WO2024150816A1

WO2024150816A1 - 血液凝固反応の分析方法

Info

Publication number: WO2024150816A1
Application number: PCT/JP2024/000586
Authority: WO
Inventors: 俊樹川辺; 健悟大西
Original assignee: 積水メディカル株式会社
Priority date: 2023-01-13
Filing date: 2024-01-12
Publication date: 2024-07-18

Abstract

血液凝固反応の分析方法であって、（１）血液検体の血液凝固反応Ｐ（ｉ）を取得すること、ここでｉは計測点数又は時間を表す変数である；（２）該Ｐ（ｉ）からｔ１及びｔ２を取得すること、ここで、ｔ１及びｔ２はともに計測点数又は時間を表し、ｔ１＝ｉ、ｔ２＜ｔ１であり、かつ、ｔ１及びｔ２は式：Ｐ（ｔ２）＝Ｐ（ｔ１） × Ｘ％を満たし、ここで、該Ｐ（ｔ１）及びＰ（ｔ２）は、それぞれｔ１及びｔ２での該血液検体の血液凝固反応を表し、Ｘは２０～７０である；（３）ｔ１とｔ２の比を表すＲｔを取得すること、を含む、方法。

Description

血液凝固反応の分析方法

　本発明は、血液凝固反応の分析方法に関する。

　血液凝固検査は、被検者の血液検体の凝固反応を調べることにより該被検者の血液凝固能を診断するための検査である。血液凝固検査では、一般に、血液検体に所定の試薬を添加した後、その凝固反応を経時的に計測し、得られた凝固反応の計測データに基づいて血液凝固時間が算出される。血液凝固時間は、従来、血液凝固能の異常を検出するための指標として使用されている。

　凝固反応の計測データには、反応計測部、試薬、検体の状態などに起因する様々なノイズが含まれ、それらは凝固時間の誤検出をもたらすことがある。例えば、初期反応異常（ｅａｒｌｙ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｅｒｒｏｒ）と呼ばれる、真の凝固反応が始まるべき時間の前から凝固反応曲線の上昇が生じる現象が起こることがある。凝固反応の計測データにおけるノイズなどの悪影響を抑えて凝固反応を正しく評価することが求められている。

　特許文献１には、血液凝固反応の測定開始から凝固反応終了までの間にチェックポイント又はチェック領域を設け、そのチェックポイント又はチェック領域における反応状態を監視することによって初期反応異常を検出することを特徴とする血液凝固反応解析方法が記載されている。特許文献２には、凝固時間とそのときに測定される散乱光量との関係に基づいてノイズ判定ラインを設定し、被検検体の凝固時間における散乱光量が該ノイズ判定ラインを超えていれば該被検検体の凝固時間を正常と判定し、そうでない場合は正常な凝固時間が取得されるまで凝固反応の計測を続けることによって、ノイズによる凝固時間の誤検出を防止することが記載されている。特許文献３には、凝固率(i)に対応する時間(T[i])と、凝固率(i+1)に対応する時間(T[i+1])との差(T[i+1]－T[i])と、凝固開始点から凝固終了点までの時間（SP～EP）との比率に基づいて凝固反応の異常を判断することが記載されている。

　近年、凝固反応計測のための自動分析装置が汎用されている。従来の自動分析装置による血液凝固検査では、凝固反応の終了まで凝固反応を計測し、取得した計測データに基づいて凝固時間を算出するのが一般的である。そのため、自動分析装置で多数の血液検体の凝固反応を計測する場合、凝固反応途中での計測終了を防止するため、凝固時間が延長する異常検体の凝固反応の終了までの計測データを収集できるように長めの計測時間を設定するのが一般的である。一方で、計測される検体のほとんどは正常検体であるため、計測時間を長く設定するほど、全体的な分析効率は低下する。

　凝固反応を計測しながらリアルタイムに凝固反応の終了を検出し、凝固時間を算出することで、各検体の凝固反応分析に要する時間を最適化する方法が開発されている。特許文献４には、微小時間帯での凝固反応の積算比Ｚに基づいて、凝固反応を計測しながらリアルタイムに凝固反応の終了を検出し、凝固時間を算出する方法が記載されている。特許文献５には、凝固反応を計測しながら、該凝固反応の反応速度Ｖをリアルタイムに取得し、取得したＶがこれまでに取得したＶの最大値のＳ％になった時点で凝固時間を算出する方法が記載されている。

特開２００３－１６９７００号公報特開２０１０－２１７０５９号公報特開２００７－１０７８８９号公報国際公開公報第２０２１／１３２５５２号国際公開公報第２０２１／２０６１０７号

　本発明は、血液凝固反応の計測データに含まれる初期反応異常と真の凝固反応を区別することができ、凝固反応のより正確な分析を可能にする方法を提供する。

　すなわち、本発明は、以下を提供する。
〔１〕血液凝固反応の分析方法であって、
（１）血液検体の血液凝固反応Ｐ（ｉ）を取得すること、ここでｉは計測点数又は時間を表す変数である；
（２）該Ｐ（ｉ）からｔ１及びｔ２を取得すること、
　ここで、ｔ１及びｔ２はともに計測点数又は時間を表し、ｔ１＝ｉ、ｔ２＜ｔ１であり、
　かつ、ｔ１及びｔ２は式：Ｐ（ｔ２）＝Ｐ（ｔ１） × Ｘ％を満たし、ここで、
　　該Ｐ（ｔ１）及びＰ（ｔ２）は、それぞれｔ１及びｔ２での該血液検体の血液凝固反応を表し、
　　Ｘは２０～７０である；
（３）ｔ１とｔ２の比を表すＲｔを取得すること、
を含む、方法。
〔２〕前記Ｒｔに基づいてＰ（ｉ）が真の血液凝固反応であるか否かを評価することをさらに含む、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記Ｒｔが所定値よりも大きいとき、Ｐ（ｉ）が初期反応であると評価することをさらに含む、〔１〕記載の方法。
〔４〕前記Ｒｔが所定値に達するか又はそれより小さくなるまで、ｉ＝ｉ＋ｋ（ここでｋ＞０）として前記（１）～（３）の工程を繰り返し、Ｐ（ｉ）、ｔ１、ｔ２及びＲｔを新たに取得することをさらに含む、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記所定値又はそれより小さいＲｔが取得された後、続けて凝固反応終了点が検出されるか又は血液凝固時間が算出されるまで、ｉの増加とともにＰ（ｉ）の取得を繰り返すことをさらに含む、〔４〕記載の方法。
〔６〕前記Ｐ（ｉ）から積算比Ｚ（ｉ）を取得すること、
　ここで、Ｚ（ｉ）＝Ｐｂ（ｉ）／Ｐａ（ｉ）
　　　　　Ｐａ（ｉ）は、Ｐ（ｉ－ｍ）からＰ（ｉ－ｗ）までの和
　　　　　Ｐｂ（ｉ）は、Ｐ（ｉ＋ｗ）からＰ（ｉ＋ｍ）までの和
　　　　　ここで、ｉは計測点数又は時間であり、
　　　　　ｉが計測点数の場合、ｗ＝１、ｍは１０～３０の整数であり、
　　　　　ｉが時間の場合、ｗは血液凝固反応の計測時間間隔、ｍは１～３秒である；
　該Ｚ（ｉ）が所定の閾値Ｚｓであるか又はそれより小さいとき、該Ｐ（ｉ）を凝固反応終了点として取得すること、
をさらに含む、〔５〕記載の方法。
〔７〕前記凝固反応終了点に基づいて血液凝固時間を算出することをさらに含む、〔６〕記載の方法。
〔８〕前記Ｐ（ｉ）から、式：Ｐ（Ｃ（ｉ））＝Ｐ（ｉ） × Ｘ％を満たすＣ（ｉ）を取得すること、ここでＸは２０～７０である；
　取得したＣ（ｉ）に基づいて凝固時間を算出すること、
をさらに含む、〔５〕記載の方法。
〔９〕取得したＰ（ｉ）から凝固反応速度データを算出すること；
　該凝固反応速度データに基づいて血液凝固時間を算出すること、
をさらに含む、〔５〕記載の方法。
〔１０〕前記Ｐ（ｉ）が所定の閾値Ｐｓに達するか又はそれを超えるまでは、前記工程（１）を繰り返すことをさらに含む、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕前記ｉが所定の計測終点に達しており、かつ前記Ｒｔが前記所定値に達していないか又はそれより小さくない場合に、前記工程の繰り返しを終了し、前記血液検体の血液凝固反応が検出されなかったという結果を取得することをさらに含む、〔４〕記載の方法。
〔１２〕前記ｉが所定の計測終点に達しており、かつ前記凝固反応終了点が検出されていないか又は凝固時間が算出されていない場合に、前記工程の繰り返しを終了し、前記血液検体の血液凝固反応が終了しなかったという結果を取得することをさらに含む、〔５〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１３〕凝固反応終了点が検出されるか又は血液凝固時間が算出された場合、該Ｐ（ｉ）の取得を止めることをさらに含む、〔５〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１４〕算出された血液凝固時間を出力することをさらに含む、〔７〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１５〕〔１〕～〔１４〕のいずれか１項記載の血液凝固反応の分析方法を行うためのプログラム。
〔１６〕〔１〕～〔１４〕のいずれか１項記載の血液凝固反応の分析方法を行うための装置。

