログルタミルロイシン換算で０．１～１００μｇ／ｍｇである。
上記固形分当たりの含有量として好ましくは０．５μｇ／ｍｇ以上であり、より好ましくは１μｇ／ｍｇ以上である。また、上記固形分当たりの含有量として好ましくは５０μｇ／ｍｇ以下であり、より好ましくは２５μｇ／ｍｇ以下であり、更に好ましくは１０μｇ／ｍｇ以下である。
一態様において、上記ピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量は、ピログルタミルロイシン換算で０．５～５０μｇ／ｍｇであることが好ましく、０．５～２５μｇ／ｍｇであることがより好ましく、１～１０μｇ／ｍｇであることが更に好ましい。
ピログルタミルロイシン又はその塩の含有量は、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により公知の方法で定量することが可能である。
ピログルタミルロイシン換算の量、又はこれに類する表現は、ピログルタミルロイシンの場合は、その量を意味し、ピログルタミルロイシンの塩の場合は、当該塩のモル数に、ピログルタミルロイシンの分子量を乗じて得られる値を意味する。
豆類由来組成物は、通常、ピログルタミルロイシン又はその塩以外のペプチド等の豆類由来成分を含む。
また、豆類由来組成物は、豆類由来成分以外の成分（その他の成分という）を含んでいてもよい。
上記豆類由来成分としては、豆類に含まれる成分及び該成分の分解物等が挙げられる。具体的には、タンパク質、炭水化物、脂質、ミネラル類、ビタミン類、イソフラボン類、アミノ酸等が挙げられる。
上記その他の成分としては特に制限されないが、豆類の加水分解に用いた触媒、溶媒等が挙げられる。
上記イソフラボン類としては例えば、ダイジン、ゲニスチン、グリシチン、プエラリン等のイソフラボンの配糖体；ダイゼイン、６－ヒドロキシダイゼイン、ジヒドロキシダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、ビオカニンＡ、フォルモネチン、クメストロール等のイソフラボンのアグリコン等が挙げられる。
一態様において、豆類由来組成物は、ダイジン及び／又はゲニスチンを含むことが好ましい。
ダイジンは、ダイゼインの７－Ｏ－グルコシドである。
ゲニスチンは、ゲニステインの７－Ｏ－グルコシドである。
上記豆類由来組成物中のダイジンの固形分当たりの含有量は特に制限されないが、０．０１～２０μｇ／ｍｇであることが好ましい。上記固形分当たりの含有量としてより好ましくは０．１～１０μｇ／ｍｇであり、更に好ましくは０．２～３μｇ／ｍｇである。
上記豆類由来組成物中のゲニスチンの固形分当たりの含有量は特に制限されないが、０．０１～２０μｇ／ｍｇであることが好ましい。上記固形分当たりの含有量としてより好ましくは０．１～１０μｇ／ｍｇであり、更に好ましくは０．２～３μｇ／ｍｇである。
上記ダイジン、ゲニスチンの含有量は、例えば、大豆および大豆を含む特定の食品中のイソフラボンを測定するためのＡＯＡＣ　Ｏｆｆｉｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　２００１．１０に準拠して液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により定量することが可能である。
上記豆類由来組成物は、ダイジンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０５～１０００であることが好ましい。上記重量比は、より好ましくは０．１～２００であり、更に好ましくは０．２～１２５であり、一層好ましくは０．５～１００であり、特に好ましくは１～１０である。
上記豆類由来組成物は、ゲニスチンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．４～１０００であることが好ましい。上記重量比は、より好ましくは０．１～２００であり、更に好ましくは０．２～１２５であり、一層好ましくは０．５～１００であり、特に好ましくは１～１０である。
上記豆類由来組成物は、下記の（Ａ）及び／又は（Ｂ）を満たすものであることが好ましい。
（Ａ）ダイジンを含み、上記ダイジンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０５～１０００である。
（Ｂ）ゲニスチンを含み、上記ゲニスチンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０４～１０００である。
上記豆類由来組成物は、より好ましくは（Ａ）及び（Ｂ）を満たす形態である。
上記豆類由来組成物中のタンパク質、ペプチド、アミノ酸及びその塩の合計量は、ケルダール法により測定することができる。上記豆類由来組成物は、ケルダール法により測定される窒素含有量が固形分１００重量％に対して８～１６重量％であることが好ましい。上記窒素含有量としてより好ましくは１０～１４重量％である。
上記窒素には、ピログルタミルロイシン又はその塩に由来する窒素も含まれる。
上記豆類由来組成物は、塩分を含んでいてもよいが、ナトリウムの含有量が固形分に対して５重量％以下であることが好ましい。より好ましくは０～３重量％であり、特に好ましくは０～２重量％である。ナトリウムの含有量は固形分１００重量％に対して０重量％を超えていてもよく、０．０１重量％以上であってもよい。
上記ナトリウムの含有量は例えば、吸光光度法により測定することができる。
豆類由来組成物の形態は特に限定されず、粉末等の固体状、ペースト状、液体状等のいずれであってもよい。
（豆類由来組成物の製造方法）
本発明の豆類由来組成物の製造方法は特に制限されないが、豆類由来原料を加水分解及び加熱する工程（以下、加水分解及び加熱工程ともいう。）を行って製造することが好ましい。上記加水分解及び加熱工程によって、豆類由来原料中のタンパク質が加水分解及び加熱される。これによって、ピログルタミルロイシン又はその塩を効率よく生成することができる。豆類由来原料を加水分解処理及び加熱処理することで、ピログルタミルロイシン又はその塩を含む豆類由来組成物を得ることができる。
上記加水分解及び加熱工程では、加水分解後に加熱を行うことが好ましい。一態様において、上記豆類由来組成物は、豆類由来原料を加水分解する工程（加水分解工程）と、次いで、該加水分解工程で得られた加水分解物を加熱する工程（加熱工程）とを行って製造されることがより好ましい。
これにより、豆類由来原料中のタンパク質が加水分解され、該タンパク質の加水分解物が加熱されることでピログルタミルロイシン又はその塩を効率よく生成することができる。
本発明は、豆類由来原料を加水分解する工程と、該加水分解工程で得られた加水分解物を加熱する工程とを有する豆類由来組成物の製造方法でもある。豆類由来原料及びその好ましい態様は、上述した通りである。豆類由来原料として、大豆オカラ、脱脂大豆及び大豆抽出物からなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、脱脂大豆の抽出物であることがより好ましい。豆類由来原料が脱脂工程を経たものであると、例えば、プロテアーゼによる加水分解がより効率よく進行するため好ましい。
上記加水分解の方法は、上記豆類由来原料中のタンパク質を加水分解できる限り特に制限されず、酸、塩基、プロテアーゼ等の触媒を用いて加水分解する方法、熱処理により加水分解する方法等が挙げられる。
上記加水分解を熱処理により行う場合、加水分解と加熱とを同時に行って豆類由来原料の加水分解物を製造することとなる。
上記加水分解の方法として好ましくは酸、塩基、プロテアーゼ等の触媒を用いる方法であり、より好ましくはプロテアーゼを用いる方法である。
上記加水分解において使用できる酸としては特に制限されないが、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、亜硫酸等の無機酸やシュウ酸、クエン酸、酢酸、ギ酸等の有機酸等が挙げられる。
上記加水分解において使用できる塩基としては特に制限されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属元素の水酸化物等が挙げられる。
上記加水分解において使用できるプロテアーゼとしては特に制限されず、細菌由来プロテアーゼ、真菌由来プロテアーゼ、植物由来プロテアーゼ、動物由来プロテアーゼ等が挙げられる。またプロテアーゼは、至適活性のｐＨ域により中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、酸性プロテアーゼに分類することができる。
細菌由来プロテアーゼとしては、例えば、プロテアーゼＮ、プロテアーゼＮＬ、プロテアーゼＳ、プロレザー（登録商標）ＦＧ－Ｆ、（以上、アマノエンザイム社製）；プロチンＮＹ、プロチンＰ、デスキン、デピレイス、プロチンＡ、サモアーゼ（登録商標）（以上、大和化成社製）；ビオプラーゼ（登録商標）ＸＬ－４１６Ｆ、ビオプラーゼ（登録商標）ＳＰ－４ＦＧ、ビオプラーゼ（登録商標）ＳＰ－１５ＦＧ（以上、ナガセケムテックス社製）；オリエンターゼ（登録商標）９０Ｎ、ヌクレイシン（登録商標）、オリエンターゼ（登録商標）１０ＮＬ、オリエンターゼ（登録商標）２２ＢＦ（以上、エイチビィアイ社製）；アロアーゼ（登録商標）ＡＰ－１０（ヤクルト薬品工業社製）；プロタメックス（登録商標）、ニュートラーゼ（登録商標）、アルカラーゼ（登録商標）（以上、ノボザイムズ社製）；Ｓｔｅｒｎｚｙｍ　ＢＰ　５２００（Ｓｔｅｒｎｚｙｍ社製）；ＣＯＲＯＬＡＳＥ　Ｎ、ＣＯＲＯＬＡＳＥ　７０８９、ＶＥＲＯＮ　Ｗ、ＶＥＲＯＮ　Ｐ（以上、ＡＢエンザイム社製）；エンチロンＮＢＳ（洛東化成工業社製）；アルカリプロテアーゼＧＬ４４０、ピュラフェクト（登録商標）４０００Ｌ、プロテアーゼ８９９、プロテックス６Ｌ（以上、ジェネンコア協和社製）；アクチナーゼ（登録商標）ＡＳ、アクチナーゼ（登録商標）ＡＦ（以上、科研ファルマ社製）；タシナーゼ（登録商標）（ジェネンコア協和社製）等の放線菌由来プロテアーゼ等が挙げられる。
真菌由来プロテアーゼとしては、例えば、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＭ、プロテアーゼＰ、ウマミザイム、ペプチダーゼＲ、ニューラーゼ（登録商標）Ａ、ニューラーゼ（登録商標）Ｆ（以上、天野エンザイム社製）；スミチーム（登録商標）ＡＰ、スミチーム（登録商標）ＬＰ、スミチーム（登録商標）ＭＰ、スミチーム（登録商標）ＦＰ、スミチーム（登録商標）ＬＰＬ（以上、新日本化学工業社製）；プロチン（登録商標）ＦＮ（大和化成社製）；デナプシン２Ｐ、デナチーム（登録商標）ＡＰ、ＸＰ－４１５（以上、ナガセケムテックス社製）；オリエンターゼ（登録商標）２０Ａ、オリエンターゼ（登録商標）ＯＮＳ、テトラーゼ（登録商標）Ｓ（以上、エイチビィアイ社製）；モルシン（登録商標）Ｆ、ＰＤ酵素、ＩＰ酵素、ＡＯ－プロテアーゼ（以上、キッコーマン社製）；サカナーゼ（科研ファルマ社製）；パンチダーゼ（登録商標）ＹＰ－ＳＳ、パンチダーゼ（登録商標）ＮＰ－２、パンチダーゼ（登録商標）Ｐ（以上、ヤクルト薬品工業社製）；フレーバザイム（登録商標）（ノボザイムズジャパン社製）；コクラーゼ（登録商標）ＳＳ、コクラーゼ（登録商標）Ｐ（以上、三共ライフテック社製）；ＶＥＲＯＮ　ＰＳ、ＣＯＲＯＬＡＳＥ　ＰＮ－Ｌ（以上、ＡＢエンザイム社製）等が挙げられる。
植物由来プロテアーゼとしては、例えば、パイナップル由来エンドペプチダーゼ（ブロメライン（登録商標））、パパインＷ－４０（アマノエンザイム社製）；食品用精製パパイン（ナガセケムテックス社製）等が挙げられる。
動物由来プロテアーゼとしては、例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等が挙げられる。
上記プロテアーゼとして好ましくはエンドペプチダーゼ活性を有するプロテアーゼである。
エンドペプチダーゼ活性を有するプロテアーゼとして好ましくはプロタメックス（登録商標）、ニュートラーゼ（登録商標）、アルカラーゼ（登録商標）、ブロメライン（登録商標）、Ｓｔｅｒｎｚｙｍ　ＢＰ　５２００（Ｓｔｅｒｎｚｙｍ社製）等である。
