WO2024063587A1 - 오토파지 활성을 유도하는 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물 - Google Patents

오토파지 활성을 유도하는 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물 Download PDF

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WO2024063587A1
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leaf extract
tree leaf
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loquat
loquat tree
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PCT/KR2023/014460
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이상한
송보림
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경북대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving skin containing loquat tree leaf extract, which induces autophagy activity, as an active ingredient.
  • the skin the body's largest organ composed of the epidermis, dermis, and subcutaneous tissue, serves as the body's first line of defense to protect the body from external environmental stress, so maintaining the function of the skin is essential.
  • Skin aging can be broadly classified into intrinsic aging and extrinsic aging. Intrinsic aging occurs due to genetic factors and the passage of time, while extrinsic aging occurs due to external environmental factors such as ultraviolet rays.
  • UVA 320-400 nm
  • UVB 280-320 nm
  • UVC 200-280 nm
  • UVB penetrates the skin and causes photoaging, phototoxic reactions, erythema, etc. causes the production of reactive oxygen species.
  • reactive oxygen species activate the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling cascade, contributing to NF- ⁇ B and AP-1 activation. It then accelerates skin aging by increasing the expression of MMPs, which induce the breakdown of extracellular matrix such as collagen, elastin, and hyaluronic acid.
  • Photoaging induced by UVB causes symptoms such as deep wrinkles, transepidermal moisture loss, dryness, and decreased skin elasticity.
  • the present invention confirms the wrinkle improvement, skin barrier strengthening, skin moisturizing, and skin irritation alleviating effects of loquat leaf extract and provides a cosmetic composition and health functional food composition using the same.
  • the present invention seeks to provide a cosmetic composition and health functional food composition that can improve skin damaged by ultraviolet rays using loquat tree leaf extract that induces autophagy activity.
  • the present invention provides a cosmetic composition for improving wrinkles containing loquat tree leaf extract as an active ingredient.
  • the loquat tree leaf extract is preferably extracted at 60-65°C for 2-3 hours using 95-100% (v/v) ethanol as an extraction solvent.
  • the loquat tree leaf extract preferably inhibits elastase activity.
  • the loquat tree leaf extract is preferably used to protect skin cells from damage caused by ultraviolet rays.
  • the loquat tree leaf extract preferably inhibits the production of reactive oxygen species by ultraviolet rays.
  • the loquat tree leaf extract preferably reduces the expression of MMP-1, the expression of which is increased by ultraviolet rays.
  • the loquat tree leaf extract preferably increases the expression of one or more of TIMP-1, SIRT1, COL1A1, ELN, or HAS2, the expression of which is reduced by ultraviolet rays.
  • the loquat tree leaf extract preferably reduces the phosphorylation of MAPKs/AP-1/NF- ⁇ B increased by ultraviolet rays.
  • the loquat tree leaf extract is preferably used to improve symptoms of wrinkles, erythema, and keratinization caused by ultraviolet rays.
  • the loquat tree leaf extract is preferably used to reduce skin thickness increased by ultraviolet rays.
  • the loquat tree leaf extract is preferably used to increase collagen fiber density in the dermis, which is reduced by ultraviolet rays.
  • the present invention provides a cosmetic composition for strengthening the skin barrier containing loquat tree leaf extract as an active ingredient.
  • the loquat tree leaf extract is preferably used to reduce transepidermal water loss increased by ultraviolet rays.
  • the loquat leaf extract preferably increases the expression of one or more selected from Cldn-1, FLG, or LASS3, which is decreased by ultraviolet rays.
  • the present invention provides a moisturizing cosmetic composition containing loquat tree leaf extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a cosmetic composition for alleviating skin irritation containing loquat tree leaf extract as an active ingredient.
  • the loquat tree leaf extract preferably reduces the expression of one or more selected from TNF- ⁇ , IL-6, or IL-1 ⁇ increased by ultraviolet rays.
  • the present invention provides a health functional food composition for improving wrinkles containing loquat tree leaf extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food composition for strengthening the skin barrier containing loquat tree leaf extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a moisturizing health functional food composition containing loquat tree leaf extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food composition for alleviating skin irritation containing loquat tree leaf extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a skin improvement composition that has the effects of improving wrinkles, strengthening the skin barrier, moisturizing, and alleviating skin irritation by containing loquat tree leaf extract, which induces autophagy activity, as an active ingredient.
  • Figure 1 shows the results of a cytotoxicity evaluation experiment of a loquat tree leaf extract in an embodiment of the present invention.
  • Figure 1a is a diagram showing the results of a cytotoxicity evaluation on skin keratinocytes (HaCaT)
  • Figure 1b is a diagram showing the results of a cytotoxicity evaluation on dermal keratinocytes (HaCaT). This diagram shows the results of cytotoxicity evaluation on fibroblasts (HDF).
  • HaCaT skin keratinocytes
  • HDF fibroblasts
  • Figure 2 is a diagram showing the inhibitory effect of loquat leaf extract on elastase activity in one embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows the protective effect of loquat leaf extract on skin keratinocytes (HaCaT) from damage to skin cells caused by ultraviolet rays, in an embodiment of the present invention
  • Figure 3a shows the results of cytotoxicity evaluation according to UVB treatment
  • Figure 3b is a diagram showing the results of cytotoxicity evaluation according to treatment with UVB and loquat leaf extract.
  • Figure 4 shows the protective effect of loquat leaf extract on dermal fibroblasts (HDF) from skin cell damage caused by ultraviolet rays in an embodiment of the present invention
  • Figure 4a shows the results of cytotoxicity evaluation according to UVB treatment
  • Figure 4b is a diagram showing the results of cytotoxicity evaluation according to treatment with UVB and loquat leaf extract.
  • Figure 5 shows the effect of the loquat leaf extract on suppressing the production of reactive oxygen species by ultraviolet rays in an embodiment of the present invention
  • Figure 5a is a diagram showing the effect of suppressing the production of reactive oxygen species in skin keratinocytes (HaCaT).
  • Figure 5b is a diagram showing the effect of suppressing reactive oxygen species production in dermal fibroblasts (HDF).
  • Figure 6 is a diagram confirming the effect of loquat leaf extract on the expression of antioxidant factors in one embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a diagram confirming the effect of loquat leaf extract on Nrf2/HO-1 pathway activity in one embodiment of the present invention.
  • Figure 8 shows the effect of loquat leaf extract on the expression of skin aging-related factors caused by ultraviolet rays in an embodiment of the present invention.
  • Figure 8a is a diagram showing the results of an experiment on skin keratinocytes (HaCaT).
  • Figure 8b is a diagram showing the results of an experiment on dermal fibroblasts (HDF).
  • Figure 9 is a diagram confirming the effect of loquat leaf extract on phosphorylation of MAPKs/AP-1/NF- ⁇ B in one embodiment of the present invention.
  • Figure 10 is a diagram confirming the effect of loquat leaf extract on the MAPKs/AP-1/NF- ⁇ B signaling pathway in one embodiment of the present invention.
  • Figure 11 is a diagram confirming the effect of loquat tree leaf extract in improving wrinkles, erythema, and keratinization caused by ultraviolet rays in a mouse model, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 12 is a diagram confirming the effect of loquat tree leaf extract in reducing skin thickness increased by ultraviolet rays in a mouse model, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 13 is a diagram confirming the effect of loquat leaf extract in reducing epidermal thickness increased by ultraviolet rays in a mouse model, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 14 is a diagram confirming the effect of loquat tree leaf extract in increasing collagen fiber density in the dermis, which was reduced by ultraviolet rays, in a mouse model, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 15 is a diagram confirming the effect of loquat tree leaf extract in reducing transepidermal water loss increased by ultraviolet rays in a mouse model, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 16 is a diagram confirming the effect of loquat leaf extract on the expression of proteins related to skin barrier function in a mouse model, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 17 is a diagram confirming the effect of loquat tree leaf extract on inflammatory cytokine expression in a mouse model, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 18 is a diagram confirming the effect of loquat leaf extract on the expression of aging-related proteins in a mouse model, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 19 is a diagram confirming the effect of loquat tree leaf extract on the expression of antioxidant-related proteins in a mouse model, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 20 is a diagram confirming the effect of loquat tree leaf extract on phosphorylation of MAPKs/AP-1/NF- ⁇ B in a mouse model, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 21 is a three-dimensional diagram confirming the results of response surface analysis to derive optimal conditions for loquat tree leaf extract in one embodiment of the present invention.