　本発明は、血液凝固反応の計測データにおける初期反応異常を検出し、又は初期反応異常と真の凝固反応とを区別することを可能にする。本発明は、初期反応異常による凝固反応分析への悪影響、例えば凝固時間の誤検出を防止することができる。あるいは、本発明は、初期反応異常を示す疾患、例えばＤＩＣのモニタリングに応用可能である。また本発明による初期反応異常の検出は、凝固反応の計測と並行して実施することが可能であるため、血液検体の凝固反応を計測しながらリアルタイムで真の凝固反応を分析することを可能にする。したがって本発明は、自動分析装置で多数の検体を分析する場合に、１検体あたりの分析時間を最適化し、全体的な分析効率を向上させることができる。

本発明の方法による凝固反応の分析の手順の概要。Ｚ（ｉ）を用いた凝固反応の分析の手順の例。Ｃ（ｉ）を用いた凝固反応の分析の手順の例。本発明の方法を行うための装置の構成を示す概念図。Ｎｏｒ、ＥＲ１、ＥＲ２の検体の凝固反応曲線。各検体のＴ１００に対する、Ｔ５０、Ｔ１０、Ｔ５、ならびにＴ１００／Ｔ５０、Ｔ１０／Ｔ１００、Ｔ５／Ｔ１００のプロット。ＮｏｒのＰ（ｉ）、Ｚ（ｉ）、及びｉ／Ｃ（ｉ）。ＥＲ１のＰ（ｉ）、Ｚ（ｉ）、及びｉ／Ｃ（ｉ）。ＥＲ２のＰ（ｉ）、Ｚ（ｉ）、及びｉ／Ｃ（ｉ）。Ｚ（ｉ）が所定値であるときのｉ／Ｃ（ｉ）の分布。Ｎｏｒ（Ａ）、ＥＲ１（Ｂ）及びＥＲ２（Ｃ）のＣ（ｉ）及びｉ／Ｃ（ｉ）。Ｎｏｒ（Ａ）、ＥＲ１（Ｂ）及びＥＲ２（Ｃ）のＣ（ｉ）及びその傾き。各図にはＰ（ｉ）がともに示されている。Ｃ（ｉ）に基づく凝固時間と、Ｚ（ｉ）に基づく凝固時間との相関。

　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。

　血液凝固検査では、血液検体に所定の試薬を添加して、その後の血液凝固反応を計測する。血液凝固反応は、一般的に、凝固反応量の経時的変化を示す凝固反応曲線で表される。凝固反応曲線に基づいて算出した血液凝固時間は、従来、血液凝固能の異常を検出するための指標として使用されている。本明細書において、血液検体、血液凝固反応、及び血液凝固時間を、それぞれ単に検体、凝固反応、及び凝固時間と称する場合がある。

　凝固時間の典型的な例としては、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンビン時間、フィブリノーゲン濃度（Ｆｂｇ）測定での凝固時間などがある。凝固反応の計測には、通常、散乱光量、透過度、吸光度等を計測する光学的な手段、又は血漿の粘度を計測する力学的な手段などが用いられる。例えば、散乱光量に基づく計測の場合、凝固反応曲線は通常、検体への試薬添加からある程度の時間が経過した時点で、凝固反応の始まりによって緩やかな上昇を示し、次いで凝固反応の進行によって急激に上昇し、その後、凝固反応が終了に近づくとともにプラトーに達し、最終的にシグモイド形状を示す。他方、透過光量に基づいて計測された凝固反応曲線は逆シグモイド形状を示す。一方、凝固能に異常を有する異常検体の凝固反応曲線は、凝固反応曲線の立ち上がり時間の遅れ、緩やかな上昇など、異常原因に応じた様々な形状を示す。異常検体の凝固反応曲線の多様さは、自動分析装置での凝固時間の正確な測定を困難にしている。

　従来の一般的な血液凝固時間測定では、少なくとも凝固反応終了までの計測データを取得し、取得した計測データに基づいて凝固時間を算出する。例えば、凝固反応が終了したと判断した後、試薬添加時点から凝固反応終了時点までの間で凝固反応曲線が最大速度に達した時点を凝固時間として決定する手法（微分法）、凝固反応量が反応終了時点のＮ％に達した時点を凝固時間として決定する手法（パーセント検出法）、などがある。しかしながら、前述のような異常検体の凝固反応曲線の異常な形状や、後述するノイズにより、凝固反応終了点の誤検出、例えば、早過ぎる時点での検出が起きたり、又は凝固反応終了点が検出されないことがある。このような凝固反応終了点の誤検出の結果、不正確な凝固時間が算出される。

　血液凝固反応の計測データには様々なノイズが含まれ、これらのノイズは、凝固反応曲線の形状に影響を与え、凝固時間の正確な算出の障害となる場合がある。その一例が、初期反応異常（ｅａｒｌｙ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｅｒｒｏｒ）と呼ばれる、真の凝固反応が始まるべき時間の前から凝固反応曲線の上昇（初期反応：ＥＲ）が生じる現象である。初期反応異常は、凝固時間の誤検出を引き起こしたり、凝固反応の分析結果の信頼性を損ねる原因となり得る。一方で、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）患者の血液検体では、重症度に応じてＡＰＴＴ測定での凝固反応に初期反応異常が観察されることが報告されており、初期反応異常がＤＩＣのモニタリングに利用できることが期待される（特表２００５－５１９２６７号公報、Clinical & Laboratory Haematology, 2002, 24(6):321-327）。検体の凝固反応のより正確な分析のために、計測データに含まれるＥＲを検出して分析結果への影響を回避することが望まれる。あるいは、検出したＥＲは、ＤＩＣ等の凝固異常の診断やモニタリングに有用である可能性がある。

　自動分析装置で多数の検体の凝固反応を分析する場合、全体的な分析効率を上げるためには、１つの検体の凝固反応の終了が検出されたら速やかに計測を終了し、次の検体の計測を開始することが望まれる。しかし、こうした手法には、前述した早過ぎる時点での凝固反応終了の誤検出が、実は反応中の検体の計測を誤って終了させ、必要な計測データの取り逃しをもたらすリスクがある。一方、一検体あたりの計測時間を充分に長い時間（一例としてＡＰＴＴ測定で７分間程度）に固定しておけば、凝固反応終了の誤検出による計測データの取り逃しを防止できるが、こうした手法は、多くの検体、例えば検体のほとんどを占める正常検体にとって、計測時間が必要以上に長くなるため、全体的な分析効率を低下させる。

　本発明は、凝固反応の計測データに含まれる初期反応異常を検出し、ＥＲと真の凝固反応を区別することを可能にする血液凝固反応の分析方法を提供する。したがって、本発明によれば、凝固反応のより正確な分析、例えば、ＥＲに起因する凝固反応終了の誤検出の防止、又は凝固時間の正確な算出を可能にする。本発明の血液凝固反応の分析方法によるＥＲの検出は、凝固反応の計測と並行して実施することが可能である。したがって、この方法は、血液検体の凝固反応を計測しながら、リアルタイムで真の凝固反応を分析し、凝固時間を算出することを可能にする。またこの方法は、正常検体や異常検体を含む様々な検体に対して各々の凝固時間算出に必要最低限な長さの凝固反応計測が行われるように、各検体の計測時間を最適化することを可能にし、ひいては、特に自動分析装置で多数の検体を分析する場合に、全体での分析効率を向上させることができる。

