WO2017213310A1 - 디프테로카푸스 인트리카투스 추출물을 이용한 피부 주름 개선용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비임상 동물실험을 통하여 피부 주름과 피부 홍반을 개선하고, 피부 보습 활성을 가지는 것으로 확인된 디프테로카푸스 인트리카투스 추출물을 이용한 피부 주름 개선용 조성물을 개시한다.
Description
본 발명은 디프테로카푸스 인트리카투스 추출물을 이용한 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.
피부는 인체의 약 16%를 차지하고 있으며, 외부환경과 직접적으로 접해 있어 온도, 습도 및 자외선 등과 같은 외부 유해인자들로부터 인체를 보호하는 중요한 역할을 하고 있다. 피부는 각질 아래 표피, 진피, 피하조직으로 구성되어 있다. 표피는 주로 케라틴으로 되어 있는 케라티노사이트(keratinocytes), 멜라닌을 생성하고 분비하는 멜라닌 세포(melanocytes), 랑게르한스 세포(langerhans cells) 등의 면역세포 그리고 지각관련세포 (Merkel's copuscles)로 구성되는 얇은 보호층으로 외부자극과 병원균의 침입을 방지하고 체온조절, 수분과 지질 성분 유지 작용을 한다. 진피는 표피 아래에 있는 결합조직으로 대부분 세포외 간질(extracellular matrix)이라 불리는 거대 분자의 망상 구조로 구성되어 있다. 이 세포외 간질은 섬유아세포에서 만들어지며, 콜라겐, 엘라스틴 등의 섬유상 단백질과 히알루론산 등의 다당체로 이루어져 있다.
나이가 들어감에 따라 각종 오염물질, 강한 자외선, 스트레스 및 영양결핍 등으로 인해 피부 세포들이 손상을 입게 되고, 세포 증식이 원활하게 되지 않아 피부에 주름, 탄력 손실 및 각질화 등이 발생한다(Gilchrest B.A., J. Am. Acad. Dermatol, 21:610, 1989). 이러한 피부의 노화는 내인성 노화와 외인성 노화로 분류된다. 내인성 노화는 나이가 들어 피부의 생리적 기능이 저하되어 자연적으로 나타나는 노화 현상으로 탄력이 감소하고 피부 결이 거칠어지고 깊은 주름이 생기며 색소가 침착되는 특징이 있다. 외인성 노화는 자외선, reactive oxygen 및 스트레스 등의 외부 요인에 의해 발생하는 노화를 말한다. 상기의 다양한 요인에 의하여 피부노화 현상이 진행되면 각질형성세포 및 섬유아세포의 분열 감소, 히알루론산 감소, 콜라겐 합성 감소, MMP 생성의 증가, 멜라닌생성의 신호 전달 증가 등이 발생하여 보습 저하, 주름 생성 및 피부 탄력 감소 등의 현상이 나타난다.
콜라겐은 피부 수분을 유지하고 피부 유연성과 탄력을 유지하는 데 가장 중요한 단백질로 진피층의 90%를 차지하고 있으며(J Am Acad Dermatol, 17(4):610-613, 2001) 피부의 강도와 장력을 부여하여 외부의 자극으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다. 콜라겐은 섬유아세포에 의해 합성되며 콜라겐나아제(collagenase)와 엘라스티나아제(elastinase)에 의해 분해된다. 나이가 들거나 자외선 등에 노출되면 섬유아세포의 작용과 세포 수가 감소하여 콜라겐의 합성량이 줄어들고 콜라겐을 분해하는 콜라겐나아제(collagenase)와 엘라스티나아제(elastinase)의 작용이 증가하여 피부 수분이 손실되고 피부 유연성과 탄력이 감소하게 된다.
