WO2024106529A1 - 抗肥満作用を有する新規化合物 - Google Patents

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WO2024106529A1
WO2024106529A1 PCT/JP2023/041403 JP2023041403W WO2024106529A1 WO 2024106529 A1 WO2024106529 A1 WO 2024106529A1 JP 2023041403 W JP2023041403 W JP 2023041403W WO 2024106529 A1 WO2024106529 A1 WO 2024106529A1
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group
compound
carbon atoms
solvate
adipocytes
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PCT/JP2023/041403
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智彦 大和田
優子 渡邉
太朗 飯利
悟 猪股
紀子 槙田
佐藤 潤一郎 内田
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国立大学法人 東京大学
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    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D471/18—Bridged systems

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound having an anti-obesity effect and a pharmaceutical composition containing the same.
  • Obesity is a condition in which excess fat accumulates in the body, and is known as obesity when it is accompanied by hyperglycemia, hyperlipidemia, hypertension, etc.
  • the Japan Society for the Study of Obesity defines "obesity" as a BMI (body mass index) of 25 or more.
  • Obesity that develops in adults is caused by overeating and reduced activity, and at the cellular level, fat cells become enlarged.
  • obese people are generally more susceptible to various diseases, and often suffer from abnormalities in carbohydrate metabolism and lipid metabolism, which increases the risk of abnormal carbohydrate metabolism, cardiovascular disorders, hypertension, sleep apnea syndrome, osteoarthritis, etc., making them targets for treatment.
  • Treatments for obesity include diet and exercise therapy, surgical treatments such as jejuno-ileal anastomosis, and drug therapy with anti-obesity drugs.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 lipase inhibitors, appetite suppressants, and ⁇ -adrenergic antagonists have been developed as anti-obesity drugs, which have the effect of suppressing inappropriate weight gain and visceral fat gain.
  • cAMP and its derivatives are known as compounds that promote lipolysis (Non-Patent Documents 1 to 5), but no other promising compounds are known.
  • the present invention aims to provide a novel compound that is useful for promoting the breakdown of neutral fats in adipocytes, and a novel drug for treating obesity and obesity-related diseases that contains the compound as an active ingredient.
  • the present inventors have now found that the compound of formula (I) sustainably promotes the breakdown of neutral fat in adipocytes.
  • the present inventors have also found that the compound of formula (I), when used in combination with a cAMP analog, synergistically enhances the neutral fat breakdown promoting effect of the cAMP analog.
  • the present inventors have also found that the compound of formula (I) activates protein kinase A and hormone-sensitive lipase.
  • administration of the compound of formula (I) to mice sustainably promotes the breakdown of neutral fat and reduces body weight.
  • the present invention is based on these findings.
  • a compound of the following formula (I) or a pharma- ceutically acceptable salt or solvate thereof (hereinafter, sometimes referred to as "the compound of the present invention"): (In the above formula, X and Z each represent a carbon atom or a nitrogen atom, and when X represents a nitrogen atom, R5 does not exist, and when Z represents a nitrogen atom, R6 does not exist, and both X and Z do not represent nitrogen atoms, and --- represents a single bond or a double bond; R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkylcarbonyl group having 1 to 4 carbon atoms, or -R a -R b (wherein R a represents -(CH 2 ) m- (m is an integer of 1 to 3), one -(CH 2 )- in -(CH 2 ) m- may represent -(C ⁇ O)-,
  • An agent for promoting neutral fat decomposition in adipocytes comprising the compound of formula (I) according to any one of the above [1] to [5] or a pharma- ceutical acceptable salt or solvate thereof as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, the compound of formula (I) according to any one of the above [1] to [5] or a pharma- ceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • composition according to any one of the above-mentioned [7] to [10], which is used in combination with another medicament (e.g., an anti-obesity drug, preferably an agent for promoting cAMP production in adipocytes).
  • another medicament e.g., an anti-obesity drug, preferably an agent for promoting cAMP production in adipocytes.
  • a method for promoting neutral fat breakdown in adipocytes comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the compound of formula (I) according to any of the above [1] to [5] or a pharmacologic agent comprising the compound or a pharmacologic agent comprising the compound or a pharmacologic agent.
  • the present invention provides a novel compound that is useful for promoting the breakdown of neutral fats in adipocytes, and a novel anti-obesity drug and a drug for treating obesity-related diseases that contain the compound as an active ingredient.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of the compound of the present invention on the production of free fatty acids from adipocytes (Test Example 2).
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of the compound of the present invention on hormone-sensitive lipase activation in adipocytes (Test Example 3).
  • 3 is a graph showing the effect of the compound of the present invention on cAMP production in adipocytes (Test Example 4).
  • the amount of cAMP production (%) is expressed as a relative percentage, with the maximum amount of cAMP production stimulated by a high concentration (10,000 nM) of isoproterenol (ISO) being taken as 100%.
  • FIG. 4 is a diagram showing the effect of the compound of the present invention on the activation of protein kinase A (PKA) in adipocytes (Test Example 5).
  • PKA protein kinase A
  • the substrate contained in the reacted reagent is phosphorylated by the activated PKA and migrates to the cathode (lower side) of electrophoresis.
  • the substrate that is not phosphorylated by PKA migrates to the anode (upper side) of electrophoresis. The stronger the band that migrates to the cathode, the stronger the activation of PKA in the sample.
  • FIG. 1 protein kinase A
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of the compound of the present invention on free fatty acid production from adipocytes (Test Example 6).
  • FIG. 6 is a graph showing the synergistic effect of the compound of the present invention and a cAMP analog (dcAMP) on the production of free fatty acids from adipocytes (Test Example 7).
  • Figure 7 shows the effect of the compound of the present invention in vivo (Test Example 8).
  • Figure 7A is a graph showing the effect of the compound of the present invention on body weight (Dunnett's test, *p ⁇ 0.01, vs. control group).
  • Figure 7B is a graph showing the effect of the compound of the present invention on free fatty acid production.
  • Figure 7C is a graph showing the effect of the compound of the present invention on hormone-sensitive lipase activation in adipocytes.
  • an "alkyl group” as a whole or part of a group means a linear, branched or cyclic aliphatic hydrocarbon chain.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group can be, for example, 1 to 4, 2 to 4, 1 to 3, 2 to 3, 1 to 2 or 1.
  • Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, a cyclopropyl group and a cyclobutyl group.
  • aliphatic ring group refers to a cyclic aliphatic hydrocarbon group.
  • the aliphatic ring group may be carbocyclic or heterocyclic.
  • the carbocyclic aliphatic ring group is a 3-8 membered (preferably 4-7 membered, 5-6 membered, or 6 membered) saturated or unsaturated monocyclic carbon ring (aliphatic carbon ring), such as a cyclopropane group, a cyclobutane group, a cyclopentane group, a cyclohexane group, a cycloheptane group, or a cyclooctane group.
  • the heterocyclic aliphatic ring group is a 3-8 membered (preferably 4-7 membered, 5-6 membered, or 6 membered) saturated or unsaturated monocyclic hetero ring (aliphatic hetero ring) containing one or more (e.g., 1-3, 1-2, or 1) heteroatoms selected from oxygen atoms, nitrogen atoms, and sulfur atoms as ring member atoms, such as a pyrrolidine group, a piperidine group, a piperazine group, a morpholine group, or a tetrahydrofuran group.
  • aromatic ring group refers to a ring-based compound or a part thereof having aromatic properties, and has a stable structure including a cyclic conjugated system with 4n+2 ⁇ electrons.
  • aromatic ring group may be an aromatic hydrocarbon group or an aromatic heterocyclic group.
  • aromatic hydrocarbon group is a 6-10 membered unsaturated carbon ring, and may be a monocyclic aromatic ring group or a bicyclic aromatic condensed ring group, for example, a phenyl group or a naphthyl group.
  • aromatic heterocyclic group is a 6-10 membered heterocyclic ring containing one or more (for example, 1-3, 1-2, or 1) heteroatoms selected from oxygen, nitrogen, and sulfur atoms as ring member atoms, and may be a monocyclic aromatic heterocyclic group or a bicyclic aromatic condensed heterocyclic group, for example, a furan group, a thiophene group, a pyrrole group, an imidazole group, a pyridine group, a pyrimidine group, a quinoline group, an isoquinoline group, and an indole group.
  • an "alkoxy group” refers to a group in which an alkyl group is bonded to an oxygen atom (-O-).
  • an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms means that the alkyl group portion has 1 to 4 carbon atoms.
  • alkoxy groups include methoxy and ethoxy groups.
  • an alkoxycarbonyl group having 1 to 4 carbon atoms means that the alkyl group portion has 1 to 4 carbon atoms.
  • alkoxycarbonyl groups include methoxycarbonyl groups, ethoxycarbonyl groups, propoxycarbonyl groups, and butoxycarbonyl groups.
  • a hydroxyl group represents -OH
  • halogen atom means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • substituted means that one or more hydrogen atoms on the substituted group or atom may be substituted with another group.
  • X and Z each independently represent a carbon atom or a nitrogen atom, but X and Z do not simultaneously represent a nitrogen atom.
  • one of X and Z represents a nitrogen atom and the other represents a carbon atom, more preferably, X represents a nitrogen atom and Z represents a carbon atom.
  • the compound of formula (I) may be a stereoisomer (diastereomer) in which the two carbon atoms to which R2 and R3 are bonded are asymmetric atoms. That is, the compound of formula (I) includes cis-trans isomers.
  • one -(CH 2 )- in -(CH 2 )m- represented by R a may represent -(C ⁇ O)-, and in this case, it is preferable that -R a and R b are bonded via this -(C ⁇ O)-.
  • R2 and R3 preferably simultaneously represent the same group, with the proviso that R2 and R3 do not simultaneously represent a hydrogen atom.
  • R 2 and R 3 may each represent a group -(C ⁇ O)-R c , where R c is -O-(CH 2 )n-(C ⁇ O)-R 13 , where n is preferably 1 or 2 and R 13 preferably represents methoxy or ethoxy, more preferably n is 1 or 2 and R 13 represents methoxy.
  • R5 may represent a group --(C.dbd.O)-- Rd , where Rd is an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms. Rd preferably represents methoxy or ethoxy.
  • R 5 can represent a group -(C ⁇ O)-R d where R d is -N(-R 21 )(-R 22 ), and preferably both of R 21 and R 22 represent a hydrogen atom, or one of them represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms (more preferably methoxy or ethoxy), and the other represents a hydrogen atom.
  • R 6 may represent a group --(C ⁇ O)--R e , where R e is an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms. R e preferably represents methoxy or ethoxy.
  • X represents a nitrogen atom
  • Z represents a carbon atom
  • --- represents a double bond
  • R2 and R3 may be the same or different and represent a methoxycarbonyl group or an ethoxycarbonyl group, preferably both R2 and R3 represent a methoxycarbonyl group or an ethoxycarbonyl group;
  • R4 and R7 represent a hydrogen atom;
  • R5 is absent, Compounds, or pharma- ceutically acceptable salts or solvates thereof, are provided in which R6 represents a me
  • the compound of the present invention also includes pharma- ceutical acceptable salts of the compound of formula (I).
  • the "pharmacologically acceptable salt” can be selected from salts described in Berge et al., J.Pharm.Sci.66:1-19(1977) and the like.
  • Examples of pharma- ceutical acceptable salts include, when an acidic group such as a carboxy group is present in the compound of formula (I), salts of alkali metals and alkaline earth metals such as lithium, sodium, potassium, magnesium, calcium, and the like; salts of amines such as ammonia, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, dicyclohexylamine, tris(hydroxymethyl)aminomethane, N,N-bis(hydroxyethyl)piperazine, 2-amino-2-methyl-1-propanol, ethanolamine, N-methylglucamine, L-glucamine, and the like; and salts with basic amino acids such as lysine, ⁇ -hydroxylysine, and arginine.
  • an acidic group such as a carboxy group is present in the compound of formula (I)
  • salts of alkali metals and alkaline earth metals such as lithium, sodium, potassium, magnesium, calcium, and the like
  • salts of amines
  • examples of the salt include salts with mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, etc.; salts with organic acids such as methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, paratoluenesulfonic acid, acetic acid, propionate, tartaric acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, oxalic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid, mandelic acid, cinnamic acid, lactic acid, glycolic acid, glucuronic acid, ascorbic acid, nicotinic acid, salicylic acid, etc.; and salts with acidic amino acids such as aspartic acid, glutamic acid, etc.