１．血液凝固反応の分析方法
１．１　凝固反応計測
　本発明の血液凝固反応の分析方法（以下、本発明の方法ともいう）で用いられる被検検体は、通常の血液凝固検査に用いられる血液検体であればよい。好ましくは、該被検検体には被検者の血漿が用いられる。該被検検体には、凝固検査に通常用いられる抗凝固剤が添加され得る。例えば、クエン酸ナトリウム入り採血管を用いて採血した後、遠心分離することで血漿が得られ、これを被検検体として使用することができる。

　前記被検検体についての凝固反応計測を行い、凝固反応の時系列データを取得する。凝固反応計測は、血液凝固検査に用いられる任意の方法、例えば、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、又はトロンビン時間法によるフィブリノーゲン濃度検査時の凝固時間の測定に用いられる方法、などに従って実施することができる。凝固反応の計測には、一般的な手段、例えば、散乱光量、透過度、吸光度等を計測する光学的な手段、又は血漿の粘度を計測する力学的な手段などを用いればよい。以下の本明細書においては、主に、ＡＰＴＴ測定のための散乱光量に基づく凝固反応計測の方法に沿って本発明の方法を説明する。本発明の方法を、その他の凝固時間（例えばプロトロンビン時間（ＰＴ））測定のための方法へ適用することは、当業者であれば実施可能である。

　凝固反応の計測においては、被検検体に凝固時間測定試薬が添加され、凝固反応が開始される。該試薬と被検検体を含む混合液の凝固反応が計測され得る。使用される凝固時間測定試薬は、測定目的に合わせて任意に選択することができる。各種凝固時間測定のための試薬は市販されている（例えば、ＡＰＴＴ試薬コアグピア　ＡＰＴＴ－Ｎ；積水メディカル株式会社製）。

　凝固反応の反応開始時点は、典型的には、被検検体にカルシウムイオン（例えば塩化カルシウム液）を添加して凝固反応を開始させた時点として定義され得るが、他のタイミングが反応開始時点として定義されてもよい。凝固反応の計測を継続する時間は、例えば、被検検体と試薬との混合の時点から数十秒～７分程度であり得る。この計測時間は、任意に定めた固定の値でもよいが、各被検検体の凝固反応の終了を検出した時点までとしてもよい。該計測時間の間、所定の間隔で凝固反応の進行状況の計測（光学的に検出する場合は測光）が繰り返し行われ得る。例えば、０．１秒間隔で計測が行われればよい。該計測中の混合液の温度は、通常の条件、例えば３０℃以上４０℃以下、好ましくは３５℃以上３９℃以下である。また、計測の各種条件は、検体や試薬、計測手段等に応じて適宜設定され得る。

　前述の凝固反応計測における一連の操作は、自動分析装置を用いて行うことができる。自動分析装置の一例として、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）が挙げられる。あるいは、一部の操作が手作業で行われてもよい。例えば、被検検体の調製を人間が行い、それ以降の操作は自動分析装置で行うことができる。

１．２　凝固反応Ｐの取得
　本発明の方法では、反応開始時点からの凝固反応Ｐ（ｉ）を逐次取得する。ここで「ｉ」は、凝固反応開始からの計測点数又は時間（以下、単に計測点数又は時間という）を表す。例えば、計測（測光）間隔が０．１秒であれば、時間＝０．１×計測点数で表される。すなわち、Ｐ（ｉ）は、変数ｉの関数であって、計測点数の関数であっても、時間の関数であってもよい。以下の本明細書において、Ｐ（ｉ）を単にＰと略記する場合がある。

　一般的には、凝固反応Ｐは、凝固反応計測での計測値（例えば散乱光量の測光値）に、通常の手段でノイズ除去もしくは平滑化処理、又は必要に応じて、初期値を調整するためのゼロ点調整もしくは曲線の相対値化が成されたものである。計測値の平滑化処理には、ノイズ除去に関する種々の公知の方法の何れかが用いられ得る。例えば、平滑化処理としては、フィルタリング処理、又は差分値や後述する区間内平均傾きの演算等により微分値を求めた後それを積分する処理、などが挙げられる。ゼロ点調整では、例えば、平滑化した計測値を計測開始時点での値が０となるように調整すればよい。好ましくは、計測値が平滑化及びゼロ点調整されて、凝固反応Ｐ（ｉ）が取得される。

１．３　Ｒｔに基づく凝固反応の分析
　前記Ｐ（ｉ）から、ｔ１及びｔ２を取得する。ｔ１及びｔ２はともに計測点数又は時間を表し、ｔ２＜ｔ１である。ｔ１は、これまでに検体のＰ（ｉ）の取得が行われた計測点数又は時間の中から任意の点を選択すればよく、ｔ２は、下記式（１）を満たす。
　Ｐ（ｔ２）＝Ｐ（ｔ１） × Ｘ％　・・・ (1)
　該Ｐ（ｔ１）及びＰ（ｔ２）は、それぞれｔ１及びｔ２での凝固反応Ｐを表す。Ｘは、２０～７０の範囲、好ましくは４０～６０の範囲である。

　取得したｔ１とｔ２の比（ｔ１／ｔ２）に基づいて、ｔ１での凝固反応Ｐ（ｔ１）が初期反応（ＥＲ）か、真の凝固反応かを区別することができる。以下、ｔ１／ｔ２をＲｔとも表す。

　後述の実施例に示すとおり、ＥＲが起こった場合、凝固反応曲線は計測のごく初期に小さな立ち上がりを示し、その後緩やかな上昇に転じ、その後、真の凝固反応が始まることで急激に上昇する。結果、凝固反応曲線は２段階で上昇する（図４参照）。こうした真の凝固反応に由来する上昇が始まる前でのＥＲに起因する凝固反応曲線の上昇は、凝固反応終了の誤検出を引き起こし不正確な凝固時間の原因となる。詳述すると、従来の凝固時間測定では、凝固反応量が反応終了時点のＮ％に達した時点を凝固時間として決定する手法（いわゆるパーセント検出法）が多く用いられており、一方、凝固反応終了点の検出方法としては、凝固反応曲線がプラトーに達したときを凝固反応の終了とする方法、凝固反応の積算比Ｚが閾値を下回ったときを凝固反応の終了とする方法、凝固反応速度曲線のピークを基準とする方法、などが用いられている。しかし、いずれの方法でも、ＥＲを真の凝固反応と誤認し、初期反応の途中で凝固反応終了を検出することがあり、その結果、誤った凝固時間が算出される場合がある。

　前記Ｒｔは、ＥＲの間、計測開始直後からの反応曲線の緩やかな上昇を反映して大きな値を示すが、その後、真の凝固反応の立ち上がり時点では急激に低下する（図７Ｂ、８Ｂ参照）。したがって、Ｒｔを基準にＥＲを検出することができる。具体的には、前記ｔ１での凝固反応Ｐ（ｔ１）は、Ｒｔが所定値Ｓよりも大きければＥＲであり、そうでなければ、真の凝固反応であると評価される。所定値Ｓは、ＥＲが出現する検体と出現しない検体との凝固反応の計測データの差異などを考慮して適宜設定することができるが、例えば１５０～２４０である。

１．４　リアルタイムでのＲｔ取得と凝固反応分析
　凝固反応計測と並行して、検体の凝固反応Ｐ（ｉ）と、それに基づくＲｔを逐次取得することで、凝固反応計測をしながら、リアルタイムにＥＲの検出や、真の凝固反応に基づく正しい凝固反応の分析（例えば凝固時間の算出）を実施することができる。例えば、ｉの増加（計測の進行）とともに、任意のｉでのＰ（ｉ）が得られたら、ｔ１＝ｉとして、前記式（１）に従ってｔ２を求める。好ましくは、反応の開始を検出するための閾値Ｐｓ（後述）を設定しておき、Ｐ（ｉ）＞Ｐｓとなった以降の任意のｉでのＰ（ｉ）が得られたら、ｔ１＝ｉとして、前記式（１）に従ってｔ２を求める。次いで、ｔ１＝ｉのときのＲｔ（＝ｔ１／ｔ２）を算出する。このｔ２及びＲｔは、いずれも変数ｉの関数として表されるので、それぞれＣ（ｉ）及びＲｔ（ｉ）と規定することができる。すなわち、Ｃ（ｉ）及びＲｔ（ｉ）は、下記式（１）'及び（２）を満たす。
　Ｐ（Ｃ（ｉ））＝Ｐ（ｉ） × Ｘ％　・・・(1)'
　Ｒｔ（ｉ）＝ｉ／Ｃ（ｉ）　　　　　・・・(2)
（Ｘは、上記で定義したとおりである。）