上記豆類由来原料の加水分解及び加熱は、溶媒の存在下で行われる。豆類由来原料に、必要に応じて溶媒を混合し、加水分解及び加熱工程を行う。豆類由来原料が溶媒を含む場合は、当該原料を加水分解及び加熱工程に供することもできる。
溶媒としては、水を含む溶媒が好ましく、水、エタノール、水とエタノールとの混合溶媒がより好ましく、水がさらに好ましい。
また、上記豆類由来原料中のタンパク質の含有量は特に制限されないが、固形分１００重量％に対して６０～１００重量％であることが好ましい。より好ましくは８０重量％以上、１００重量％未満であり、更に好ましくは８０重量％以上、９９重量％以下である。
豆類由来原料中のタンパク質の含有量はＡＯＡＣ　９８４．１３の飼料粉末中の粗タンパク質の測定法に準拠したケルダール法により測定することができる。
上記加水分解においてプロテアーゼを使用する場合、プロテアーゼの使用量は、上記豆類由来原料中のタンパク質の量に応じて設定することができるが、例えば、原料の固形分に対して０．０１～１０ＡＵ／ｇであることが好ましい。より好ましくは０．１～１ＡＵ／ｇである。
上記加水分解における反応温度は使用する触媒（酸、塩基、酵素）等に応じて設定することができるが３０～７０℃が好ましい。より好ましくは５０～６０℃であり、更に好ましくは５０～５５℃である。
上記加水分解においてプロテアーゼを使用する場合、使用するプロテアーゼの至適温度付近の温度で行うことが好ましい。プロテアーゼを使用する場合、反応温度は、例えば５０～５５℃であることが好ましい
上記加水分解において、熱処理により加水分解する場合、温度としては５０～５５℃であることが好ましい。
上記加水分解における反応時間は特に制限されないが、１～５時間が好ましい。より好ましくは３～５時間である。
上記加熱処理では、加熱温度は、１１０～１５０℃であることが好ましい。より好ましくは１２０～１４０℃である。
上記加熱は、圧力（ゲージ圧）１０１～３００ｋＰａで行うことが好ましく、１８０～２２０ｋＰａで行うことがより好ましい。
加熱時間は特に制限されないが、１～６時間が好ましい。より好ましくは２～４時間である。
豆類由来原料を加水分解処理した後、得られた加水分解物を加熱する場合、加水分解を行った反応溶液をそのまま加熱してもよい。
上記の加水分解及び加熱工程によって、ピログルタミルロイシン又はその塩を含むタンパク質加水分解物の溶液が得られる。上記の加水分解及び加熱工程で得られる溶液は、ピログルタミルロイシン又はその塩を含む。当該溶液は、上述した本発明の豆類由来組成物として使用することができる。必要に応じて、上記溶液から不溶性成分、粗大粒子等を除去してもよい。上記溶液に、希釈、濃縮、乾燥等の処理を行ってもよい。上記の加水分解及び加熱工程で得られる溶液、その希釈液、濃縮物、乾燥物等は、上述した本発明の豆類由来組成物として使用することができる。
上記豆類由来組成物の製造方法は、上記加水分解及び加熱工程後に、精製工程、濃縮工程、乾燥工程等を含んでいてもよい。
上記精製工程における精製方法としては特に制限されないが、ろ過、デカンテーション、遠心分離等の方法が挙げられる。上記精製工程としてより具体的には、ろ過等により不溶性成分、粗大粒子等を除去することが挙げられる。
上記濃縮工程における濃縮方法としては特に制限されないが、減圧濃縮、加熱濃縮、通風濃縮、冷凍濃縮、噴霧濃縮等の方法が挙げられる。
上記乾燥工程における乾燥方法としては特に制限されないが、天日乾燥、（熱）風乾燥、真空乾燥、通気乾燥、流動乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥、赤外線乾燥、高周波乾燥等の方法が挙げられる。
（ニワトリの砂肝由来組成物）
本発明のニワトリの砂肝由来組成物は、ニワトリの砂肝を原料とするものであって、ピログルタミルロイシン又はその塩を含むものであれば特に制限されない。本発明のニワトリの砂肝由来組成物は、ニワトリの砂肝加水分解物であることが好ましい。上記砂肝加水分解物は、ニワトリの砂肝に由来するタンパク質（ニワトリ砂肝タンパク質）の加水分解物を含むものである。ニワトリの砂肝由来組成物は、ピログルタミルロイシン又はその塩を含むニワトリ砂肝タンパク質加水分解物であることが好ましい。本発明のニワトリの砂肝由来組成物に含まれるピログルタミルロイシン又はその塩は、通常、ニワトリの砂肝タンパク質に由来する。上記ニワトリの砂肝加水分解物には、ニワトリの砂肝を加水分解して得られるニワトリ砂肝の加水分解処理物、ニワトリの砂肝を加水分解し、さらに加熱等の処理を行ったものが含まれる。
本発明のニワトリの砂肝由来組成物としては、ニワトリの砂肝を加水分解及び加熱して得られるものが好ましく、ニワトリの砂肝を加水分解し、得られた加水分解処理物を加熱して得られる、ニワトリの砂肝の加水分解処理物の加熱物がより好ましい。
ニワトリの砂肝は、ニワトリの砂嚢を意味する。
上記ニワトリの砂肝由来組成物におけるピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量は特に制限されないが、ピログルタミルロイシン換算で０．１～１００μｇ／ｍｇであることが好ましい。
上記固形分当たりの含有量としてより好ましくは０．５μｇ／ｍｇ以上であり、更に好ましくは０．８μｇ／ｍｇ以上であり、特に好ましくは１μｇ／ｍｇ以上である。また、上記固形分当たりの含有量としてより好ましくは５０μｇ／ｍｇ以下であり、更に好ましくは２５μｇ／ｍｇ以下であり、特に好ましくは１０μｇ／ｍｇ以下である。
一態様において、上記ニワトリの砂肝由来組成物において、上記ピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量は、ピログルタミルロイシン換算で０．５～５０μｇ／ｍｇであることがより好ましく、０．８～２５μｇ／ｍｇであることが更に好ましく、１～１０μｇ／ｍｇであることが特に好ましい。
上記ニワトリの砂肝由来組成物は、ニワトリの砂肝をプロテアーゼ処理して加水分解したものであることが好ましい。上記ニワトリの砂肝由来組成物がニワトリの砂肝のプロテアーゼ処理物である形態は、本発明の好ましい実施形態の１つである。本発明のニワトリの砂肝由来組成物として、ニワトリの砂肝のプロテアーゼ処理物を加熱して得られる、ニワトリの砂肝のプロテアーゼ処理物の加熱物がより好ましい。
上記ニワトリの砂肝由来組成物の形態は特に制限されず、粉末等の固体状、ペースト状、液体状等のいずれであってもよい。
上記ニワトリの砂肝由来組成物は、水等の溶媒を含んでいてもよい。液状の場合、固形分濃度は特に制限されないが、９５～１００重量％であることが好ましい。
ニワトリ砂肝タンパク質加水分解物は、通常、ペプチド等の混合物である。上記ニワトリの砂肝由来組成物は、ピログルタミルロイシン又はその塩を含むニワトリ砂肝タンパク質加水分解物を含むことが好ましい。ニワトリの砂肝由来組成物は、ピログルタミルロイシン等のペプチド又はその塩以外のその他の成分を含んでいてもよい。
その他の成分としては特に制限されないが、ニワトリの砂肝由来の成分、ニワトリの砂肝の加水分解に用いた触媒等、加水分解反応で生じたアミノ酸等の生成物等が挙げられる。
上記ニワトリの砂肝由来の成分としては、タンパク質、脂質、ミネラル類、ビタミン類等が挙げられる。
上記ニワトリの砂肝由来組成物中のタンパク質、ペプチド、アミノ酸及びその塩の合計量は、ケルダール法により測定することができる。上記ニワトリの砂肝由来組成物は、ケルダール法により測定される窒素含有量が固形分１００重量％に対して８～１６重量％であることが好ましい。上記窒素含有量としてより好ましくは１０～１４重量％である。
上記窒素には、ピログルタミルロイシン又はその塩に由来する窒素も含まれる。
上記ニワトリの砂肝由来組成物は、タウリンを含んでいてもよく、その含有量は、固形分当たり好ましくは１～１０ｍｇ／ｇであり、より好ましくは２～５ｍｇ／ｇである。
上記タウリンは、ＡＯＡＣ　９９４．１２に準拠し、ＨＰＬＣ（ＵＶ検出器）により測定することができる。
（ニワトリの砂肝由来組成物の製造方法）
本発明のニワトリの砂肝由来組成物の製造方法は特に制限されないが、ニワトリの砂肝を加水分解及び加熱する工程（以下、加水分解及び加熱工程ともいう。）を行って製造することが好ましい。
これにより、ニワトリの砂肝中のタンパク質が加水分解及び加熱されることでピログルタミルロイシン又はその塩を効率よく生成することができる。
上記加水分解及び加熱工程では、加水分解後に加熱を行うことが好ましい。上記ニワトリの砂肝由来組成物は、ニワトリの砂肝を加水分解する工程（以下、加水分解工程ともいう。）と、該加水分解工程で得られた加水分解物を加熱する工程（以下、加熱工程ともいう。）とを行って製造されることが好ましい。
これにより、ニワトリの砂肝中のタンパク質が加水分解され、該タンパク質の加水分解物が加熱されることでピログルタミルロイシン又はその塩を効率よく生成することができる。
本発明は、ニワトリの砂肝を加水分解する工程と、該加水分解工程で得られた加水分解物を加熱する工程とを有するニワトリの砂肝由来組成物の製造方法でもある。
上記ニワトリの砂肝由来組成物の製造方法の加水分解工程における加水分解の方法、加水分解工程で使用できるプロテアーゼ、反応温度、反応時間の具体例、好ましい形態、好ましい範囲は、上記豆類由来組成物の製造方法の加水分解工程におけるそれらと同様である。
上記加水分解工程に用いるニワトリの砂肝の原料の形態は特に制限されないが、例えば、加水分解の反応性の観点から、ミンチ状であることが好ましい。より好ましくはミンチ状の砂肝を水に懸濁させた形態である。
上記加水分解工程に用いる原料のニワトリの砂肝中のタンパク質の含有量は特に制限されないが、固形分１００重量％に対して６０～１００重量％であることが好ましい。より好ましくは８０重量％以上、１００重量％未満である。
ニワトリの砂肝中のタンパク質の含有量はケルダール法により測定することができる。
上記加水分解工程においてプロテアーゼを使用する場合、プロテアーゼの使用量は、上記砂肝原料中のタンパク質の量に応じて設定することができるが、例えば、原料の固形分に対して０．０１～１０ＡＵ／ｇであることが好ましい。より好ましくは０．１～１ＡＵ／ｇである。
上記ニワトリの砂肝由来組成物の製造方法の加熱工程における加熱温度、加熱時間の具体例、好ましい範囲は、上記豆類由来組成物の製造方法の加熱工程におけるそれらと同様である。
上記ニワトリの砂肝由来組成物の製造方法は、上記加熱工程後に精製工程、濃縮工程、乾燥工程等を含んでいてもよい。
上記精製工程における精製方法、上記濃縮工程における濃縮方法及び上記乾燥工程における乾燥方法の具体例、好ましい形態は、上記豆類由来組成物の製造方法におけるそれらと同様である。
（豆類由来組成物を含む経口用組成物、ニワトリの砂肝由来組成物を含む経口用組成物）
本発明の豆類由来組成物、及び、ニワトリの砂肝由来組成物は、一態様において、好ましくは経口用の組成物である。
上記豆類由来組成物を含む経口用組成物も本発明の１つである。
上記ニワトリの砂肝由来組成物を含む経口用組成物もまた本発明の１つである。
上記豆類由来組成物を含む経口用組成物及び上記ニワトリの砂肝由来組成物を含む経口用組成物をまとめて本発明の経口用組成物ということもある。
本発明の豆類由来組成物を含む経口用組成物は、豆類由来原料の加水分解物を含むことが好ましい。
上記経口用組成物中の豆類由来原料の加水分解物の含有量は特に限定されず、例えば、２～１００重量％であってよく、４～１００重量％が好ましい。
上記経口用組成物中のピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量は特に制限されないが、上述の豆類由来組成物における固形分当たりの含有量と同様であることが好ましい。
本発明のニワトリの砂肝由来組成物を含む経口用組成物は、ニワトリの砂肝加水分解物を含むことが好ましい。
上記経口用組成物中の、ニワトリの砂肝加水分解物の含有量は特に限定されず、例えば、２～１００重量％であってよく、４～１００重量％が好ましい。