  • the compounds of the present invention also include solvates of the compounds of formula (I) or their pharma- ceutically acceptable salts. Examples of solvates include hydrates and
  • the compound of the present invention represented by formula (I) can be prepared according to the following scheme 1. That is, the compound of formula (I) can be prepared by reacting a compound of formula (II) (wherein R 1 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are defined as defined in formula (I)) with a compound of formula (III) (wherein R 2 and R 3 are defined as defined in formula (I)) in an organic solvent (non-polar solvent (toluene, dichloromethane) to polar protic solvent (ethanol, isopropanol), etc.) at room temperature to 120° C. for 0.5 to 24 hours.
  • an organic solvent non-polar solvent (toluene, dichloromethane) to polar protic solvent (ethanol, isopropanol), etc.
  • the compound of the present invention can promote the decomposition of neutral fat (triacylglycerol) in adipocytes. Therefore, the compound of the present invention can be used to promote the decomposition of neutral fat in adipocytes, and can also be used to treat, prevent or improve diseases or symptoms that can be treated, prevented or improved by promoting the decomposition of neutral fat in adipocytes.
  • neutral fat triacylglycerol
  • Diseases or symptoms that can be treated, prevented, or improved by promoting the breakdown of neutral fat in adipocytes include obesity and related diseases or symptoms (Edward T et al., Nat.Metab., 2019, 1(2):189-200, Shannon M et al., Nature Reviews Endocrinology, 2017, 13:633-643).
  • diseases or symptoms related to obesity include impaired glucose tolerance, dyslipidemia, hypertension, hyperuricemia, gout, coronary artery disease, cerebral infarction, fatty liver, menstrual disorders, pregnancy complications, sleep apnea syndrome, obesity hypoventilation syndrome, orthopedic diseases, and obesity-related kidney disease (Obesity Diagnostic Criteria 2011, Japan Society for the Study of Obesity).
  • the compounds of the present invention when used in combination with a cAMP analog in adipocytes, can synergistically enhance the neutral fat decomposition promoting effect of the cAMP analog. Therefore, the compounds of the present invention can be preferably used in combination with a cAMP analog (PKA activator) such as dcAMP or a cAMP production promoter in adipocytes.
  • a cAMP analog PKA activator
  • dcAMP a cAMP analog
  • cAMP production promoter in adipocytes include ⁇ -adrenergic receptor agonists such as isoproterenol and adenylate cyclase activators such as forskolin.
  • Agents that promote cAMP production in fat cells are known as anti-obesity drugs that induce cAMP production in fat cells and break down neutral fats, but the neutral fat decomposition effect of compounds that induce cAMP production, such as isoproterenol and forskolin, is transient and disappears 24 hours after introduction of these compounds into fat cells.
  • the compound of the present invention promoted neutral fat decomposition without any weakening even 24 and 72 hours after introduction into fat cells.
  • the compound of the present invention is advantageous in that it is expected to continuously break down neutral fats in mast cells.
  • the compounds of the present invention can promote the decomposition of neutral fats in adipocytes without the production of cAMP, it is believed that the compounds of the present invention can promote the decomposition of neutral fats through a pathway that does not involve ⁇ -adrenergic receptor stimulation (activation of protein kinase A and activation of hormone-sensitive lipase). Therefore, the compounds of the present invention can be used to treat, prevent, or improve obesity, in which neutral fats accumulate in adipocytes due to reduced stimulation of ⁇ -adrenergic receptors ( ⁇ 2 or ⁇ 3 receptors), as well as diseases and symptoms associated therewith.
  • ⁇ -adrenergic receptors ⁇ -adrenergic receptors
  • the compound of the present invention has the effect of promoting neutral fat decomposition in adipocytes and also has the effect of reducing body weight
  • the compound of the present invention can be administered to a subject at risk of developing obesity or a disease or symptom associated therewith, thereby reducing the risk of developing obesity or a disease or symptom associated therewith.
  • subject at risk of developing obesity or a disease or symptom associated therewith means a subject who does not have subjective symptoms of obesity or the like, but is likely to develop obesity or the like in the future.
  • reducing the risk of developing obesity or a disease or symptom associated therewith means reducing the probability of developing obesity or the like.
  • an agent for reducing the risk of developing obesity or a disease or symptom associated therewith and a composition for reducing the risk of developing obesity or a disease or symptom associated therewith, which comprise the compound of the present invention as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition and a therapeutic preparation comprising the compound of the present invention as an active ingredient are provided.
  • the route of administration of the compound of the present invention is not particularly limited, and may be either oral administration or parenteral administration (e.g., intravenous administration, subcutaneous administration).
  • Oral administration agents include, for example, tablets, capsules, granules, powders, pills, lozenges, chewable tablets, syrups, liquids, emulsions, and suspensions.
  • Parenteral administration agents include, for example, injections, suppositories, inhalants, and transdermal absorption agents.
  • preparations can be formulated using a pharmacopoeia that is pharmacopoeia 18th Edition, a known method described in the General Provisions for Preparations, etc., using a pharmacopoeia that is pharmacopoeia 18th Edition.
  • pharmacopoeia that is pharmacopoeia 18th Edition
  • examples of pharmacopoeia that is pharmacopoeia 18th Edition include excipients, binders, diluents, lubricants, additives, flavors, buffers, thickeners, colorants, stabilizers, emulsifiers, dispersants, suspending agents, and preservatives.
  • the dosage of the compound of the present invention depends on the sex, age, and weight of the subject, symptoms, time of ingestion, dosage form, route of administration, and drugs to be combined, and may be appropriately determined by the doctor's judgment in some cases.
  • the daily dosage for an adult can be, for example, in the range of 0.01 to 1000 mg in the case of oral administration, and can be, for example, in the range of 0.001 to 100 mg in the case of parenteral administration such as intravenous injection, but is not limited thereto.
  • the compound of the present invention can be administered not only to humans who require it, but also to mammals other than humans (for example, mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, sheep, goats, and monkeys).
  • the compounds of the present invention can be administered in combination with other pharmaceutical agents (e.g., anti-obesity drugs).
  • other pharmaceutical agents e.g., anti-obesity drugs.
  • a single formulation containing both drugs may be administered, or each drug may be formulated separately and administered separately.
  • the timing of administration is not particularly limited, and the drugs may be administered simultaneously or at intervals (e.g., at different times with an interval between each other or on different days).
  • a method for promoting neutral fat decomposition in adipocytes comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the compound of formula (I) or a pharma- ceutically acceptable salt or solvate thereof, or a composition comprising the same.
  • a method for treating, preventing, or improving a disease or symptom that can be treated, prevented, or improved by promoting neutral fat decomposition in adipocytes comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the compound of formula (I) or a pharma- ceutically acceptable salt or solvate thereof, or a composition comprising the same.
  • a method for reducing the risk of developing obesity or a disease or symptom associated therewith comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the compound of formula (I) or a pharma- ceutical acceptable salt or solvate thereof, or a composition comprising the same.
  • the method of the present invention can be carried out according to the description of the compounds and medicaments of the present invention.
  • the use of the present invention can be carried out according to the description of the compound and medicament of the present invention.
  • a compound of formula (I) or a pharma- ceutically acceptable salt or solvate thereof, or a composition comprising the same for use in the method of the present invention. That is, according to another aspect of the present invention, there is provided a compound of formula (I) or a pharma-ceutically acceptable salt or solvate thereof, or a composition comprising the same, for use in promoting neutral fat decomposition in adipocytes.
  • a compound of formula (I) or a pharma-ceutically acceptable salt or solvate thereof, or a composition comprising the same for use in treating, preventing, and/or improving a disease or symptom that can be treated, prevented, or improved by promoting neutral fat decomposition in adipocytes.
  • a compound of formula (I) or a pharma-ceutically acceptable salt or solvate thereof, or a composition comprising the same for use in reducing the risk of developing obesity or a disease or symptom associated therewith.
  • the above invention can be carried out according to the description of the compound and medicament of the present invention.
  • the reaction solution was concentrated, and 200 mL of 1 mol/L hydrochloric acid was added to the residue, followed by extraction with 200 mL of ethyl acetate three times.
  • the organic layer was washed with 200 mL of 1 mol/L hydrochloric acid, then with 200 mL of water twice, and finally with 200 mL of saturated saline.
  • the organic layer was dried over sodium sulfate and concentrated.
  • Test Example 1 Preparation of mature adipocytes
  • Mouse fibroblast cells 3T3-L1 were seeded on a dish and cultured until confluent.
  • the medium was replaced with 10% fetal bovine serum, Dulbecco's modified Eagle medium (high glucose 4.5 g/L) (sometimes referred to as "DMEM” in this specification), 500 ⁇ M isobutylmethylxanthine (Sigma, sometimes referred to as "IBMX” in this specification), 5 ⁇ g/mL insulin, 250 nM dexamethasone (DEX)) (Day 0).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • IBMX isobutylmethylxanthine
  • DEX dexamethasone
  • DMEM medium 10% fetal bovine serum, 5 ⁇ g/mL insulin.
  • DMEM medium 10% fetal bovine serum, 5 ⁇ g/mL insulin.
  • Mature adipocytes 8 days (Day 8) or later from the start of differentiation induction were used as adipocytes in the examples described below.
  • Test Example 2 Effect of Compound LIS on Promoting Neutral Fat Decomposition (1)
  • DMEM medium 2% bovine serum albumin (WAKO, hereinafter the same), various agonists added.
  • agonists compound LIS001 100 ⁇ M, isoproterenol ( ⁇ -adrenergic receptor agonist, sometimes referred to as "ISO” in this specification) 100 nM and 100 ⁇ M, dibutyryl cAMP (cAMP analog, sometimes referred to as "dcAMP” in this specification) 300 ⁇ M, or forskolin (adenylate cyclase activator) 1 ⁇ M were used.
  • a group (non-added) to which no agonist was added was prepared as a control group. 3 hours, 24 hours, 48 hours, and 72 hours after administration of the agonist, a portion of the cell supernatant was collected, and the free fatty acid concentration in the supernatant was measured using a non-esterified fatty acid kit (NEFA C-Test Wako, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Specifically, the collected cell supernatant was chemically reacted with the reagents in the kit, and the absorbance (wavelength 550 nm) was measured using a spectrophotometer. The concentration ( ⁇ M) of the free fatty acid in each sample was calculated based on the absorbance of the free fatty acid (palmitic acid) with a known concentration included in the kit.
  • a non-esterified fatty acid kit NEFA C-Test Wako, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Test Example 3 Hormone-sensitive lipase activation effect of compound LIS (1) Experimental procedure Mature adipocytes prepared in Test Example 1 were used. The medium was replaced with DMEM medium (2% bovine serum albumin, various agonists added). As agonists, 300 ⁇ M of compound LIS001, 300 ⁇ M of compound LIS016, 300 ⁇ M of compound LIS017, and 100 nM and 1 ⁇ M of isoproterenol were used. The control group was a group to which no agonist was added (non-addition).
  • adipocytes were collected using SDS (composition: 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) (prepared with Tris from Sigma and 1 M hydrochloric acid from Wako), 10% SDS (Wako), 50% glycerol (Wako) and ⁇ -mercaptoethanol (2-mercaptoethanol, min. 98%, Sigma).
  • SDS composition: 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) (prepared with Tris from Sigma and 1 M hydrochloric acid from Wako), 10% SDS (Wako), 50% glycerol (Wako) and ⁇ -mercaptoethanol (2-mercaptoethanol, min. 98%, Sigma).
  • HSL hormone-sensitive lipase
  • HSL is an enzyme that controls lipolysis
  • HSL activity is positively regulated by phosphorylation of Ser563 and Ser660 residues (generally enhanced via cAMP-PKA stimulation) and negatively regulated by phosphorylation of Ser565 residue (Antonis D. Lampidonis et al., Gene, 2011, 477: 1-11.
  • HSL activity was evaluated by Western blotting according to a conventional method. Specifically, the collected samples were boiled and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to detect phosphorylated HSL proteins in the cells.
  • SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • the primary antibodies were anti-phosphorylated HSL Ser563 antibody (Phospho-HSL (S563) Rabbit Ab, cell signaling technology, Inc., the same applies below), anti-phosphorylated HSL Ser565 antibody (Phospho-HSL (S565) Rabbit Ab, cell signaling technology, Inc.), and anti-HSL antibody (HSL Rabbit Ab, cell signaling technology, Inc., the same applies below).
  • the strength of phosphorylation (band strength) of the HSL Ser563 residue by the compound LIS was evaluated using an anti-phosphorylated HSL Ser563 antibody.
  • the amount of HSL protein in each sample was evaluated using an anti-HSL antibody.
  • the strength of dephosphorylation of the HSL Ser565 residue by the compound LIS was evaluated using an anti-phosphorylated HSL Ser565 antibody.
  • HSL activity is high, the dephosphorylation of the Ser565 residue is strong, and the band detected by the anti-phosphorylated HSL Ser565 antibody becomes weak.
  • the hormone-sensitive lipase activating effect of compounds LIS001 and LIS016 was shown to be sustained, unlike the hormone-sensitive lipase activating effect of isoproterenol (ISO) stimulating the ⁇ -adrenergic receptor, which disappears 24 hours after administration and is transient. Furthermore, this result and the result of Test Example 4 described below suggest that LIS016 activates hormone-sensitive lipase not via cAMP but partly via PKA activation. In fat cells administered with compound LIS017, no increase in the Ser563 phosphorylated protein of hormone-sensitive lipase or decrease in the Ser565 phosphorylated protein was observed. These results show that the addition of compounds LIS001 and LIS016 to fat cells strongly and sustainably activates hormone-sensitive lipase in fat cells.
  • Test Example 4 Effect of Compound LIS on cAMP Production (1) Experimental Procedure Mature adipocytes prepared in Test Example 1 were used. The medium was replaced with cAMP assay buffer (1xHBSS, prepared by mixing the following: KCl: Wako, KH 2 PO 4 : Sigma, NsCl: Sigma, Na 2 HPO 4 : Sigma, D-Glucose: Nacalai Tesque), 1M HEPES (Sigma), 7.5% bovine serum albumin, 500mM IBMX, various agonists added). Compound LIS016 100000nM and ISO 0, 0.1, 1, 10, 100, 1000, 10000nM were used as agonists.
  • Test Example 5 Protein kinase A activation effect of compound LIS (1) Experimental procedure Mature adipocytes prepared in Test Example 1 were used. The medium was replaced with DMEM medium (with PKA inhibitor added). 30 ⁇ M H-89 was used as the PKA inhibitor. Then, one hour after H-89 administration, various agonists were added to the above DMEM medium. As the agonist, 100 ⁇ M of compound LIS001 and 300 ⁇ M of 6-benzoyl-cAMP (6-Bnz-cAMP: cAMP analog, Life Science Institute) were used as a positive control. 6-Bnz-cAMP activates protein kinase A (sometimes referred to as "PKA" in this specification) (Johannes L. Bos., Trends Biochem.
  • PKA protein kinase A activation effect of compound LIS
  • adipocytes were collected using PKA assay buffer (1M tris HCl, EDTA, EGTA, ⁇ -mercaptoethanol, protease inhibitor). PKA activity of collected cells was evaluated using cAMP-Dependent Protein Kinase of PepTag Assay for Non-Redioactive Detection of Protein Kinase C or cAMP-Dependent Protein Kinase (Promega).
  • cells collected in PKA assay buffer were crushed on ice using a Dounce homogenizer and centrifuged at 14000g to separate intracellular components into liquid and solid phases.
  • the liquid phase was collected, and a part of the liquid phase was reacted with the reagent included in the kit, and then applied to an agarose gel for electrophoresis and electrophoresed.
  • Test Example 6 Effect of Compound LIS on Promoting Neutral Fat Decomposition (2) (1) Experimental Procedure Mature adipocytes prepared in Test Example 1 were used. The medium was replaced with DMEM medium (2% bovine serum albumin, various agonists added). As agonists, 100 ⁇ M of LIS compounds LIS001, LIS016, LIS017 and LIS018 were used alone. In addition, a control group was prepared in which no agonist was added (non-added). The concentration of free fatty acids in each sample was calculated in the same manner as in Test Example 2 (1), except that a portion of the cell supernatant was collected 24 hours after agonist administration.
  • Test Example 6 it was confirmed that the compounds LIS017 and LIS018, which were not found to have any effect of promoting neutral fat decomposition when used alone, synergistically enhanced the production of free fatty acids from adipocytes by the cAMP analog when administered in combination with a cAMP analog. This suggests that the compounds LIS017 and LIS018 can synergistically enhance the neutral fat decomposition promoting effect of the cAMP analog when administered in combination with a cAMP analog.
  • Test Example 8 In vivo neutral fat decomposition promoting effect of compound LIS (1) Experimental procedure Male 16-week-old C57/BL6 mice (16 mice) were weighed. The weights were about 30 g. Then, the mice were anesthetized with a triple-mixture anesthesia (medetomidine hydrochloride 0.3 mg/kg, midazolam 4 mg/kg, butorphanol tartrate 5 mg/kg). Then, LIS001 30 mg/0.03 mL DMSO was diluted with 3 mL olive oil, and compound LIS001 was injected intraperitoneally to give doses of 0, 10, 30, and 100 mg/kg body weight. After weighing 24 hours and 72 hours after administration, the mice were sacrificed.
  • a triple-mixture anesthesia medetomidine hydrochloride 0.3 mg/kg, midazolam 4 mg/kg, butorphanol tartrate 5 mg/kg.
  • LIS001 30 mg/0.03 mL DMSO was diluted with 3 mL olive oil,
  • adipose tissue was extracted from the epididymis, and hormone-sensitive lipase (HSL) activity in the adipocytes was evaluated by Western blotting using anti-phosphorylated HSL Ser563 antibody in the same manner as in Test Example 3(1).
  • HSL hormone-sensitive lipase
  • the results of Figure 7A show that the group administered 30 mg/kg of compound LIS001 had a decrease in body weight 72 hours after administration compared to before administration, and the group administered 100 mg/kg of compound LIS001 had a significant decrease in body weight before and after administration compared to the control group (non-administered).
  • the results of Figure 7B show that when compound LIS001 was administered in vivo, the serum free fatty acid concentration increased compared to the control group (non-administered), and this effect continued even 72 hours after administration. These results confirmed that compound LIS001 has an effect of continuously promoting the decomposition of neutral fats in vivo.

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Abstract

本発明は、脂肪細胞における中性脂肪の分解促進に有用な新規化合物と、それを有効成分とする新規な肥満症治療薬および肥満関連疾患治療薬の提供を目的とする。本発明によれば、下記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物と、それを有効成分とする肥満症治療薬および肥満関連疾患治療薬が提供される。 （式中、ＸおよびＺは窒素または炭素を表し、Ｒ１がアルキル、基－Ｒａ－Ｒｂ等を表し、Ｒ２およびＲ３が水素、アルコキシカルボニルまたはアルキルカルバモイル等を表し、Ｒ４およびＲ７が水素を表し、Ｒ５およびＲ６が水素、アルコキシカルボニルまたはアルキルカルバモイル等を表す）

Description

抗肥満作用を有する新規化合物 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国出願である特願２０２２－１８４９０６（出願日：２０２２年１１月１８日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、抗肥満作用を有する新規化合物と、それを含んでなる医薬組成物に関する。
　肥満は身体に脂肪が過剰に蓄積した状態であり、高血糖や、高脂血症、高血圧等を呈するとき肥満症といい、日本肥満学会ではＢＭＩ（体容量指数）が２５以上を「肥満」と定義している。成人に発症する肥満は、過食や活動性の低下が原因であり、細胞レベルでは脂肪細胞の肥大が生じている。肥満者は非肥満者に比較して、総じて種々の疾患に罹患しやすく、糖質代謝異常や脂質代謝異常をしばしば合併し、糖代謝異常、心血管障害、高血圧、睡眠時無呼吸症候群、骨関節炎等の危険性が高まるため、治療の対象となる。肥満の治療として、食事・運動療法、空腸－回腸吻合術等の外科療法、抗肥満薬による薬物療法が行われてきた。
　これまでに抗肥満薬として、不適切な体重の増加や内臓脂肪の増加を抑制する作用を有するリパーゼ阻害剤、食欲抑制剤およびβアドレナリン作動性アンタゴニスト等が開発されている（特許文献１および２）。また、脂肪分解を促進する化合物としてｃＡＭＰやその誘導体が知られている（非特許文献１～５）が、これら以外には有望な化合物が知られていない。
国際公開第２００６／１２９７８５号 特開２０００－８００４７号公報
Journal of Molecular Endocrinology, 2014, 52: R199-R222 日薬理誌, 2015, 146: 93-97 Nature Metabolism, 2021, 3: 1445-1465 Gene, 2011, 477: 1-11 昭和大学薬学雑誌, 2010, 1: 39-51