  • Figure 22 is a diagram confirming the expression of autophagy-related proteins of loquat tree leaf extract in an embodiment of the present invention (T: group applying 150 mg/kg of loquat leaf extract, O: 150 mg/kg/kg of loquat leaf extract day oral administration group).
  • the present invention relates to a composition for improving skin containing loquat tree leaf extract as an active ingredient.
  • the loquat tree Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl
  • the loquat tree is native to southeastern China and is cultivated in Spain, Portugal, Japan, and Korea.
  • the loquat tree is a small evergreen tree grown for ornamental purposes.
  • the young branches have brown hairs, the flowers bloom white from October to December, and the fruits are yellow.
  • the loquat tree leaf extract of the present invention is preferably extracted at 60 to 65°C for 2 to 3 hours using 95 to 100% (v/v) ethanol as an extraction solvent.
  • the present invention provides a cosmetic composition or health functional food composition for improving wrinkles containing loquat tree leaf extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a cosmetic composition or health functional food composition for strengthening the skin barrier containing loquat tree leaf extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a moisturizing cosmetic composition or health functional food composition containing loquat tree leaf extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a cosmetic composition or health functional food composition for alleviating skin irritation containing loquat tree leaf extract as an active ingredient.
  • the loquat tree leaf extract can be obtained by extraction and separation from nature using extraction and separation methods known in the art, and "extract" as defined in the present invention can be used using an appropriate solvent. It is extracted from the leaves of the loquat tree ( Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl), and includes, for example, crude extract, polar solvent-soluble extract, or non-polar solvent-soluble extract.
  • the appropriate solvent for extracting the extract from the leaves of the loquat tree may be any organic solvent acceptable in food science or pharmaceutical science, and water or an organic solvent may be used.
  • purified water alcohol with 1 to 4 carbon atoms including methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, etc., acetone ), Ether, Benzene, Chloroform, Ethyl acetate, Methylene chloride, Hexane, and Cyclohexane, alone or in combination. You can use it.
  • an extraction method any one of the following methods can be selected and used: hot water extraction, cold needle extraction, reflux cooling extraction, solvent extraction, steam distillation, ultrasonic extraction, elution, and compression.
  • the desired extract may be further subjected to a conventional fractionation process or may be purified using a conventional purification method.
  • the extract included in the composition of the present invention can be prepared in powder form from the primary extract extracted by the above-described hot water extraction or solvent extraction method by additional processes such as reduced pressure distillation and freeze-drying or spray drying.
  • the primary extract was further purified into fractions using various chromatographies such as silica gel column chromatography, thin layer chromatography, and high performance liquid chromatography. You can also get it. Therefore, in the present invention, extract is a concept that includes all extracts, fractions, and purifications obtained at each stage of extraction, fractionation, or purification, as well as their dilutions, concentrates, or dried products.
  • the “cosmetic composition” of the present invention can be prepared including a cosmetically effective amount of the extract extracted from the leaves of the loquat tree ( Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl) of the present invention described above and a cosmetically acceptable carrier. You can.
  • cosmetically effective amount means an amount sufficient to achieve the skin improvement effect of the present invention described above.
  • the appearance of the cosmetic composition contains a cosmetically or dermatologically acceptable medium or base.
  • a cosmetically or dermatologically acceptable medium or base are all formulations suitable for topical application, such as solutions, gels, solids, pasty anhydrous products, emulsions obtained by dispersing the oil phase in the water phase, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionic forms (liposomes) and It may be provided in the form of a non-ionic vesicular dispersion, or in the form of a cream, skin, lotion, powder, ointment, spray or concealer stick.
  • These compositions can be prepared according to conventional methods in the art.
  • the composition according to the invention can also be used in the form of a foam or in the form of an aerosol composition further containing a compressed propellant.
  • the cosmetic composition according to an embodiment of the present invention is not particularly limited in its formulation, and includes, for example, softening lotion, astringent lotion, nourishing lotion, nourishing cream, massage cream, essence, eye cream, eye essence, and cleansing lotion. It can be formulated into cosmetics such as cream, cleansing foam, cleansing water, pack, powder, body lotion, body cream, body oil, and body essence.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a paste, cream or gel, animal fiber, vegetable fiber, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide, etc. are used as carrier ingredients. This can be used.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a powder or spray
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, or polyamide powder can be used as the carrier ingredient.
  • chlorofluorohydride may be used additionally. May contain propellants such as carbon, propane/butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solvating agent or emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene.
  • a carrier component such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene.
  • carrier component such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene.
  • carrier component such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene.
  • the carrier component includes water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester, Microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar, or tracant may be used.
  • a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester
  • Microcrystalline cellulose aluminum metahydroxide, bentonite, agar, or tracant may be used.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a surfactant-containing cleansing agent
  • aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, and sarcosinate are used as carrier ingredients.
  • fatty acid amide ether sulfate, alkylamidobetaine, fatty alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, linoline derivative, or ethoxylated glycerol fatty acid ester can be used.
  • the cosmetic composition of the present invention includes skin, lotion, cream, essence, pack, foundation, color cosmetics, sunscreen, two-way cake, face powder, compact, makeup base, skin cover, eye shadow, lipstick, lip gloss, lip fix, and eyebrow pencil. , can be applied to cosmetics such as lotion and detergents such as shampoo and soap.
  • the cosmetic composition according to an embodiment of the present invention may further include functional additives and components included in general cosmetic compositions in addition to the extract extracted from the leaves of the loquat tree ( Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl).
  • the functional additive may include ingredients selected from the group consisting of water-soluble vitamins, oil-soluble vitamins, polymer peptides, polymer polysaccharides, sphingolipids, and seaweed extract.
  • the cosmetic composition of the present invention may also contain components included in general cosmetic compositions, if necessary.
  • Other ingredients included include oils and fats, moisturizers, emollients, surfactants, organic and inorganic pigments, organic powders, ultraviolet absorbers, preservatives, disinfectants, antioxidants, plant extracts, pH adjusters, alcohol, pigments, fragrances, and blood circulation agents. Examples include accelerators, cooling agents, restrictors, and purified water.
  • the health functional food composition of the present invention in addition to containing the extract as an active ingredient, may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like a typical food composition.
  • Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, etc.; Disaccharides such as maltose, sucrose, etc.; and polysaccharides, such as common sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • the above-described flavoring agents include natural flavoring agents (thaumatin), stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.), and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.).
  • the food composition of the present invention can be formulated in the same manner as the pharmaceutical composition below and used as a functional food or added to various foods.
  • Foods to which the composition of the present invention can be added include, for example, beverages, meat, chocolate, foods, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, candy, ice cream, alcoholic beverages, vitamin complexes, health supplements, etc. There is.
  • the food composition contains, in addition to the extract as the active ingredient, various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic and natural flavors, colorants and thickening agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid, and salts thereof. , alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, etc.
  • the food composition of the present invention may contain pulp for the production of natural fruit juice and fruit juice drinks and vegetable drinks.
  • the health functional food composition of the present invention can be manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc.
  • 'health functional food composition' refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients with functionality useful to the human body in accordance with Act No. 6727 on Health Functional Food, and refers to food that is manufactured and processed with respect to the structure and function of the human body. It means taking it for the purpose of controlling nutrients or obtaining useful health effects such as physiological effects.
  • the health functional food of the present invention may contain common food additives, and its suitability as a food additive is determined according to the general rules and general test methods of the food additive code approved by the Ministry of Food and Drug Safety, unless otherwise specified.
  • Items listed in the 'Food Additive Code' include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid; Natural additives such as dark pigment, licorice extract, crystalline cellulose, kaoliang pigment, and guar gum; Examples include mixed preparations such as sodium L-glutamate preparations, noodle additive alkaline preparations, preservative preparations, and tar coloring preparations.
  • health functional foods in the form of tablets are prepared by granulating a mixture of the active ingredient of the present invention with excipients, binders, disintegrants and other additives in a conventional manner, adding a lubricant, etc., and compression molding, or The mixture can be directly compression molded.
  • the health functional food in tablet form may contain a flavoring agent, etc., if necessary.