上記経口用組成物中のピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量は特に制限されないが、上述のニワトリの砂肝由来組成物における固形分当たりの含有量と同様であることが好ましい。
上記豆類由来組成物を含む経口用組成物は、ダイジン及び／又はゲニスチンを含むことが好ましい。ダイジン及びゲニスチンは、豆類由来原料の加水分解物由来であってよい。
上記豆類由来組成物を含む経口用組成物中のダイジンの固形分当たりの含有量は特に制限されないが、０．０１～２０μｇ／ｍｇであることが好ましい。上記固形分当たりの含有量としてより好ましくは０．１～１０μｇ／ｍｇであり、更に好ましくは０．２～３μｇ／ｍｇである。
上記豆類由来組成物を含む経口用組成物中のゲニスチンの固形分当たりの含有量は特に制限されないが、０．０１～２０μｇ／ｍｇであることが好ましい。上記固形分当たりの含有量としてより好ましくは０．１～１０μｇ／ｍｇであり、更に好ましくは０．２～３μｇ／ｍｇである。
上記豆類由来組成物を含む経口用組成物は、ダイジンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０５～１０００であることが好ましい。上記重量比は、より好ましくは０．１～２００であり、更に好ましくは０．２～１２５であり、一層好ましくは０．５～１００であり、特に好ましくは１～１０である。
上記豆類由来組成物を含む経口用組成物は、ピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）に対するダイジンの重量比が、０．００１～２０であることが好ましい。上記重量比は、より好ましくは０．００５～１０であり、更に好ましくは０．００８～５であり、一層好ましくは０．０１～２であり、特に好ましくは０．１～１である。
上記豆類由来組成物を含む経口用組成物は、ゲニスチンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０４～１０００であることが好ましい。上記重量比は、より好ましくは０．１～２００であり、更に好ましくは０．２～１２５であり、一層好ましくは０．５～１００であり、特に好ましくは１～１０である。
上記豆類由来組成物を含む経口用組成物は、ピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）に対するゲニスチンの重量比が、０．００１～２５であることが好ましい。上記重量比は、より好ましくは０．００５～１０であり、更に好ましくは０．００８～５であり、一層好ましくは０．０１～２であり、特に好ましくは０．１～１である。
豆類由来組成物を含む経口用組成物が、下記の（Ａ）及び／又は（Ｂ）を満たす形態は、本発明の好ましい実施形態の１つである。
（Ａ）ダイジンを含み、上記ダイジンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０５～１０００である。
（Ｂ）ゲニスチンを含み、上記ゲニスチンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０４～１０００である。
上記経口用組成物は、より好ましくは（Ａ）及び（Ｂ）を満たす形態である。
（本発明の組成物の用途）
本発明の豆類由来組成物及びニワトリの砂肝由来組成物は、免疫活性化作用を有する。
本発明の豆類由来組成物及びニワトリの砂肝由来組成物は、自然免疫活性化作用を有することが好ましい。
本発明の組成物は、免疫活性化のための有効成分として好適に使用され得る。本発明の組成物は、自然免疫活性化のための有効成分としてより好適に使用され得る。
本発明の組成物及び経口用組成物は、免疫を活性化するために使用されることが好ましく、自然免疫を活性化するために使用されることがより好ましい。
一態様において、本発明の組成物及び経口用組成物は、自然免疫活性化用組成物として好ましく使用される。
自然免疫の活性化は、自然免疫の強化、自然免疫の維持を含む。
自然免疫系では、マクロファージ、単球等の血液中の免疫細胞が重要な役割を担っている。マクロファージの機能を改善することは、自然免疫の活性化に有効である。例えば、マクロファージの機能を改善することで、自然免疫を強化又は維持することができる。
マクロファージは、細菌、ウイルス、死んだ細胞等の異物を取り込む作用（貪食作用）を有する。侵入した病原体を貪食により取り込み、破壊することは、自然免疫反応の重要な構成要素である（参考文献１：Ｆｌａｎｎａｇａｎ　ＲＳ，　Ｊａｕｍｏｕｉｌｌｅ’　Ｖ，　Ｇｒｉｎｓｔｅｉｎ　Ｓ．　Ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ．　Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｐａｔｈｏｌ．　２０１２；７：６１－９８）。
貪食された異物はマクロファージによって食胞（ファゴソーム）に取り込まれる。ファゴソームはリソソームと融合し、ファゴリソソームが形成される。取り込まれた異物はファゴリソソームで死滅又は分解される。病原体を殺傷する過程で、ファゴリソソームで活性酸素種（ＲＯＳ）が産生される。貪食の間マクロファージによる活性酸素種の産生を促進することで、病原体の殺傷を促進することができる。マクロファージが産生する活性酸素種として、スーパーオキサイドアニオン（ＳＯ）、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル等が挙げられる。
マクロファージは刺激にさらされると、各種のサイトカインを放出する。マクロファージから分泌されるサイトカインは、免疫シグナル伝達経路の重要なメディエーターであり、免疫反応の開始と制御の役目を果たしている。マクロファージが産生するサイトカインに、例えば、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、単球走化性促進因子（ｍｏｎｏｃｙｔｅ　ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ－１：ＭＣＰ－１、ＣＣＬ２とも呼ばれる）等のケモカインがある。ケモカインは、自然免疫細胞及び適応免疫細胞を感染部位に動員し、その細胞傷害性機能及び抗菌性メディエーター産生能を増強することによって、感染時に重要な役割を果たす。ＩＬ－８は、細胞内カルシウムの上昇の誘導及び呼吸バーストの誘導によって、感染部位に好中球、マクロファージ等の標的細胞を動員し、活性化する（参考文献２：Ｂｒｅｃｈａｒｄ　Ｓ，　Ｂｕｅｂ　ＪＬ，　Ｔｓｃｈｉｒｈａｒｔ　ＥＪ．　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－８　ｐｒｉｍｅｓ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｂｕｒｓｔ　ｉｎ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ－ｌｉｋｅ　ＨＬ－６０　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ　ｃａｌｃｉｕｍ．　Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ．　２００５　Ｊｕｎ；３７（６）：５３１－４０）。好中球、マクロファージ等の標的細胞が感染部位に到着すると、ＩＬ－８はファゴサイトシスも引き起こす。ＭＣＰ－１も同様に単球及びマクロファージを感染部位に呼び寄せる。
上記のように、マクロファージは、貪食、サイトカインの放出、活性酸素種の産生等の機能を有する。後記の実施例に示されるように、本発明の組成物は、マクロファージの貪食を促進する作用を有する。また、本発明の組成物は、マクロファージによるサイトカインの放出を促進する作用を有する。本発明の組成物は、マクロファージによる活性酸素種の産生を促進する作用を有する。本発明の組成物は、マクロファージの機能を改善する作用を有する。
一態様において、本発明の組成物は、例えば、マクロファージ機能を改善するために使用することができる。本発明の組成物は、例えば、マクロファージの貪食を促進するため、マクロファージによるサイトカイン放出を促進するため、又はマクロファージによる活性酸素種の産生を促進するために使用することができる。
一態様において、本発明の組成物は、マクロファージの機能の改善によって自然免疫を強化又は維持するために好ましく使用することができる。マクロファージの機能の改善は、好ましくは、マクロファージの貪食促進、マクロファージによるサイトカイン放出の促進及びマクロファージによる活性酸素種の産生促進からなる群より選択される少なくとも１つである。上記サイトカインは、好ましくは、ＭＣＰ－１及び／又はＩＬ－８である。一態様において、サイトカインは、好ましくはＩＬ－８である。
本発明の組成物及び経口用組成物は、免疫活性化がその予防又は改善に有効な状態又は疾患の予防又は改善のために使用することができ、自然免疫活性化がその予防又は改善に有効な状態又は疾患の予防又は改善のために好ましく使用することができる。自然免疫活性化等の免疫活性化は、例えば、感染症、歯周病、悪性腫瘍等の状態又は疾患の予防又は改善に有効である。これらの状態又は疾患は、免疫系の機能低下によって発症しやすくなるためである。感染症として、ウイルス、バクテリアなどの微生物による感染症が挙げられ、例えば、コレラ菌、毒素原性大腸菌、赤痢菌、サルモネラ、ウイルス等による感染性腸炎、インフルエンザ、風邪症候群、口内炎等が挙げられる。一態様において、本発明の組成物及び経口用組成物は、上記の状態又は疾患を予防又は改善するために使用することができる。
本明細書中、状態又は疾患の予防は、状態又は疾患の発症を防止すること、状態又は疾患の発症を遅延させること、状態又は疾患の発症率を低下させること、状態又は疾患の発症のリスクを軽減すること、状態又は疾患に対する対象の抵抗性を高めることを包含する。状態又は疾患の改善は、対象を状態又は疾患から回復させること、状態又は疾患の症状を軽減すること、状態又は疾患の症状を好転させること、状態又は疾患の進行を遅延させること又は防止すること等を包含する。回復は、少なくとも部分的に回復させることを含む。
本発明の組成物及び経口用組成物には、自然免疫活性化作用等の免疫活性化作用により発揮される機能の表示が付されていてもよい。このような表示は機能性表示ともいう。上記表示は、特に限定されない。このような表示として、例えば、「免疫機能を維持」、「自然免疫機能を維持」、「免疫系応答を改善」、「自然免疫系応答を改善」、「免疫の健康をサポート」、「免疫防御を強化」、「自然免疫防御を強化」、「病原体に対する免疫防御をサポート」、「病原体に対する生体防御を強化」、「適切な免疫系応答の開始をサポート」、「適切な自然免疫系応答の開始をサポート」、「免疫機能が気になる方に」、「免疫システムを調節する」、及び、これらと同視できる表示又は機能性表示が挙げられる。
本発明の組成物及び経口用組成物には、上記のような表示の１又は２以上が付されていてもよい。本発明の一態様において、本発明の組成物及び経口用組成物は、上記の表示が１又は２以上付された飲食品であることが好ましい。また上記の表示は、上記の機能を得るために上記組成物を用いる旨の表示であってもよい。当該表示は、組成物自体に付されてもよいし、組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
本発明の豆類由来組成物及びニワトリの砂肝由来組成物は、腸管バリア機能を改善する作用を有する。
本発明の組成物は、腸管バリア機能を改善するための有効成分として使用され得る。
本発明の組成物及び経口用組成物はまた、腸管バリア機能を改善するために使用されることが好ましい。
一態様において、本発明の組成物及び経口用組成物は、腸管バリア機能改善用組成物として好ましく使用される。
腸管バリア機能を改善することにより、腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患の予防又は改善にも寄与し得る。