　前記Ｒｔ（ｉ）に基づいて、該Ｐ（ｉ）が真の血液凝固反応であるか否かを評価することができる。具体的には、該Ｒｔ（ｉ）が所定値Ｓより大きければ、該Ｐ（ｉ）はＥＲであるので、真の凝固反応が得られるまで凝固反応の計測を続ける。すなわち、該Ｒｔ（ｉ）が所定値Ｓに達するか又はそれより小さくなるまで、ｉ＝ｉ＋ｋとして、新たなＰ（ｉ）、ｔ１、ｔ２及びＲｔ（ｉ）を取得することを繰り返す（ここで、ｋ＞０であり、例えば、ｉが計測点数の場合、好ましくはｋ＝１～１０であり、ｉが時間の場合、好ましくはｋ＝計測時間間隔（秒）×１～１０である）。

　前記Ｒｔ（ｉ）が前記所定値Ｓに達しているか又はそれより小さいことが確認されたら、以降に取得されたＰ（ｉ）を真の凝固反応とみなすことができる。このとき、すなわち該Ｒｔ（ｉ）が該所定値Ｓ又はそれより小さい値に達したときのｔ１を、Ｔｒとする。Ｔｒ以降に取得された真の凝固反応とみなされるＰ（ｉ）は、凝固反応の分析に利用することができる。したがって、該Ｔｒ後も凝固反応の計測は継続されて新たなＰ（ｉ）や凝固反応曲線が取得され得、それらのデータは、凝固反応の分析、例えば凝固反応終了点の検出、凝固時間の算出などに用いることができる。つまり、本発明によれば、被検検体の凝固反応終了点及び凝固時間は、該Ｔｒ以降の期間から検出される。具体的には、該Ｔｒ後、凝固反応終了点が検出されるか又は凝固時間が算出されるまで、ｉを増加させ、すなわちｉ＝ｉ＋ｋ（ｋ＝１、又は計測時間間隔）として、凝固反応の計測とＰ（ｉ）の取得を繰り返す。このとき、ともに、又は一定間隔ごとにｔ１、ｔ２及びＲｔ（ｉ）の取得を繰り返してもよいが、その必要はない。また、凝固反応終了点又は凝固時間が検出された後、凝固反応の計測と、該新たなＰ（ｉ）の取得は終了してもよいが、継続してもよい。

１．５　オフラインでのＲｔ取得と凝固反応分析
　凝固反応計測の終了後に、得られたＰ（ｉ）を用いて、前記式（１）'及び（２）に従ってＲｔ（ｉ）又はＣ（ｉ）を算出することができる。Ｒｔ（ｉ）が前記所定値Ｓより大きいときＰ（ｉ）はＥＲであり、一方、Ｒｔ（ｉ）が前記所定値Ｓに達するか又はそれより小さいときのｉをＴｒとするとき、該Ｔｒ以降のＰ（ｉ）は真の凝固反応である。真の凝固反応とみなされたＰ（ｉ）は、凝固反応の分析、例えば凝固反応終了点の検出、凝固時間の算出などに用いることができる。

１．６　Ｒｔに関するその他の説明
　以下の本明細書において、Ｒｔ（ｉ）をＲｔと略記することがある。したがって、以下の本明細書において「Ｒｔ」とは、特定のｔ１におけるＲｔと、ｉにおけるＲｔ（ｉ）を包含し、いずれを意味するかは文脈により判断することができる。基本的には、前記１．４のようなリアルタイム分析や、前記１．５のようなオフライン分析を行う場合は、「Ｒｔ」とは、ｉにおけるＲｔ（ｉ）を意味する。

　本発明において、ＥＲ検出の基準として、Ｒｔ（＝ｔ１／ｔ２又はｉ／Ｃ（ｉ））の代わりに、その逆数１／Ｒｔ（＝ｔ２／ｔ１又はＣ（ｉ）／ｉ）を使用することができる。具体的には、１／Ｒｔが所定値Ｓ'よりも小さければＥＲであり、そうでなければ、真の凝固反応であると評価される。所定値Ｓ'は適宜設定することができるが、例えば（１／１５０～１／２４０である。

１．７　閾値Ｐｓ
　凝固反応の計測開始直後は、ｔ１とｔ２が近接するためＲｔが前記所定値Ｓを下回る。このような計測開始直後でのｔ１とｔ２の近接によるＥＲ又は真の凝固反応の誤検出を防ぐためには、計測開始から一定時間は、Ｒｔの取得、又はＲｔと所定値Ｓとの比較を行わないことが好ましい。あるいは、Ｐ（ｉ）が閾値Ｐｓに達する又はこれを超えるまではＲｔの取得、又はＲｔと所定値Ｓとの比較を行わない（すなわちＲｔの取得工程をスキップして新たなＰ（ｉ）を取得する）ことが好ましい。
　一方、実質的にＥＲのない検体でも、本反応前の凝固反応曲線のわずかな変化によりＲｔが高値になることがある。このような場合でも、計測開始から一定時間は、Ｒｔの取得、又はＲｔと所定値Ｓとの比較を行わないことにするか、あるいは、Ｐ（ｉ）が閾値Ｐｓに達する又はこれを超えるまでＲｔの取得、又はＲｔと所定値Ｓとの比較を行わないことで、ＥＲの誤検出を防ぐことができる。

２．凝固反応終了点及び凝固時間の取得
　本発明では、前述のとおり取得したＰ（ｉ）から、積算比Ｚ（ｉ）、又は凝固反応速度データＶ（ｉ）を取得してもよい。該Ｚ（ｉ）及びＶ（ｉ）は、各々、被検検体の凝固反応終了点の検出、又は凝固時間の算出に用いることができる。

２．１　積算比Ｚ（ｉ）
　積算比Ｚ（ｉ）は、微小時間帯でのＰ（ｉ）の積算値を表し、下記式（３）にて算出される：　Ｚ（ｉ）＝Ｐｂ（ｉ）／Ｐａ（ｉ）　・・・(3)
ここで、
　Ｐａ（ｉ）は、Ｐ（ｉ－ｍ）からＰ（ｉ－ｗ）までの和
　Ｐｂ（ｉ）は、Ｐ（ｉ＋ｗ）からＰ（ｉ＋ｍ）までの和
　ｉは計測点数又は時間であり、
　ｉが計測点数の場合はｗ＝１であり、ｉが時間の場合は、ｗは凝固反応の計測時間間隔である。
　すなわち、ｉが計測点数の場合、Ｚ（ｉ）は、下記式（３）'にて表すこともできる。
　Ｚ（ｉ）＝｛Ｐ（ｉ＋１）＋Ｐ（ｉ＋２）＋．．．＋Ｐ（ｉ＋ｍ）｝／｛Ｐ（ｉ－ｍ）＋Ｐ（ｉ－ｍ＋１）＋．．．＋Ｐ（ｉ－１）｝　・・・(3)'
　ｍは、凝固反応の計測条件や分析項目等によって適宜設定することができる。ｉ－ｍからｉ－ｗまで（又はｉ＋ｗからｉ＋ｍまで）の時間幅が１秒間から３秒間になるように設定されることが好ましい。例えば、ｉが計測点数であるとき、ｍは（１～３秒）／計測時間間隔（秒）であり、例えば１０～３０の範囲の整数である。すなわち、計測時間間隔が０．１秒ならｍは１０から３０が好ましく、計測時間間隔が０．２秒ならｍは５から１５が好ましい。計測条件を考慮して適切な凝固時間が算出できるようにｍの最適値を選択すればよい。以下の本明細書において、Ｚ（ｉ）を単にＺと略記する場合がある。

　Ｚ（ｉ）が所定の閾値Ｚｓに達するか又はそれ未満となる最も早い計測点数又は時間での凝固反応Ｐ（ｉ）を、凝固反応終了点Ｐｅとして検出する。Ｚｓは、分析項目に応じて適宜設定され得る。例えばＡＰＴＴ測定の場合、Ｚｓは、好ましくは１．０５０以下であり、より好ましくは１．０１０から１．００１の範囲で設定される。ＥＲによるＰｅの誤検出を防ぐためには、Ｚ（ｉ）の算出は、前記Ｔｒ以降に行われることが好ましい。またＺ（ｉ）の算出は、Ｐ（ｉ）が閾値Ｐｓに達した又はこれを超えたとき以降に行われることが好ましい。