  • hard capsules can be manufactured by filling a regular hard capsule with a mixture of the active ingredient of the present invention mixed with additives such as excipients
  • soft capsules can be prepared by mixing the active ingredient of the present invention with additives such as excipients. It can be manufactured by filling the mixture with a capsule base such as gelatin.
  • the soft capsule may contain plasticizers such as glycerin or sorbitol, colorants, preservatives, etc., if necessary.
  • the health functional food in the form of a ring can be prepared by molding a mixture of the active ingredient of the present invention and excipients, binders, disintegrants, etc. by a previously known method, and can be coated with white sugar or other coating agent as needed. Alternatively, the surface can be coated with substances such as starch or talc.
  • Health functional food in the form of granules can be manufactured into granules by mixing a mixture of excipients, binders, disintegrants, etc. of the active ingredients of the present invention by a known method, and may contain flavoring agents, flavoring agents, etc., if necessary. You can.
  • Loquat tree Eriobotrya japonica leaves were dried and ground. 15 g of loquat leaf powder was mixed with 150 mL of 97.8% (v/v) ethanol and extracted by refluxing at 62.7°C three times for 2.5 hours each. The supernatant was filtered, concentrated using a rotary vacuum concentrator, and freeze-dried for 3 days using a freeze dryer to prepare loquat leaf extract ( Eriobotrya japonica leaf extract, EJLE).
  • Skin keratinocytes (HaCaT) and dermal fibroblasts (HDF) were distributed at 1 ⁇ 10 5 cells/well each in a 96 well plate, and DMEM supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum) and 1% Penicillin/Streptomycin was used as the medium. (Dulbecco's modified Eagle's medium) was used and cultured at 5% CO 2 and 37°C for 24 hours.
  • the loquat tree leaf extract according to Example 1 was treated at different concentrations (1, 3, 10, 30, 100 ⁇ g/mL) and reacted for 24 hours. Afterwards, the medium was recovered, the cells were washed with DPBS, treated with MTT reagent, and reacted at 37°C for 3 hours. After dissolving the formazan formed in the cells with DMSO, the absorbance was measured at 595 nm using a microplate reader (Perkin Elmer, Wallac Victor3, MA, USA).
  • Figure 1a is a diagram showing the cytotoxicity evaluation results for skin keratinocytes (HaCaT), and Figure 1b is a diagram showing the cytotoxicity evaluation results for dermal fibroblasts (HDF).
  • the loquat tree leaf extract of the present invention showed a cell viability of more than 80% at all concentrations, confirming that it does not cause cytotoxicity to skin keratinocytes (HaCaT) and dermal fibroblasts (HDF). Therefore, it was confirmed that the loquat tree leaf extract of the present invention is not toxic to human cells, is harmless to the human body, and has excellent safety, so it can be usefully used in cosmetics, food, pharmaceuticals, and other medicines applied to the human body. .
  • Elastase is a proteolytic enzyme that breaks down elastin and promotes the formation of wrinkles on the skin.
  • the effect of the loquat tree leaf extract of the present invention on improving or preventing skin wrinkles by inhibiting the activity of elastase was confirmed.
  • the elastase inhibitory activity of the loquat tree leaf extract of the present invention increased as the concentration increased, and the elastase inhibitory activity was confirmed to be significantly higher than that of EGCG, a positive control.
  • Skin keratinocytes (HaCaT) and dermal fibroblasts (HDF) were distributed at 1 ⁇ 10 5 cells/well each in a 96 well plate, and DMEM supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum) and 1% Penicillin/Streptomycin was used as the medium. (Dulbecco's modified Eagle's medium) was used and cultured at 5% CO 2 and 37°C for 24 hours.
  • the loquat tree leaf extract according to Example 1 was treated at different concentrations (1, 3, 10, 30, 100 ⁇ g/mL) and reacted for 24 hours. Afterwards, the medium was recovered, the cells were washed with DPBS, an amount of DPBS was added to slightly cover the cells, and UVB was irradiated.
  • FIG. 3 shows the results of the experiment on skin keratinocytes (HaCaT), and Figure 4 shows the results of the experiment on dermal fibroblasts (HDF).
  • HaCaT skin keratinocytes
  • HDF dermal fibroblasts
  • Skin keratinocytes (HaCaT) and dermal fibroblasts (HDF) were distributed at 1 ⁇ 10 5 cells/well each in a black 96 well plate and cultured for 24 hours.
  • the loquat tree leaf extract according to Example 1 was treated at different concentrations (1, 3, 10, 30, 100 ⁇ g/mL) and reacted for 24 hours. After irradiation with UVB (40 mJ/cm 2 ), the cells were cultured in serum-free DMEM for 24 hours, then 40 ⁇ M DCFH-DA was added and cultured for 1 hour.
  • Figure 5a is a diagram showing the effect of suppressing the production of reactive oxygen species in skin keratinocytes (HaCaT), and Figure 5b is a diagram showing the effect of suppressing the production of reactive oxygen species in dermal fibroblasts (HDF).
  • HaCaT skin keratinocytes
  • HDF dermal fibroblasts
  • dermal fibroblasts were irradiated with loquat leaf extract (1, 3, 10 ⁇ g/mL) and UVB, then added to RIPA buffer containing 1% protease inhibitor cocktail and 1% phosphatase inhibitor cocktail. Proteins were extracted by. The total protein concentration was quantified using the BCA protein analysis kit, then separated by SDS-PAGE (6-15% gel) and transferred to a membrane. The membrane was blocked with 5% BSA or skim milk for 1 hour, incubated with primary antibody overnight at 4°C, and reacted with secondary antibody for 2 hours at room temperature. Afterwards, the membrane was treated with ECL solution, and the band was identified and quantified using the ChemiDocTM XRS+ System and Image LabTM Software.
  • Nrf2 is a transcription factor affected by oxidative stress and the expression pattern of antioxidant enzymes CAT, SOD-1, HO-1, TRXR1, and TXNIP, which inhibits the activity of TRX
  • the loquat leaf extract of the present invention It was confirmed that it reduces oxidative stress and has an antioxidant effect.
  • Example 5 Based on the experimental results of Example 5 and Example 6, it was confirmed whether the loquat leaf extract (10 ⁇ g/mL) of the present invention exerts an effect of suppressing the production of reactive oxygen species through activation of the Nrf2/HO-1 pathway. .
  • Nrf2 an Nrf2 inhibitor.
  • Figure 7a the expression of Nrf2 and HO-1 decreased with Brusatol treatment, confirming that HO-1 expression requires Nrf2 activation.
  • Brusatol (Nrf2 inhibitor), ZnPP (HO-1 inhibitor), and CoPP (HO-1) were obtained from dermal fibroblasts (HDF) of the loquat leaf extract (10 ⁇ g/mL) of the present invention.
  • the effect of suppressing reactive oxygen species production was confirmed in the presence and absence of an inducer.
  • Brusatol and ZnPP reduced the inhibitory effect of loquat leaf extract on reactive oxygen species production, while CoPP increased the inhibitory effect of loquat leaf extract on reactive oxygen species generation. Therefore, it was determined that the loquat tree leaf extract of the present invention exerts an inhibitory effect on the production of reactive oxygen species through activation of the Nrf2/HO-1 pathway.
  • Example 6 protein expression of factors related to skin aging caused by UVB irradiation was analyzed in skin keratinocytes (HaCaT) and dermal fibroblasts (HDF).
  • HaCaT skin keratinocytes
  • HDF dermal fibroblasts
  • Figure 8a shows the experimental results of skin keratinocytes (HaCaT), and Figure 8b shows the experimental results of dermal fibroblasts (HDF).
  • HaCaT skin keratinocytes
  • HDF dermal fibroblasts
  • MMP-1 is a factor that affects skin photoaging, and when looking at the expression pattern of TIMP-1, an inhibitor of MMP-1, it can be seen that the loquat tree leaf extract of the present invention has the effect of improving or alleviating skin photoaging.
  • the loquat tree leaf extract of the present invention has an effect of inhibiting collagen decomposition.
  • UVB is known to decompose the extracellular matrix and increase wrinkles, which increases the expression of type 1 pro-collagen (COL1A1), elastin (ELN), and hyaluronan synthase 2 (HAS2), which are major components of the extracellular matrix.
