KR20060044298A - 비파엽 추출물을 유효성분으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비파엽 추출물을 유효성분으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 비파엽 추출물은 항산화능을 증가시키고, 세포독성이 없으며, 엘라스타제, 콜라게나제 및 MMP 발현 억제효과가 우수하고, 피부주름개선 효과가 우수하며, 피부 안전성 및 경시적 안정성이 우수함으로, 주름개선용 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

비파엽 추출물을 유효성분으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising extract of Eriobotrya japonica L. for improving wrinkle}

도 1은 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 지표성분인 올레아놀산 및 우르솔산의 액체크로마토그래피/질량분석 스펙트럼을 나타낸 도이다.

도 2는 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 액체크로마토그래피/질량분석 스펙트럼을 나타낸 도이다.

도 3은 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 사람 섬유아세포에 대한 독성을 나타낸 도이다.

도 4는 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 MMP-1, MMP-2, MMP-9 발현 억제 정도를 전기영동방법으로 나타낸 도이다.

본 발명은 비파엽 추출물을 유효성분으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부 주름 생성과 관련된 주요 기작은 피부가 대기오염, 자외선 노출, 스트레스 또는 질병 등의 유해환경으로부터 산화적 스트레스(oxidative stress)에 계속적으로 노출되어 체내의 라디칼이 증가되고, 진피의 결합조직인 콜라겐(Collagen), 엘라스틴(Elastin), 히아루론산(Hyaluronic aicd) 등을 파괴하여 피부의 일정 부위 침하 현상(주름)을 일으킬 수 있는 것으로 설명된다. 또한 이러한 기작들은 세포막의 지질 부분을 산화시켜 세포의 파괴 현상을 일으켜 피부염, 여드름 또는 피부암 등의 질병을 유발할 수 있다. 이외에도 라디칼은 멜라닌 형성과정에 관여하여 기미, 주근깨 및 주름생성의 원인이 되기도 한다.

이러한 피부 주름 개선을 위해서 기존에는 아스코르브산, α-토코페롤, 레티놀 및 그 유도체, SOD 등이 자유 라디칼 소거 기능 또는 피부 주름 개선을 위한 물질로 화장료나 의약품에 배합되어 주름 및 기타 피부 질환을 방지하기 위하여 이용되어 왔으나, 이들은 가격이 고가일 뿐만 아니라 화학적 안정성이 좋지 못하여 실질적인 효과를 기대하기가 어려운 문제점이 있었다. 이러한 이유로 보다 안전하면서 피부 주름 개선에 효과가 높은 물질을 개발하는 것이 의약품이나 식품 분야 뿐 만 아니라 화장품 산업 분야에서도 중요한 과제로 대두되어 많은 연구가 진행되고 있다.

특히, 피부 주름 개선을 위한 목적으로 레티노이드 (레티놀 및 그 유도체)를 이용한 사례는 미국 특허공보 제 4603146호, 제 4877805호 등에 개시되어 있다.

피부 주름 개선 화장료에 사용되는 레티노이드에는 레티놀 (retinol), 레티 날 (retinal), 레틴산 (retinoic acid), 레티닐 아세테이트 (retinyl acetate), 레티닐 리놀리에이트 (retinyl linoleate) 및 레티닐 팔미테이트 (retinyl palmitate) 등이 있다. 이들 중 레티놀은 인체에 자연적으로 존재하는 내인성 화합물로서 상피 조직의 분화와 성장에 필수적인 물질이며, 레틴산 등의 레티노이드에 비해 매우 높은 안전성을 가지고 있어 피부 주름 개선 화장료의 원료로서 매우 적합하다고 할 수 있다.

이러한 레티노이드의 피부 주름 개선에 효능, 효과가 있는 것으로 피부 임상을 통하여 검증되었지만 제품에 처방될 경우 변색, 변취 현상이 발생하고, 소량 사용시에도 피부 자극이 유발되는 부작용이 있으며, 경시적인 변화에 의한 역가 감소와 이에 따른 효과 감소 등이 큰 문제점으로 인식되고 있으며, 이를 보완하기 위한 기술 개발이 미국특허 제 4,826,828호, 제 3,906,108호, 제 4,247,547호 및 제 4,720,353호, 유럽특허 0440,398BI, 유럽특허 1568106A1 등을 통하여 보고된 바 있으며 현재까지도 지속적으로 연구되고 있다.