本発明において、腸管バリア機能とは、腸管上皮細胞外（腸管内腔）から体内への異物（例えば、エンドトキシン等の毒素、起炎物質、未消化物等）の侵入（透過）を防ぐ機能をいう。腸管には、大腸及び小腸が含まれる。正常な状態と比べて腸管上皮細胞外から体内への異物の侵入が促進されている状態を、腸管上皮細胞における異物の透過性が上昇（亢進）した状態と呼ぶ。腸管バリア機能改善とは、腸管上皮細胞における異物の透過性の上昇を抑制すること、及び、腸管上皮細胞における異物の透過性を低下させることのいずれをも意味する。また、本発明において、腸管バリア機能改善は、腸管バリア機能の低下を抑制すること、低下した腸管バリア機能を高めることを含む意味でも用いられる。例えば、腸管上皮細胞におけるタイトジャンクションタンパク質の発現を促進若しくは維持、又はその発現低下を抑制して透過性を調節することで、腸管バリア機能が改善される。一態様において、本発明の組成物及び経口用組成物は、腸管上皮細胞におけるタイトジャンクションタンパク質の発現を促進若しくは維持することによって、又は、タイトジャンクションタンパク質の発現低下を抑制することによって、腸管バリア機能を改善するために使用され得る。
腸管上皮細胞のタイトジャンクションは、上皮を横断する溶質及び有機分子の選択的な移動に関わるタイトジャンクションタンパク質により構成されている。タイトジャンクションタンパク質として、例えば、クローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ）ファミリー（例えば、クローディン－３等）、ＺＯ（ｚｏｎｕｌａ　ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）（例えば、ＺＯ－１）等が挙げられる。タイトジャンクションタンパク質の減少がタイトジャンクションの機能低下をもたらすことが報告されている。
腸管バリア機能改善効果は、例えば、腸管上皮細胞の電気抵抗値（経上皮電気抵抗値（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ＴＥＥＲ））が上昇することによって、又は、ＴＥＥＲの低下を抑制することによって示される。上記ＴＥＥＲを上昇させる又はその低下を抑制する物質は、腸管バリア機能を正常化又は強化する作用を有する。また、腸管バリア機能改善効果は、腸管上皮細胞におけるタイトジャンクションタンパク質の発現量の増加又は発現量の低下抑制によっても示される。また、腸管バリア機能改善効果は、腸管上皮細胞の腸管側から体内側へ透過する異物の量が減少することによっても示される。
当業者は、目的に応じて腸管バリア機能改善効果の具体的な評価方法を選択することができる。
例えば後述する実施例に示したように、ヒト腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ－２細胞）を用いた腸管透過モデルを用いて、ＴＥＥＲを測定する方法を用いることができる。
また、ヒト腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ－２細胞）を用いた腸管透過性モデルを用いて、タイトジャンクションタンパク質の発現を調べる方法を用いることができる。
具体的には、Ｃａｃｏ－２単層培養細胞にリポ多糖（ＬＰＳ）及びインターロイキン－１β（ＩＬ－１β）を添加してヒトで腸管バリア機能を破綻させ得る状態を作り出す。
被験物質の添加により、該物質を添加しない場合と比べてＴＥＥＲの低下が抑制されれば、その被験物質には腸管バリア機能改善効果があると評価することができる。
また、被験物質の添加により、該物質を添加しない場合と比較してタイトジャンクションタンパク質の発現が促進又は発現低下が抑制されれば、その被験物質には腸管バリア機能改善効果があると評価することができる。
実施例に示されるように、本発明の組成物は、Ｃａｃｏ－２を用いた腸管透過モデルにおいて、ＬＰＳ及びＩＬ－１βの添加によるＴＥＥＲの低下を抑制した。これは、本発明の組成物が、腸管バリア機能改善効果を有することを示す。
また、実施例に示されるように、Ｃａｃｏ－２細胞において、タイトジャンクションタンパク質であるＺＯ－１、クローディン－３の発現量は、ＬＰＳ及びＩＬ－１βの添加によって低下した。
本発明の組成物による前処理によって、ＬＰＳ及びＩＬ－１βの添加によるＺＯ－１、クローディン－３の発現量低下が抑制された。
従って、本発明の組成物は、腸管上皮細胞においてタイトジャンクションタンパク質の発現を促進若しくは維持、又は、タイトジャンクションタンパク質の発現低下を抑制する作用を有し、腸管バリア機能を改善するために使用することができる。
一態様において、本発明の組成物は、腸管上皮細胞におけるタイトジャンクションタンパク質の発現を促進するために使用することができる。一態様において、本発明の組成物は、腸管上皮細胞におけるタイトジャンクションタンパク質の発現の促進若しくは維持により、又は、タイトジャンクションタンパク質の発現の低下抑制により、腸管バリア機能を改善するために使用することができる。
タイトジャンクションタンパク質は、好ましくは、ＺＯ－１及び／又はクローディン－３である。
本発明の組成物及び経口用組成物は、腸管バリア機能改善効果を奏する。このため本発明の組成物及び経口用組成物は、腸管バリア機能の改善がその予防又は改善等に有効な状態又は疾患、例えば腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患の予防又は改善に有用である。腸管バリア機能の異常には、腸管バリア機能の低下が含まれる。腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患としては、腸管バリア機能の異常に起因する状態若しくは疾患、又は、腸管バリア機能の異常を伴う状態若しくは疾患が挙げられる。このような腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患として、例えば、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、全身性自己免疫疾患（関節リウマチ、エリテマトーデス等）、アレルギー（食物アレルギー、花粉症等）、生活習慣病（肥満、１型又は２型糖尿病、高血圧、高脂血症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、動脈硬化等）等が挙げられる（例えば、Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ　Ｌｉｖｅｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　３０３：　Ｇ７７５－Ｇ７８５，　２０１２；　Ｍｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｆｒｏｎｔ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　Ｖｏｌ．８，　Ａｒｔｉｃｌｅ　５９８，　２０１７；　Ｂｉｓｃｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ．，　ＢＭＣ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　２０１４　１４：１８９）。
腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患のより具体的な症状の一例として、下痢、便秘、おなか（腹部）の不快感（膨満感、ごろごろ感、腹痛等）等の症状が挙げられる。本発明の組成物及び経口用組成物は、腸管バリア機能を改善することにより、腸の状態を改善する作用を有する。従って本発明の組成物及び経口用組成物は、腸管バリア機能改善により腸の調子を整えることができ、上記のような腸の症状の予防又は改善のために有用である。一態様において、本発明の組成物及び経口用組成物は、整腸のため（例えば、下痢、便秘、腹部の不快感等を予防又は改善するため）に使用され得る。また、腸管バリア機能の異常は、生活習慣病等とも関連する（例えば上記のＢｉｓｃｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ．，　ＢＭＣ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　２０１４　１４：１８９）。腸管バリア機能を改善することは、生活習慣病の予防又は改善にも有効である。生活習慣病の症状として、糖代謝異常、脂質代謝異常、体脂肪増加、内臓脂肪増加、腹囲脂肪増加、高めの血圧、動脈硬化等が挙げられる。従って本発明の組成物及び経口用組成物は、腸管バリア機能を改善することにより、糖代謝の改善、脂質代謝の改善、体脂肪、内臓脂肪、腹囲脂肪等の脂肪の減少又は増加抑制、高めの血圧の改善、動脈硬化の改善等にも寄与し得る。
腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患として、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、関節炎、肥満誘発性変形性関節症、喘息も挙げられる。
一態様において、本発明の組成物及び経口用組成物は、腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患を予防又は改善するために使用することができる。本発明の組成物及び経口用組成物は、腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患の予防又は改善用の組成物であってよい。腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患は、下痢、便秘、腹部不快感、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、全身性自己免疫疾患、アレルギー、生活習慣病、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、関節炎、肥満誘発性変形性関節症又は喘息であってよい。
本発明の組成物及び経口用組成物には、腸管バリア機能改善作用により発揮される機能の表示が付されていてもよい。このような表示は機能性表示ともいう。上記表示は、特に限定されない。このような表示として、例えば、「腸管バリア機能を改善」、「腸管バリア機能の低下を抑制」、「腸管バリアの完全性を維持」、「腸管から全身へのバクテリアの移動を抑制」、「腸管透過性の増加を抑制」、「腸管の恒常性を維持」、「腸管バリアを保護」、「腸管バリア機能の破壊を抑制」及び「胃腸障害を予防」、及び、これらと同視できる表示又は機能性表示が挙げられる。
本発明の組成物及び経口用組成物には、腸管バリア機能改善作用に基づく作用として、整腸作用を有する旨の表示が付されていてもよい。整腸作用は、腸管バリア機能の改善に基づく整腸作用であればよく、特に限定されない。上記整腸作用を有する旨の表示の一例として、「便秘又は下痢気味な方に」、「おなかの調子が気になる方に」、「おなかの不快感を感じやすい方に」、「便通を改善」、「便の状態を改善」、「排便回数を改善」、「排便量を改善」、「おなかすっきり」、「おなかの調子を整える」、「腸の調子を整える」、「おなかの不快感を改善」、「ガスの発生を和らげる」、「おなかの張りを和らげる」、「おなかのごろごろ感を和らげる」、「腸を調節する」等が挙げられる。
本発明の組成物及び経口用組成物には、上記のような表示の１又は２以上が付されていてもよい。
本発明の一態様において、本発明の組成物及び経口用組成物は、上記の表示が１又は２以上付された飲食品であることが好ましい。また上記の表示は、上記の機能を得るために上記組成物を用いる旨の表示であってもよい。当該表示は、組成物自体に付されてもよいし、組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