　より好ましくは、凝固反応を計測しながら（ｉの増加とともに）、Ｐ（ｉ）を逐次取得する。Ｐ（ｉ）が閾値Ｐｓに達した又はこれを超えた後に、前述のとおり、該逐次取得されるＰ（ｉ）に基づいてリアルタイムにＲｔが取得及び所定値Ｓと比較される。該Ｒｔが所定値Ｓ又はそれより小さい値に達した後（すなわちＴｒ以降）、該逐次取得されるＰ（ｉ）に基づいてＺ（ｉ）が逐次算出される。Ｚ（ｉ）が最初に所定の閾値Ｚｓ又はそれ未満に達したときのＰ（ｉ）を、凝固反応終了点Ｐｅとして検出する。
　あるいは、Ｐ（ｉ）を逐次取得し、取得したＰ（ｉ）が閾値Ｐｓに達した又はこれを超えた後、Ｚ（ｉ）を逐次算出し、Ｚ（ｉ）が所定の閾値Ｚｓ又はそれ未満に達した場合に、対応するＰ（ｉ）に基づくＲｔが所定値Ｓ又はそれより小さい値に達していれば、該Ｐ（ｉ）を凝固反応終了点Ｐｅとして検出する。
　本手順においては、凝固反応を計測しながら、リアルタイムにＰ（ｉ）及びＺ（ｉ）を取得し、Ｐｅを検出することができる。Ｐｅが検出された後は、凝固反応の計測と、新たなＰ（ｉ）の取得は終了してもよいが、継続してもよい。

２．２　凝固反応速度データＶ（ｉ）
　凝固反応速度データＶ（ｉ）は、Ｐ（ｉ）を１次微分して得られる。微分処理は任意の手法にて実施できるが、例えば、区間内平均傾き値の算出により行われ得る。区間内平均傾き値の算出では、各計測点ｉの前後の一定数の計測点、例えば、ｉ－Ｋからｉ＋Ｋまでの２Ｋ＋１個の計測点が利用され得る。例えば、ｉが計測点数の場合、ｉ－２，ｉ－１，ｉ，ｉ＋１，ｉ＋２の５点の計測点が利用され得る。平均傾き値は、これら複数の計測点を直線近似したときの傾き値を意味する。直線近似の演算方法には、最小二乗法などの定法が利用され得る。これらの計測点の平均傾き値が、計測点ｉでの１次微分値とみなされ得る。

　Ｖ（ｉ）に基づいて凝固反応終了点Ｐｅを検出することができる。例えば、Ｖ（ｉ）のピークが最大値に達した後、該最大値のＳ％に達するか又はそれ未満となる最も早い計測点数又は時間でのＰ（ｉ）を、凝固反応終了点Ｐｅとして検出することができる（特許文献５参照）。
　より好ましくは、凝固反応を計測しながら（ｉの増加とともに）、Ｐ（ｉ）を逐次取得し、Ｐ（ｉ）が閾値Ｐｓに達した又はこれを超えた後に、逐次取得されるＰ（ｉ）に基づいてＶ（ｉ）が算出され、該Ｖ（ｉ）に基づいてＰｅが検出される。Ｐｅが検出された後は、凝固反応の計測と、新たなＰ（ｉ）の取得は終了してもよいが、継続してもよい。

２．３　Ｃ（ｉ）
　前記１．４のとおりｔ１＝ｉとしてＰ（ｉ）からｔ２を逐次取得した場合、ｔ２は変数ｉの関数として表され、この関数をＣ（ｉ）と規定する。該Ｃ（ｉ）に基づいて凝固時間を算出することができる。具体的には、後述の実施例に示すとおり、真の凝固反応によるＰ（ｉ）の急激な上昇に伴って、Ｃ（ｉ）は急激に増加し、その後、凝固反応が終了に近づくに従って増加が緩やかになり、プラトーに達する（図１０参照）。したがって、Ｃ（ｉ）を指標に、凝固時間の算出を行うことができる。例えば、Ｃ（ｉ）の変化率が所定条件を満たした時間を凝固時間とすることができる。例えば、Ｃ（ｉ）の変化率は、所定範囲でのＣ（ｉ）の平均変化量（例えばｉが計測点数の場合、[｛Ｃ（ｉ）－Ｃ（ｉ－ｋ）｝／ｋ]、ｋは好ましくは５～２０）として求めることができ、該平均変化量が閾値（例えば０．０６～０．０１）以下に達したときを凝固時間とすることができる。また例えば、Ｃ（ｉ）の変化率は、Ｃ（ｉ）の接線の傾き（例えば、Ｃ（ｉ－ｋ）からＣ（ｉ＋ｋ）までの２ｋ＋１個のＣの区間内平均傾き、ｋは、ｉが計測点数の場合、好ましくは５～２０）として求めることができ、該接線の傾きが閾値（例えば０．０１～０．０６）以下に達したときを凝固時間とすることができる。以下の本明細書において、Ｃ（ｉ）を単にＣと略記する場合がある。

　より好ましくは、凝固反応を計測しながら（ｉの増加とともに）、Ｐ（ｉ）を逐次取得し、Ｐ（ｉ）が閾値Ｐｓに達した又はこれを超えた後に、前述のとおり、逐次取得されるＰ（ｉ）に基づいてＣ（ｉ）を算出し、その平均変化量又は区間内平均傾きを閾値Ｃｓと比較する。該平均変化量又は区間内平均傾きが最初に閾値Ｃｓ又はそれより小さい値に達した時点を、凝固時間として算出する。凝固時間が算出された後は、凝固反応の計測と、新たなＰ（ｉ）の取得は終了してもよいが、継続してもよい。

２．４　凝固時間の算出
　前記Ｚ（ｉ）、Ｖ（ｉ）又はＣ（ｉ）に基づいて凝固時間を算出することができる。一例においては、前述のとおり該Ｚ（ｉ）又はＶ（ｉ）を用いて取得した凝固反応終了点Ｐｅに基づいて、凝固時間を算出することができる。例えば、Ｐ（ｉ）が凝固反応終了点ＰｅのＮ％に達した時点を、凝固時間として算出することができる（パーセント検出法）。凝固時間の算出法の別の例としては、Ｃ（ｉ）の変化率（例えば前述したＣ（ｉ）の平均変化量又は区間内平均傾き）が閾値以下に到達した時間を凝固時間とする方法（前記２．３）、Ｖ（ｉ）のピークが最大値に達した時点を凝固時間として算出する方法（微分法）、Ｚ（ｉ）の経時的変化に基づいて凝固時間を算出する方法（特許文献４参照）、などが挙げられる。

　前記Ｚ（ｉ）、Ｖ（ｉ）又はＣ（ｉ）を利用することにより、凝固反応計測と並行して（いわゆるリアルタイムに）、凝固時間の算出を行うことができる。しかし、Ｚ（ｉ）、Ｖ（ｉ）又はＣ（ｉ）を用いた凝固時間の算出は、凝固反応計測の終了後に行うこともできる。あるいは、凝固反応計測の終了後に、真の凝固反応を従来一般的な手順に従って分析し、凝固時間を算出することができる。例えば、真の凝固反応Ｐ（ｉ）が最大のときを凝固反応終了点Ｐｅとして検出し、Ｐ（ｉ）がＰｅのＮ％に達した時点を凝固時間として決定することができる（パーセント検出法）。

３．分析結果の出力
　本発明の方法は、前記の分析で得られた結果を出力することを含んでいてもよい。該分析結果には、ＥＲの有無、検出されたＥＲもしくは真の凝固反応のデータ（反応曲線等）、凝固反応終了点、凝固時間、などの情報が含まれ得る。