또한 이러한 레티노이드의 문제점들을 극복하기 위한 또 다른 대안으로 피부 주름 개선에 효능, 효과를 나타내는 신규 화합물의 탐색과 이를 이용한 산업화가 현재 진행 중이다.

이러한 기술들 중 신규 화합물 탐색은 약용 식물 자원을 활용한 사례가 주를 이루고 있으며, 이를 이용한 피부 주름 개선을 위한 화장료로는 피부노화억제효과를 갖는 산수유 추출물 함유하는 화장료 조성물 및 그의 제조방법(대한민국 특허출원번호 제 10-2002-12877호), 지유 추출물을 포함하는 항산화(자유라디칼 소거) 화 장료(대한민국 특허출원번호 제 10-2000-76358호), 빈랑자 추출물을 함유하는 자유 라디칼 소거 화장료 조성물(대한민국 특허출원번호 제 10-1999-56924호) 등이 있다. 이러한 천연물을 이용한 피부 주름 개선용 화장료는 천연물 유래 생리 활성 물질들을 이용한 것으로서 레티노이드에 비하여 피부 부작용이 적고, 경시적인 화학적 변화가 적어 화장료의 안전성 및 안정성이 우수하다는 장점이 있다. 따라서, 피부 주름 개선용 화장료로 약용 식물 자원들에 대한 연구가 지속되고 있다.

한편, 비파(Eriobotrya japonica)는 장미과(Rosaceae)에 속하는 상록교목으로서 한방에서는 그것의 열매, 뿌리, 줄기껍질 및 잎을 약용으로 사용한다. 특히, 비파엽은 폐를 맑게하고 위를 조화시키며 기를 강하시키고 담을 삭이는 효능이 있다고 알려져 있다(중약대사전). 또한, 염증과 관련된 피부질환, 기침, 가래 등에도 효과가 있으며, 혈당강하, 간기능 개선 및 여러 가지 항염증활성 등의 약리활성도 보고되어 있다(Nishioka et al., Biol. Pharm. Bull., 25: 1053-1057, 2002). 비파엽의 성분으로는 우르솔산(ursolic acid), 올레아놀산(oleanolic acid), 마스리닌산(maslinic acid) 및 토멘틱산(tormentic acid)을 비롯한 다양한 트리테르페노이드(triterpenoids) 화합물이 많이 함유되어 있으며 (Taniguchi et al., Phytochemistry, 59: 315-323 (2002)), 이 외에도 세스퀴테르펜 배당체(sesquiterpene glycosides), 플라보노이드 배당체(flavonoid glycosides) 및 여러 가지 폴리페놀 등이 함유되어 있는 것으로 보고되어 있다 (Shimizu et al., Chem. Pharm. Bull., 34: 2614-2617 (1986); de Tommaasi et al., J. Nat. Prod., 55: 1025-1032, 1067-1073 (1992); Kawahara et al., Chem. Pharm. Bull., 50: 1619- 1620 (2002)). 비파 추출물 및 이들 성분의 약리활성에 관한 연구로는 항염증활성, 항산화활성, 혈당강하 및 세포독성 등이 보고되어 있으며 (Shimizu et al., Chem. Pharm. Bull., 34: 2614-2617 (1986); de Tommaasi et al., Planta Med., 57: 414-416 (1991); Jung et al., Arch. Pharm. Res., 22: 213-218 (1999); Taniguchi et al., Phytochemistry, 59: 315-323 (2002)), 혈관형성 억제제 조성물에 관한 연구가 대한민국 특허출원번호 제 10-1996-4026호에 기재되어 있다.

이에, 본 발명자들은 경시적 안정성이 우수하고 피부 부작용이 적으면서 피부 주름 개선을 목적으로 하는 화장료 조성물에 대해 천연 약용 식물 자원에서 탐색하던 중, 비파엽 추출물에서 항산화능이 증가하고, 세포독성이 없으며, 엘라스타제, 콜라게나제 및 MMP 발현 억제효과가 우수하고, 피부주름개선 효과가 우수하며, 피부 안전성 및 경시적 안정성이 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 비파엽 추출물을 유효성분으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 비파엽 추출물을 유효성분으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 비파엽 추출물은, 비파엽을 건조, 분쇄한 후 물, 알콜 또는 알콜수용액으로 가온 추출한 후, 감압 농축하여 암녹색 슬러지 성상의 비파엽 알콜 추출물을 얻는다. 이때, 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 또는 이의 수용액으로부터 선택된 1종 이상을 포함한다. 본 발명에서는 에탄올이 가장 바람직하다. 이때, 비파엽 알콜 추출물에는 올레아놀산 및 우르솔산 등의 지표 성분들이 비파엽 추출물 총중량에 대하여 각각 0.01~3.50 중량% 및 0.01~7.00 중량% 함유된다.