以下では、本発明の経口用組成物についてさらに説明する。
本発明の経口用組成物は、治療用途（医療用途）又は非治療用途（非医療用途）のいずれにも適用することができる。
本発明の経口用組成物は、例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の形態で提供することができるが、これらに限定されるものではない。本発明の経口用組成物は、それ自体が飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等であってもよく、これらに使用される添加剤等の製剤、素材であってもよい。本発明の経口用組成物は、一例として、剤の形態で提供することができるが、本形態に限定されるものではない。当該剤をそのまま組成物として、又は、当該剤を含む組成物として提供することもできる。一態様において、本発明の経口用組成物は、免疫活性化剤ということもできる。一態様において、本発明の経口用組成物は、免疫活性化剤又は自然免疫活性化剤ということもできる。一態様において、本発明の経口用組成物は、腸管バリア機能改善剤ということもできる。
本発明の経口用組成物は、飲食品、経口用医薬品又は経口用医薬部外品であることが好ましく、飲食品又は経口用医薬品であることがより好ましく、飲食品であることが更に好ましい。
本発明の経口用組成物の形態は特に限定されず、固体状（例えば、粉末状、顆粒状、タブレット状等）、液状、ペースト状等のいずれであってもよい。
本発明の経口用組成物は、上述した豆類由来組成物又はニワトリの砂肝由来組成物を含み、更に飲食品、医薬品、医薬部外品等への添加物として許容されている各種の希釈剤、酸味料、抗酸化剤、安定剤、保存料、香料、乳化剤、色素類、調味料、ｐＨ調整剤、栄養強化剤等が添加されていてもよい。
例えば、本発明の経口用組成物を飲食品とする場合、豆類由来組成物又はニワトリの砂肝由来組成物に、飲食品に使用可能な成分（例えば、食品素材、必要に応じて使用される食品添加物等）を配合して、種々の飲食品（飲食品組成物）とすることができる。飲食品は特に限定されず、例えば、一般的な飲食品、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、健康補助食品、病者用食品等が挙げられる。上記健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、健康補助食品、病者用食品等は、例えば、液剤、細粒剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、ドライシロップ剤、流動食等の各種製剤形態として使用することができる。
錠剤、丸剤及び顆粒剤の場合、必要に応じて慣用的な剤皮を施した剤形、例えば糖衣錠、ゼラチン被包剤、腸溶被包剤、フィルムコーティング剤等とすることもでき、また錠剤は二重錠等の多層錠とすることもできる。
本発明の経口用組成物を医薬品又は医薬部外品とする場合、本発明の組成物に、薬理学的に許容される担体、必要に応じて添加される添加剤等を配合して、各種剤形の医薬品（医薬品組成物）又は医薬部外品（医薬部外品組成物）とすることができる。そのような担体、添加剤等は、医薬品又は医薬部外品に使用可能な、薬理学的に許容されるものであればよく、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤等の１又は２以上が挙げられる。経口投与のための剤形としては、例えば、液剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、糖衣錠、カプセル剤、懸濁液、乳剤、チュアブル剤等が挙げられる。医薬品は、非ヒト動物用医薬であってもよい。
本発明の経口用組成物を飼料とする場合には、本発明の組成物を飼料に配合すればよい。飼料には飼料添加剤も含まれる。飼料としては、例えば、牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料；ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料；犬、猫、小鳥等に用いるペットフードなどが挙げられる。
本発明の経口用組成物を、例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等とする場合、その製造方法は特に限定されず、本発明の組成物、又はこれを含有する原料を用いて、一般的な方法により製造することができる。
一態様において、本発明の経口用組成物は、液状組成物であることが好ましく、飲料であることがより好ましい。飲料は、例えば、機能性飲料であってよい。飲料の形態は特に限定されず、容器詰飲料であってよい。容器詰飲料の容器は特に限定されず、いずれの形態及び材質の容器を用いてもよく、例えば、アルミ缶、スチール缶等の金属製容器；ペットボトル等の樹脂製容器；紙パック等の紙容器；ガラス瓶等のガラス製容器；樽等の木製容器等の通常用いられる容器のいずれも用いることができる。このような容器に飲料を充填及び密閉することにより、容器詰飲料が得られる。
本発明の経口用組成物を投与又は摂取させる対象（以下、単に投与対象ともいう）は、ヒト、ヒト以外の動物が好ましく、ヒト、非ヒト哺乳動物がより好ましく、ヒトがさらに好ましい。
本発明の一態様において、本発明の経口用組成物の投与対象として、免疫活性化を必要とする又は希望する対象が好ましく、自然免疫活性化を必要とする又は希望する対象がより好ましい。例えば、自然免疫系の機能が低下した対象、上述した免疫活性化又は自然免疫活性化がその予防又は改善に有効な状態又は疾患の予防又は改善を希望する対象、当該状態又は疾患の予防又は改善を必要とする対象等が好適な対象として挙げられる。一態様において、投与対象として、上記の状態又は疾患を有する対象（例えば、患者）が挙げられる。一態様において、本発明の経口用組成物は、自然免疫活性化等の免疫活性化や、感染症等の上記の状態又は疾患の予防等を目的として、健常な状態にある対象に対して用いることができる。
本発明の一態様において、本発明の経口用組成物の投与対象として、腸管バリア機能改善を必要とする又は希望する対象が好ましい。例えば、腸管バリア機能が低下した対象、上述した腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患の予防又は改善を希望する対象、当該状態又は疾患の予防又は改善を必要とする対象等が好適な対象として挙げられる。一態様において、投与対象として、腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患を有する対象（例えば、患者）が挙げられる。一態様において、本発明の経口用組成物は、腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患の予防を目的として、健常な状態にある対象に対して用いることができる。
本発明の経口用組成物は、経口で摂取（経口投与）されるものである。本発明の経口用組成物を、例えば免疫活性化効果又は腸管バリア機能改善効果を得るために用いる場合、その投与量は、免疫活性化効果又は腸管バリア機能改善効果が得られるような量であればよく、特に限定されず、投与形態、投与方法、対象の体重等に応じて適宜設定すればよい。
本発明の一態様として、本発明の経口用組成物を、ヒト（好ましくは成人）を対象に投与する又は摂取させる場合、ピログルタミルロイシン又はその塩の摂取量は、ピログルタミルロイシン換算で、１日あたり、好ましくは０．００５ｍｇ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ以上、更に好ましくは０．０５ｍｇ以上、特に好ましくは０．１ｍｇ以上、また、好ましくは２００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下である。一態様において、本発明の経口用組成物をヒト（好ましくは成人）に摂取させる又は投与する場合、ピログルタミルロイシン又はその塩の摂取量は、ピログルタミルロイシン換算で、１日あたり、好ましくは０．００５～２００ｍｇ、より好ましくは０．００５～１００ｍｇ、さらに好ましくは０．０１～１００ｍｇ、さらにより好ましくは０．０５～１００ｍｇ、特に好ましくは０．１～１００ｍｇである。
ピログルタミルロイシン又はその塩の摂取量が上記範囲となるように、本発明の経口用組成物を、例えば１日１回で又は２～３回に分けて投与又は摂取することが好ましい。
本発明の一態様として、本発明の経口用組成物を、免疫活性化効果を得るために、ヒト（好ましくは成人）を対象に投与する又は摂取させる場合、ピログルタミルロイシン又はその塩の摂取量は、ピログルタミルロイシン換算で、１日あたり、好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは０．０５ｍｇ以上、さらに好ましくは０．１ｍｇ以上、また、好ましくは２００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下である。一態様において、本発明の経口用組成物を、免疫活性化効果を得るために、ヒト（好ましくは成人）に摂取させる又は投与する場合、ピログルタミルロイシン又はその塩の摂取量は、ピログルタミルロイシン換算で、１日あたり、好ましくは０．０１～２００ｍｇ、より好ましくは０．０５～２００ｍｇ、さらに好ましくは０．１～２００ｍｇ、特に好ましくは０．１～１００ｍｇである。
本発明の一態様として、本発明の経口用組成物を、腸管バリア機能改善効果を得るために、ヒト（好ましくは成人）を対象に投与する又は摂取させる場合、ピログルタミルロイシン又はその塩の摂取量は、ピログルタミルロイシン換算で、１日あたり、好ましくは０．００５ｍｇ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ以上、更に好ましくは０．０５ｍｇ以上、特に好ましくは０．１ｍｇ以上、また、好ましくは２００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下である。一態様において、本発明の経口用組成物を、腸管バリア機能改善効果を得るために、ヒト（好ましくは成人）に摂取させる又は投与する場合、ピログルタミルロイシン又はその塩の摂取量は、ピログルタミルロイシン換算で、１日あたり、好ましくは０．００５～２００ｍｇ、より好ましくは０．０１～２００ｍｇ、さらに好ましくは０．０５～２００ｍｇ、さらにより好ましくは０．０５～２００ｍｇ、特に好ましくは０．１～１００ｍｇである。
本発明の一態様においては、上記量の本発明の経口用組成物を、経口で摂取させる又は投与することが好ましい。上記ピログルタミルロイシン又はその塩の摂取量は、体重６０ｋｇあたり、１日あたりの摂取量であってよい。
一態様として例えば、本発明の経口用組成物は、該組成物の成人１人１日当たりの摂取量中、ピログルタミルロイシン又はその塩の含有量が、ピログルタミルロイシン換算で、０．００５～２００ｍｇが好ましく、０．００５～１００ｍｇがより好ましく、０．０１～１００ｍｇがさらに好ましく、０．０５～１００ｍｇがさらにより好ましく、０．１～１００ｍｇが特に好ましい。
本発明の経口用組成物は、継続して摂取又は投与されるものであることが好ましい。本発明の経口用組成物を継続的に摂取又は投与することによって、より高い効果が得られることが期待される。一態様において、本発明の経口用組成物は、好ましくは１週間以上、より好ましくは４週間以上、さらに好ましくは８週間以上継続して摂取又は投与されることが好ましい。本発明の経口用組成物は、飲食品などとして摂取可能であり、安全性の観点から、例えば長期摂取することにも問題が少ないと考えられる。
本発明は、以下の免疫活性化方法、使用も包含する。
豆類由来組成物を対象に投与することを含み、上記豆類由来組成物は、ピログルタミルロイシン又はその塩を含み、ピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量が、ピログルタミルロイシン換算で０．１～１００μｇ／ｍｇである、免疫活性化方法。