  • COL1A1 type 1 pro-collagen
  • ENN elastin
  • HAS2 hyaluronan synthase 2
  • Example 6 the effect of loquat leaf extract on phosphorylation of MAPKs/AP-1/NF- ⁇ B by UVB irradiation in dermal fibroblasts (HDF) was confirmed.
  • Figure 9a shows the phosphorylation confirmation results of NF- ⁇ B
  • Figure 9b shows AP-1
  • Figure 9c shows the MAPKs signaling pathway.
  • Phosphorylation of MAPKs/AP-1/NF- ⁇ B increased upon UVB (40 mJ/cm 2 ) irradiation, whereas phosphorylation of MAPKs/AP-1/NF- ⁇ B decreased upon treatment with the loquat leaf extract of the present invention. was confirmed.
  • mice This experiment was approved (KNU-2022-0001) by the Institutional Animal Care and Use Committee of Kyungpook National University.
  • the experimental groups were normal group ((G1) Normal control group; UVB untreated group), control group ((G2) Control group; UVB only treated group), and positive control group (EGCG 100, which helps maintain skin health from skin damage caused by UV rays.
  • mg/kg administration group (G3)) loquat tree leaf extract 50 mg/kg application group ((G4)), loquat tree leaf extract 150 mg/kg application group ((G5)), loquat leaf extract 150 mg/kg/ The daily oral administration group ((G6)) was selected.
  • Figure 11 shows a photo taken of a mouse, etc. after the end of the experiment.
  • experimental group G2 wrinkles were formed and erythema and keratinization appeared, while the group in which loquat leaf extract was applied (G4, G5) or orally (G6) showed improvement in wrinkles, erythema, and keratinization.
  • a section 1 cm wide below the center of the mouse's back was made into a double layer, and the skin thickness was measured using a digital caliper (Absolute Digimatic Thickness Gauge (Mitutoyo Corp.)).
  • Tissue sections were prepared by cutting into thin sections at 4 ⁇ m thickness, stained with hematoxylin and eosin, and observed using a microscope (Eclipse TE2000-U, Nikon).
  • the epidermis thickness increased in experimental group G2, while the epidermis thickness decreased in the group where loquat leaf extract was applied (G4, G5) or orally administered (G6).
  • Tissue sections of 4 ⁇ m thickness were stained with Masson's trichrome and observed using a microscope (Eclipse TE2000-U, Nikon).
  • the collagen fiber density within the dermis decreased in experimental group G2, while the collagen fiber density within the dermis increased in the group where loquat leaf extract was applied (G4, G5) or orally administered (G6).
  • the transepidermal water loss (TEWL) value is the amount of moisture released from the skin. The higher the value, the lower the moisturizing function of the skin is, indicating that the skin's inherent barrier function is damaged. Changes in transepidermal water loss from the skin of mice were measured using a Vapometer (Delfin Technologies Ltd).
  • transepidermal water loss increased in experimental group G2 but transepidermal water loss decreased in the group (G6) to which loquat leaf extract was applied (G4, G5) or orally administered.
  • the administration group (G6) showed a significant decrease of about 75.5% compared to the experimental group G2.
  • Example 6 the expression of proteins related to skin barrier function by UVB irradiation was confirmed.
  • TNF- ⁇ As shown in Figure 17, the expression of TNF- ⁇ , IL-6, and IL-1 ⁇ increased in experimental group G2, but in the group where loquat leaf extract was applied (G4, G5) or orally administered (G6), TNF- ⁇ , The expression of IL-6 and IL-1 ⁇ decreased.
  • Example 6 protein expression of factors related to skin aging caused by UVB irradiation was analyzed in the skin of mice, etc.
  • Example 6 As in Example 6, the effect of UVB irradiation on the expression of antioxidant-related factors in the skin of mice, etc. was confirmed.
  • Nrf2 and HO-1 decreased in experimental group G2, but the expression of Nrf2 and HO-1 increased in the group where loquat leaf extract was applied (G4, G5) or orally administered (G6). .
  • the response surface analysis model used Box-Behnken Design (BBD), a 3-level-3-factor experiment plan. Table 3 shows the main variables. Ethanol concentration ( 0, 50 , and 100%) was set as The above three extraction factors were encoded into three levels of +1, 0, and -1, respectively, and an extraction experiment was conducted by setting 15 districts according to BBD as shown in Table 4. In addition, the dependent variable affected by the above independent variables was Elastase inhibitory activity (%), which was measured three times and the average value was used in regression analysis.
  • BBD Box-Behnken Design
  • Table 4 shows the results of the dependent variables obtained by extracting 15 g of loquat leaf powder with 150 mL of solvent according to the extraction conditions (ethanol concentration, extraction time, extraction temperature) listed in Table 4 below.
  • Table 5 shows the regression equation, coefficient of determination R 2 , p-value, and F-value showing the relationship between each dependent variable and independent variable through the Box-Behnken design model using the above results.
  • the optimized value of each independent variable was determined through the above regression equation, and a response surface contour line was formed according to the interaction of each variable.
  • the regression equation was expressed graphically on a three-dimensional response surface curve, and each contour curve fixed one of the three independent variables and expressed the infinite value of the combination of the remaining two variables ( Figure 21).
  • the optimal extraction conditions for loquat leaves showing the highest elastase inhibitory activity were ethanol concentration (X 1 ) 97.8%, extraction time (X 2 ) 2.5 h, and extraction temperature (X 3 ) 62.7. It was derived as °C. Elastase inhibitory activity predicted under these extraction conditions was 88.35%, and the actual test results showed that the elastase inhibitory activity was 88.93%, similar to the predicted value.
  • UVB 40 mJ/cm 2
  • the expression of p-mTOR and p62 proteins increased and the expression of Beclin1, ATG5, and LC3 proteins decreased, but when the loquat leaf extract of the present invention was applied (UV+ T) or orally administered (UV+O), the expression of p-mTOR and p62 proteins decreased, and the expression of Beclin1, ATG5, and LC3 proteins increased.
  • the loquat tree leaf extract of the present invention upregulates the initial stage of autophagy and regulates autophagy under stress situations such as UVB ultraviolet rays.

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Abstract

본 발명은 오토파지 활성을 유도하는 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것으로, 주름 개선, 피부 장벽 강화, 보습, 피부 자극 완화 효과가 있어 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물로 사용할 수 있다.

Description

오토파지 활성을 유도하는 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물
본 발명은 오토파지 활성을 유도하는 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.
표피, 진피 및 피하조직으로 구성되는 신체의 가장 큰 기관인 피부는 외부 환경 스트레스로부터 신체를 보호하는 신체의 1차 방어선 역할을 하므로, 피부의 기능을 유지하는 것은 필수적이다. 피부 노화는 크게 내인성 노화(Intrinsic aging)와 외인성 노화(Extrinsic aging)로 분류할 수 있다. 내인성 노화는 유전적 요인과 시간의 흐름에 따라 발생하는 반면, 외인성 노화는 자외선 등의 외부 환경적 요소에 의해 발생한다.
자외선은 파장에 따라 UVA(320~400 nm), UVB(280~320 nm), UVC(200~280 nm)로 분류되는데, 특히 UVB는 피부에 침투하여 광노화, 광독성 반응, 홍반 등을 유발하며, 활성산소종의 생성을 유발한다. 또한 과도한 활성산소종은 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 신호 전달 캐스케이드를 활성화하여 NF-κB 및 AP-1 활성화에 기여한다. 그런 다음, 콜라겐, 엘라스틴, 히알루로산과 같은 세포 외 기질의 분해를 유도하는 MMP의 발현을 증가시켜 피부 노화를 가속화한다. UVB에 의해 유도된 광노화는 깊은 주름, 경표피수분손실, 건조, 피부 탄력 감소 등의 증상을 유발한다.
한편, 본 발명은 비파나무 잎 추출물의 주름 개선, 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 자극 완화 효과를 확인하여 이를 활용한 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 오토파지 활성을 유도하는 비파나무 잎 추출물을 이용하여 자외선에 의해 손상되는 피부를 개선할 수 있는 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 95~100%(v/v) 에탄올을 추출용매로 하여, 60~65℃에서 2~3시간 추출한 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 엘라스타아제(elastase) 활성을 억제하는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의한 피부 세포 손상을 보호하는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의한 활성산소종 생성을 억제하는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 발현 증가된 MMP-1의 발현을 감소시키는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 발현 감소된 TIMP-1, SIRT1, COL1A1, ELN 또는 HAS2 중 어느 하나 이상을 발현 증가시키는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 증가된 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화를 감소시키는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 유발되는 주름, 홍반, 각질화 증상을 개선하는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 증가된 피부 두께를 감소시키는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 감소한 진피 내 콜라겐 섬유 밀도를 증가시키는 것이 좋다.