　本発明は、脂肪細胞における中性脂肪の分解促進に有用な新規化合物と、それを有効成分とする新規な肥満症治療薬および肥満関連疾患治療薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは今般、式（Ｉ）の化合物が、脂肪細胞において中性脂肪の分解を持続的に促進させることを見出した。本発明者らはまた、式（Ｉ）の化合物が、ｃＡＭＰアナログと併用することにより、ｃＡＭＰアナログの中性脂肪分解促進作用を相乗的に増強させることを見出した。本発明者らはまた、式（Ｉ）の化合物が、プロテインキナーゼＡおよびホルモン感受性リパーゼを活性化することを見出した。本発明者らはまた、式（Ｉ）の化合物をマウスに投与したところ中性脂肪の分解を持続的に促進させるとともに、体重を減少させることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
　本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］下記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物（以下、「本発明の化合物」ということがある）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （上記式中、
　ＸおよびＺは、炭素原子または窒素原子を表し、Ｘが窒素原子を表すときＲ５は存在せず、Ｚが窒素原子を表すときＲ６は存在せず、ＸおよびＺの両方が窒素原子を表すことはなく
　---は、単結合または二重結合を表し、
　Ｒ１は、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルキルカルボニル基または－Ｒａ－Ｒｂ（式中、Ｒａは－（ＣＨ２）ｍ－（ｍは１～３の整数である）を表し、－（ＣＨ２）ｍ－の一つの－（ＣＨ２）－は－（Ｃ＝Ｏ）－を表してもよく、Ｒｂは芳香環基または脂肪族環基を表し、前記芳香環基および脂肪族環基は、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のアルキル基またはハロゲン原子により置換されていてもよい）を表し、
　Ｒ２およびＲ３は、同一または異なっていてもよく、水素原子または－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｃ（式中、Ｒｃは、水酸基、炭素数１～４のアルコキシ基、－Ｎ（－Ｒ１１）（－Ｒ１２）（式中、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ水素原子または炭素数１～４のアルキル基を表す）または－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒ１３（式中、ｎは１～３の整数であり、Ｒ１３は炭素数１～４のアルキル基を表す）を表し、但し、Ｒ２およびＲ３が同時に水素原子を表すことはなく、
　Ｒ４およびＲ７は、水素原子を表し、
　Ｒ５は、水素原子または－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｄ（式中、Ｒｄは、水酸基、炭素数１～４のアルコキシ基、－Ｎ（－Ｒ２１）（－Ｒ２２）（式中、Ｒ２１およびＲ２２はそれぞれ水素原子または炭素数１～４のアルキル基を表す）または－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒ２３（式中、ｐは１～３の整数であり、Ｒ２３は炭素数１～４のアルキル基を表す）を表し、
　Ｒ６は、水素原子または－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｅ（式中、Ｒｅは、水酸基、炭素数１～４のアルコキシ基、－Ｎ（－Ｒ３１）（－Ｒ３２）（式中、Ｒ３１およびＲ３２はそれぞれ水素原子または炭素数１～４のアルキル基を表す）または－Ｏ－（ＣＨ２）ｒ－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒ３３（式中、ｒは１～３の整数であり、Ｒ３３は炭素数１～４のアルキル基を表す）を表す。）
［２］Ｒ１が、炭素数１～４のアルキル基または－Ｒａ－Ｒｂ（式中、Ｒａは－ＣＨ２－または－Ｃ（＝Ｏ）－を表し、Ｒｂは置換されていてもよい芳香環基または脂肪族炭素環基を表す）を表す、上記［１］に記載の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
［３］---が、二重結合を表す、上記［１］または［２］に記載の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
［４］Ｒ２およびＲ３が、同一または異なっていてもよく、炭素数１～４のアルコキシカルボニル基を表す、上記［１］～［３］のいずれかに記載の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
［５］Ｘが窒素原子を表し、Ｚが炭素原子を表し、Ｒ５が存在せず、かつ、Ｒ６が、炭素数１～４のアルコキシカルボニル基を表す、上記［１］～［４］のいずれかに記載の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
［６］上記［１］～［５］のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を有効成分として含んでなる、脂肪細胞における中性脂肪分解促進剤。
［７］上記［１］～［５］のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を有効成分として含んでなる、医薬組成物。
［８］脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善に用いるための、上記［７］に記載の医薬組成物。
［９］前記疾患または症状が、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状である、上記［８］に記載の医薬組成物。
［１０］肥満症と関連する疾患および症状が、耐糖能障害、脂質異常症、高血圧、高尿酸血症、痛風、冠動脈疾患、脳梗塞、脂肪肝、月経異常、妊娠合併症、睡眠時無呼吸症候群、肥満低換気症候群、整形外科的疾患および肥満関連腎臓病からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［９］に記載の医薬組成物。
［１１］他の医薬（例えば、抗肥満薬、好ましくは、脂肪細胞におけるｃＡＭＰ産生促進剤）と併用される、上記［７］～［１０］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１２］有効量の上記［１］～［５］のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、脂肪細胞における中性脂肪分解促進方法、脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療方法、予防方法または改善方法、あるいは、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクの低減方法。
［１２－１］式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物と、他の医薬（例えば、抗肥満薬、好ましくは、脂肪細胞におけるｃＡＭＰ産生促進剤）とをそれを必要とする対象に投与する、上記［１２］の方法。
［１２－２］式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物と、他の医薬（例えば、抗肥満薬、好ましくは、脂肪細胞におけるｃＡＭＰ産生促進剤）とを同時に、逐次的に、または別々に投与する、上記［１２－１］の方法。
［１３］脂肪細胞における中性脂肪分解促進剤の製造のための、脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防および／または改善剤の製造のための、あるいは、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクの低減剤の製造のための、上記［１］～［５］のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物の使用。
［１４］医薬に使用するための、上記［１］～［５］のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
［１５］脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防および／または改善に使用するための、上記［１］～［５］のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
［１６］他の医薬（例えば、抗肥満薬、好ましくは、脂肪細胞におけるｃＡＭＰ産生促進剤）と組み合わせて使用するための、上記［１４］または［１５］に記載の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
［１７］他の医薬（例えば、抗肥満薬、好ましくは、脂肪細胞におけるｃＡＭＰ産生促進剤）と組み合わせて、同時に、逐次的に、または別々に使用するための、上記［１４］～［１６］のいずれかに記載の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
　本発明によれば、脂肪細胞における中性脂肪の分解促進に有用な新規化合物と、それを有効成分とする新規な抗肥満薬および肥満関連疾患治療薬が提供される。
図１は、脂肪細胞からの遊離脂肪酸産生に対する本発明の化合物の効果（試験例２）を表したグラフである。 図２は、脂肪細胞のホルモン感受性リパーゼ活性化に対する本発明の化合物の効果（試験例３）を表した図である。 図３は、脂肪細胞のｃＡＭＰ産生に対する本発明の化合物の影響（試験例４）を表したグラフである。ｃＡＭＰ産生量（％）は、高濃度（１００００ｎＭ）のイソプロテレノール（ＩＳＯ）刺激によるｃＡＭＰの最大産生量を１００％とする相対的な割合で表記した。 図４は、脂肪細胞のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）活性化に対する本発明の化合物の効果（試験例５）を表した図である。試料中のＰＫＡが活性化されている場合には、反応させた試薬に含まれる基質が活性化ＰＫＡによってリン酸化されて、電気泳動の陰極（下側）に泳動される。一方、ＰＫＡによってリン酸化されなかった基質は、電気泳動の陽極（上側）に泳動される。陰極に泳動されたバンドが強いほど、試料中のＰＫＡが強く活性されたことを示す。 図５は、脂肪細胞からの遊離脂肪酸産生に対する本発明の化合物の効果（試験例６）を表したグラフである。 図６は、脂肪細胞からの遊離脂肪酸産生に対する本発明の化合物とｃＡＭＰアナログ（ｄｃＡＭＰ）との相乗効果（試験例７）を表したグラフである。 図７は、イン・ビボにおける本発明の化合物の効果（試験例８）を示した図である。図７Ａは、体重に対する本発明の化合物の効果を表したグラフである（Dunnett検定、＊ｐ＜０．０１、ｖｓ対照群）。図７Ｂは、遊離脂肪酸産生に対する本発明の化合物の効果を表した図である。図７Ｃは、脂肪細胞のホルモン感受性リパーゼ活性化に対する本発明の化合物の効果を表した図である。
発明の具体的説明
＜＜定義＞＞
　本発明において基の全部または一部としての「アルキル基」は、直鎖状、分岐状または環状の脂肪族炭化水素鎖を意味する。アルキル基の炭素数は、例えば、１～４個、２～４個、１～３個、２～３個、１～２個または１個とすることができる。アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロプロピル基、シクロブチル基が挙げられる。
　本発明において「脂肪族環基」は、環状の脂肪族炭化水素基を意味する。脂肪族環基は、炭素環式であっても、複素環式であってもよい。炭素環式の脂肪族環基は、３～８員（好ましくは４～７員、５～６員または６員）の飽和または不飽和の単環式炭素環（脂肪族炭素環）であり、例えば、シクロプロパン基、シクロブタン基、シクロペンタン基、シクロヘキサン基、シクロヘプタン基およびシクロオクタン基が挙げられる。複素環式の脂肪族環基は、酸素原子、窒素原子および硫黄原子から選択される１個または複数個（例えば、１～３個、１～２個または１個）の異種原子を環員原子として含む、３～８員（好ましくは４～７員、５～６員または６員）の飽和または不飽和の単環式複素環（脂肪族複素環）であり、例えば、ピロリジン基、ピペリジン基、ピペラジン基、モルホリン基、テトラヒドロフラン基が挙げられる。
　本発明において「芳香環基」は、芳香族の特性を有する環系化合物またはその部分をいい、例えば、π電子が４ｎ＋２個ある環状共役系を含む安定な構造を有する。「芳香環基」は、芳香族炭化水素基であっても、芳香族複素環基であってもよい。「芳香族炭化水素基」は、６～１０員の不飽和炭素環であり、単環式の芳香族環基であっても、２環式の芳香族縮合環基であってもよく、例えば、フェニル基、ナフチル基が挙げられる。「芳香族複素環基」は、酸素原子、窒素原子および硫黄原子から選択される１個または複数個（例えば、１～３個、１～２個または１個）の異種原子を環員原子として含む、６～１０員の複素環であり、単環式の芳香族複素環基であっても、２環式の芳香族縮合複素環基であってもよく、例えば、フラン基、チオフェン基、ピロール基、イミダゾール基、ピリジン基、ピリミジン基、キノリン基、イソキノリン基、インドール基が挙げられる。
　本発明において「アルコキシ基」は、アルキル基が酸素原子（－Ｏ－）と結合した基を意味し、例えば、炭素数１～４のアルコキシ基とは、アルキル基部分の炭素原子数が１～４個であることを意味する。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基が挙げられる。
　本発明において「アルコキシカルボニル基」は、アルコキシ基が酸素原子（－Ｏ－）を介してカルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）と結合した基を意味し、例えば、炭素数１～４のアルコキシカルボニル基とは、アルキル基部分の炭素原子数が１～４個であることを意味する。アルコキシカルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基が挙げられる。
　本発明において、水酸基は－ＯＨを表し、カルボキシ基は－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＨを表す。
　本発明において「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子を意味する。
　本発明において「置換されていてもよい」とは、置換される基または原子上の１または複数個の水素原子が別の基に置換されていてもよいことを意味する。
＜＜化合物＞＞
　式（Ｉ）においてＸおよびＺは、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子を表すが、ＸおよびＺが同時に窒素原子を表すことはない。好ましくは、ＸおよびＺのいずれか一方が窒素原子を表し、他方が炭素原子を表し、より好ましくはＸが窒素原子を表し、Ｚが炭素原子を表す。Ｘが窒素原子を表すときＲ５は存在せず、Ｚが窒素原子を表すときＲ６は存在しない。
　式（Ｉ）において---は、単結合または二重結合を表し、好ましくは二重結合である。---が単結合を表すとき、式（Ｉ）の化合物はＲ２およびＲ３がそれぞれ結合する２つの炭素原子を不斉原子とする立体異性体（ジアステレオマー）となりうる。すなわち、式（Ｉ）の化合物にはシス・トランス異性体が含まれる。
　式（Ｉ）においてＲ１が表す基－Ｒａ－Ｒｂにおいて、Ｒａが表す－（ＣＨ２）ｍ－の一つの－（ＣＨ２）－は－（Ｃ＝Ｏ）－を表してもよく、この場合、－ＲａとＲｂとはこの－（Ｃ＝Ｏ）－を介して結合することが好ましい。
　式（Ｉ）においてＲ１が表す基－Ｒａ－Ｒｂは、好ましくはＲａが－ＣＨ２－または－Ｃ（＝Ｏ）－を表し、Ｒｂが置換されていてもよい芳香環基または脂肪族炭素環基を表すものであってもよく、芳香環基としては好ましくはフェニルが挙げられ、脂肪族炭素環基としては好ましくはシクロヘキシル基が挙げられる。
　式（Ｉ）においてＲ１は、好ましくは炭素数１～４のアルキル基または－Ｒａ－Ｒｂ（式中、Ｒａは－ＣＨ２－または－Ｃ（＝Ｏ）－を表し、Ｒｂは置換されていてもよい芳香環基または脂肪族炭素環基を表す）を表す。
　式（Ｉ）においてＲ２およびＲ３は、好ましくは同時に同じ基を表すが、但しＲ２およびＲ３が同時に水素原子を表すことはない。
　式（Ｉ）においてＲ２およびＲ３はそれぞれ、Ｒｃが炭素数１～４のアルコキシ基である基－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｃを表すことができる。Ｒｃは好ましくはメトキシまたはエトキシを表す。
　式（Ｉ）においてＲ２およびＲ３はそれぞれ、Ｒｃが－Ｎ（－Ｒ１１）（－Ｒ１２）である基－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｃを表すことができ、Ｒ１１およびＲ１２は好ましくは両方が水素原子を表すか、あるいはいずれか一方が炭素数１～４のアルキル基（より好ましくはメトキシまたはエトキシ）を表し、他方が水素原子を表す。
　式（Ｉ）においてＲ２およびＲ３はそれぞれ、Ｒｃが－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒ１３である基－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｃを表すことができ、ｎは好ましくは１または２であり、Ｒ１３は好ましくはメトキシまたはエトキシを表し、より好ましくはｎが１または２であり、かつ、Ｒ１３がメトキシを表す。