ピログルタミルロイシン又はその塩を含むニワトリの砂肝由来組成物を対象に投与する、免疫活性化方法。
ピログルタミルロイシン又はその塩を含み、ピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量が、ピログルタミルロイシン換算で０．１～１００μｇ／ｍｇである豆類由来組成物の、免疫を活性化するための使用。
ピログルタミルロイシン又はその塩を含むニワトリの砂肝由来組成物の、免疫を活性化するための使用。
上記方法及び使用は、治療的な方法及び使用であってもよく、非治療的な方法及び使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為、すなわち手術、治療又は診断を含まない概念である。本発明の組成物は、対象の免疫を活性化するために、対象に投与して（又は摂取させて）使用することができる。一態様において、本発明の組成物は、マクロファージの機能を改善するために使用することができる。本発明の組成物は、例えば、マクロファージの貪食促進、マクロファージによるサイトカイン放出の促進又はマクロファージによる活性酸素種の産生促進によって免疫を活性化するために使用することができる。
上記方法及び使用において、本発明の組成物は、免疫活性化効果が得られる量、すなわち有効量であればよく、特に限定されず、例えば上述した量を投与することが好ましい。好ましくは、本発明の組成物を経口投与する。上記組成物、対象（投与対象）、投与方法、投与量及びそれらの好ましい態様等は、上述した本発明の組成物におけるものと同じである。
上記方法及び使用において、免疫の活性化は、自然免疫の活性化であることが好ましい。
一態様において、本発明の組成物は、上記の感染症、歯周病、悪性腫瘍等の状態又は疾患を予防又は改善するために使用することができる。本発明は、本発明の組成物を対象に投与する、上記の状態又は疾患の予防又は改善方法も包含する。上記組成物、対象（投与対象）、投与方法、投与量及びそれらの好ましい態様等は、上述した本発明の組成物におけるものと同じである。
本発明は、以下の腸管バリア機能改善方法、使用も包含する。
ピログルタミルロイシン又はその塩を含み、ピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量が、ピログルタミルロイシン換算で０．１～１００μｇ／ｍｇである豆類由来組成物を対象に投与する、腸管バリア機能改善方法。
ピログルタミルロイシン又はその塩を含むニワトリの砂肝由来組成物を対象に投与する、腸管バリア機能改善方法。
ピログルタミルロイシン又はその塩を含み、ピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量が、ピログルタミルロイシン換算で０．１～１００μｇ／ｍｇである豆類由来組成物の、腸管バリア機能を改善するための使用。
ピログルタミルロイシン又はその塩を含むニワトリの砂肝由来組成物の、腸管バリア機能を改善するための使用。
上記方法及び使用は、治療的な方法及び使用であってもよく、非治療的な方法及び使用であってもよい。本発明の組成物は、対象の腸管バリア機能を改善するために、対象に投与して（又は摂取させて）使用することができる。本発明の組成物は、腸管上皮細胞におけるタイトジャンクションタンパク質の発現を促進若しくは維持するため、又は、タイトジャンクションタンパク質の発現低下を抑制するために使用することができる。一態様において、本発明の組成物は、例えば、腸管上皮細胞におけるタイトジャンクションタンパク質の発現促進若しくは維持、タイトジャンクションタンパク質の発現の低下抑制、ＴＥＥＲの維持又はＴＥＥＲの低下抑制によって腸管バリア機能を改善するために使用することができる。
上記方法及び使用において、本発明の組成物の投与量は、腸管バリア機能改善効果が得られる量、すなわち有効量であればよく、特に限定されず、例えば上述した量を投与することが好ましい。好ましくは、本発明の組成物を経口投与する。上記組成物、対象（投与対象）、投与方法、投与量及びそれらの好ましい態様等は、上述した本発明の組成物におけるものと同じである。
一態様において、本発明の組成物は、上記の腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患を予防又は改善するために使用することができる。
本発明は、本発明の組成物を対象に投与する、腸管バリア機能の異常が関連する状態又は疾患の予防又は改善方法も包含する。ピログルタミルロイシン又はその塩、対象（投与対象）、投与方法、投与量及びそれらの好ましい態様等は、上述した腸管バリア機能改善用組成物と同じである。
本発明は、免疫活性化用組成物の製造における、本発明の組成物の使用；腸管バリア機能改善用組成物の製造における、本発明の組成物の使用、も包含する。免疫活性化用組成物、腸管バリア機能改善用組成物及びその好ましい態様は、上述した本発明の組成物及びその好ましい態様と同じである。
本発明の組成物は、免疫活性化のために使用される飲食品、医薬品、医薬部外品等の製造のために使用することができる。
本発明は、免疫活性化のために使用される、上述した本発明の豆類由来組成物も包含する。
本発明は更に、免疫活性化のために使用される、ピログルタミルロイシン又はその塩を含むニワトリの砂肝由来組成物も包含する。
本発明の組成物は、腸管バリア機能改善のために使用される飲食品、医薬品、医薬部外品等の製造のために使用することができる。
本発明は、腸管バリア機能改善のために使用される、上述した本発明の豆類由来組成物も包含する。
本発明は更に、腸管バリア機能改善のために使用される、ピログルタミルロイシン又はその塩を含むニワトリの砂肝由来組成物も包含する。
上記使用における本発明の組成物の好ましい態様もまた、上述のとおりである。
本明細書において下限値と上限値によって表されている数値範囲、即ち「下限値～上限値」は、それら下限値及び上限値を含む。例えば、「１～２」により表される範囲は、１以上２以下を意味し、１及び２を含む。本明細書において、上限及び下限は、いずれの組み合わせによる範囲としてもよい。
なお、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全ては、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、本発明をより具体的に説明する実施例を示す。なお、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
＜実施例１＞
（大豆原料の加水分解物の調製）
大豆タンパク質単離物（ジェブセン＆ジェッセン社製、ＧＳ５１００）を、大豆原料として使用した。
大豆原料を温水で懸濁して得た混合物に、エンドペプチダーゼを添加し、数時間酵素処理して加水分解を行った。得られた加水分解物を含む溶液を加圧下で１００℃以上の高温で数時間加熱した。加熱後の溶液をふるいに通して大きな粒子を除去し、次いで、ろ過、濃縮、噴霧乾燥等の後処理を行い、大豆原料の加水分解物を粉末として得た。
上記の調製方法を２回行い、バッチの異なる大豆原料の加水分解物（組成物（Ａ）及び（Ｂ））を得た。得られた大豆原料の加水分解物中のピログルタミルロイシン（ｐＥＬ）、ダイジン及びゲニスチンの固形分当たりの含有量をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。これらの含有量と、ダイジン又はゲニスチンに対するピログルタミルロイシンの重量比とを表１に示した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定条件は以下のとおりである。
使用機器：ＬＣ（アジレント・テクノロジー（株）製、Ａｇｉｌｅｎｔ　１２９０）と飛行時間型分光器（ＡＢ　Ｓｃｉｅｘ社製、ＴｒｉｐｌｅＴＯＦＴＭ５６００システム）との組み合わせ。
ＬＣカラム：Ｅｃｌｉｐｓｅ　ｐｌｕｓ　Ｃ１８、１８μｍ、２．１×５０ｍｍ（アジレント・テクノロジー（株）製）
試料注入量：５μＬ
カラム温度：常温
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＜実施例２＞
（ニワトリの砂肝加水分解物の調製）
鶏の新鮮な砂肝を細かくミンチし、温水に懸濁させて得た混合物に、エンドペプチダーゼ（アルカリ性プロテアーゼ）を添加し、数時間酵素処理して加水分解を行った。得られた加水分解物を含む溶液を１００℃以上の高温で数時間加熱した。加熱後の溶液をふるいに通して大きな粒子を除去し、次いで、ろ過、濃縮、噴霧乾燥等の後処理を行い、ニワトリの砂肝加水分解物を粉末として得た。
得られたニワトリの砂肝加水分解物中のピログルタミルロイシンの固形分当たりの含有量を上記条件によりＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定したところ、２．１μｇ／ｍｇであった。
＜実施例３＞
実施例１で得られた大豆原料の加水分解物（組成物（Ａ））（以下、ＨＳＯともいう）、実施例２で得られたニワトリの砂肝加水分解物（以下、ＨＣＧともいう）の免疫への効果をｉｎ　ｖｉｔｒｏ免疫アッセイを用いて調べた。
Ｕ９３７細胞株は、ＡＴＣＣから入手した。Ｐｈｏｒｂｏｌ　１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ　１３－ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。ｐＨｒｏｄｏＴＭ　Ｒｅｄ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢｉｏｐａｒｔｉｃｌｅｓＴＭ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）は、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。
（貪食（ファゴサイトシス）アッセイ）
Ｕ９３７細胞は、単球の形態を示す細胞株である。Ｕ９３７細胞をマクロファージに分化させて貪食アッセイを行った。
Ｕ９３７細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）　１６４０培地（以下、分化培地ともいう。）で培養した。Ｕ９３７細胞を６ウェルプレートで１０ｎｇ／ｍＬ　ＰＭＡで２４時間分化させた後、培地をリフレッシュし、さらに２４時間分化させた。分化したＵ９３７細胞を９６ウェルプレートに５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で再播種してＨＳＯ又はＨＣＧ処理に用いた。ＨＳＯ又はＨＣＧ処理を行わない細胞を、コントロール（未処理コントロール）とした。ＨＳＯ又はＨＣＧ処理においては、分化したＵ９３７細胞を、ＨＳＯ又はＨＣＧを含む分化培地で培養した。
ＨＳＯ処理には、ＨＳＯ濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬの分化培地を使用した。
ＨＣＧ処理には、ＨＣＧ濃度が１．５ｍｇ／ｍＬの分化培地を使用した。
細胞をＨＳＯ又はＨＣＧで２４時間処理し、ｐＨｒｏｄｏＴＭ　Ｒｅｄ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢｉｏｐａｒｔｉｃｌｅｓＴＭでさらに２時間インキュベートした。フローサイトメトリー分析のため、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定して、１０μＭのＨｏｅｃｈｓｔ　３３２５８で染色した。フローサイトメトリーは、ＢＤ　ＬＳＲ　ＩＩ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤＴＭ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。データの解析にはＦｌｏｗＪｏ　Ｖ１０．７．１－ＣＬ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤＴＭ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。