외인성 노화를 일으키는 가장 중요한 요인으로 자외선이 있으며, 자외선에 의한 외인성 노화현상을 광노화라고 한다(Lee JN et al., J Soc Cosmet Scientists Korea 32:227-231, 2006). 피부가 자외선에 지속적으로 노출되면 피부에 유해한 대사과정이 일어나게 되며 활성산소가 증가한다(Rittie L and Fisher GJ. Ageing Res. Rev. 1:705-720. 2002.). 활성산소는 MMP9, MMP2 등 MMPs(기질분해 효소, matrix metalloproteinase) 등 다양한 종류의 콜라게나제의 발현 및 활성증가를 유도하여 불규칙적인 콜라겐이 형성되는데, 이로 인해 피부 표면 이 거칠고 비대해 지며 깊은 주름이 생기게 되는 것으로 알려져 있다(Fisher GJ et al., J Invest Dermatol 117:219-226, 2001; Jean LB. Am J Med 8:S99-S103, 1995; Laure RG and Fisher J. Ageing Res Rev 1:705-720, 2002).
현재 피부 주름형성을 억제하는 물질로는 레티노산과 레티놀(Simon C et al., J Invest Dermatol 98:248-260, 1992; Elaine S et al., J Invest Dermatol 96:975-978, 1991)의 효과가 입증되어 있고, dehydroepiandrosterone(Shin MH et al., J Invest Dermatol 124:315-323, 2005), 인삼에서 추출한 ginsenoside Rg3(Kim SW et al., J Soc Cosmet Scientists Korea 30:221-225, 2004), 플라보노이드(Francesco B et al., Int J Pharm 145:87-94, 1996), 팥배나무 추출물(한국 등록특허 제101008833호), 연교 추출물(한국 등록특허 제100825450호) 등 다양한 물질의 주름 개선 및 피부 보호효과가 탐색되었다. 그러나 일부 물질들은 안정성이 낮거나 피부 자극을 일으켜 안전성에 문제가 있기 때문에 사용에 제한이 있다. 이에 따라 우수한 주름개선 활성 효과와 안전성 및 안정성을 지닌 물질의 탐색이 지속되고 있다.
본 발명은 디프테로카푸스 인트리카투스(Dipterocarpus
intricatus) 추출물의 주름 개선 활성 등을 개시한다.
본 발명은 디프테로카푸스 인트리카투스 추출물을 이용한 주름 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이 비임상 동물실험을 통하여, UV 조사에 의하여 유발되는 피부 홍반, 멜라닌 생성, 피부 주름, 피부 보습 등이 디프테로카푸스 인트리카투스 추출물의 처리에 의하여 개선·억제되고, 피부 주름 생성과 관련된 인자들 MMP9 및 MMP2의 발현이 억제되며, 콜라겐의 생합성을 촉진하여 피부 주름 생성을 억제하는 ERK(extracellular signal-regulated kinase)가 활성화됨을 확인함으로써 완성된 것이다. 여기서 디프테로카푸스 인트리카투스은 태국, 캄보디아, 라오스, 베트남 등에서 자생하는 Dipterocarpaceae 과에 속하는 식물이다.
전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 일 측면에 있어서, 디프테로카푸스 인트리카투스 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 조성물에 관한 것이고, 다른 측면에 있어서는 디프테로카푸스 인트리카투스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 조성물에 관한 것이며, 또 다른 측면에 있어서는 디프테로카푸스 인트리카투스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 홍반 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서, "디프테로카푸스 인트리카투스 추출물"이란 추출 대상인 디프테로카푸스 인트리카투스 잎, 줄기, 지상부, 뿌리, 근경, 지하부 또는 이들의 혼합물을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물, 더 바람직하게는 추출용매로서 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다.
또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또 본 명세서에서, "개선"이란 피부 주름, 피부 홍반 등의 증상의 완화, 그러한 증상의 발현 억제, 발현 지연, 발현 제거를 포함하는 의미이다.