　凝固反応に異常がある被検検体の中には、凝固反応が小さすぎて反応の検出が難しい検体、凝固反応の開始が明確でなく、凝固反応曲線に急激な立ち上がりが見られない検体、凝固反応の終了までに時間がかかる又は終了が明確でない検体、などが含まれることがある。そのような検体では、本発明の方法において凝固反応計測を所定時間続けても、Ｐ（ｉ）がＰｓに達せず前記Ｒｔの取得ができない、該Ｒｔが所定値Ｓに達しない、又は、該Ｒｔが所定値Ｓに達しても、凝固反応終了点Ｐｅが検出できない、などの異常が生じる場合がある。それらの場合、本発明の方法では、これらの異常に関する情報、例えば異常の発生又は異常の種類、を出力することができる。
　一例においては、ｉが所定の最大計測時間（計測終点）に達しており、かつＲｔが所定値Ｓに達していないか又はそれより小さくない場合に、前記Ｐ（ｉ）、ｔ１、ｔ２及びＲｔを取得する工程の繰り返しを終了する。この場合、被検検体の真の凝固反応が検出されなかったという結果が取得される。
　別の一例においては、ｉが所定の最大計測時間（計測終点）に達しており、かつ凝固反応終了点Ｐｅが検出されていないか又は凝固時間が算出されていない場合に、前記Ｐ（ｉ）、ｔ１、ｔ２及びＲｔを取得する工程の繰り返しを終了する。この場合、被検検体の凝固反応が終了しなかったという結果が取得される。

４．その他の応用
　本発明による血液凝固反応の分析方法は、基本的には、散乱光量に基づいて計測された凝固反応を用いて行われるが、当業者であれば、本発明の方法を他の手段、例えば透過度、吸光度などに基づいて計測された凝固反応を用いるように応用することが可能である。

　本明細書の検出基準において、目的の凝固反応又はＥＲを検出できる限り、閾値又は所定値「以上」と閾値又は所定値「より大きい」の基準を交換可能に使用できること、同様に、閾値又は所定値「以下」と、閾値又は所定値「より小さい」の基準を交換可能に使用できることは、当業者であれば理解できるであろう。

５．例示的分析手順
　以下に、本発明の方法による凝固反応の分析の手順の例として、凝固時間測定の手順を説明する。以下に示す手順は例示であり、例えば演算の順序の入れ替えなど、当業者による通常の変更が可能である。

　凝固時間測定手順の概要を以下及び図１に説明する。
Ｓ１：凝固反応の計測開始。
Ｓ２：Ｐ（ｉ）＞Ｐｓとなれば反応ありと判断する。
Ｓ３：Ｒｔに基づきＥＲが検出された場合、真の凝固反応（本反応）を待つ。
Ｓ４：本反応から凝固時間を算出。
Ｓ５：（オプション）凝固反応の異常の有無を判定。
Ｓ６：凝固時間を出力する。（オプション）あわせてＥＲ又は凝固反応の異常の検出に関する情報を出力する。
Ｓ７：計測終了。計測は凝固時間が算出されたら終了、又は所定の時間で終了。

　さらに、Ｚ（ｉ）を用いた凝固時間測定手順の例を以下及び図２Ａに説明する。
Ｓ１：Ｐ（ｉ）を取得する。
Ｓ２：最大計測時間（計測終点）を超えたときは計測を終了する。（オプション）凝固反応の異常の検出を記録する。
Ｓ３：Ｐ（ｉ）＞ＰｓとなるまでＳ１に戻ってＰ（ｉ）の取得を継続する。
Ｓ４：Ｐ（Ｃ（ｉ））＝Ｐ（ｉ） × Ｘ％を満たすＣ（ｉ）を算出する。
Ｓ５：ｉ／Ｃ（ｉ）≦ＳとなるまでＳ１に戻ってＰ（ｉ）の取得を継続する。（オプション）ｉ／Ｃ（ｉ）＞ＳであればＥＲ検出を記録する。
Ｓ６：Ｐ（ｉ－２ｍ）からＰ（ｉ）までの２ｍ＋１個のＰからＺ（ｊ）を算出する。（ｊ＝ｉ－ｍ）
Ｓ７：Ｚ（ｊ）≦ＺｓとなるまでＳ１に戻ってＰ（ｉ）の取得を継続する。
Ｓ８：Ｐ（ｊ）を凝固反応終了点として凝固時間を算出する。
Ｓ９：Ｓ８で算出した凝固時間を出力する。
　　　（オプション）Ｓ２でＹｅｓの場合は凝固時間が得られなかったことを出力する。
　　　（オプション）あわせてＥＲ又は凝固反応の異常の検出に関する情報を出力する。

　さらに、Ｃ（ｉ）を用いた凝固時間測定手順の例を以下及び図２Ｂに説明する。
Ｓ１：Ｐ（ｉ）を取得する。
Ｓ２：最大計測時間（計測終点）を超えたときは計測を終了する。（オプション）凝固反応の異常の検出を記録する。
Ｓ３：Ｐ（ｉ）＞ＰｓとなるまでＳ１に戻ってＰ（ｉ）の取得を継続する。
Ｓ４：Ｐ（Ｃ（ｉ））＝Ｐ（ｉ） × Ｘ％を満たすＣ（ｉ）を算出する。
Ｓ５：ｉ／Ｃ（ｉ）≦ＳとなるまでＳ１に戻ってＰ（ｉ）の取得を継続する。（オプション）ｉ／Ｃ（ｉ）＞ＳであればＥＲ検出を記録する。
Ｓ６：Ｃ（ｉ－２ｋ）からＣ（ｉ）までの２ｋ＋１個のＣからＣ（ｊ）の接線の傾きを算出する。（ｊ＝ｉ－ｋ）
Ｓ７：Ｃ（ｊ）の接線の傾き≦閾値となるまでＳ１に戻ってＰ（ｉ）の取得を継続する。
Ｓ８：Ｃ（ｊ）を凝固時間とする。
Ｓ９：Ｓ８で算出した凝固時間を出力する。
　　　（オプション）Ｓ２でＹｅｓの場合は凝固時間が得られなかったことを出力する。
　　　（オプション）あわせてＥＲ又は凝固反応の異常の検出に関する情報を出力する。

６．プログラム及び装置
　本発明の血液凝固反応の分析方法は、コンピュータプログラムを用いて自動的に行われ得る。したがって、本発明の一態様は、前述の本発明の血液凝固反応の分析方法を行うためのプログラムである。また、前述した本発明の方法の一連の工程は、自動分析装置によって自動的に行われ得る。したがって、本発明の一態様は、前述の本発明の血液凝固反応の分析方法を行うための装置である。当該装置による本発明の方法の実行は、本発明のプログラムによって制御され得る。本発明のさらなる一態様は、本発明の血液凝固反応の分析方法を行うためのシステムであり、当該システムは、前述の本発明の血液凝固反応の分析方法を行うための装置又はプログラムを備える。

　本発明のプログラムは、例えば、図２Ａ又はＢに示される手順の実施を制御する。

　本発明の装置の一実施形態について、以下に説明する。本発明の装置の一実施形態は、図３に示すような自動分析装置１である。自動分析装置１は、制御ユニット１０と、操作ユニット２０と、測定ユニット３０と、出力ユニット４０とを備える。

　制御ユニット１０は、自動分析装置１の全体の動作を制御する。制御ユニット１０は、計算機（例えばパーソナルコンピュータ）によって構成され得る。制御ユニット１０は、ＣＰＵ、メモリ、ストレージ、通信インターフェース（Ｉ／Ｆ）などを備え、操作ユニット２０からのコマンドの処理、測定ユニット３０の動作の制御、測定ユニット３０から受けた計測データの保存やデータ分析、分析結果の保存、出力ユニット４０による分析結果の出力の制御、などを行うことができる。さらに制御ユニット１０は、外部メディア、ホストコンピュータなどの他の機器と接続されてもよい。なお、制御ユニット１０において、測定ユニット３０の動作を制御する計算機と、ユニット３０で計測したデータの分析を行う計算機とは、同一であっても、異なっていてもよい。

　操作ユニット２０は、操作者からの入力を取得し、得られた入力情報を制御ユニット１０へと伝達する。例えば、操作ユニット２０は、キーボード、タッチパネル等のユーザーインターフェース（ＵＩ）を備える。出力ユニット４０は、制御ユニット１０の制御下で、凝固反応の分析結果、及び必要に応じて、測定ユニット３０で計測した凝固反応データや、それに基づくＰ（ｉ）、Ｒｔ、Ｚ（ｉ）、Ｖ（ｉ）、Ｃ（ｉ）、Ｐｅ、凝固時間、ＥＲ検出、異常に関する情報などの分析結果を出力する。例えば、出力ユニット４０は、ディスプレイ等の表示装置を備える。