　式（Ｉ）においてＲ５は、Ｒｄが炭素数１～４のアルコキシ基である基－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｄを表すことができる。Ｒｄは好ましくはメトキシまたはエトキシを表す。
　式（Ｉ）においてＲ５は、Ｒｄが－Ｎ（－Ｒ２１）（－Ｒ２２）である基－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｄを表すことができ、Ｒ２１およびＲ２２は好ましくは両方が水素原子を表すか、あるいはいずれか一方が炭素数１～４のアルキル基（より好ましくはメトキシまたはエトキシ）を表し、他方が水素原子を表す。
　式（Ｉ）においてＲ５は、Ｒｄが－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒ２３である基－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｄを表すことができ、ｐは好ましくは１または２であり、Ｒ２３は好ましくはメトキシまたはエトキシを表し、より好ましくはｐが１または２であり、かつ、Ｒ２３がメトキシを表す。
　式（Ｉ）においてＲ６は、Ｒｅが炭素数１～４のアルコキシ基である基－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｅを表すことができる。Ｒｅは好ましくはメトキシまたはエトキシを表す。
　式（Ｉ）においてＲ６は、Ｒｅが－Ｎ（－Ｒ３１）（－Ｒ３２）である基－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｅを表すことができ、Ｒ３１およびＲ３２は好ましくは両方が水素原子を表すか、あるいはいずれか一方が炭素数１～４のアルキル基（より好ましくはメトキシまたはエトキシ）を表し、他方が水素原子を表す。
　式（Ｉ）においてＲ６は、Ｒｅが－Ｏ－（ＣＨ２）ｒ－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒ３３である基－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｅを表すことができ、ｒは好ましくは１または２であり、Ｒ３３は好ましくはメトキシまたはエトキシを表し、より好ましくはｒが１または２であり、かつ、Ｒ３３がメトキシを表す。
　本発明の好ましい態様によれば、式（Ｉ）において、
　ＸおよびＺのいずれか一方が窒素原子を表し、他方が炭素原子を表し、
　---が、二重結合を表し、
　Ｒ１が、炭素数１～４のアルキル基または－Ｒａ－Ｒｂ（式中、Ｒａは－ＣＨ２－または－Ｃ（＝Ｏ）－を表し、Ｒｂは置換されていてもよい芳香環基または脂肪族炭素環基を表す）を表し、
　Ｒ２およびＲ３が、同一または異なっていてもよく、炭素数１～４のアルコキシカルボニル基（好ましくは、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基）を表し、
　Ｒ４およびＲ７が、水素原子を表し、
　Ｒ５が、水素原子または炭素数１～４のアルコキシカルボニル基を表し、但し、Ｘが窒素原子を表すときＲ５は存在せず、
　Ｒ６が、水素原子または炭素数１～４のアルコキシカルボニル基を表し、但し、Ｚが窒素原子を表すときＲ６は存在しない
化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物が提供される。
　本発明のより好ましい態様によれば、式（Ｉ）において、
　Ｘが窒素原子を表し、Ｚが炭素原子を表し、
　---が、二重結合を表し、
　Ｒ１が、炭素数１～４のアルキル基または－Ｒａ－Ｒｂ（式中、Ｒａは－ＣＨ２－または－Ｃ（＝Ｏ）－を表し、Ｒｂは置換されていてもよい芳香環基（好ましくはフェニル基）または脂肪族炭素環基（好ましくはシクロヘキシル基）を表す）を表し、
　Ｒ２およびＲ３が、同一または異なっていてもよく、メトキシカルボニル基またはエトキシカルボニル基を表し、好ましくはＲ２およびＲ３の両方が、メトキシカルボニル基またはエトキシカルボニル基を表し
　Ｒ４およびＲ７が、水素原子を表し、
　Ｒ５が存在せず、
　Ｒ６が、メトキシカルボニル基またはエトキシカルボニル基を表す
化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物が提供される。
　本発明の化合物には式（Ｉ）の化合物の薬学上許容される塩も含まれる。ここで「薬理学上許容される塩」は、Berge et al.,J.Pharm.Sci.66:1-19(1977)等に記載されている塩から選択することができる。薬学上許容される塩としては、例えば、式（Ｉ）の化合物にカルボキシ基等の酸性基が存在する場合には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩；アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ、Ｎ－ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、エタノールアミン、Ｎ－メチルグルカミン、Ｌ－グルカミン等のアミンの塩；あるいはリジン、δ－ヒドロキシリジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。式（Ｉ）の化合物に塩基性基が存在する場合には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸塩、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；あるいはアスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との塩が挙げられる。
　本発明の化合物には式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩の溶媒和物も含まれる。溶媒和物の例としては、水和物、エタノール和物が挙げられる。
＜＜化合物の製造＞＞
　本発明の式（Ｉ）の化合物は、下記スキーム１により調製することができる。すなわち、式（Ｉ）の化合物は、式（II）の化合物（式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は式（Ｉ）で定義された内容と同義である）と式（III）の化合物（式中、Ｒ２およびＲ３は式（Ｉ）で定義された内容と同義である）とを有機溶媒（無極性溶媒（トルエン、ジクロロメタン）～極性プロトン性（エタノール、イソプロパノール）等）中、室温～１２０℃の温度条件で、０．５～２４時間かけて反応させることにより調製することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　式（II）の化合物は、後記実施例の合成例１の記載に従って調製することができる。
　式（III）の化合物は、市販試薬から入手することができる。
＜＜化合物の用途＞＞
　後記実施例によれば、本発明の化合物は、脂肪細胞において中性脂肪（トリアシルグリセロール）の分解を促進できる。従って、本発明の化合物は、脂肪細胞における中性脂肪分解促進に用いることができるとともに、脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善に用いることができる。
　脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状としては肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状が挙げられる（Edward T et al., Nat.Metab., 2019, 1（2）:189-200、Shannon M et al., Nature Reviews Endocrinology, 2017, 13:633-643）。また、肥満症と関連する疾患もしくは症状としては、耐糖能障害、脂質異常症、高血圧、高尿酸血症、痛風、冠動脈疾患、脳梗塞、脂肪肝、月経異常、妊娠合併症、睡眠時無呼吸症候群、肥満低換気症候群、整形外科的疾患、肥満関連腎臓病が挙げられる（肥満症診断基準２０１１、日本肥満学会）。
　後記実施例によれば、本発明の化合物は、脂肪細胞においてｃＡＭＰアナログと併用することにより、ｃＡＭＰアナログの中性脂肪分解促進作用を相乗的に増強することができる。従って、本発明の化合物は好ましくは、ｄｃＡＭＰのようなｃＡＭＰアナログ（ＰＫＡ活性化剤）または脂肪細胞におけるｃＡＭＰ産生促進剤と併用することができる。脂肪細胞におけるｃＡＭＰ産生促進剤としては、イソプロテレノールのようなβアドレナリン受容体アゴニストおよびホルスコリンのようなアデニル酸シクラーゼ活性化剤が挙げられる。
　脂肪細胞におけるｃＡＭＰの産生を誘導し、中性脂肪を分解する抗肥満薬として、脂肪細胞におけるｃＡＭＰ産生促進剤が知られているが、イソプロテレノールおよびホルスコリン等のｃＡＭＰ産生を伴う化合物による中性脂肪分解作用は、これらの化合物を脂肪細胞に導入してから２４時間後には消失し一過性であった。これに対し、本発明の化合物は、脂肪細胞に導入してから２４時間後および７２時間後においても減弱することなく持続して中性脂肪分解を促進した。すなわち、本発明の化合物は肥満細胞における持続的な中性脂肪の分解が期待できる点で有利である。
　本発明の化合物は、脂肪細胞においてｃＡＭＰ産生を伴わずに中性脂肪の分解を促進できることから、本発明の化合物はβアドレナリン受容体刺激を伴わない経路（プロテインキナーゼＡの活性化およびホルモン感受性リパーゼの活性化）により中性脂肪分解を促進できると考えられる。従って、本発明の化合物は、脂肪細胞においてβアドレナリン受容体（β２またはβ３受容体）刺激の低下により中性脂肪が蓄積した肥満症並びにそれと関連する疾患および症状の治療、予防または改善に用いることができる。
　本発明の化合物は脂肪細胞における中性脂肪分解を促進する作用を有するとともに、体重を減少させる作用を有することから、本発明の化合物は、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクがある対象に投与することができ、それにより、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクを低減することができる。ここで、「肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクがある対象」は、肥満症等の自覚症状がないが、将来において肥満症等の発症の恐れがある対象を意味する。また、「肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクの低減」は、肥満症等の発症確率が低減されることを意味する。すなわち、本発明の別の面によれば、本発明の化合物を有効成分として含んでなる、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクの低減剤および肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクの低減用組成物が提供される。
＜＜医薬および治療方法＞＞
　本発明によれば本発明の化合物を有効成分として含んでなる医薬組成物および治療製剤が提供される。本発明の化合物の投与経路は特に限定されることなく、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、皮下投与）のいずれであってもよい。経口投与剤としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ錠剤、チュアブル錠剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口投与剤としては、例えば、注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法（例えば、第十八改正日本薬局方　製剤総則等に記載の公知の方法）により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、希釈剤、滑沢剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。
　本発明の化合物の投与量は、投与対象の性別、年齢および体重、症状、摂取時間、剤形、投与経路並びに組み合わせる薬剤等に依存して、場合によっては医師の判断により適宜決定できる。本発明の化合物を脂肪細胞における中性脂肪分解促進や脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善を目的として投与する場合の成人１日あたりの投与量は、経口投与の場合には、例えば、０．０１～１０００ｍｇの範囲とすることができ、静脈注射等の非経口投与の場合には、例えば、０．００１～１００ｍｇの範囲とすることができるが、これに限定されるものではない。本発明の化合物は、それを必要とするヒトのみならず、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル）に対しても投与することができる。
　本発明の化合物は、他の医薬（例えば、抗肥満薬）と組み合わせて投与することができる。両薬剤を併用する場合、単一製剤中に両薬剤が含まれた製剤を投与してもよく、あるいは、それぞれが別々に製剤化され、別々に投与してもよい。別々に投与する場合、その投与の時期は特に限定されず、同時に投与してもよく、または、間隔をあけて（例えば、時間をあけて異なる時間に、または、異なる日に）投与してもよい。
　本発明の別の面によれば、有効量の前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、脂肪細胞における中性脂肪分解促進方法が提供される。本発明の別の面によればまた、有効量の前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療方法、予防方法または改善方法が提供される。本発明の別の面によればまた、有効量の前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクの低減方法が提供される。本発明の方法は、本発明の化合物および医薬に関する記載に従って実施することができる。
　本発明の別の面によればまた、脂肪細胞における中性脂肪分解促進剤の製造のための、脂肪細胞における中性脂肪分解促進剤としての、あるいは、脂肪細胞における中性脂肪分解促進方法における、前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物の使用が提供される。本発明の別の面によればまた、脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防および／または改善剤の製造のための、脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防および／または改善剤としての、あるいは、脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療方法、予防方法または改善方法における、前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物の使用が提供される。本発明の別の面によればさらに、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクの低減剤の製造のための、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクの低減剤としての、あるいは、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクの低減方法における、前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物の使用が提供される。本発明の使用は、本発明の化合物および医薬に関する記載に従って実施することができる。
　本発明のさらに別の面によれば、本発明の方法に使用するための前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物が提供される。すなわち本発明の別の面によれば、脂肪細胞における中性脂肪分解促進に用いるための、前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物が提供される。本発明の別の面によればまた、脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防および／または改善に用いるための、前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物が提供される。本発明の別の面によればさらに、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクの低減に用いるための、前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物が提供される。上記発明は、本発明の化合物および医薬に関する記載に従って実施することができる。
　以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
合成例１：エチル２－ベンジル－２Ｈ－ピロロ［３，４－ｃ］ピリジン－６－カルボキシラート（脂肪放出誘導刺激化合物（Ｌｉｐｉｄ　ｒｅｌｅａｓｅ　Ｉｎｄｕｃｉｎｇ　Ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）０２３、単に「ＬＩＳ０２３」ともいう）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　化合物ＬＩＳ０２３は、以下のようにして調製した。