본 발명의 피부 주름 개선용 조성물, 피부 보습용 조성물 및 피부 홍반 개선용 조성물(이하 "본 발명의 조성물")은 유효성분 이외에, 피부 관련 활성을 보강·추가하기 위하여 당업계에 공지된 피부 미백 성분, 피부 주름 개선 성분, 자외선 보호 성분, 피부 보습 성분 등을 포함하여 제조될 수 있다. 구체적으로 피부 미백 성분으로서는 알부틴, 나이아신아마이드, 아스코빌글루코사이드, 알파-비사보롤, 유용성 감초 추출물(Oil Soluble Licorice(Glycyrrhiza) Extract) 등을 들 수 있으며, 또 피부 주름 개선 성분으로서는 레티놀, 레티닐팔미테이트, 아데노신, 폴리에톡실레이티드아마이드 등을 들 수 있고, 자외선 보호 성분으로서는 드로메트리졸, 드로메트리졸트리실록산, 디갈로일트리올리에이트, 디메치코디에칠벤잘말로네이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 소나무 껍질 추출물 등의 복합물, 포스파티딜세린, 핑거루트 추출 분말, 홍삼과 산수유 등의 복합 추출물 등을 들 수 있다. 또 보습 성분으로서는 AP 콜라겐 효소 분해 펩타이드, Collactive 콜라겐 펩타이드, N-아세틸글루코사민, 곤약 감자 추출물, 민들레 등의 복합 추출물, 쌀겨 추출물, 옥수수 배아 추출물, 저분자 콜라겐 펩타이드, 지초 추출 분말, 포스파티딜세린, 히알루론산 등을 들 수 있다. 여타의 피부 미백 성분, 주름 개선 성분, 자외선 보호 성분, 피부 보습 성분들에 대해서는 화장품법에 따른 기능성화장품공전(식약처고시 "기능성화장품 기준 및 시험방법"), 건강기능식품에관한법률의 건강기능식품공전(식약처고시 "건강기능식품 기준 및 규격)을 참조할 수 있다. 이러한 성분들은 본 발명의 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물에서 그 유효성분은 그것이 주름 개선 활성, 피부 보습 활성, 피부 홍반 개선 활성 등을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 20.0 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 주름 개선 효과, 피부 보습 효과, 피부 홍반 개선 효과 등을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 화장료 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 파악될 경우에도 그 화장료 조성물은 그 용도상, 법률상 임의의 제품 구분을 띨 수 있으며, 구체적으로 피부 미백 등의 용도를 가진 기능성 화장품, 비기능성 일반 화장품 등일 수 있다. 제품 형태에 있어서도 임의의 제품 형태를 띨 수 있는데, 구체적으로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 구체적인 제품 형태에 있어서는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형 등일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부 주름 개선 활성 등을 나타내는 그 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에 통상적으로 행하여지는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 건강기능식품에관한법률에 따른 건강기능식품이거나, 식품위생법의 식품공전(식약처 고시, 식품의 기준 및 규격)상 각 식품유형에 따른 두유류, 발효음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해되는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 복용되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품위생법에 따른 식품첨가물공전(식약처 고시, 식품첨가물 기준 및 규격)에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 화학적 합성품, 천연 첨가물, 혼합 제제류로 구분하여 한정적으로 규정되어 있다.
이들 식품첨가물은 기능적 측면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분될 수 있다.
감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수도 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.
그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 약제학적 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약제학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.
약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 디프테로카푸스 인트리카투스 추출물을 이용한 피부 주름 개선용 조성물을 제공할 수 있으며, 또한 디프테로카푸스 인트리카투스 추출물을 이용한 피부 보습용 조성물과 피부 홍반 개선용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 피부 주름 개선용 조성물 등은 식품, 화장품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.
도 1은 피부 홍반 지수를 측정한 결과이다.
도 2는 피부 멜라닌 지수를 측정한 결과이다.
도 3은 경피수분손실량을 측정한 결과이다.
도 4는 피부 수분 함량을 측정한 결과이다.
도 5는 피부 주름의 형태학적 관찰 결과와 주름 지수를 측정한 결과이다.
도 6은 MMP9 및 MMP2의 Zymography 결과이다.
도 7은 ERK 및 p38에 대한 Western blot 결과이다.
도 8은 MMP9 및 MMP2의 RT-PCR 결과 및 MMP2에 대한 Western blot 결과이다.