또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 증가한 경피수분손실량을 감소시키는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 감소한 Cldn-1, FLG 또는 LASS3 중 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 증가시키는 것이 좋다.
또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 보습용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 자극 완화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 증가한 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β 중 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 감소하는 것이 좋다.
또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 강화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 보습용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 자극 완화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 오토파지 활성을 유도하는 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함함에 따라 주름 개선, 피부 장벽 강화, 보습, 피부 자극 완화 효과가 있는 피부 개선용 조성물을 제공한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 세포독성 평가 실험 결과를 나타낸 것으로, 도 1a는 피부각질세포(HaCaT)에 대한 세포독성 평가 결과를 나타낸 도이고, 도 1b는 진피섬유아세포(HDF)에 대한 세포독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 엘라스타아제(elastase) 활성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 피부각질세포(HaCaT)에서 자외선에 의한 피부 세포 손상 보호 효과를 나타낸 것으로, 도 3a는 UVB 처리에 따른 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이고, 도 3b는 UVB 및 비파나무 잎 추출물 처리에 따른 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 진피섬유아세포(HDF)에서 자외선에 의한 피부 세포 손상 보호 효과를 나타낸 것으로, 도 4a는 UVB 처리에 따른 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이고, 도 4b는 UVB 및 비파나무 잎 추출물 처리에 따른 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 자외선에 의한 활성산소종 생성 억제 효과를 나타낸 것으로, 도 5a는 피부각질세포(HaCaT)에서 활성산소종 생성 억제 효과를 나타낸 도이고, 도 5b는 진피섬유아세포(HDF)에서 활성산소종 생성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물이 항산화 인자 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 Nrf2/HO-1 경로 활성에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 자외선에 의한 피부 노화 관련 인자 발현에 미치는 영향을 확인한 것으로, 도 8a는 피부각질세포(HaCaT)에 대한 실험 결과를 나타낸 도이고, 도 8b는 진피섬유아세포(HDF)에 대한 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물이 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물이 MAPKs/AP-1/NF-κB 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 자외선에 의한 주름, 홍반, 각질화를 개선하는 효과를 확인한 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 자외선에 의해 증가한 피부 두께를 감소시키는 효과를 확인한 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 자외선에 의해 증가한 표피 두께를 감소시키는 효과를 확인한 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 자외선에 의해 감소한 진피 내 콜라겐 섬유 밀도를 증가시키는 효과를 확인한 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 자외선에 의해 증가한 경피수분손실량을 감소시키는 효과를 확인한 도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 피부 장벽기능 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 염증성 사이토카인 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 노화 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 항산화 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 최적조건 도출을 위한 반응표면분석을 수행한 결과를 3차원으로 확인한 도이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 있어서 비파나무 잎 추출물의 오토파지 관련 단백질 발현을 확인한 도이다(T:비파나무 잎 추출물 150 mg/kg 도포군, O:비파나무 잎 추출물 150 mg/kg/day 경구 투여군).
본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.
비파나무(Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl)는 중국 남동부를 원산지로 하며, 스페인, 포르투갈, 일본, 한국 등에서 재배된다. 비파나무는 관상용으로 기르는 상록 작은키나무로, 어린 가지에 갈색 털이 있고, 꽃은 10~12월에 흰색으로 피며, 열매는 노란색이다.
본 발명의 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 95~100%(v/v) 에탄올을 추출용매로 하여, 60~65℃에서 2~3시간 추출한 것이 좋다.
본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 보습용 화장료 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 자극 완화용화장료 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 당업계에 공지된 추출 및 분리방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적절한 용매를 이용하여 비파나무(Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl)의 잎으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 상기 비파나무(Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl)의 잎으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 식품학 또는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(Methanol), 에탄올(Ethanol), 프로판올(Propanol), 이소프로판올(Isopropanol), 부탄올(Butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알콜, 아세톤(Acetone), 에테르(Ether), 벤젠(Benzene), 클로로포름(Chloroform), 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(Methylene chloride), 헥산(Hexane) 및 시클로헥산 (Cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
본 발명의 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 “화장료 조성물”은 상술한 본 발명의 비파나무(Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl)의 잎에서 추출한 추출물의 화장품학적 유효량(Cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조할 수 있다.
본 명세서에서 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 피부 개선 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(Foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알콜 설페이트, 지방족 알콜 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알콜, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬, 화장수 등의 화장품 및 샴푸, 비누 등의 세정제에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물에는 상기 비파나무(Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl)의 잎에서 추출한 추출물 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
한편, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분인 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 하기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화 되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알콜 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강 기능성 식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강 기능성 식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강 기능성 식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀 기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
모든 결과는 최소 3번의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시되었으며 SigmaPlot Software V.12.5(Systat Software Inc.)를 활용한 Dunnett’s Multiple Comparison Test와 함께 일원 분산 분석에 의해 결정하였다. 통계적 유의성은 *P<0.05, **P<0.01로 설정되었다. 또한 RSM 결과의 통계 분석은 Design Expert 소프트웨어 V.11(Stat-Ease Inc.)을 사용하여 분석하였다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
<실시예 1> 비파나무 잎 추출물의 제조
비파나무(Eriobotrya japonica) 잎을 건조시킨 후 분쇄하였다. 비파나무 잎 분말 15g을 97.8%(v/v) 에탄올 150 mL와 혼합하고 62.7℃에서 2.5시간씩 3회 반복하여 환류냉각추출하였다. 상등액을 여과한 뒤, 회전식 진공농축기를 이용하여 농축하고, 동결건조기를 사용하여 3일간 동결건조하여 비파나무 잎 추출물(Eriobotrya japonica leaf extract, EJLE)을 제조하였다.
<실시예 2> 세포독성 평가
피부각질세포(HaCaT)와 진피섬유아세포(HDF)를 96 well plate에 각각 1×105 cells/well로 분주하고, 배지로 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% Penicillin/Streptomycin이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)을 사용하여, 5% CO2, 37℃에서 24시간 배양하였다. 상기 실시예 1에 따른 비파나무 잎 추출물을 농도별(1, 3, 10, 30, 100 ㎍/mL)로 처리하고 24시간 반응시켰다. 이후 배지를 회수하고 세포를 DPBS로 세척한 뒤, MTT 시약을 처리하고 37℃에서 3시간 반응시켰다. 세포 내 형성된 formazan을 DMSO로 용해한 후, microplate reader(Perkin Elmer, Wallac Victor3, MA, USA)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 1a는 피부각질세포(HaCaT)에 대한 세포독성 평가 결과를 나타낸 도이고, 도 1b는 진피섬유아세포(HDF)에 대한 세포독성 평가 결과를 나타낸 도이다. 도 1에서 보듯이, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 모든 농도에서 80% 이상의 세포생존율을 보여 피부각질세포(HaCaT)와 진피섬유아세포(HDF)에 대한 세포독성을 유발하지 않음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 인체 세포에 독성이 없고, 인체에 무해하고, 안전성이 우수하므로, 인체에 적용되는 화장품, 식품, 의약품, 의외약품 등에 활용 시 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
<실시예 3> Elastase 억제 활성
엘라스타아제(elastase)는 엘라스틴(elastin)을 분해하는 단백질 분해효소로, 피부의 주름생성을 촉진시킨다. 본 실험에서는 본 발명의 비파나무 잎 추출물이 엘라스타제의 활성을 저해함에 따른 피부 주름 개선 또는 예방 효과를 확인하였다.
*96 웰 플레이트(well plate)에 상기 실시예 1에 따른 비파나무 잎 추출물을 농도별(1, 3, 10, 30, 100 ㎍/mL)로 2 μL 처리 후, 0.1 M Tris-HCl buffer(pH 8.8)를 사용하여 녹인 0.78 mM substrate(N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide)과 0.04 U elastase 100 μL를 반응시켰다. 이후 icroplate reader(Perkin Elmer, Wallac Victor3, MA, USA)를 이용하여 405nm에서 1분 간격으로 총 25분간 측정하였다. 대조군으로는 Epigallocatechin gallate(EGCG; PHR1333; Sigma-Aldrich Korea)를 사용하였다.