상기 알콜 농축액에 물을 넣어 현탁시키고, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트로 순차 분리한다. 상기 분획중 TLC 상에서 에틸아세테이트층에서 트리테르페노이드 화합물을 확인하고, 에틸아세테이트층을 농축한 후 완전히 건조시켜 암갈색 가루 성상의 비파엽 에틸아세테이트 추출물을 얻는다. 이때, 비파엽 에틸아세테이트 추출물에는 올레아놀산 및 우르솔산 등의 지표 성분들이 비파엽 추출물 총중량에 대하여 각각 0.5~10.0 중량% 및 5.0~20.0 중량% 함유된다.

상기 농축된 에틸아세테이트층을 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올로 이루어진 극성 용매 및 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄, 클로로포름으로 이루어진 무극성 용매 중에서 선택된 2종 이상으로 이루어진 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리한다. 혼합용매로는 헥산과 에틸아세테이트(5:5) 및 디클로로메탄과 에틸아세테이트(8:2)의 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 분획중 트리테르페노이드 성분이 확인되는 분획을 모아 감압 농축한 후, 완전히 건조시켜 엷은 노란색 가루 성상의 비파엽 추출 분획을 얻는다. 이때, 비파엽 추출 분획에는 올레아놀산 및 우르솔산 등의 지표 성분들이 비파엽 추출물 총중량에 대하여 각각 10.0~50.0 중량% 및 20.0~80.0 중량% 함유된다.

본 발명에 따른 비파엽 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물은, 상기 비파엽 추출물을 화장료 조성물 총중량에 대하여 0.001~20.00 중량%, 바람직하게는 0.001~15.00 중량% 함유한다.

본 발명의 비파엽 추출물의 제조 방법은 상기한 추출 방법으로 국한되는 것은 아니며, 비파엽 추출물의 생산 공정 및 설비의 변동, 추출 용매의 선택 등과 같은 요인에 의하여 변화될 수 있다.

상기에서 얻은 농축된 에틸아세테이트층을 액체크로마토그래피/질량분석법을 수행한 결과, 지표성분의 표준품과 동일한 피크 유지 시간(retention-time)을 가지는 지표성분으로 추정되는 트리테르페노이드 화합물인 올레아놀산 및 우르솔산 성분임이 확인되었다(도 1 및 도 2 참조). 또한, 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 지표성분인 올레아놀산 및 우르솔산의 함량은 비파엽을 추출, 분리, 정제할수록 지표성분의 함량이 증가한다.

본 발명에 따른 비파엽 추출물은 항산화능을 증가시키고, 세포독성이 없으며, 엘라스타제, 콜라게나제 및 MMP 발현 억제효과가 우수하고, 피부주름개선 효과가 우수하며, 피부 안전성 및 경시적 안정성이 우수함으로, 주름개선용 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 주름 개선용 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 보통의 성분을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 비파엽 추출물을 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물의 유상 성분 함량은 유화 능력의 보강 및 경제성 등을 고려하여 선택되며, 유상 성분으로서 주로 사용될 수 있는 오일로는 식물성 오일, 광물성 오일, 실리콘유 및 합성유 중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 이 외에 유화 능력을 보강하기 위하여 계면활성제, 고급알콜 등을 0.1 내지 5 중량% 첨가할 수 있다. 이러한 계면 활성제로는 비이온 계면활성제, 인지질 등과 같은 통상적인 계면활성제를 사용할 수 있으며, 고급 알콜로는 탄소수가 12 내지 20인 알콜을 단독으로 또는 1종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