（１）Ｎ－ベンジル－３，４－ジシアノピロールの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　ＴＨＦ１００ｍＬ中のフマロニトリル（１１９９．６ｍｇ、１５．３６５７ｍｍｏｌ）およびパラトルエンスルホニルメチルイソシアネートＴｏｓＭＩＣ（３０００．９ｍｇ、１５．３６５７ｍｍｏｌ）に６０％鉱油分散水素化ナトリウム（７３７．２ｍｇ、１８．４３８８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。その後、４０℃に加温し２時間撹拌した。そこに臭化ベンジル（２．７５ｍＬ、３９３２．５ｍｇ、２２．９９１７ｍｍｏｌ）および６０％鉱油分散水素化ナトリウム（７４０．２ｍｇ、１８．５０５０ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、その後に４０℃に加温して４時間反応させた。反応液を濃縮し、残渣に１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２００ｍＬを加え、酢酸エチル２００ｍＬで３回抽出した。有機層を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２００ｍＬ、次いで水２００ｍＬで二回、最後に飽和食塩水２００ｍＬで洗浄した。硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させ、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：アセトン＝５：１→３：１→１：１）で精製し、Ｎ－ベンジル－３，４－ジシアノピロールを黄色固体として得た（２０６０．１ｍｇ、９．５４０８ｍｍｏｌ、収率６８％）。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) = 7.430-7.400(m, 3H), 7.190-7.160(m, 2H),7.180 (s, 2H) 5.100 (s, 2H);13C NMR (CDCl3, 100 MHz):δ (ppm) = 133.70,129.49,129.36,129.27,127.81, 112.58, 91.53, 54.88;
HRMS (ESI-TOF, [M+H]+): 計算値(C13H10N3), 208.0869. 測定値, 208.0868.;
元素分析　計算値(C13H9N3): N, 20.28; C, 75.35; H, 4.38. 測定値: N, 20.18; C, 75.21; H, 4.59.; 融点 154.0-155.0℃（針状，ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサンより再結晶）
（２）Ｎ－ベンジル－３，４－ジアルデヒドピロールの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　塩化メチレン１００ｍＬ中の上記（１）で得られたＮ－ベンジル－３，４－ジシアノピロール（１５４３．８ｍｇ、７．４４９７ｍｍｏｌ）にアルゴン雰囲気下でジイソブチルアルミニウムヒドリドの１ｍｏｌ／Ｌ　トルエン溶液１５ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）を５分かけて０℃下で添加し、１時間撹拌した。その後硫酸ナトリウム８水和物を約３０ｇ加えて反応を停止させ、セライト濾過した。ろ液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：アセトン＝１：１）で精製し、Ｎ－ベンジル－３，４－ジアルデヒドピロールを無色固体として得た。これを更に酢酸エチル／ヘキサンより再結晶した（１２４６．４ｍｇ、５．８４７６ｍｍｏｌ、収率７８％）。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) = 10.148 (s, 2H), 7.408-7.375(m, 3H), 7.361(s, 2H), 7.220-7.190 (m, 2H), 5.119 (s, 2H);
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ (ppm) = 186.33, 134.55, 129.74, 129.34, 129.01, 127.09, 125.40, 54.58; HRMS (ESI-TOF, [M+Na]+):計算値[C13H11O2NNa]+, 236.0682. 測定値:236.0682; 
元素分析 計算値(C13H11O2N): N, 6.57; C, 73.23; H, 5.20. 測定値: N, 6.71; C, 73.08; H, 5.31.; 
融点 68.0-69.0℃（針状酢酸エチル／ヘキサンより再結晶）
（３）２－ベンジル－２Ｈ－ピロロ［３，４－ｃ］ピリジン－６－エチルカルボキシラートの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　エタノール９０ｍＬ中の上記（２）で得られたＮ－ベンジル－３，４－ジアルデヒドピロール（１０１０．８ｍｇ、４．７４０４ｍｍｏｌ）にジエチルアミン（１．４７ｍＬ、１０４０．１ｍｇ、１４．２２１２ｍｍｏｌ）およびグリシンエチルエステル塩酸塩（１３２３．３ｍｇ、９．４８０８ｍｍｏｌ）を室温下で添加し、反応液を１時間還流させた。その後、室温まで冷却したのちに濃縮した。残渣を水９０ｍＬに溶解し酢酸エチル９０ｍＬで３回抽出した。有機層を水９０ｍＬで２回、飽和食塩水９０ｍＬで洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（アセトン／ヘキサン＝１：１）で精製し、２－ベンジル－２Ｈ－ピロロ［３，４－ｃ］ピリジン－６－エチルカルボキシラートを黄色固体として得た（１２００．３ｍｇ、４．２８１８ｍｍｏｌ、収率９０％）。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 9.06 (1H, s), 8.36 (1H, s), 7.39 - 7.32 (5H, m), 7.19 - 7.17 (2H, m), 5.42 (2H, s), 4.46 (2H, q, J = 7.2 Hz), 1.44 (3H, t, J = 7.2 Hz);
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 166.82, 146.24, 136.23, 135.67, 129.12, 128.65, 127.58, 124.43, 121.98, 118.32, 114.25, 114.09, 61.22, 55.45, 14.51;HRMS (ESI-TOF, [M+Na]+): 計算値[C17H16N2NaO2 +]: 303.1104. 測定値: 303.1068.;
元素分析　計算値[C17H16N2O2]; C, 72.84; H, 5.75; N, 9.99. 測定値:C, 72.64; H, 5.82; N, 9.83.;
融点: 109-110℃（酢酸エチル／ヘキサンより再結晶）.
合成例２：３－エチル６，７－ジメチル（５Ｒ，８Ｓ）－９－ベンジル－５，８－ジヒドロ－５，８－エピミノイソキノリン－３，６，７－トリカルボキシラート（脂肪放出誘導刺激化合物００１、単に「ＬＩＳ００１」ともいう）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　トルエン３ｍＬ中のＬＩＳ０２３（２００．０ｍｇ、０．７１３５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、アセチレンジカルボン酸ジメチル（１３２μＬ、１５２．６ｍｇ、１．０７０３ｍｍｏｌ）を加えた。４時間後、全体をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝６：１～４：１～２：１～１：１～１：２）に直接かけ、ＬＩＳ００１（２５７．０ｍｇ、０．６０８４ｍｍｏｌ、８５％）を黄色アモルファスとして得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ(ppm) = 8.687 (s, 1H), 8.150 (s, 1H), 7.350-7.280 (m 3H), 7.270-6.900 (m 2H), 5.054 (s, 1H), 5.014 (s, 1H), 4.514-4.435 (m, 2H), 3.802 (s, 3H), 3.800 (s, 3H), 3.580 (s, 2H), 1.434 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ(ppm) = 164.29, 162.78, 157.64, 151.54, 148.90,148.07, 146.29, 145.26, 141.55, 136.08, 128.47, 128.15, 127.23, 118.93,74.08, 71.96, 70.55, 61.46, 52.92, 52.56, 52.01, 13.81.
HRMS (ESI-TOF, [M+Na]+)：分析結果：C23H22N2NaO6 +、計算値：445.1370. 測定値：445.1373. 分析結果：C23H22N2O6、計算値：+ 0.2 Acetone + 0.2 H2O + 0.1 hexane; C, 64.21; H, 5.57; N, 6.19. 測定値：C, 64.35; H, 5.97; N, 6.13.
合成例３：トリメチル（５Ｒ，８Ｓ）－９－ベンジル－５，８－ジヒドロ－５，８－エピミノイソキノリン－３，６，７－トリカルボキシラート（脂肪放出誘導刺激化合物０１６、単に「ＬＩＳ０１６」ともいう）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　トルエン５ｍＬ中のＬＩＳ０２３誘導体（メチルエステル）（６０７．６ｍｇ、２．２８１６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、アセチレンジカルボン酸ジメチル（４２１μＬ、４８６．４ｍｇ、３．４２２４ｍｍｏｌ）を加えた。１２時間後、全体をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／アセトン＝６：１～４：１～２：１～１：１）に直接かけ、ＬＩＳ０１６（６１９．８ｍｇ、１．５１０２ｍｍｏｌ、６６％）を黄色アモルファスとして得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ(ppm) = 8.699 (s, 1H), 8.180 (s, 1H), 7.354-7.327 (m 3H), 7.280-7.233 (m 2H), 5.085 (s, 1H), 5.042 (s, 1H), 4.024 (s, 3H), 3.827 (s, 3H), 3.825 (s, 3H), 3.612 (brs, 2H), 3.800 (s, 3H), 3.580 (s, 2H), 1.434 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ(ppm) = 165.11, 163.04, 157.97, 149.12, 148.37, 146.25,145.68,141.80,136.27,128.75,128.47, 128.46, 127.55, 119.16, 72.29, 70.85, 52.88, 52.72, 52.34, 52.32.
HRMS (ESI-TOF, [M+Na]+) :分析結果：C22H20N2NaO6 +、計算値：431．12136. 測定値：431．12174. 分析結果：C22H20N2O6、計算値：+ 0．7H2O; C, 62．76; H, 5．12; N, 6．65. 測定値：C, 62．57; H, 4．83; N, 6．55.
合成例４：トリメチル（５Ｓ，６Ｓ，７Ｒ，８Ｒ）－９－ベンジル－５，６，７，８－テトラヒドロ－５，８－エピミノイソキノリン－３，６，７－トリカルボキシラート（ラセミ体）（脂肪放出誘導刺激化合物０１７、単に「ＬＩＳ０１７」ともいう）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　乾燥トルエン４ｍＬ中のＬＩＳ０２３誘導体（メチルエステル）（５００．３ｍｇ、１．８７８７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、無水マレイン酸（５５２．７ｍｇ、５．６３６３ｍｍｏｌ）およびヒドロキノン（１０．３ｍｇ、０．０９３９ｍｍｏｌ）を加えた。全体をマイクロ波反応器で６７℃に加熱した。３時間後、反応混合物を室温まで冷却させた。全体をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１：１～１：２～１：３）に直接かけ、Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ付加物（５０２．３ｍｇ）を褐色アモルファスとして得た。中間体をすぐにメタノール５ｍＬに溶解し、ＡｃＯＥｔ０．５ｍＬ中の４ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌを加えた。２時間後、全体を蒸発させ、真空下で乾燥させた。得られた残渣を乾燥メタノール５ｍＬに溶解し、ヘキサン２．５ｍＬ中の０．６ｍｏｌ／Ｌ　ＴＭＳＣＨＮ２を加えた。２０分間撹拌した後、全体を蒸発させ、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／アセトン＝６：１～４：１～２：１～１：１）で精製して、ＬＩＳ０１７（２４０．５ｍｇ、０．５８６０ｍｍｏｌ、４３％）を淡黄色アモルファスとして得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ(ppm) = 8.671 (s, 1H), 8.108 (s, 1H), 7.310-7.232 (m 5H), 4.647 (s, 1H), 4.606 (s, 1H), 4.022 (s, 3H), 3.735 (s, 6H), 3.695 (s, 2H), 2.823 (d, J = 9.2 Hz,1H), 2.762 (d, J = 9.6 Hz,1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ(ppm) = 170.89, 170.83, 165.46, 155.05, 147.53, 143.40, 142.95, 137.90, 128.21, 128.14, 127.17, 119.2767.17, 67.01, 65.66, 52.14, 47.43.
HRMS (ESI-TOF, [M+Na]+) : 分析結果：C22H22N2NaO6 +、計算値：433．13701. 測定値：433.13751. 分析結果： C22H22N2O6、計算値：+ 0.3 acetone; C, 64.29; H, 5.61; N, 6.55. 測定値：C, 64.61; H, 5.93; N, 6.37.
合成例５：３－エチル６，７－ジメチル（５Ｒ，８Ｓ）－９－ベンゾイル－５，８－ジヒドロ－５，８－エピミノイソキノリン－３，６，７－トリカルボキシラート（脂肪放出誘導刺激化合物０１８、単に「ＬＩＳ０１８」ともいう）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　ジオキサン４０ｍＬおよびＨ２Ｏ　２０ｍＬ中のＬＩＳ００１（２．６３６７ｇ、６．２４１６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＮＢＳ（４．４４３５ｇ、２４．９６６６ｍｍｏｌ）およびＢＰＯ（１５．１ｍｇ、０．０６２４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を７０℃に加熱してから、その温度に到達した。反応混合物を室温で放置した。２４時間後、全体を蒸発させ、真空下で乾燥させた。ほとんど固化して、得られた残留物を乾燥ＴＨＦ　４０ｍＬに溶解した。この溶液をトリエチルアミン（８．９ｍＬ、６２．４１６４ｍｍｏｌ）および塩化ベンゾイル（２．９ｍＬ、２４．９６６６ｍｍｏｌ）に加えた。全体を１６時間攪拌した。反応の完了後、全体を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液１００ｍＬに注ぎ、ＥｔＯＡｃ　１００ｍＬで３回抽出した。合わせた有機層をＨ２Ｏ　１００ｍＬ、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液１００ｍＬ、ブライン１００ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝６：１～４：１～２：１～１：１～１：２～１：３）で精製して、ＬＩＳ０１８（２．１１６４ｇ、４．８４９５ｍｍｏｌ、７８％））をオレンジ色のアモルファスとして得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ (ppm) = 8.682 (s, 1H), 8.161 (s, 1H), 7.448 (m 3H), 6.193 (brs 2H), 6．010 (brs, 1H), 4.388 (quartet, J = 6.8 Hz, 2H), 3.724 (brs, 6H), 1.339 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ (ppm) = 168.95, 164.15, 161.61, 157.02, 150,75, 148.90, 144.41, 140.90, 132.06, 131.96, 128.57, 127.88, 118.08, 69,54, 68.31, 66.31, 65.06, 61.87, 52.52, 13.99.