도 2에서 보듯이, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 농도가 증가함에 따라 엘라스타아제 저해 활성이 증가하였으며, 양성대조군인 EGCG에 비해 월등히 높은 엘라스타아제 저해 활성을 확인하였다.
<실시예 4> 자외선으로부터 피부 세포 보호 효과
피부각질세포(HaCaT)와 진피섬유아세포(HDF)를 96 well plate에 각각 1×105 cells/well로 분주하고, 배지로 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% Penicillin/Streptomycin이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)을 사용하여, 5% CO2, 37℃에서 24시간 배양하였다. 상기 실시예 1에 따른 비파나무 잎 추출물을 농도별(1, 3, 10, 30, 100 ㎍/mL)로 처리하고 24시간 반응시켰다. 이후 배지를 회수하고 세포를 DPBS로 세척한 뒤, 세포를 살짝 덮을 만큼의 DPBS를 첨가하고 UVB를 조사하였다. 이후 무혈청 DMEM으로 교체하여 24시간 배양하고, 세포를 DPBS로 세척한 후, MTT 시약을 처리하고 37℃에서 3시간 반응시켰다. 세포 내 형성된 formazan을 DMSO로 용해한 후, microplate reader(Perkin Elmer, Wallac Victor3, MA, USA)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 Epigallocatechin gallate(EGCG; PHR1333; Sigma-Aldrich Korea)를 사용하였다.
도 3에 피부각질세포(HaCaT)에 대한 실험 결과를, 도 4에 진피섬유아세포(HDF)에 대한 실험 결과를 나타내었다. 도 3 및 도 4에서 보듯이, UVB를 조사할 경우 세포 생존률이 크게 감소하였다. 구체적으로, UVB(40 mJ/cm2) 조사에 따라 피부각질세포(HaCaT)의 세포 생존율이 82%, 진피섬유아세포(HDF)의 세포 생존율이 77%로 감소하였다. 반면, 비파나무 잎 추출물을 처리한 경우에는 세포 생존율이 농도 의존적으로 증가하였다. 즉, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 자외선으로부터의 세포 손상을 보호하는 효과가 있음을 확인하였다.
<실시예 5> 자외선 조사에 따른 활성산소종 생성 억제 효과
자외선에 의해 생성되는 세포 내의 활성산소는 피부 노화에 가장 중요한 요인으로 간주되고 있다. 본 실험에서는 본 발명의 비파나무 잎 추출물이 활성산소를 억제하는 효과가 있는지 확인하였다.
피부각질세포(HaCaT)와 진피섬유아세포(HDF)를 black 96 well plate에 각각 1×105 cells/well로 분주하여 24시간 배양하였다. 상기 실시예 1에 따른 비파나무 잎 추출물을 농도별(1, 3, 10, 30, 100 ㎍/mL)로 처리하고 24시간 반응시켰다. UVB(40 mJ/cm2)를 조사한 뒤, 무혈청 DMEM에서 24시간 배양 후, 40 μM DCFH-DA를 첨가하여 1시간 배양하였다. 세포를 DPBS로 세척한 후 Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader(BIO-TEK Instruments Inc., Ex : 485/20 nm / Em : 528/20 nm)를 이용하여 형광도를 측정하였다. 대조군으로는 Epigallocatechin gallate (EGCG; PHR1333; Sigma-Aldrich Korea)와 gallic acid(GA)를 사용하였다.
도 5a는 피부각질세포(HaCaT)에서 활성산소종 생성 억제 효과를 나타낸 도이고, 도 5b는 진피섬유아세포(HDF)에서 활성산소종 생성 억제 효과를 나타낸 도이다. 도 5에서 보듯이, UVB 조사에 따라 활성산소종이 대폭 증가하였으나, 본 발명의 비파나무 잎 추출물 처리에 따라 활성산소종의 생성이 유의하게 억제되는 것을 확인하였다.
<실시예 6> 자외선 조사에 따른 항산화 인자 발현
상기 실시예 4와 동일하게 진피섬유아세포(HDF)에 비파나무 잎 추출물(1, 3, 10 ㎍/mL)과 UVB를 조사한 뒤, 1% protease inhibitor cocktail과 1% phosphatase inhibitor cocktail을 포함하는 RIPA buffer에 의해 단백질을 추출하였다. 총 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트로 정량한 다음 SDS-PAGE(6-15% 겔)로 분리하고 membrane으로 transfer하였다. membrane을 5% BSA 또는 skim milk로 1시간 동안 blocking한 후 1차 항체와 함께 4℃에서 overnight하고 상온에서 2시간 2차 항체를 사용하여 반응시켰다. 이후 membrane에 ECL 용액을 처리하고 ChemiDoc™ XRS+ System과 Image Lab™ Software를 사용하여 밴드를 확인하고 정량하였다.
도 6에서 보듯이, UVB(40 mJ/cm2) 조사에 따라 Nrf2, CAT, SOD-1, HO-1, TRXR1의 발현은 감소하였고 TXNIP의 발현은 증가하였으나, 본 발명의 비파나무 잎 추출물 처리에 따라 Nrf2, CAT, SOD-1, HO-1, TRXR1의 발현은 증가하고 TXNIP의 발현은 감소하였다. Nrf2가 산화적 스트레스에 영향을 받는 전사인자이고, 항산화 효소인 CAT, SOD-1, HO-1, TRXR1과, TRX의 활성을 저해하는 TXNIP의 발현 양상을 볼 때, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 산화적 스트레스를 감소시키며, 항산화 효과를 나타냄을 확인하였다.
<실시예 7> Nrf2/HO-1 경로 활성화에 의한 활성산소종의 생성 억제 효과
상기 실시예 5 및 실시예 6의 실험 결과를 바탕으로, 본 발명의 비파나무 잎 추출물(10 ㎍/mL)이 Nrf2/HO-1 경로 활성화를 통해 활성산소종의 생성 억제 효과를 발휘하는지 확인하였다.
상기 실시예 6을 참고하여, Nrf2 억제제인 Brusatol을 사용하여 동일하게 실험을 진행하였다. 도 7a에서 보듯이, Brusatol 처리에 따라 Nrf2와 HO-1의 발현이 감소하였으며, 이에 따라 HO-1 발현은 Nrf2 활성화를 필요로 함을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 실시예 5를 참고하여, 본 발명의 비파나무 잎 추출물(10 ㎍/mL)의 진피섬유아세포(HDF)에서 Brusatol(Nrf2 억제제), ZnPP(HO-1 억제제) 및 CoPP(HO-1 유도제)의 존재 및 부재 하에 활성산소종 생성 억제 효과를 확인하였다. 도 7b에서 보듯이, Brusatol과 ZnPP는 비파나무 잎 추출물의 활성산소종 생성 억제 효과를 감소시킨 반면, CoPP는 비파나무 잎 추출물의 활성산소종 생성 억제 효과를 증가시켰다. 따라서, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 Nrf2/HO-1 경로 활성화를 통해 활성산소종 생성 억제 효과를 발휘하는 것으로 판단되었다.
<실시예 8> UVB 조사에 의한 피부 노화 관련 인자의 발현
상기 실시예 6과 동일하게, 피부각질세포(HaCaT)와 진피섬유아세포(HDF)에서 UVB 조사에 의한 피부 노화 관련 인자의 단백질 발현을 분석하였다.
도 8a에 피부각질세포(HaCaT)의 실험 결과를, 도 8b에 진피섬유아세포(HDF)의 실험 결과를 나타내었다. UVB(40 mJ/cm2) 조사에 따라 MMP-1의 발현이 증가하고, TIMP-1, SIRT1, COL1A1, ELN 및 HAS2의 발현은 감소하였으나, 본 발명의 비파나무 잎 추출물 처리에 따라 MMP-1 발현이 감소하고, TIMP-1, SIRT1, COL1A1, ELN 및 HAS2의 발현은 증가하였다.
MMP-1은 피부 광노화에 영향을 미치는 인자이며, MMP-1의 억제제인 TIMP-1의 발현 양상을 볼 때, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 피부 광노화를 개선 또는 완화하는 효과가 있음을 알 수 있다
또한, SIRT1이 광노화에 따른 콜라겐 분해를 억제하는 것으로 알려져 있는바, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 콜라겐 분해 억제 효과가 있음을 알 수 있다.