또한 화장료 조성물에 있어서, 수상 성분은 수상의 점도 또는 경도를 조절하기 위하여 카보머, 잔탄검, 벤토나이트 등과 같은 1종 이상의 점증제를 0.001 내지 5 중량% 더 첨가할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물에는 필요에 따라 고급 지방산, 비타민 등의 약효 성분과 자외선 차단제, 산화 방지제, 방부제, 향료, 착색제, pH 조절제 등 통상적인 화장품에서 사용되는 성분을 더 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부를 통해 흡수되는 제품으로, 유연화장수(스킨), 수렴화장수, 영양화장수(로션), 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 겔, 팩, 파우더, 피부외용연고, 첩포제, 현탁액, 에멀젼, 스프레이, 또는 미용액 등의 통상의 화장료 형태로 제조될 수 있으며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 담체와 첨가제를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한 다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 비파엽 추출물의 제조

1. 비파엽으로부터 추출 및 분리

비파(Eriobotrya japonica L.)의 엽 1㎏을 건조, 분쇄한 후 100%, 70%, 50% 에탄올 수용액 6~12ℓ로 80℃에서 가온 추출하였다. 상기 에탄올 추출액 중 지표성분인 우르솔산 및 올레아놀산이 100% 에탄올 추출물에서 함량이 가장 많이 포함되어 있는 것을 확인하였다. 상기 100% 에탄올 추출액을 여과하고 감압 농축하여 암녹색 슬러지 성상의 농축액 116.7g을 얻었다.

상기 암녹색 슬러지 성상의 농축액에 물을 넣어 현탁시키고, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트로 순차 분리하였다. 상기 분획중 TLC 상에서 에틸아세테이트층에서 트리테르페노이드 화합물을 확인하고, 에틸아세테이트층을 농축한 후 완전히 건조시켜 암갈색 가루 성상의 비파엽 에틸아세테이트 추출물 54.8g을 얻었다.

상기 농축된 비파엽 에틸아세테이트 추출물을 하기 실험예 1~5에 사용하였다.

2. 비파엽 추출물의 정제

상기 1에서 얻은 농축된 에틸아세테이트층을 헥산과 에틸아세테이트(5:5)의 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(230~400메쉬)로 분리하였다. 상기 분획중 트리테르페노이드 성분이 확인되는 분획을 모아 감압 농축한 후 완전히 건조시키고, 이 건조분을 다시 디클로로메탄과 에틸아세테이트(8:2)의 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(230~400메쉬)로 분리하였다. 상기 분획중 트리테르페노이드 성분이 확인되는 분획을 모아 감압 농축한 후, 완전히 건조시켜 7.7g의 엷은 노란색 가루 성상의 비파엽 추출 분획을 얻었다.

3. 비파엽 추출물에서 지표성분 확인

상기 1에서 얻은 에틸아세테이트층에서 지표성분으로 추정되는 트리테르페노이드 화합물을 확인하기 위하여 액체크로마토그래피/질량분석법 (LC/MS; Hewlett-Packard 1100 Series Liquid Chromatograph/Mass Spectrometer)을 수행하였다.

본 발명에 따른 비파엽 추출물에서 지표성분 표준품인 올레아놀산 및 우르솔산의 액체크로마토그래피/질량분석 스펙트럼은 도 1에 나타내었으며, 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 액체크로마토그래피/질량분석 스펙트럼은 도 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 비파엽 추출물이 액체크로마토그래피 스펙트럼에서 지표성분의 표준품과 동일한 피크 유지 시간(retention-time)을 가지므로, 두 성분 화합물이 동일하다는 것을 알 수 있다. 올레아놀산 및 우르솔산은 동일한 분자량 456.7 (이론 값)을 가지는 이성질체이며, 질량분석 결과의 479.8 [M+Na]+ (실험 값)의 형태로 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 19.179분과 19.742분 피크 유지 시간의 화합물은 각각 올레아놀산 및 우르솔산 성분으로 확인되었다.

4. 비파엽 추출물에서 지표성분 함량 측정

상기 1 및 2에서 얻은 비파엽 추출물의 지표성분인 올레아놀산 및 우르솔산의 함량을 HPLC로 분석하였다. 결과는 표 1 및 2에 나타내었다.