（細胞性活性酸素種（ＲＯＳ）検出アッセイ）
分化したＵ９３７細胞（Ｕ９３７マクロファージ）を、上記のようにＨＳＯ又はＨＣＧで処理した。
ＨＳＯ処理には、ＨＳＯ濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬの分化培地を使用した。
ＨＣＧ処理には、ＨＣＧ濃度が１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬの分化培地を使用した。
処理後、培地上清のＲＯＳ産生量を測定し、ＨＳＯ及びＨＣＧの効果を評価した。
ＲＯＳ産生量は、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ＲＯＳ／Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ社）を用いて測定した。蛍光は、Ｖａｒｉｎｏｓｋａｎ　ＬＵＸ　Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。データは、未処理コントロールのＲＯＳ産生量に対する相対比（倍率変化）で示した。
（サイトカイン放出アッセイ）
ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ　１６４０培地中で培養した。細胞を９６ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度で播種し、ＨＳＯ又はＨＣＧで処理した。
ＨＳＯ処理には、ＨＳＯ濃度が１ｍｇ／ｍＬのＲＰＭＩ　１６４０培地を使用した。
２μｇ／ｍＬ　ＬＰＳで処理した細胞を陽性コントロールとした。２４時間処理後、細胞培養上清を回収し、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ　Ｍｕｌｔｉ－Ａｎａｌｙｔｅ　Ｆｌｏｗ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を用いて炎症性サイトカイン／ケモカイン分析を行った。マルチプレックスアッセイは、製造業者のプロトコールに従って実施した。データはＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ　Ｄａｔａ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して解析した。
（統計解析）
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　ｖｅｒｓｉｏｎ　７．０（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて実施した。すべての結果は、平均値±標準偏差（ＳＤ）で表した。統計解析は、特に断りのない限り、Ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡの後、事後検定Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によって行った。データは、Ｐ値、ｐ＜０．０５の場合に有意であるとみなした。
（結果）
（分化したＵ９３７細胞の貪食活性へのＨＳＯ及びＨＣＧの効果）
図１Ａは、分化したＵ９３７細胞の貪食活性へのＨＳＯの効果を調べた結果を示すグラフであり、図１Ｂは、分化したＵ９３７細胞の貪食活性へのＨＣＧの効果を調べた結果を示すグラフである。数値は平均値±ＳＤを表す（ｎ＝３）。＊は、コントロールに対してｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１の有意差を示す。
図１Ａの縦軸の「平均蛍光強度」は、ｐＨｒｏｄｏ　Ｒｅｄ陽性細胞の平均蛍光強度を示す。
図１Ｂの縦軸の「ｐＨｒｏｄｏ　Ｒｅｄ陽性細胞の割合（％）」は、全細胞に対するｐＨｒｏｄｏ　Ｒｅｄ陽性細胞の割合を示す。
図１Ａに示すグラフの縦軸（ｐＨｒｏｄｏ　Ｒｅｄ陽性細胞の平均蛍光強度）の値が大きいほど、Ｕ９３７細胞の貪食活性が促進されていることを示す。
図１Ｂに示すグラフの縦軸（ｐＨｒｏｄｏ　Ｒｅｄ陽性細胞の割合（％））の値が大きいほど、Ｕ９３７細胞の貪食活性が促進されていることを示す。
コントロール群と比較して、ｐＨｒｏｄｏ　Ｒｅｄ陽性細胞の割合の増加及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）レベルの上昇に特徴づけられるように、ＨＳＯ及びＨＣＧは、分化したＵ９３７細胞の貪食を促進した。
（活性酸素種（ＲＯＳ）の産生へのＨＳＯ及びＨＣＧの効果）
食細胞の呼吸バーストにおけるＲＯＳの産生は、病原体の殺傷と関連している。さらに、ＨＳＯ又はＨＣＧ処理が分化したＵ９３７細胞のＲＯＳ産生を促進するかどうかを調べた。
図２Ａは、分化したＵ９３７細胞におけるＲＯＳ産生に対するＨＳＯの効果を調べた結果を示すグラフであり、図２Ｂは、分化したＵ９３７細胞におけるＲＯＳ産生に対するＨＣＧの効果を調べた結果を示すグラフである。数値は平均値±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊＊＊は、コントロールに対してｐ＜０．００１で有意差があることを示す。
図２Ａ及び図２Ｂは、ＨＳＯ又はＨＣＧ処理後の培地上清中のＲＯＳの相対量を示す。
結果は、コントロール（未処理コントロール）の培養上清中のＲＯＳの相対量を１としたときの、当該コントロールに対する倍率変化（相対比率）を示している。
ＨＳＯ及びＨＣＧは、分化したＵ９３７細胞の活性酸素種産生を促進する作用を示した。
（ＨＳＯのｈＰＢＭＣのサイトカイン放出への効果）
図３Ａ及び図３Ｂに、ｈＰＢＭＣからのサイトカイン分泌へのＨＳＯの効果を調べた結果を示す。図３Ａは、ＨＳＯで処理したｈＰＢＭＣの培養上清中のＭＣＰ－１の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。図３Ｂは、ＨＳＯで処理したｈＰＢＭＣの培養上清中のＩＬ－８濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。数値は平均値±ＳＤを表す（ｎ＝３）。＊＊＊はコントロールに対してｐ＜０．００１の有意差を示す。ＨＳＯは、ｈＰＢＭＣによるＭＣＰ－１とＩＬ－８の分泌を促進した。
上記のように、ＨＳＯ及びＨＣＧは、分化したＵ９３７マクロファージの貪食活性を高めることができた。また、ＨＳＯは、ｈＰＢＭＣのケモカイン発現を促進して免疫応答をサポートした。ＨＳＯ及びＨＣＧは、浸潤している免疫細胞の反応を改善することにより、自然免疫力を高めることができた。
＜実施例４＞
実施例１で得られたＨＳＯ、実施例２で得られたＨＣＧの腸管バリア機能への効果をｉｎ　ｖｉｔｒｏ炎症性腸疾患（ＩＢＤ）モデルを用いて調べた。
Ｃａｃｏ－２細胞株は、ＡＴＣＣから入手した。Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｉ，　Ｒａｔ　Ｔａｉｌ、ＺＯ－１モノクローナル抗体、Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ　６４７、Ｄｏｎｋｅｙ　ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）　Ａｌｅｘａ　５６８及びＧｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）　Ａｌｅｘａ　５６８は、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。クローディン－３モノクローナル抗体と組換えヒトＩＬ－１β（ＩＬ－１β）は、それぞれＣｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社とＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）０．４μｍ　Ｐｏｒｅ　Ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ　ＭｅｍｂｒａｎｅはＣｏｒｎｉｎｇ社から購入した。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のリポ多糖（ＬＰＳ）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。
（Ｃａｃｏ－２細胞培養）
Ｃａｃｏ－２細胞は、２０％ＦＢＳ、１Ｘ　ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＭＥＭ培地中で維持した。実験では、コラーゲンＩでコートしたトランズウェルインサート又は９６ウェルプレートに、細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、２１日間分化させた。分化の最初の１週間は２０％ＦＢＳを添加した培地で、培地の半量を交換し、その後の週は１０％ＦＢＳを添加した培地で、全培地交換を行った。培地は１日おきに交換した。Ｃａｃｏ－２細胞は、２１日間の分化期間の終了時に分化したとみなされた。
（ＨＳＯ又はＨＣＧ処理）
分化したＣａｃｏ－２単層をＨＳＯ又はＨＣＧで１時間前処理した。
前処理において、ＨＳＯは、ＨＳＯ濃度が１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、ＨＣＧは、ＨＣＧ濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。
１時間の前処理後、１０μｇ／ｍＬ　ＬＰＳ及び１０ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－１βをトランズウェルの頂部チャンバー又は９６ウェルプレートに直接加え、２４～４８時間細胞を培養した。
つまり、ＨＳＯ又はＨＣＧ処理サンプルでは、上記前処理後、Ｃａｃｏ－２細胞を、ＨＳＯ又はＨＣＧの存在下、刺激剤（ＬＰＳ及びＩＬ－１β）で２４～４８時間処理した。
刺激剤（ＬＰＳ及びＩＬ－１β）並びにＨＳＯ及びＨＣＧを添加しないウェルを、刺激なしコントロールとした。刺激剤を添加し、ＨＳＯ及びＨＣＧを添加しないウェルを、刺激ありコントロールとした。陽性コントロールとしてデキサメタゾンを使用した。陽性コントロールでは、刺激剤及びデキサメタゾン（デキサメタゾン濃度１００μＭ）を添加した培地で、細胞を２４～４８時間培養した。
（経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定）
ＴＥＥＲは、ＥＶＯＭ３メーター（Ｗｏｒｌｄ　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）のＳＴＸ１００電極を用いて測定した。ＴＥＥＲ測定は、ＨＳＯ又はＨＣＧによる前処理前（０時間（Ｂａｓｅｌｉｎｅ））と刺激剤（ＬＰＳ及びＩＬ－１β）で２４時間及び４８時間処理した後に行った。下記式に従って、ｒｅｐｏｒｔｅｄ　ＴＥＥＲ値（ＴＥＥＲＲｅｐｏｒｔｅｄ）を決定した。
ＴＥＥＲＲｅｐｏｒｔｅｄ＝［ＲＣｅｌｌｓ（Ω）－ＲＢｌａｎｋ（Ω）］×インサート表面積（ｃｍ２）
（上記式中、ＲＣｅｌｌｓ（Ω）は、細胞を含むウェルの電気抵抗値であり、ＲＢｌａｎｋ（Ω）は、細胞を含まないウェル（ブランク）の電気抵抗値である。インサート表面積は、細胞を培養したウェルの表面積である。）
実施例４においては、上記インサート表面積は０．３３ｃｍ２であった。