　測定ユニット３０は、血液凝固検査のための一連の操作を実行し、血液検体を含む試料の凝固反応の計測データを取得する。測定ユニット３０は、血液凝固検査に必要な各種の器材や分析モジュール、例えば、血液検体を収める検体容器、検査用試薬を収める試薬容器、検体と試薬との反応のための反応容器、血液検体及び試薬を反応容器に分注するためのプローブ、光源、反応容器内の試料からの散乱光又は透過光を検出するための検出器、検出器からのデータを制御ユニット１０に送るデータ処理回路、制御ユニット１０の指令を受けて測定ユニット３０の操作を制御する制御回路、などを備える。

　制御ユニット１０は、凝固反応データに基づいて検体の凝固反応の分析を行う。本分析には、前述したＰ（ｉ）、Ｒｔ、Ｚ（ｉ）、Ｖ（ｉ）、Ｃ（ｉ）の取得、ＥＲ、Ｐｅの検出、凝固時間の算出、などが含まれ得る。あるいは、該分析は、測定ユニット３０からの計測データに基づいて制御ユニット１０で実施されてもよく、又は、別の機器、例えば測定ユニット３０で実施され、結果が制御ユニット１０に送られてもよい。制御ユニット１０には、ＥＲやＰｅの検出に用いる閾値が保存されていてもよく、又は制御ユニット１０は、外部機器又はネットワーク上に保存された該閾値を該検出のために取り込んでもよい。

　以上の本分析は、本発明の方法を行うためのプログラムによって実施され得る。したがって、制御ユニット１０は、本発明の血液凝固反応の分析方法を行うためのプログラムを備え得る。

　以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

１．方法
１）試料
　被検検体として、凝固異常のある血漿と凝固異常のない血漿の合計１０６２検体を使用した。

２）試薬
　ＡＰＴＴ測定用試薬としてコアグピア　ＡＰＴＴ－Ｎ（積水メディカル株式会社製）を用いた。塩化カルシウム液としてコアグピア　ＡＰＴＴ－Ｎ　塩化カルシウム液（積水メディカル株式会社製）を用いた。

３）凝固反応計測
　試料の凝固反応計測は、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）を用いて行った。検体５０μＬをキュベット内にて３７℃で４５秒間加温した後、約３７℃のＡＰＴＴ測定用試薬５０μＬを添加し、さらに１７１秒経過後に塩化カルシウム液５０μＬを添加して凝固反応を開始させた。反応は３７℃で行った。凝固反応の測定では、キュベットにＬＥＤを光源とする波長６６０ｎｍの光を照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱光の散乱光量を計測した。計測時間は３６０秒間とした。

４）凝固反応曲線の作成
　測光データに対してノイズ除去を含む平滑化処理を行った後、測光開始時点の散乱光量が０となるようにゼロ点調整処理して凝固反応曲線Ｐ（ｉ）を作成した。反応曲線の最大値をＰｍａｘとした。

５）積算比Ｚの取得
　凝固反応曲線Ｐ（ｉ）の積算比Ｚ（ｉ）（特許文献４参照）を以下のとおり算出した。
　積算比Ｚ（ｉ）＝Ｐｂ（ｉ）／Ｐａ（ｉ）
　　Ｐａ（ｉ）＝Ｐ（ｉ－２０）からＰ（ｉ－１）までの和
　　Ｐｂ（ｉ）＝Ｐ（ｉ＋１）からＰ（ｉ＋２０）までの和
　（ＥＲを回避するため）Ｐ（ｉ）がＰｍａｘの５０％に達した以降で、Ｚ（ｉ）が閾値Ｚｓ（＝１．０１０）未満となる最も早い時点を凝固反応終了時点Ｔ１００（秒）とし、以下の式を満たすＴ５０、Ｔ１０及びＴ５（いずれも秒）をそれぞれ求めた。
　Ｐ（Ｔ５０）＝Ｐ（Ｔ１００）×５０％
　Ｐ（Ｔ１０）＝Ｐ（Ｔ１００）×１０％
　Ｐ（Ｔ５）＝Ｐ（Ｔ１００）×５％

６）検体の分類
　Ｐ（ｉ）の形状に基づいて被検検体（ｎ＝１０６２）を以下の３群に分類した。
　Ｎｏｒ：初期反応（ＥＲ）なし（ｎ＝１０４３）
　ＥＲ１：Ｐ（Ｔ１００）の１０％以上の高さのＥＲあり（ｎ＝５）
　ＥＲ２：ＥＲ１を除いて、Ｐ（Ｔ１００）の５％以上の高さのＥＲあり（ｎ＝１４）

７）Ｃ（ｉ）の取得
　ｔ１＝ｉとして、下記式を満たすＣ（ｉ）を算出した。
　　Ｐ（Ｃ（ｉ））＝Ｐ（ｉ） × Ｘ％（Ｘ＝５０）
　ｉ／Ｃ（ｉ）を求めた。

２．結果
１）凝固反応曲線
　Ｎｏｒ（実線）、ＥＲ１（点線）、ＥＲ２（鎖線）の検体の凝固反応曲線の例を図４に示す。図４に示す凝固反応曲線は、各検体のＰｍａｘを１００％としたときの相対散乱光量を表す。Ｎｏｒでは、本反応が現れるまで反応曲線の変化は見られなかった。一方、ＥＲ１及びＥＲ２では、反応曲線は、ＥＲにより計測開始直後に立ち上がり緩やかな上昇を続け、その後は本反応による急激な上昇を示した。ＥＲ部の高さは、Ｐｍａｘに対して、ＥＲ１では１０％を超え、ＥＲ２では５％を超えていた。

　図５Ａ、Ｂ、Ｃは、各検体のＴ１００に対する、Ｔ５０、Ｔ１０、Ｔ５のプロット、ならびに図５Ｄ、Ｅ、Ｆは、Ｔ１００／Ｔ５０、Ｔ１０／Ｔ１００、Ｔ５／Ｔ１００のプロットを示す。Ｎｏｒ（＋）、ＥＲ１（〇）、ＥＲ２（△）の各群の分布は、Ｔ５０（図５Ａ、Ｄ）では重なっているが、Ｔ１０（図５Ｂ、Ｅ）ではＥＲ１が下方に位置し、Ｔ５（図５Ｃ、Ｆ）ではＥＲ１とＥＲ２の両方がＮｏｒより下方に位置していた。これらの結果からも、ＥＲ１では、本反応より早くＰ（Ｔ１００）の１０％以上の高さのＥＲが現れたこと、ＥＲ２では、本反応より早くＰ（Ｔ１００）の５％以上の高さのＥＲが現れたことが確認された。

２）Ｚ（ｉ）、ｉ／Ｃ（ｉ）
　図６～８は、それぞれ、Ｎｏｒ、ＥＲ１、ＥＲ２のＰ（ｉ）、Ｚ（ｉ）、ｉ／Ｃ（ｉ）の例を表す。図６～８中、Ｐ（ｉ）及びＺ（ｉ）はそれぞれＰ及びＺと表示されている。図６～８Ａ、Ｂには、それぞれＺ（ｉ）及びｉ／Ｃ（ｉ）がＰ（ｉ）とともに図示され、図６～８Ｃには、Ｚ（ｉ）がｉ／Ｃ（ｉ）とともに図示されている。また図６～８中、各図のＹ軸に沿った点線は、Ｐ（ｉ）が閾値Ｐｓ（＝２００）を超えた時点ＰｓＴを示し、ＡのＸ軸に沿った点線はＺｓを示す。図６～８Ａに示すとおり、Ｎｏｒは、本反応の立ち上がり前にＺ（ｉ）≦Ｚｓとならなかったが、ＥＲ１とＥＲ２は本反応の前にＺ（ｉ）≦Ｚｓとなった。これは、ＥＲ１とＥＲ２では、他の制約条件がなければＥＲ部で凝固反応終了時点Ｔ１００が検出され、誤った凝固時間が算出されることを示している。

　図６～８Ｂに示すとおり、ｉ／Ｃ（ｉ）は、３群とも本反応の前に高値化してピークが現れ、本反応開始後は直線的に増加した。このｉ／Ｃ（ｉ）のピークとＰｓＴとの位置関係を観察すると、Ｎｏｒではピークを通り越した後にＰｓＴがあったのに対し、ＥＲ１とＥＲ２では、ピークの始まりにＰｓＴがあった。すなわち、ＰｓＴ以降にｉ／Ｃ（ｉ）が所定の閾値を超えた場合には、ＥＲが出現していると判定することができることが示された。