	비파엽 추출물
	100% 에탄올 추출물	70% 에탄올 추출물	50% 에탄올 추출물	물 추출물
비파엽 추출물 총중량에 대한 지표성분(트리테르페노이드 화합물)의 함량(%)	1.469	0.711	0.016	불검출

	비파엽 추출물 총중량에 대한 지표성분의 함량(%)
	우르솔산	올레아놀산
비파엽 에탄올 추출물	1.02	4.15
비파엽 추출물의 에틸아세테이트층	3.31	12.46
비파엽 추출물의 에틸아세테이트층을 컬럼크로마토그래피로 정제후 추출 분획	18.51	75.50

표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 비파엽 에탄올 추출물 중 100% 에탄올 추출물에서 지표성분 함량이 가장 많이 포함되어 있으므로, 100% 에탄올의 추출 효율이 가장 우수함을 알 수 있다.

표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 지표성분인 올레아놀산 및 우르솔산의 함량은 비파엽을 추출, 분리, 정제할수록 지표성분의 함량이 증가함을 확인하였다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 : 화장료 제제

1. 로션 (함량 : 중량%)

원료명 (중량%)	비교 제제예	제제예
1,3-부틸렌 글리콜	3.00	3.00
하이드로제네이티드레시틴	1.00	1.00
잔탄검	0.30	0.30
콘드로이친 설페이트	0.50	0.50
소듐히아루로네이트	8.00	8.00
글리세린	5.00	5.00
d-판테놀	0.20	0.20
알란토인	0.25	0.25
디포타슘글리시리제이트	0.25	0.25
알파-비사보롤	0.20	0.20
티타늄옥사이드/정제수/알루미나/실리카/소듐폴리아크릴레이트	1.50	1.50
이소프로필미리스테이트	4.00	4.00
토코페릴아세테이트	0.40	0.40
소듐아크릴레이츠 코폴리머/하이드로제네이티드 폴리아이소부텐/포스포리피드/폴리글리세릴-10 스테아레이트/선플라워 씨드 오일	2.00	2.00
기타 첨가물	3.00	3.00
식물 추출물	5.00	5.00
에탄올	3.00	3.00
보존제	적량	적량
조합향료	적량	적량
비파엽 추출물	-	1.0
정제수	잔량	잔량

2. 유연화장수 (함량 : 중량%)

본 발명에 따른 비파엽 추출물 0.01

글리세린 3.0

부틸렌글리콜 2.0

프로필렌글리콜 2.0

카복시비닐폴리머 0.1

에탄올 10.0

트리에탄올아민 0.1

방부제, 미량색소, 미량향료, 미량정제수 잔량

총계 100.0

3. 영양화장수 (함량 : 중량%)

본 발명에 따른 비파엽 추출물 0.01

밀납 4.0

폴리솔베이트 60 1.5

솔비탄세스퀴올레이트 0.5

유동파라핀 5.0

스쿠알란 5.0

카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0

글리세린 3.0

부틸렌글리콜 3.0

프로필렌글리콜 3.0

카복시비닐폴리머 0.1

트리에탄올아민 0.2

방부제, 미량색소, 미량향료, 미량정제수 잔량

총계 100.0

4. 영양크림 (함량 : 중량%)

본 발명에 따른 비파엽 추출물 0.005

밀납 10.0

폴리솔베이트 60 1.5

솔비탄세스퀴올레이트 0.5

유동파라핀 10.0

스쿠알란 5.0

카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0

글리세린 5.0

부틸렌글리콜 3.0

프로필렌글리콜 3.0

트리에탄올아민 0.2

방부제, 미량색소, 미량향료, 미량정제수 잔량

총계 100.0

5. 맛사지 크림 (함량 : 중량%)

본 발명에 따른 비파엽 추출물 0.005

밀납 10.0

폴리솔베이트 60 1.5

솔비탄세스퀴올레이트 0.8

유동파라핀 40.0

스쿠알란 5.0

카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0

글리세린 5.0

부틸렌글리콜 3.0

프로필렌글리콜 3.0

트리에탄올아민 0.2

방부제, 미량색소, 미량향료, 미량정제수 잔량

총계 100.0

6. 팩 (함량 : 중량%)

본 발명에 따른 비파엽 추출물 0.005

폴리비닐알콜 13.0

소듐카복시메틸셀룰로스 0.2

알란토인 0.1

에탄올 5.0

노닐페닐에테르 0.3

방부제, 미량색소, 미량향료, 미량정제수 잔량

총계 100.0

실험예 1 : 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 DPPH법에 의한 항산화능 측정

본 발명에 따른 비파엽 추출물의 항산화능을 알아보기 위하여, DPPH법을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴히드라질)법은 산화/환원 환경변화에 따라 색을 띄는 라디칼로 시료의 라디칼 제거능력을 흡광도 측정을 통해 직접 확인할 수 있는 일반적인 시험 방법이다.