HRMS (ESI-TOF, [M+Na]+) : 分析結果：C23H20N2NaO7 +、計算値：459.11627. 測定値：433.13751459.11631. 分析結果：C23H20N2O7 、計算値：+ 0．3 AcOEt + 0.2 H2O ; C, 62.80; H, 4.88; N, 6.05. 測定値：C, 62.46; H, 4.91; N, 6.16.
試験例１：成熟脂肪細胞の調製
　マウス繊維芽細胞３Ｔ３－Ｌ１をディッシュに播種しコンフルエントになるまで培養した。コンフルエントになった３Ｔ３－Ｌ１を脂肪細胞へ分化誘導するために、培地を１０％ウシ胎児血清、ダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース４．５ｇ／Ｌ）（本明細書において「ＤＭＥＭ」ということがある）、５００μＭイソブチルメチルキサンチン（ｓｉｇｍａ社、本明細書において「ＩＢＭＸ」ということがある。）、５μｇ／ｍＬインスリン、２５０ｎＭデキサメタゾン（ＤＥＸ））に交換した（Ｄａｙ０）。２日後（Ｄａｙ２）に、培地をＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎児血清、５μｇ／ｍＬインスリン）に交換した。交換から６日後（Ｄａｙ８）に成熟脂肪細胞への分化誘導が完了した。分化誘導開始時から８日後（Ｄａｙ８）以降の成熟脂肪細胞を後記例において脂肪細胞として用いた。
試験例２：化合物ＬＩＳの中性脂肪分解促進作用（１）
（１）実験手順
　試験例１で調製した成熟脂肪細胞を用いた。培地を、ＤＭＥＭ培地（２％ウシ血清アルブミン（ｗａｋｏ社、以下同様）、各種アゴニスト添加）に交換した。アゴニストとしては、化合物ＬＩＳ００１　１００μＭ、イソプロテレノール（βアドレナリン受容体アゴニスト、本明細書において「ＩＳＯ」ということがある）１００ｎＭおよび１００μＭ、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ　ｃＡＭＰ：ｃＡＭＰアナログ、本明細書において「ｄｃＡＭＰ」ということがある）３００μＭまたはホルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ：アデニル酸シクラーゼ活性化剤）１μＭを用いた。また、対照群としてアゴニストを添加しない群（非添加）を作製した。アゴニスト投与から３時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後に、細胞の上清液を一部回収し、上清液中の遊離脂肪酸濃度を非エステル結合型脂肪酸キット（ＮＥＦＡ　Ｃ－テストワコー、和光純薬工業社）を用いて測定した。具体的には、回収した細胞の上清液とキットの試薬とを化学反応させ、分光光度計にて吸光度（波長５５０ｎｍ）を測定した。キットに付属している濃度が既知の遊離脂肪酸（パルミチン酸）の吸光度を元に、各検体の遊離脂肪酸の濃度（μＭ）を算出した。
（２）結果
　結果は、図１に示される通りであった。
　化合物ＬＩＳ００１を脂肪細胞に添加すると、脂肪細胞から遊離脂肪酸が産生されることが示された。また、化合物ＬＩＳ００１の遊離脂肪酸産生作用は、βアドレナリン受容体刺激によりｃＡＭＰ産生を惹起するアゴニスト（イソプロテレノール）、アデニル酸シクラーゼ活性化剤であるホルスコリン、およびｃＡＭＰアナログであるｄｃＡＭＰの遊離脂肪酸産生作用が一過性であるのとは異なり、持続的であることが示された。具体的には、化合物ＬＩＳ００１投与後３０分～１時間で遊離脂肪酸の産生が観察され、投与後２４時間および７２時間でも減弱することなく持続することが確認された。以上から、化合物ＬＩＳ００１は、脂肪細胞において中性脂肪の分解を持続的に促進する作用を有することが確認された。
試験例３：化合物ＬＩＳのホルモン感受性リパーゼ活性化作用
（１）実験手順
　試験例１で調製した成熟脂肪細胞を用いた。培地を、ＤＭＥＭ培地（２％ウシ血清アルブミン、各種アゴニスト添加）に交換した。アゴニストとしては、化合物ＬＩＳ００１　３００μＭ、化合物ＬＩＳ０１６　３００μＭ、化合物ＬＩＳ０１７　３００μＭ並びにイソプロテレノール１００ｎＭおよび１μＭを用いた。また、対照群はアゴニストを添加しない群（非添加）とした。アゴニスト投与から１時間後および２４時間後に、ＳＤＳ（組成：０．５Ｍ　Ｔｉｒｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）（ｓｉｇｍａ社のＴｒｉｓとｗａｋｏ社の１Ｍ塩酸で調製）、１０％ＳＤＳ（ｗａｋｏ社）、５０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ｗａｋｏ社）およびβメルカプトエタノール（２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，ｍｉｎ．９８％、ｓｉｇｍａ社）を用いて脂肪細胞を回収した。回収した細胞のホルモン感受性リパーゼ（ｈｏｒｍｏｎｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｌｉｐａｓｅ、本明細書において「ＨＳＬ」ということがある。）の活性を評価した。ここで、ＨＳＬは脂肪分解を司る酵素であり、ＨＳＬ活性は、Ｓｅｒ５６３残基とＳｅｒ６６０残基のリン酸化（一般的にｃＡＭＰ－ＰＫＡ刺激を介して増強される）により正に制御され、Ｓｅｒ５６５残基のリン酸化により負に制御される（Antonis D. Lampidonis et al., Gene, 2011, 477: 1-11）。ＨＳＬ活性は、ウエスタンブロッティング法により常法に従って評価した。具体的には、回収したサンプルをボイルし、ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を行い、細胞内のＨＳＬのリン酸化タンパク質を検出した。一次抗体は、抗リン酸化ＨＳＬ　Ｓｅｒ５６３抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＨＳＬ（Ｓ５６３）Ｒａｂｂｉｔ　Ａｂ、ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、以下同様）、抗リン酸化ＨＳＬ　Ｓｅｒ５６５抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＨＳＬ（Ｓ５６５）Ｒａｂｂｉｔ　Ａｂ、ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）および抗ＨＳＬ抗体（ＨＳＬ　Ｒａｂｂｉｔ　Ａｂ、ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いた。抗リン酸化ＨＳＬ　Ｓｅｒ５６３抗体により、化合物ＬＩＳによるＨＳＬ　Ｓｅｒ５６３残基のリン酸化の強さ（バンドの強さ）を評価した。また、ＨＳＬ　Ｓｅｒ５６３残基のリン酸化の強さの違いが、回収した細胞の量的な違いに起因しないことを検証するために、抗ＨＳＬ抗体により、各試料のＨＳＬタンパク質量を評価した。抗リン酸化ＨＳＬ　Ｓｅｒ５６５抗体により、化合物ＬＩＳによるＨＳＬ　Ｓｅｒ５６５残基の脱リン酸化の強さを評価した。ここで、ＨＳＬ活性が高い場合は、Ｓｅｒ５６５残基の脱リン酸化が強くなるため、抗リン酸化ＨＳＬ　Ｓｅｒ５６５抗体によって検出されるバンドが弱くなる。
（２）結果
　結果は、図２に示される通りであった。
　化合物ＬＩＳ００１またはＬＩＳ０１６を投与した脂肪細胞では、対照群（非添加）と比較して、ホルモン感受性リパーゼのＳｅｒ５６３残基のリン酸化タンパク質の増加およびＳｅｒ５６５残基のリン酸化タンパク質の減少が確認された。すなわち、化合物ＬＩＳ００１およびＬＩＳ０１６は、ホルモン感受性リパーゼのＳｅｒ５６３残基のリン酸化を増強し、Ｓｅｒ５６５残基のリン酸化を強力に抑制することで、ホルモン感受性リパーゼを活性化することが示された。また、化合物ＬＩＳ００１およびＬＩＳ０１６のホルモン感受性リパーゼ活性化作用は、イソプロテレノール（ＩＳＯ）によるβアドレナリン受容体刺激のホルモン感受性リパーゼ活性化作用が投与後２４時間には消失して一過性であるのとは異なり、持続的であることが示された。さらに、本結果および後記試験例４の結果から、ＬＩＳ０１６は、ｃＡＭＰを介さずに、一部はＰＫＡ活性化を介して、ホルモン感受性リパーゼを活性化することが示唆された。化合物ＬＩＳ０１７を投与した脂肪細胞では、ホルモン感受性リパーゼのＳｅｒ５６３残基のリン酸化タンパク質の増加およびＳｅｒ５６５残基のリン酸化タンパク質の減少が確認されなかった。以上の結果から、化合物ＬＩＳ００１およびＬＩＳ０１６を脂肪細胞に添加すると、脂肪細胞においてホルモン感受性リパーゼが強力かつ持続的に活性化されることが示された。
試験例４：化合物ＬＩＳのｃＡＭＰ産生に与える影響
（１）実験手順
　試験例１で調製した成熟脂肪細胞を用いた。培地を、ｃＡＭＰアッセイバッファー（１×ＨＢＳＳ、下記を混合して調製：ＫＣｌ：ｗａｋｏ社、ＫＨ２ＰＯ４：ｓｉｇｍａ社、ＮｓＣｌ：ｓｉｇｍａ社、Ｎａ２ＨＰＯ４：ｓｉｇｍａ社、Ｄ－Ｇｌｕｃｏｓｅ：ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ社）、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ（ｓｉｇｍａ社）、７．５％ウシ血清アルブミン、５００ｍＭ　ＩＢＭＸ、各種アゴニスト添加）に交換した。アゴニストとしては、化合物ＬＩＳ０１６　１０００００ｎＭおよびＩＳＯ　０、０．１、１、１０、１００、１０００、１００００ｎＭを用いた。アゴニスト投与から３０分後に、１０％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘを細胞に添加し、３０分間インキュベートした。次いで、細胞外の上清液を一部回収して、上清液中のｃＡＭＰ量をＬＡＮＣＥ　Ｕｌｔｒａ　ｃＡＭＰ　Ｋｉｔ（パーキンエルマー社）を用いて評価した。具体的には、上清液を、キットに付属する試薬と反応させて、ｃＡＭＰ産生量（ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの強さ、波長６６５ｎｍ）をマルチプレートリーダー（ＥｎＳｐｉｒｅ、パーキンエルマー社）を用いて測定した。なお、上清液中のｃＡＭＰの濃度が高いほど、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルは低下することから、ｃＡＭＰ産生量はＴＲ－ＦＲＥＴシグナルのベースからの低下の度合いで示した。
（２）結果
　結果は、図３に示される通りであった。
　イソプロテレノール（ＩＳＯ）によるβアドレナリン受容体刺激により脂肪細胞のｃＡＭＰ産生量はＩＳＯの濃度依存的に増加したのに対し、化合物ＬＩＳ０１６の投与はｃＡＭＰを産生させないことが確認された。従って、化合物ＬＩＳ０１６による刺激は、ｃＡＭＰ産生を伴うβアドレナリン受容体（β２およびβ３受容体）刺激とは異なること、また、βアドレナリン受容体（β２およびβ３受容体）刺激によるｃＡＭＰ産生を増強しないことが確認された。
試験例５：化合物ＬＩＳのプロテインキナーゼＡ活性化作用
（１）実験手順
　試験例１で調製した成熟脂肪細胞を用いた。培地を、ＤＭＥＭ培地（ＰＫＡ阻害剤添加）に交換した。ＰＫＡ阻害剤は３０μＭ　Ｈ－８９を用いた。次いで、Ｈ－８９投与から１時間後に、各種アゴニストを上記ＤＭＥＭ培地に添加した。アゴニストとしては、化合物ＬＩＳ００１　１００μＭおよびポジティブコントロールとして６－ベンゾイル－ｃＡＭＰ（６－Ｂｎｚ－ｃＡＭＰ：ｃＡＭＰアナログ、ｌｉｆｅ　ｓｃｉｅｎｃｅ　ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社）３００μＭを用いた。６－Ｂｎｚ－ｃＡＭＰはプロテインキナーゼＡ（本明細書において「ＰＫＡ」ということがある。）を活性化する（Johannes L. Bos., Trends Biochem. Sci., 2006, 31:680-686）。また、対照群としてアゴニストを添加しない群（非添加）を作製した。アゴニスト投与から１．５時間後に、ＰＫＡアッセイバッファー（１Ｍ　ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、βメルカプトエタノール、プロテアーゼインヒビター）を用いて脂肪細胞を回収した。回収した細胞のＰＫＡ活性を、PepTag Assay for Non-Redioactive Detection of Protein Kinase C or cAMP-Dependent Protein Kinase（プロメガ社製）のcAMP-Dependent Protein Kinaseを用いて評価した。具体的には、ＰＫＡアッセイバッファーで回収した細胞を、ダウンス型ホモジナイザーを用いて氷上で破砕し、１４０００ｇで遠心し、細胞内の成分を液相と固相に分離した。液相を回収し、液相の一部をキットに付属する試薬と反応させた後、泳動用のアガロースゲルにアプライし、電気泳動した。
（２）結果
　結果は、図４に示される通りであった。