도 9, 10 및 11은 조직염색(H&E, Masson's trichrome staining 및 Fontana-Masson staining) 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
시료의 제조
실험에 사용할 시료는 아래의 표 1과 같이 디프테로카푸스 인트리카투스(Dipterocarpus
intricatus) 추출물이 1.0 중량%, 3.0 중량% 및 9.0 중량%가 포함된 크림 제형으로 제조하였다. 또 알부틴(arbutin) 2 중량% 과 레티노산(retinoic acid) 0.02 중량%가 함유된 크림 제형의 시료를 제조하여 양성대조군으로 사용하였다. 크림 제형은 수상 성분들을 80℃에서 용해하고 유상 성분들을 80℃에서 용해한 후 이 둘을 교반하여 유화하고 증점제를 첨가한 후에 탈포하여 제조하였다.
디프테로카푸스 인트리카투스 추출물은 건조된 디프테로카푸스 인트리카투스(Dipterocarpus
intricatus) 잎 100 g에 50% 에탄올 1 L를 가하여 상온에서 24 시간 1회 침지추출 후 여과지로 여과하고 그 여액을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말상으로 직접 제조하여 사용하였고, 화장품공전(기능성화장품 기준 및 방법)상의 피부 미백제인 알부틴과 화장품공전상의 피부 주름 개선제인 레티놀(retinol)의 활성 형태인 레티노산은 시중에서 구입하여 사용하였다.
| 분류 | 성분 | 대조군 시료 | 양성대조군(PC1) 시료 1 | 양성대조군(PC2) 시료 2 | 실험군 시료 |
| 수상 | 정제수 | to 100 | to 100 | to 100 | to 100 |
| 글리세린 | 6.0 | 6.0 | 6.0 | 6.0 | |
| 프로필렌글리콜 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | |
| 잔탄검 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | |
| 트리에탄올아민 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |
| 추출물 | - | - | 1.0, 3.0, or 9.0 | ||
| 알부틴 | - | 2.0 | - | ||
| 레티노산 | - | - | 0.02% | - | |
| 유상 | 왁스 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
| 유동파라핀 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | |
| 스쿠알란 | 8.0 | 8.0 | 8.0 | 8.0 | |
| 세틸알콜 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | |
| 글리세릴모노스테아레이트 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | |
| 디메치콘 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |
| 초산 토코페롤 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | |
| 증점제 | 카보머 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| * 추출물: 디프테로카푸스 인트리카투스 추출물 | |||||
<실험예>
비임상시험을 통한 피부 주름 개선 활성 실험 등
1.
실험 방법
<1> 실험동물 및 그룹 설정
실험동물은 5주령 HRM-2 hairless mouse(Male, 체중 22±5g)를 분양받아 1주일간 사육실에서 순화시킨 후 실험에 사용하였으며, 아래의 표 2와 같이 그룹을 설정하여 실험을 수행하였다.
- 정상군(normal group, N): 아무런 처리를 하지 않은 군
- 대조군(vehicle control group, VC): 자외선 조사 + 대조군 시료 도포군
- 양성대조군 1(positive control group, PC1): 자외선 조사 + 양성대조군 1 시료 도포군
- 양성대조군 2(positive control group, PC2): 자외선 조사 + 양성대조군 2 시료 도포군
- 실험군(experimental group, E): 자외선 조사 + 실험군 시료 도포군
<2> 동물의 사육 및 처치
실험동물은 cage에 각 2~3마리씩 넣고 22℃의 온도와 50%의 습도에서 12시간 간격으로 light-dark cycle을 유지하면서 사육하였고, 사료와 물은 자율급식으로 무제한 공급하였다.
모든 동물실험은 (재)경기과학기술진흥원 동물실험윤리위원회의 동물실험표준작업지침서(Standard Operation Procedures, SOP)에 따라 수행하였다 (승인번호: 2015-12-0001).