또한, UVB는 세포 외 기질을 분해하고 주름을 증가시키는 것으로 알려져 있는바, 세포외 기질을 구성하는 주요 성분인 type 1 pro-collagen(COL1A1), elastin(ELN) 및 hyaluronan synthase 2(HAS2)의 발현 양상을 볼 때, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 세포 외 기질 분해를 억제하며, 주름 개선 효과가 있음을 알 수 있다.
<실시예 9> UVB 조사에 의한 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화
상기 실시예 6과 동일하게, 진피섬유아세포(HDF)에서 비파나무 잎 추출물이 UVB 조사에 의한 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화에 미치는 영향을 확인하였다.
도 9a에 NF-κB, 도 9b에 AP-1, 도 9c에 MAPKs 신호 전달 경로의 인산화 확인 결과를 나타내었다. UVB(40 mJ/cm2) 조사에 따라 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화가 증가한 반면, 본 발명의 비파나무 잎 추출물 처리에 따라 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화가 감소함을 확인하였다.
<실시예 10> MAPKs/AP-1/NF-κB 신호전달 경로 확인
상기 실시예 9를 참고하여, 본 발명의 비파나무 잎 추출물이 MAPKs/AP-1/NF-κB 경로 억제를 통해 MMP-1 발현이 감소하고, TIMP-1 및 COL1A1 발현이 증가하는 것인지 확인하기 위해, MAPKs/AP-1/NF-κB 억제제를 사용하였다.
상기 실시예 8을 참고하여, U0126(ERK 억제제), SP600125(JNK 억제제), SB202190(P38 억제제), SP100030(AP-1 억제제) 및 PDTC(NF-κB 억제제)의 존재 또는 부존재 하에 진피섬유아세포(HDF)에서 UVB 조사에 의한 MMP-1, TIMP-1 및 COL1A1의 단백질 발현 수준을 확인하였다.
실험 결과를 도 10에 나타내었다. 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 MAPKs/AP-1/NF-κB 경로 억제를 통한 자외선에 따른 피부노화 억제 효과를 발휘하는 것으로 확인되었다.
<실시예 11> 동물모델에서 비파나무 잎 추출물의 효과 확인
본 실험은 경북대학교 동물실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인(KNU-2022-0001)을 받았다. 실험동물(6주령의 수컷 마우스(BALB/C mice, Samtako, Osan, Korea), n=30)는 온도 22 ± 2℃, 습도 60 ± 5%, 12시간 명암 주기에서 음식과 물에 자유롭게 접근 가능하도록 유지되었으며, 일주일간 사육실 환경에 적응시켰다. 이후, 동물용 클리퍼와 제모 크림을 사용하여 각 마우스의 등쪽 피부 털을 제모한 뒤, 5마리씩 무작위로 그룹을 배정하여 실험을 진행하였다.
실험군 실험물질 처리상태의 설명
G1 정상군 : Normal control group; UVB 무처리군
G2 대조군 : Control group; UVB 단독 처리군
G3 UVB + EGCG 100 mg/kg 투여군
G4 UVB + 비파나무 잎 추출물 50 mg/kg 도포군
G5 UVB + 비파나무 잎 추출물 150 mg/kg 도포군
G6 UVB + 비파나무 잎 추출물 150 mg/kg/day 경구 투여군
실험군은 정상군((G1) Normal control group; UVB 무처리군), 대조군((G2) Control group; UVB 단독 처리군), 양성대조군(자외선에 의한 피부 손상으로부터 피부 건강 유지에 도움을 주는 EGCG 100 mg/kg 투여군(G3)), 비파나무 잎 추출물 50 mg/kg 도포군((G4)), 비파나무 잎 추출물 150 mg/kg 도포군((G5)), 비파나무 잎 추출물 150 mg/kg/day 경구투여군((G6))으로 하였다.
정상군을 제외한 모든 그룹은 비파나무 잎 추출물 또는 EGCG 처리 후 주 5회 총 4주간 자외선을 조사하였다. UVB 조사량은 75 mJ/cm2으로 시작하여 점차 증가시켰다(1 MED(1 minimal erythema dose = 75 mJ/cm²): 3일, 2 MED: 3일, 3 MED: 4일, 4 MED: 10일). 사육 종료일에 마우스를 흡입마취 후, 피부조직을 채취하여 실험에 사용하였다.
11-1. 주름, 홍반, 각질화 개선 효과
도 11에 실험 종료 후 마우스 등을 촬영한 사진을 나타내었다. 실험군 G2에서 주름이 형성되고 홍반, 각질화가 나타난 반면, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 주름, 홍반, 각질화가 개선된 것을 확인하였다.
11-2. 피부 두께 변화
마우스 등 중앙 부위에서 너비 1 cm 아래 부분을 잡아 두겹의 형태로 만든 후, 디지털 캘리퍼(Absolute Digimatic Thickness Gauge (Mitutoyo Corp.))를 이용하여 피부 두께를 측정하였다.
도 12에서 보듯이, 실험군 G2에서 피부 두께가 증가한 반면, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 피부 두께가 감소하였다. 특히 실험군 G5는 UVB 처리군(G2)에 비해 30.3% 가량 유의적인 감소가 확인되었다.
또한, 절취한 피부조직을 10% 포르말린으로 고정한 후, 파라핀에 포매(embedding)하여 파라핀 블럭을 제작하였다. 4 μm 두께로 박절하여 조직 절편을 제조하고, hematoxylin and eosin 염색 한 뒤, 현미경(Eclipse TE2000-U, Nikon)을 사용하여 관찰하였다.
도 13에서 보듯이, 실험군 G2에서 표피 두께(Epidermis thickness)가 증가한 반면, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 표피 두께가 감소하였다.
11-3. 콜라겐 섬유 밀도 변화
4 μm 두께의 조직 절편을 Masson's trichrome 염색 한 뒤, 현미경(Eclipse TE2000-U, Nikon)을 사용하여 관찰하였다.
도 14에서 보듯이, 실험군 G2에서 진피 내 콜라겐 섬유 밀도가 감소한 반면, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 진피 내 콜라겐 섬유 밀도가 증가하였다.
11-4. 피부 장벽기능 강화
경피수분손실량(transepidermal water loss, TEWL) 수치는 피부로부터 발산되는 수분량으로서, 수치가 높을수록 피부의 보습 기능이 떨어져 있음을 의미하며, 피부 고유의 장벽 기능이 손상되었음을 나타낸다. 마우스 등 피부의 경피수분손실량의 변화를 Vapometer (Delfin Technologies Ltd)를 사용하여 측정하였다.
도 15에서 보듯이, 실험군 G2에서 경피수분손실량이 증가하였으나, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 경피수분손실량이 감소하였으며, 특히, 비파나무 잎 추출물 경구 투여군(G6)은 실험군 G2 대비 75.5% 가량 유의적인 감소를 보였다.
또한, 상기 실시예 6과 동일하게, UVB 조사에 의한 피부 장벽기능 관련 단백질 발현을 확인하였다.
도 16에서 보듯이, 실험군 G2에서 Cldn-1, FLG 및 LASS3 발현이 감소하였으나, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 Cldn-1, FLG 및 LASS3 발현이 증가하였다.
11-5. 염증성 사이토카인 발현 변화
균질화된 마우스 등 피부조직으로부터 TRIzol™을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 260 nm/280 nm의 비율로 1.8-2.0 사이의 RNA 순도를 흡광도로 측정하여 정량하였다. 2 μg의 RNA가 cDNA Synthesis & Go Kit에 의해 cDNA 합성에 사용되었다. 염증성 사이토카인과 관련된 유전자의 mRNA 발현을 결정하기 위해, RT-PCR은 특정 프라이머를 이용하여 제조된 cDNA에 대한 PCR Thermal Cycler(Takara Bio Inc.)에 의해 수행되었다. RT-PCR을 통해 얻어진 cDNA를 이용하여 PCR 후 1% agarose gel과 StaySafeTM Nucleic Acid Gel Stain로 전기영동을 하여 ChemiDoc™과 Image Lab™ Software를 사용하여 결과를 확인하였다.