　化合物ＬＩＳ００１を添加した脂肪細胞では、対照群（非添加）と比較して、ＰＫＡが活性化されることが示された。また、ポジティブコントロールである６－Ｂｚ　ｃＡＭＰを添加した脂肪細胞においてもＰＫＡが活性化されることが確認された。一方、化合物ＬＩＳ００１または６－Ｂｚ　ｃＡＭＰによるＰＫＡの活性化は、ＰＫＡ阻害剤であるＨ－８９の前投与によって阻害されることが示された。以上の結果および試験例４の結果から、化合物ＬＩＳ００１によるＰＫＡ活性化はｃＡＭＰ非依存的であることが示唆された。
試験例６：化合物ＬＩＳの中性脂肪分解促進作用（２）
（１）実験手順
　試験例１で調製した成熟脂肪細胞を用いた。培地を、ＤＭＥＭ培地（２％ウシ血清アルブミン、各種アゴニスト添加）に交換した。アゴニストとしては、ＬＩＳ００１、ＬＩＳ０１６、ＬＩＳ０１７およびＬＩＳ０１８のＬＩＳ化合物１００μＭをそれぞれ単独で用いた。また、対照群としてアゴニストを添加しない群（非添加）を作製した。アゴニスト投与から２４時間後に、細胞の上清液を一部回収した以外は試験例２（１）と同様にして各検体の遊離脂肪酸の濃度を算出した。
（２）結果
　結果は、図５に示される通りであった。
　脂肪細胞からの遊離脂肪酸産生能は、各化合物ＬＩＳによって異なることが確認された。すなわち、脂肪細胞における中性脂肪分解促進の程度は、各化合物ＬＩＳにより異なることが確認された。
試験例７：化合物ＬＩＳとｃＡＭＰアナログとの相乗効果による中性脂肪分解促進作用
　試験例６の結果から、化合物ＬＩＳ０１７およびＬＩＳ０１８は単独では中性脂肪分解促進作用が確認されなかった。主にこれらの化合物ＬＩＳについて、化合物ＬＩＳとｄｃＡＭＰとの相乗効果による遊離脂肪酸産生能を評価した。
（１）実験手順
　試験例１で調製した成熟脂肪細胞を用いた。培地を、ＤＭＥＭ培地（２％ウシ血清アルブミン、各種アゴニストおよびｄｃＡＭＰ添加）に交換した。アゴニストとしては、ＬＩＳ０１７およびＬＩＳ０１８をそれぞれ２００μＭで用い、ｄｃＡＭＰは３００μＭで用いた。また、対照群としてアゴニストおよびｄｃＡＭＰを添加しない群（非添加）並びにｄｃＡＭＰのみを添加する群（ｄｃＡＭＰのみ）を作製した。アゴニスト投与から４時間後に、細胞の上清液を一部回収した以外は例２（１）と同様にして各検体の遊離脂肪酸の濃度を算出した。各検体の遊離脂肪酸の濃度は、化合物ＬＩＳおよびｄｃＡＭＰの遊離脂肪酸産生能を反映する。化合物ＬＩＳおよびｄｃＡＭＰの遊離脂肪酸産生能が強いほど、化合物ＬＩＳとｄｃＡＭＰとの相乗効果が強いと判定した。
（２）結果
　結果は、図６に示される通りであった。
　試験例６において単独では中性脂肪分解促進作用が確認されない化合物ＬＩＳ０１７およびＬＩＳ０１８が、ｃＡＭＰアナログと併用投与することにより、ｃＡＭＰアナログによる脂肪細胞からの遊離脂肪酸産生を相乗的に増強させることが確認された。従って、化合物ＬＩＳ０１７およびＬＩＳ０１８はｃＡＭＰアナログと併用投与することにより、ｃＡＭＰアナログの中性脂肪分解促進作用を相乗的に増強できることが示唆された。
試験例８：化合物ＬＩＳのイン・ビボにおける中性脂肪分解促進作用
（１）実験手順
　雄性１６週齢Ｃ５７／ＢＬ６マウス（１６匹）を体重測定した。体重はいずれも約３０ｇであった。次いで、三種混合麻酔（塩酸メデトミジン０．３ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム４ｍｇ／ｋｇ、酒石酸ブトルファノール５ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔した。次いで、ＬＩＳ００１　３０ｍｇ／０．０３ｍＬ　ＤＭＳＯをオリーブオイル　３ｍＬで希釈し、化合物ＬＩＳ００１を０、１０、３０、１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量となるように腹腔内に注射投与した。投与から２４時間後、７２時間後に体重測定した後、屠殺した。心臓および後大静脈より血液を採取し血液を３０分静置後、４℃、１０００ｘｇで２０分間遠心分離した後、上清（血清）中の遊離脂肪酸の濃度（μＭ）を試験例２（１）と同様にして算出した。また、精巣上体から脂肪組織を摘出し、脂肪細胞のホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）の活性を試験例３（１）と同様にして抗リン酸化ＨＳＬ　Ｓｅｒ５６３抗体を用いたウエスタンブロッティング法により評価した。
（２）結果
　結果は、図７に示される通りであった。
　図７Ａの結果から、化合物ＬＩＳ００１を３０ｍｇ／ｋｇ投与した群では投与前と比較して投与後７２時間の体重が減少すること、化合物ＬＩＳ００１を１００ｍｇ／ｋｇ投与した群では投与前後の体重が対照群（非添加）と比較して有意に減少することが示された。図７Ｂの結果から、化合物ＬＩＳ００１をイン・ビボにおいて投与すると、血清中の遊離脂肪酸濃度が対照群（非添加）と比較して増加すること、この作用は投与後７２時間においても持続することが示された。これらの結果から、化合物ＬＩＳ００１は、イン・ビボにおいて中性脂肪の分解を持続的に促進する作用を有することが確認された。図７Ｃの結果から、化合物ＬＩＳ００１を投与した群では、対照群（非添加）と比較して、ホルモン感受性リパーゼのＳｅｒ５６３残基のリン酸化タンパク質の増加が確認された。すなわち、化合物ＬＩＳ００１は、イン・ビボにおいてホルモン感受性リパーゼのＳｅｒ５６３残基のリン酸化を増強することで、ホルモン感受性リパーゼを活性化することが示された。また、化合物ＬＩＳ００１のホルモン感受性リパーゼ活性化作用は、投与後７２時間において持続することが示された。これらの結果から、化合物ＬＩＳ００１をイン・ビボで投与すると、脂肪細胞においてホルモン感受性リパーゼが強力かつ持続的に活性化されることが示された。以上の結果から、化合物ＬＩＳ００１をイン・ビボで投与すると、脂肪細胞においてホルモン感受性リパーゼが持続的に活性化されて中性脂肪分解が促進され、血清中の遊離脂肪酸濃度が増加すること、また、体重が減少することが示唆された。

Claims (15)

  1. 　下記式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （上記式中、
    　ＸおよびＺは、炭素原子または窒素原子を表し、Ｘが窒素原子を表すときＲ５は存在せず、Ｚが窒素原子を表すときＲ６は存在せず、ＸおよびＺの両方が窒素原子を表すことはなく
    　---は、単結合または二重結合を表し、
    　Ｒ１は、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルキルカルボニル基または－Ｒａ－Ｒｂ（式中、Ｒａは－（ＣＨ２）ｍ－（ｍは１～３の整数である）を表し、－（ＣＨ２）ｍ－の一つの－（ＣＨ２）－は－（Ｃ＝Ｏ）－を表してもよく、Ｒｂは芳香環基または脂肪族環基を表し、前記芳香環基および脂肪族環基は、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のアルキル基またはハロゲン原子により置換されていてもよい）を表し、
    　Ｒ２およびＲ３は、同一または異なっていてもよく、水素原子または－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｃ（式中、Ｒｃは、水酸基、炭素数１～４のアルコキシ基、－Ｎ（－Ｒ１１）（－Ｒ１２）（式中、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ水素原子または炭素数１～４のアルキル基を表す）または－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒ１３（式中、ｎは１～３の整数であり、Ｒ１３は炭素数１～４のアルキル基を表す）を表し、但し、Ｒ２およびＲ３が同時に水素原子を表すことはなく、
    　Ｒ４およびＲ７は、水素原子を表し、
    　Ｒ５は、水素原子または－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｄ（式中、Ｒｄは、水酸基、炭素数１～４のアルコキシ基、－Ｎ（－Ｒ２１）（－Ｒ２２）（式中、Ｒ２１およびＲ２２はそれぞれ水素原子または炭素数１～４のアルキル基を表す）または－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒ２３（式中、ｐは１～３の整数であり、Ｒ２３は炭素数１～４のアルキル基を表す）を表し、
    　Ｒ６は、水素原子または－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｅ（式中、Ｒｅは、水酸基、炭素数１～４のアルコキシ基、－Ｎ（－Ｒ３１）（－Ｒ３２）（式中、Ｒ３１およびＲ３２はそれぞれ水素原子または炭素数１～４のアルキル基を表す）または－Ｏ－（ＣＨ２）ｒ－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒ３３（式中、ｒは１～３の整数であり、Ｒ３３は炭素数１～４のアルキル基を表す）を表す。）
  2. 　Ｒ１が、炭素数１～４のアルキル基または－Ｒａ－Ｒｂ（式中、Ｒａは－ＣＨ２－または－Ｃ（＝Ｏ）－を表し、Ｒｂは置換されていてもよい芳香環基または脂肪族炭素環基を表す）を表す、請求項１に記載の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
  3. 　---が、二重結合を表す、請求項１または２に記載の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
  4. 　Ｒ２およびＲ３が、同一または異なっていてもよく、炭素数１～４のアルコキシカルボニル基を表す、請求項１または２に記載の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
  5. 　Ｘが窒素原子を表し、Ｚが炭素原子を表し、Ｒ５が存在せず、かつ、Ｒ６が、炭素数１～４のアルコキシカルボニル基を表す、請求項１または２に記載の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
  6. 　請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を有効成分として含んでなる、脂肪細胞における中性脂肪分解促進剤。
  7. 　請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を有効成分として含んでなる、医薬組成物。
  8. 　脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善に用いるための、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 　前記疾患または症状が、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状である、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　肥満症と関連する疾患および症状が、耐糖能障害、脂質異常症、高血圧、高尿酸血症、痛風、冠動脈疾患、脳梗塞、脂肪肝、月経異常、妊娠合併症、睡眠時無呼吸症候群、肥満低換気症候群、整形外科的疾患および肥満関連腎臓病からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 　他の医薬と併用される、請求項７に記載の医薬組成物。
  12. 　有効量の請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、脂肪細胞における中性脂肪分解促進方法、脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療方法、予防方法または改善方法、あるいは、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクの低減方法。
  13. 　脂肪細胞における中性脂肪分解促進剤の製造のための、脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防および／または改善剤の製造のための、あるいは、肥満症またはそれと関連する疾患もしくは症状の発症リスクの低減剤の製造のための、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物あるいはそれを含む組成物の使用。
  14. 　医薬に使用するための、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
  15. 　脂肪細胞における中性脂肪分解促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防および／または改善に使用するための、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物。
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