<3> UV 조사 및 시료 도포
실험동물의 등 부위를 사각형 모양의 구멍(3×3cm2)이 뚫린 거즈로 덮은 후, UV는 처음 1주 동안에는 1 MED로 조사하고 점차 1.5 MED(2주차), 2 MED(3주차), 3 MED(4주차)까지 조사량을 늘려 피부 노화를 유발하였다. 1 MED(Minimal Erythema Dose)은 홍반을 일으킬 수 있는 최소한의 UV 조사량이다.
UV 조사는 2일 간격으로 주 3회 조사하였으며, 설정된 UV조사 후 30분 정도 경과 뒤, 시료를 마우스의 등 표면에 골고루 도포하였다. 시료는 1일 2회(오전/오후), 주 6일, 4주 동안 도포하였다. 시료 도포는 1Cm2당 2mg(2㎕)으로 9cm2당 18mg (18㎕)을 도포하였다.
<4> 피부 홍반지수 측정
피부 홍반지수(erythema index, 아래 문헌 [1], [2] 및 [3] 참조)의 변화는 DSM II colormeter(Cortex technology)를 이용하여 측정하였다. 측정 시 실내 온도는 20~22℃, 습도 40~60%로 유지하였고, 홍반지수를 실험기간 동안 도포일로부터 주 1회 총 4회 측정하였다.
<5> 피부 멜라닌 양 측정
피부 멜라닌 양의 변화는 DSM II colormeter(Cortex technology)를 멜라닌 지수(melainin index, 아래 문헌 [1], [2] 및 [3] 참조)이용하여 측정하였다. 측정 시 실내 온도는 20~22℃, 습도 40~60%로 유지하였고, 멜라닌 양도 실험기간 동안 도포일로부터 주 1회 총 4회 측정하였다.
<6> 경피수분손실량 (Transepidermal Water Loss, TEWL)측정
경피수분손실량(TEWL)은 조사 부위에 표피피부기능측정시스템인 DermaLab usb(Cortex technology)에 TEWL probe를 연결하여 센서를 표피 면에 접지 후 표피의 수분손실량을 측정하였다. 측정 시 실내 온도는 20~22℃, 습도 40~60%로 유지하였고, 표피의 수분손실량도 실험기간 동안 주 1회 총 4회 측정하였다.
<7> 수분 함량 측정
수분 함량은 DermaLab usb(Cortex technology)에 Moisture pin probe를 연결하여 측정하였다. 측정 시 실내 온도는 20~22℃, 습도 40~60%로 유지하였고, 수분 함량도 실험기간 동안 주 1회 총 4회 측정하였다.
<8> 피부 주름의 형태학적 관찰
피부 주름 양상은 4주째 도포가 끝나면, 실험동물을 가볍게 마취한 뒤, 등 부위를 실리콘 폴리머 (SILFLO)를 도포하여 굳도록 방치하여 모사판을 떠서 주름 지표를 분석하였다(아래 문헌 [1], [2], [3] 및 [4] 참조).
<9> Zymography(MMPs enzyme 활성)
피부 조직을 non-denaturing loading buffer에 섞어 37℃에서 30분간 incubation하고 0.1%의 젤라틴을 기질로 함유하고 있는 10% SDS-PAGE를 시행하였다. 전기영동 후, 젤은 2.5% Triton X-100 용액으로 실온에서 1시간 동안 세척하여 SDS를 제거하고 developing buffer(50 mM Tris (pH 7.5), 10 mM CaCl2, and 150 mM NaCl)로 37℃에서 15~18시간 반응시켰다. 반응이 끝난 젤은 0.5% Coomassie brilliant blue가 포함된 염색 용액(30% methanol-10% acetic acid)으로 2시간 동안 염색하고, 다시 탈색 용액(30% methanol-10% acetic acid)으로 탈색하였다.