　図６～８Ｃから、ＰｓＴ以降において、Ｚ（ｉ）≦Ｚｓ、かつ、ｉ／Ｃ（ｉ）がピーク内、となるのはＥＲ部であることが分かった。この関係から、次の２つの方法によりＥＲによる凝固反応終了点の誤検出を回避することができることが示唆された：一番目は、Ｚ（ｉ）≦Ｚｓとなったときにｉ／Ｃ（ｉ）が閾値を超えていない場合に凝固反応終了点とする方法である；二番目は、ｉ／Ｃ（ｉ）のピークを通り越してから探索を開始してＺ（ｉ）≦Ｚｓとなったときを凝固反応終了点とする方法である。

　図９は、ＥＲ１とＥＲ２の各検体における、Ｚ（ｉ）が閾値Ｚｓ（Ｚｓが１．０１から１．０５まで０．０１刻み）に到達した時点Ｔ１００でのｉ／Ｃ（ｉ）、すなわち、異なるＺｓに対するＴ１００／Ｃ（Ｔ１００）の分布である。図中、黒色のプロットは、ＥＲ中にＺ（ｉ）が最初に閾値Ｚｓに到達した時点でのｉ／Ｃ（ｉ）を表し、灰色のプロットは本反応開始後に最初にＺ（ｉ）が閾値Ｚｓに到達した時点でのｉ／Ｃ（ｉ）を表す。黒色と灰色のプロットの分布域は分かれており、このことからｉ／Ｃ（ｉ）に基づいてＥＲを検出できることが示された。

３）Ｚ（ｉ）に基づく凝固時間算出
　前記１．５）に従って求めた凝固反応終了時点Ｔ１００での凝固反応Ｐ（Ｔ１００）を求め、Ｐ（ｉ）がＰ（Ｔ１００）の５０％であった時点を凝固時間とした。なお、これは前記１．５）で求めたＴ５０に相当する。

４）Ｃ（ｉ）に基づく凝固時間算出
　図１０Ａ～Ｃに、それぞれ、Ｎｏｒ、ＥＲ１、ＥＲ２のＣ（ｉ）及びｉ／Ｃ（ｉ）を示す。図中、Ｃ（ｉ）はＣと表示されている。各図のＹ軸に沿った点線は、Ｐ（ｉ）が閾値Ｐｓ（＝２００）を超えた時点ＰｓＴを示す。Ｃ（ｉ）は、ｉ／Ｃ（ｉ）のピークが終わる時点、すなわち、本反応が立ち上がる時点で急上昇し、その後に平坦化した。このＣ（ｉ）の急上昇後の平坦化、例えば変化率の減少を指標に、凝固時間を算出できることが示唆された。そこでＣ（ｉ）の変化率の指標の一例として、ｉの前後１０点を用いてＣ（ｉ）の区間内平均傾きを算出した。Ｐ（ｉ）が閾値Ｐｓ（＝２００）を超えた時点ＰｓＴ以降で、傾き≦閾値Ｃｓ（＝０．０５）が最初に満たされたときを凝固時間とした。図１１Ａ～Ｃに、それぞれ、Ｎｏｒ、ＥＲ１、ＥＲ２のＣ（ｉ）及びその傾きを、Ｐ（ｉ）とともに示す。図中、Ｐ（ｉ）及びＣ（ｉ）はそれぞれＰ及びＣと表示され、Ｙ軸に沿った点線はＰ（ｉ）が閾値Ｐｓ（＝２００）を超えた時点ＰｓＴを示し、Ｘ軸に沿った点線は閾値Ｃｓを示す。Ｃ（ｉ）は、Ｐ（ｉ）の本反応が立ち上がる時点付近で急上昇し、その後本反応が終了に近づくとともに平坦化した。Ｃ（ｉ）の傾きは、本反応が終了に近づくとともに徐々に低下した。

　前記で求めたＣ（ｉ）に基づく凝固時間を、前記３）で求めたＺ（ｉ）に基づく凝固時間に対してプロットした。図１２に示すとおり、検体群にかかわらず、両方法で求めた凝固時間は高い相関を有し、いずれの方法でもほぼ同等の凝固時間が得られることが示された。

Claims

　血液凝固反応の分析方法であって、
（１）血液検体の血液凝固反応Ｐ（ｉ）を取得すること、ここでｉは計測点数又は時間を表す変数である；
（２）該Ｐ（ｉ）からｔ１及びｔ２を取得すること、
　ここで、ｔ１及びｔ２はともに計測点数又は時間を表し、ｔ１＝ｉ、ｔ２＜ｔ１であり、
　かつ、ｔ１及びｔ２は式：Ｐ（ｔ２）＝Ｐ（ｔ１） × Ｘ％を満たし、ここで、
　　該Ｐ（ｔ１）及びＰ（ｔ２）は、それぞれｔ１及びｔ２での該血液検体の血液凝固反応を表し、
　　Ｘは２０～７０である；
（３）ｔ１とｔ２の比を表すＲｔを取得すること、
を含む、方法。
　前記Ｒｔに基づいてＰ（ｉ）が真の血液凝固反応であるか否かを評価することをさらに含む、請求項１記載の方法。
　前記Ｒｔが所定値よりも大きいとき、Ｐ（ｉ）が初期反応であると評価することをさらに含む、請求項１記載の方法。
　前記Ｒｔが所定値に達するか又はそれより小さくなるまで、ｉ＝ｉ＋ｋ（ここでｋ＞０）として前記（１）～（３）の工程を繰り返し、Ｐ（ｉ）、ｔ１、ｔ２及びＲｔを新たに取得することをさらに含む、請求項１記載の方法。
　前記所定値又はそれより小さいＲｔが取得された後、続けて凝固反応終了点が検出されるか又は血液凝固時間が算出されるまで、ｉの増加とともにＰ（ｉ）の取得を繰り返すことをさらに含む、請求項４記載の方法。
　前記Ｐ（ｉ）から積算比Ｚ（ｉ）を取得すること、
　ここで、Ｚ（ｉ）＝Ｐｂ（ｉ）／Ｐａ（ｉ）
　　　　　Ｐａ（ｉ）は、Ｐ（ｉ－ｍ）からＰ（ｉ－ｗ）までの和
　　　　　Ｐｂ（ｉ）は、Ｐ（ｉ＋ｗ）からＰ（ｉ＋ｍ）までの和
　　　　　ここで、ｉは計測点数又は時間であり、
　　　　　ｉが計測点数の場合、ｗ＝１、ｍは１０～３０の整数であり、
　　　　　ｉが時間の場合、ｗは血液凝固反応の計測時間間隔、ｍは１～３秒である；
　該Ｚ（ｉ）が所定の閾値Ｚｓであるか又はそれより小さいとき、該Ｐ（ｉ）を凝固反応終了点として取得すること、
をさらに含む、請求項５記載の方法。
　前記凝固反応終了点に基づいて血液凝固時間を算出することをさらに含む、請求項６記載の方法。
　前記Ｐ（ｉ）から、式：Ｐ（Ｃ（ｉ））＝Ｐ（ｉ） × Ｘ％を満たすＣ（ｉ）を取得すること、ここでＸは２０～７０である；
　取得したＣ（ｉ）に基づいて血液凝固時間を算出すること、
をさらに含む、請求項５記載の方法。
　取得したＰ（ｉ）から凝固反応速度データを算出すること；
　該凝固反応速度データに基づいて血液凝固時間を算出すること、
をさらに含む、請求項５記載の方法。
　前記Ｐ（ｉ）が所定の閾値Ｐｓに達するか又はそれを超えるまでは、前記工程（１）を繰り返すことをさらに含む、請求項１記載の方法。
　前記ｉが所定の計測終点に達しており、かつ前記Ｒｔが前記所定値に達していないか又はそれより小さくない場合に、前記工程の繰り返しを終了し、前記血液検体の血液凝固反応が検出されなかったという結果を取得することをさらに含む、請求項４記載の方法。
　前記ｉが所定の計測終点に達しており、かつ前記凝固反応終了点が検出されていないか又は凝固時間が算出されていない場合に、前記工程の繰り返しを終了し、前記血液検体の血液凝固反応が終了しなかったという結果を取得することをさらに含む、請求項５記載の方法。
　凝固反応終了点が検出されるか又は血液凝固時間が算出された場合、該Ｐ（ｉ）の取得を止めることをさらに含む、請求項５記載の方法。
　算出された血液凝固時間を出力することをさらに含む、請求項７～９のいずれか１項記載の方法。