算出したＴＥＥＲＲｅｐｏｒｔｅｄを、以下のように２回正規化し、正規化ＴＥＥＲ（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ＴＥＥＲ）を得た。最初に、すべての時点（０時間（ＨＳＯ又はＨＣＧによる前処理前）、刺激剤処理２４時間又は４８時間）についてＢａｓｅｌｉｎｅ　ＴＥＥＲＲｅｐｏｒｔｅｄに対して正規化し、次に、その時点の刺激なしコントロール（２４時間又は４８時間インキュベート後の刺激なしコントロール（刺激剤添加なし））に対して正規化した。Ｂａｓｅｌｉｎｅ　ＴＥＥＲＲｅｐｏｒｔｅｄは、ＨＳＯ又はＨＣＧによる前処理前の０時間におけるｒｅｐｏｒｔｅｄ　ＴＥＥＲ値（ＴＥＥＲＲｅｐｏｒｔｅｄ）である。ここで、正規化とは、平均値で割ることを指す。例えば、ある時点のＢａｓｅｌｉｎｅ　ＴＥＥＲＲｅｐｏｒｔｅｄに対する正規化は、当該時点のＴＥＥＲＲｅｐｏｒｔｅｄの計算値の平均値を、Ｂａｓｅｌｉｎｅ　ＴＥＥＲＲｅｐｏｒｔｅｄの平均値で割ることで行った。
（タイトジャンクションタンパク質の免疫細胞化学的研究）
上記のように、Ｃａｃｏ－２細胞を９６ウェルプレート中で分化させ、処理した。処理期間の終わりに、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００で透過処理した。細胞をＰＢＳ中の１％ＢＳＡで室温で１時間ブロックした後、一次抗体ＺＯ－１又はクローディン－３と４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞を二次抗体と１時間インキュベートした。細胞核を可視化するために、ＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を二次抗体とともにインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ　Ｐｉｃｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で画像化した。画像はＣｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ｘｐｒｅｓｓ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて処理及び解析した。各タイトジャンクションタンパク質の染色の蛍光強度は、フィールドビュー内のＤＡＰＩ陽性細胞数に対して正規化し、陽性細胞率（％）として表した。
（統計解析）
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　ｖｅｒｓｉｏｎ　７．０（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて実施した。すべての結果は、平均値±標準偏差（ＳＤ）で表した。統計解析は、特に断りのない限り、Ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡの後、事後検定Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によって行った。データは、Ｐ値、ｐ＜０．０５の場合に有意であるとみなした。
（結果）
（分化したＣａｃｏ－２細胞のＴＥＥＲへのＨＳＯ及びＨＣＧの効果）
図４Ａは、刺激剤（ＬＰＳ及びＩＬ－１β）で２４時間及び４８時間処理した分化したＣａｃｏ－２細胞の正規化ＴＥＥＲへのＨＳＯの効果を示すグラフである。
図４Ｂは、刺激剤（ＬＰＳ及びＩＬ－１β）で２４時間及び４８時間処理した分化したＣａｃｏ－２細胞の正規化ＴＥＥＲへのＨＣＧの効果を示すグラフである。
データは、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ分析と事後検定Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で解析した。数値は平均値±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊＊はｐ＜０．０１の有意差を、＊＊＊はｐ＜０．００１の有意差をそれぞれ示す（刺激剤処理２４時間の刺激ありコントロールに対して）。＃はｐ＜０．０５の有意差を、＃＃は、ｐ＜０．０１の有意差を、＃＃＃は、ｐ＜０．００１の有意差をそれぞれ示す（刺激剤処理４８時間の刺激ありコントロールに対して）。
図４Ａ及び図４Ｂ中の白いバーは、０時間（ＨＳＯ又はＨＣＧによる前処理前、ベースライン）、灰色のバーは、刺激剤処理２４時間、黒色のバーは、刺激剤処理４８時間である。
図４Ａ及び図４Ｂ並びに後記の図５Ａ～図５Ｄ中、「刺激なし」は刺激なしコントロール、「刺激あり」は刺激ありコントロール、「ＤＸ」は陽性コントロール（デキサメタゾン）である。
ＴＥＥＲは、細胞のバリアの完全性及び透過性の指標となる。刺激なしコントロールの細胞は、ＩＬ－１β及びＬＰＳで処理した細胞よりもＴＥＥＲが高かった。
ＩＬ－１β及びＬＰＳによる刺激は、分化したＣａｃｏ－２細胞のバリア形成を破壊し、刺激なしコントロールと比較してＴＥＥＲ測定において低下をもたらした。
ＴＥＥＲの低下は、ＨＳＯ又はＨＣＧで前処理することにより軽減され、その効果は刺激後４８時間まで維持された。
（分化したＣａｃｏ－２細胞のタイトジャンクションタンパク質発現へのＨＳＯ及びＨＣＧの効果）
図５Ａは、分化したＣａｃｏ－２細胞におけるＺＯ－１の発現へのＨＳＯの効果を示すグラフであり、図５Ｂは、分化したＣａｃｏ－２細胞におけるＺＯ－１の発現へのＨＣＧの効果を示すグラフであり、図５Ｃは、分化したＣａｃｏ－２細胞におけるクローディン－３の発現へのＨＳＯの効果を示すグラフであり、図５Ｄは、分化したＣａｃｏ－２細胞におけるクローディン－３の発現へのＨＣＧの効果を示すグラフである。数値は平均値±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊＊＊は、ｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５の有意差を示す（刺激ありコントロールに対して）。
図５Ａ～図５Ｄに示される陽性細胞（％）の値が高いほど、Ｃａｃｏ－２細胞によるＺＯ－１及びクローディン－３の発現が高いことを意味する。
ＺＯ－１、クローディン－３等のタイトジャンクションタンパク質は、必要な分子の輸送を可能にし、有害な物質を制限することで、バリアの完全性の維持に寄与している。ＺＯ－１及びクローディン－３の発現量の低下は、ＨＳＯ又はＨＣＧの前処理により抑制された。
上記の結果から、ＨＳＯ及びＨＣＧは、腸管バリア機能改善作用を有することが明らかとなった。ＨＳＯ及びＨＣＧは、慢性炎症状態においてＴＥＥＲの低下を防ぎ、タイトジャンクションタンパク質の発現を維持することによって、腸管バリアの完全性を回復させることができる。

 

Claims (19)

  1. ピログルタミルロイシン又はその塩を含み、ピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量が、ピログルタミルロイシン換算で０．１～１００μｇ／ｍｇである、豆類由来組成物。
  2. 前記豆類由来組成物が、豆類由来原料の加水分解物である、請求項１に記載の豆類由来組成物。
  3. 前記豆類由来組成物が、豆類由来原料のプロテアーゼ処理物である、請求項１又は２に記載の豆類由来組成物。
  4. 前記豆類が、大豆である、請求項１又は２に記載の豆類由来組成物。
  5. 前記豆類由来原料が、大豆オカラ、脱脂大豆及び大豆抽出物からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２に記載の豆類由来組成物。
  6. 前記豆類由来組成物は、下記の（Ａ）及び／又は（Ｂ）を満たすものである、請求項１又は２に記載の豆類由来組成物。
    （Ａ）ダイジンを含み、前記ダイジンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０５～１０００である。
    （Ｂ）ゲニスチンを含み、前記ゲニスチンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０４～１０００である。
  7. 請求項１に記載の豆類由来組成物を含む、経口用組成物。
  8. 前記経口用組成物は、下記の（Ａ）及び／又は（Ｂ）を満たすものである、請求項７に記載の組成物。
    （Ａ）ダイジンを含み、前記ダイジンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０５～１０００である。
    （Ｂ）ゲニスチンを含み、前記ゲニスチンに対するピログルタミルロイシン又はその塩（ピログルタミルロイシン換算）の重量比が、０．０４～１０００である。
  9. ピログルタミルロイシン又はその塩を含む、ニワトリの砂肝由来組成物。
  10. 前記ピログルタミルロイシン又はその塩の固形分当たりの含有量が、ピログルタミルロイシン換算で０．１～１００μｇ／ｍｇである、請求項９に記載のニワトリの砂肝由来組成物。
  11. 前記ニワトリの砂肝由来組成物が、ニワトリの砂肝のプロテアーゼ処理物である、請求項９又は１０に記載のニワトリの砂肝由来組成物。
  12. 請求項９に記載のニワトリの砂肝由来組成物を含む、経口用組成物。
  13. 前記経口用組成物は、免疫活性化のために使用される、請求項７又は１２に記載の経口用組成物。
  14. 前記経口用組成物は、自然免疫活性化のために使用される、請求項７又は１２に記載の経口用組成物。
  15. 前記経口用組成物は、腸管バリア機能改善のために使用される、請求項７又は１２に記載の経口用組成物。
  16. 前記経口用組成物は、飲食品又は経口用医薬品である、請求項７又は１２に記載の経口用組成物。
  17. 請求項１に記載の豆類由来組成物を製造する方法であって、
    該製造方法は、豆類由来原料を加水分解する工程と、該加水分解工程で得られた加水分解物を加熱する工程とを有する、豆類由来組成物の製造方法。
  18. 請求項９に記載のニワトリの砂肝由来組成物を製造する方法であって、
    該製造方法は、ニワトリの砂肝を加水分解する工程と、該加水分解工程で得られた加水分解物を加熱する工程とを有する、ニワトリの砂肝由来組成物の製造方法。
  19. 前記加水分解は、プロテアーゼを用いて行う、請求項１７又は１８に記載の組成物の製造方法。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008237127A (ja) * 2007-03-28 2008-10-09 Fuji Oil Co Ltd 大豆たん白加水分解物及びその製造方法
WO2010032322A1 (ja) * 2008-09-22 2010-03-25 日清ファルマ株式会社 抗炎症性ペプチド
WO2011007612A1 (ja) * 2009-07-13 2011-01-20 不二製油株式会社 経口性抗炎症剤及び経口性抗炎症ペプチド

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008237127A (ja) * 2007-03-28 2008-10-09 Fuji Oil Co Ltd 大豆たん白加水分解物及びその製造方法
WO2010032322A1 (ja) * 2008-09-22 2010-03-25 日清ファルマ株式会社 抗炎症性ペプチド
WO2011007612A1 (ja) * 2009-07-13 2011-01-20 不二製油株式会社 経口性抗炎症剤及び経口性抗炎症ペプチド

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHIRAKO SAKI: "Structure and biological activities of hydrophobic short chain pyroglutamyl peptides in fermented foods and food protein hydrolysates", DOCTORAL DISSERTATION, KYOTO UNIVERSITY, 1 January 2020 (2020-01-01), XP093228962 *

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