<9> Western blot
각각의 피부 조직 sample을 액체 질소를 이용하여 균질화고 lysis solution(PRO-PREP, Intron)을 600㎕씩 첨가하였다. 13,000rpm(4℃)에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 tube에 저장하였다. 추출된 단백질은 Bradford assay를 이용하여 정량한 후, 40㎍의 샘플들을 10% SDS-PAGE gel을 이용하여 전기영동 한 후, nitrocellulose membrane에 transfer 하였다. Membrane은 5% BSA가 포함된 TBS-T(0.1% Tween-20/1×TBS)로 1시간 blocking 하고, 각각의 항체(ERK, p-ERK, p-p38, p38, MMP-2)를 4℃에서 15시간 이상 반응시켰다. Membrane을 TBS-T로 세척 후 5분 간격으로 3번, horseradish-peroxidase labeled 2차 항체로 1시간 반응시키고 TBS-T로 세척 과정 7분 간격으로 4번 이상을 거친 뒤, Enhanced chemiluminoscent(ECL, Thermo scientific)를 1분간 처리하여 ERK, p-ERK, p-p38, p38, MMP2 단백질의 발현 및 인산화 정도를 비교하여 평가하였다.
<10> RT-PCR (Reverse transcription and polymerase chain reaction)
Total RNA는 TRIzol(Invitrogen)을 이용하여 추출하였다. 역전사는 50℃에서 50분간 2㎍ RNA와 200 unit Superscript RT(Invitrogen)를 이용하여 20㎕로 하여 실시하였다. PCR 증폭은 1㎕의 RT 산물과 아래 표 3의 primer(10 pmol), Accupower pfu PCR Premix(Bioneer)를 이용하였다. 95℃에서 5분간 초기 반응 후에, 95℃ 30초, 55℃ 45초 및 72℃ 1분로 구성된 27 증폭 cycles을 실시하였으며 72℃에서 10분간 최종 extension을 실시하였다. 반응 산물들은 ethidium bromide를 함유한 2% agarose gel을 이용하여 1×TAE buffer에 전기영동을 실시하였다.
| MMP9 | F: (서열번호 1)CGC TCA TGT ACC CGC TGT AT |
| R: (서열번호 2)TGT CTG CCG GAC TCA AAG AC | |
| MMP2 | F: (서열번호 3)ACA TCT TTG CAG GAG ACA AG |
| R: (서열번호 4)AAG CCA CCC TCT TAA ATC TG | |
| GAPDH | F: (서열번호 5)CAG GTA AAC TCA GGA GAG TG |
| R: (서열번호 6)GTA GAC TCC ACG ACA TAC TC |
<11> 조직염색 (H&E, Fontana-Masson, Masson's trichrome staining)
실험군 및 대조군의 조사 및 도포 부위를 절제 후 10% 포르말린 용액에 넣어 24시간 고정시켰다. 고정된 조직은 Tissue processing을 수행하고 포매를 하여 파라핀 블럭으로 제작하였다. 그 후, microtome을 이용하여 조직을 0.4mm 두께로 section 후 slide glass위에 부착시켜 관찰하였다. Slide상의 조직은 알콜과 증류수를 이용하여 단계별로 수분을 제거하고 H&E(hematoxylin-eosin), Masson's trichrome 및 Fontana-Masson 염색을 실시하여 표피층, 교원섬유 및 멜라닌의 분포를 현미경으로 관찰하였다.
<12> 통계처리
실험 결과의 통계학적 유의성은 Studentt-test로 분석하였으며, p-value가 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다(* p<0.05; ** p<0.01).
<13> 참고문헌
1. J ENVIRON TOXICOL 24(4) : 351-357 (2009)
2. Korean J Microscopy 41(2) : 129-137 (2011)
3. Lab Anim Res 26(1) : 37-45 (2010)
4. Aging Res Rev 1 : 705-720 (2002)
2.
실험 결과
<1> 피부 홍반지수 측정
피부 홍반 지수를 측정한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하여 보면, 실험 4주째 모든 실험군에서 대조군(VC)에 비해 유의성 있게 피부 홍반이 개선되었음을 알 수 있다. 또 모든 실험군에서 양성대조군 1(Arbutin 2%)과 양성대조군 2(RA 0.02%)보다 피부 홍반 개선 효과가 높았다.