Figure PCTKR2023014460-appb-img-000001
도 17에서 보듯이, 실험군 G2에서 TNF-α, IL-6, IL-1β의 발현이 증가하였으나, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 TNF-α, IL-6, IL-1β의 발현이 감소하였다.
11-6. 노화 관련 인자 발현 변화
상기 실시예 6과 동일하게, 마우스 등 피부에서 UVB 조사에 의한 피부 노화 관련 인자의 단백질 발현을 분석하였다.
도 18에서 보듯이, 실험군 G2에서 MMP-1 MMP-9의 발현이 증가하고, TIMP-1, SIRT1, COL1A1, ELN 및 HAS2의 발현은 감소하였으나, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 MMP-1 MMP-9의 발현이 감소하고, TIMP-1, SIRT1, COL1A1, ELN 및 HAS2의 발현이 증가하였다.
11-7. 항산화 관련 인자 발현 변화
상기 실시예 6과 동일하게, 마우스 등 피부에서 UVB 조사에 의한 항산화 관련 인자 발현에 미치는 영향을 확인하였다.
도 19에서 보듯이, 실험군 G2에서 Nrf2, HO-1의 발현이 감소하였으나, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 Nrf2, HO-1의 발현이 증가하였다.
11-8. MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화
상기 실시예 6과 동일하게, 마우스 등 피부에서 UVB 조사에 의한 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화에 미치는 영향을 확인하였다.
도 20에서 보듯이, 실험군 G2에서 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화가 증가하였으나, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화가 감소하였다.
<실시예 12> 비파나무 잎 추출물의 최적 추출조건 도출
비파나무 잎 추출물의 Elastase 저해 활성을 최대로 나타내는 최적 추출조건을 도출하기 위해 반응표면분석법을 이용하였다. 반응표면분석법의 모델은 3-level-3-factor 실험계획인 Box-Behnken Design(BBD)를 사용하였다. 표 3에 주요 변수를 나타내었다. 에탄올 농도(0, 50 및 100%)를 X1, 추출 시간(2, 3 및 4h)을 X2, 추출온도(60, 75, 90°C)를 X3로 설정하였다. 상기 세 가지 추출 요소를 각각 +1, 0 및 -1의 3 단계로 부호화 하였으며, BBD에 따라 표 4와 같이 15구로 설정하여 추출실험을 실시하였다. 또한 상기의 독립변수에 영향을 받는 종속변수는 Elastase 억제 활성(%)으로 하여 3회 반복 측정하여 그 평균값을 회귀분석에 사용하였다.
Figure PCTKR2023014460-appb-img-000002
비파나무 잎을 건조시킨 후 분쇄하였다. 비파나무 잎 분말 15g을 하기 표 4에 나열된 추출조건(에탄올 농도, 추출 시간, 추출 온도)에 따라 150 mL의 용매로 추출하여 얻어진 종속변수의 결과를 표 4에 나타내었다. 상기 결과를 이용한 Box-Behnken 설계모델을 통해 각 종속변수와 독립변수의 관계를 보여주는 회귀방정식과 결정계수 R2, p-value, F-value 값을 표 5에 나타내었다.
Figure PCTKR2023014460-appb-img-000003
Figure PCTKR2023014460-appb-img-000004
하기 표 6과 같이 분산분석(Analysis of variance, ANOVA)을 수행하여 반응모델의 적합성 뿐만 아니라 각 항의 계수와 유의성에 대해 확인하였다.
Figure PCTKR2023014460-appb-img-000005
비파나무 잎의 최적 추출조건을 도출하기 위해, 상기 회귀방정식을 통해 각 독립변수의 최적화된 값을 결정하고 각 변수의 상호작용에 따라 반응표면 등고선을 형성하였다. 3차원 반응 표면곡선에 회귀방정식의 그래픽 표현으로 나타내었으며, 각각의 등고선 곡선은 세 가지의 독립변수 중 한 가지는 고정시키고 나머지 두 변수 조합의 무한 값으로 나타내었다(도 21). 회귀방정식 및 반응표면 등고선의 분석을 통하여 가장 높은 Elastase 억제 활성을 나타내는 비파나무 잎의 최적 추출 조건은 에탄올 농도(X1) 97.8%, 추출 시간(X2) 2.5h, 추출온도(X3) 62.7℃로 도출되었다. 이와 같은 추출 조건으로 예측되는 Elastase 억제 활성은 88.35%이며, 실제 실험 결과 Elastase 억제 활성은 예측값과 유사한 88.93%으로 나타났다.
Figure PCTKR2023014460-appb-img-000006
<실시예 13> 비파나무 잎 추출물의 오토파지 관련 단백질 발현
상기 실시예 6과 동일하게, 진피섬유아세포(HDF)에서 UVB 조사에 의한 오토파지(autophagy) 관련 단백질 발현을 분석하였다.
도 22a에서 보듯이, 진피섬유아세포(HDF)에서 UVB(40 mJ/cm2) 조사에 따라 p-mTOR 및 p62 단백질의 발현이 증가하였고 Beclin1, ATG5, LC3 단백질의 발현이 감소하였으나, 본 발명의 비파나무 잎 추출물 처리(low:1 ㎍/mL, high: 10 ㎍/mL)에 따라 p-mTOR 및 p62 단백질의 발현은 감소하고 Beclin1, ATG5, LC3 단백질의 발현은 증가하였다.
또한, 마우스 모델에서 비파나무 잎 추출물을 처리한 경우 오토파지 관련 단백질 발현 결과를 도 22b에 나타내었다. 본 발명의 비파나무 잎 추출물을 도포(UV+T)하거나 경구 투여한(UV+O) 경우, 처리하지 않은 실험군(NT)에 비해 Beclin1, ATG5, LC3 단백질의 발현이 증가하였다. UVB(40 mJ/cm2) 단독 처리군(UV)은 p-mTOR 및 p62 단백질의 발현이 증가하였고 Beclin1, ATG5, LC3 단백질의 발현이 감소하였으나, 본 발명의 비파나무 잎 추출물을 도포(UV+T)하거나 경구 투여한(UV+O) 경우 p-mTOR 및 p62 단백질의 발현은 감소하고 Beclin1, ATG5, LC3 단백질의 발현은 증가하였다.
즉, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 초기 오토파지의 단계를 상향조절하며, UVB 자외선 등의 스트레스 상황에서 오토파지를 조절하는 것을 의미한다.

Claims (21)

  1. 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 비파나무 잎 추출물은,
    95~100%(v/v) 에탄올을 추출용매로 하여, 60~65℃에서 2~3시간 추출한 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 비파나무 잎 추출물은,
    엘라스타아제(elastase) 활성을 억제하는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 비파나무 잎 추출물은,
    자외선에 의한 피부 세포 손상을 보호하는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 비파나무 잎 추출물은,
    자외선에 의한 활성산소종 생성을 억제하는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 비파나무 잎 추출물은,
    자외선에 의해 발현 증가된 MMP-1의 발현을 감소시키는 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 비파나무 잎 추출물은,
    자외선에 의해 발현 감소된 TIMP-1, SIRT1, COL1A1, ELN 또는 HAS2 중 어느 하나 이상을 발현 증가시키는 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 비파나무 잎 추출물은,
    자외선에 의해 증가된 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화를 감소시키는 것인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 비파나무 잎 추출물은,
    자외선에 의해 유발되는 주름, 홍반, 각질화 증상을 개선하는 것인, 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 비파나무 잎 추출물은,
    자외선에 의해 증가된 피부 두께를 감소시키는 것인, 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 비파나무 잎 추출물은,
    자외선에 의해 감소한 진피 내 콜라겐 섬유 밀도를 증가시키는 것인, 조성물.
  12. 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 비파나무 잎 추출물은,
    자외선에 의해 증가한 경피수분손실량을 감소시키는 것인, 조성물.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 비파나무 잎 추출물은,
    자외선에 의해 감소한 Cldn-1, FLG 또는 LASS3 중 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  15. 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 보습용 화장료 조성물.
  16. 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 자극 완화용 화장료 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 비파나무 잎 추출물은,
    자외선에 의해 증가한 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β 중 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 감소하는 것인, 조성물.
  18. 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 건강기능식품 조성물.
  19. 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 강화용 건강기능식품 조성물.
  20. 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 보습용 건강기능식품 조성물.
  21. 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 자극 완화용 건강기능식품 조성물.
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