<2> 피부 멜라닌 양 측정
피부 멜라닌 지수를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하여 보면, 실험 4주째 모든 실험군에서 대조군(VC)에 비해 유의성 있게 멜라닌을 감소시킴을 알 수 있다. 양성대조군 2(RA 0.02%)의 경우는 유의성 있는 멜라닌 억제 효과가 나타났으나, 양성대조군 1(Arbutin 2%)의 경우 유의성 있는 멜라닌 억제 효과가 나타나지 않았다.
<3> 경피수분손실량 (Transepidermal Water Loss, TEWL)측정
경피수분손실양을 측정한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하여 보면, 실험 4주째 모든 실험군과 모든 양성대조군에서 대조군(VC)에 비해 유의성 있게 경피수분손실량이 감소함을 확인할 수 있다.
<4> 수분 함량 측정
수분 함량을 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하여 보면, 실험 4주째 수분 함량이 모든 실험군과 모든 양성대조군에서 대조군(VC)에 비해 유의성 있게 높음을 알 수 있다.
<5> 피부 주름의 형태학적 관찰 및 주름 지표 분석
피부 주름의 형태학적 관찰 결과와 주름 지표(주름 면적, 거칠기 및 주름 깊이)를 분석한 결과를 도 5에 나타내었다.
실험 4주째 주름 지표가 3%, 9% 처리 실험군에서 대조군(VC)에 비해 감소함을 확인할 수 있다. 그 효과는 양성대조군 1 및 2보다 우수하였다.
<6> Zymography(MMPs enzyme 활성)
Zymography를 통해 MMP9 및 MMP2의 활성을 측정한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6을 참조하여 보면, MMP9 및 MMP2의 활성이 실험군에서 대조군(VC)에 비해 감소함을 확인할 수 있다.
<7> ERK 및 p38에 대한 Western blot
Western blot를 ERK 및 p38의 활성화 정도를 측정한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7를 참조하여 보면, 실험군에서 대조군(VC)에 비해 멜라닌 생합성을 억제하고 콜라겐의 생성을 촉진하는 ERK가 활성화되고 MMP9 및 MMP2의 발현을 유도하는 p38의 활성화가 억제됨을 알 수 있다.
<8> MMP9 및 MMP2에 대한 RT-PCR 및 MMP2에 대한 Western blot
MMP9 및 MMP2에 대한 RT-PCR 결과(상)와 MMP2에 대한 western blot 결과(하)를 도 8에 나타내었다.
MMP9 및 MMP2의 발현이 모든 실험군에서 대조군(VC)에 비해 뚜렷하게 억제됨을 확인할 수 있다.
<9> 조직염색 (H&E,
Masson's
trichrome
staining 및 Fontana-
Masson
staining)
결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.
H&E 염색 결과, 대조군(VC)에서 표피의 두께가 유의적으로 증가함을 확인하였으며, 모든 실험군에서 피부 표피의 두께가 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또 Masson's trichrome 염색을 통해 교원질의 양과 형태를 분석한 결과, 대조군(VC)에서 교원섬유가 파괴되어 배열이 불규칙적이고 양도 많이 감소된 것을 확인하였으며, 실험군에서 상대적으로 교원섬유가 조밀하고 규칙적으로 나타나는 것을 관찰하였다. 또 멜라닌 색소에 관련된 Fontana-Masson 염색을 통해 멜라닌 생성을 분석한 결과, 대조군(VC)에서 증가된 멜라닌 색소가 실험군에서 현저하게 감소되는 것을 관찰하였다.
Claims (9)
- 디프테로카푸스 인트리카투스 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 디프테로카푸스 인트리카투스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용조성물.
- 제5항에 있어서,상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제5항 또는 제6항에 있어서,상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제5항 또는 제6항에 있어서,상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 디프테로카푸스 인트리카투스의 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매에 의한 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 홍반 개선용 화장료 조성물.
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| WIART, CHRISTOPHE: "Medicinal Plants of the Asia-Pacific: Drugs for the future?", 2006, WORLD SCIENTIFIC PUBLISHING CO. PTE. LTD., ISBN: 981-256-341-5, article "B. Order THEALES Lindley 1833", pages: 138 - 142, XP055598715 * |
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