상기 실시예에서 제조한 비파엽 추출물을 농도별(0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1 %(w/v))로 적당한 용매에 녹인 후, 이 용액 100 ㎕ 시료에 100 μM의 DPPH 용액 900 ㎕를 섞어주었다. 조심해서 잘 섞은 후 상온에서 10분간 배양한 다음 540 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 공시험액(blank)으로는 증류수 또는 용매를 사용하였으며, 비교군으로는 시료를 넣지 않고 DPPH와 증류수 또는 용매로만 구성된 것을 사용하였다. 측정된 흡광도로부터 하기 수학식 1로 계산하여 자유라디칼소거활성 (Free radical scavenging activity)을 결정하였다.

결과는 표 3에 나타내었다.

자유라디칼소거활성 (%) = [1-(시료의 흡광도/비교군의 흡광도)] × 100

	본 발명의 비파엽 추출물의 농도 (%, w/v)
	0	0.001	0.005	0.01	0.05	0.1
본 발명의 비파엽 추출물	0	4	16	28	59	68
비타민 C(ascorbic acid)	0	82	82	82	-	-

표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 비파엽 추출물은 0.1% (w/v) 까지 농도에 따라 유의성 있게 DPPH에 의한 항산화능이 증가하였다. 또한 비타민 C와 비교하였을 때, 비타민 C는 순물질이고 비파엽 추출물이 혼합물이라는 점을 감안하면 비파엽 추출물의 자유라디칼소거활성이 우수함을 알 수 있다.

실험예 2 : 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 세포독성 시험

본 발명에 따른 비파엽 추출물의 세포독성을 알아보기 위하여, 섬유아세포(human fibroblast cell)를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

사람의 섬유아세포를 1 × 10⁵ cell/㎖로 24 웰 플레이트에 살포(seeding)하고, 1일 후 새 배지(10% 또는 2% 소혈청을 함유한 배지)로 갈아주면서 상기 실시예에서 제조한 비파엽 추출물을 농도별(1, 10, 25, 50, 100, 250, 500 ㎍/㎖)로 처리하였다. 24시간 배양 후 MTT (2.5㎎/㎖) 100㎕를 첨가하여 37℃에서 4시간 배양시킨 후, 그 배지를 버리고 DMSO 1㎖를 첨가하여 상온에서 10분 동안 녹였다. 완전히 녹인 후 96 웰 플레이트로 200㎕씩 옮겨 570㎚에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존 정도를 확인하였다.

결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 50% 이상 세포가 생존하지 못하였을 경우 세포 독성이 있다고 판단하므로, 본 발명에 따른 비파엽 추출물은 사람의 섬유아세포에 대하여 500 ㎍/㎖의 높은 농도에서도 세포 독성이 관찰되지 않았으므로 안전함을 알 수 있다.

실험예 3 : 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 엘라스타제 억제효과 시험

본 발명에 따른 비파엽 추출물의 엘라스타제 억제효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예에서 제조한 비파엽 추출물 0.1g을 정확하게 달아 DMSO 10㎖에 넣고 완전히 용해시켰다. 이 용액의 농도가 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 250㎍/㎖, 500㎍/㎖, 1,000㎍/㎖가 되도록 정제수로 희석한 액을 검액으로 하였다. 0.267 M 트리스액을 pH 8.0이 되도록 0.267 M 염산 용액으로 조정한 완충액 60㎕에 엘라스타제 기질 Succ-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐라이드(p-nitroanilide) 표준품을 8.8 mM로 한 기질액 20㎕, 검액 100㎕를 넣고 섞은 후, 돼지 췌장 엘라스타제(Porcine Pancreatic Elastase) 표준품을 10㎍/㎖가 되도록 만든 효소액 20㎕씩을 넣어 흔들어 섞어 25℃에서 15분간 반응시켜 p-니트로아닐린의 생성량을 파장 410㎚에서 검액이 반응된 흡광도 B를 측정하였다. 반응된 흡광도 B에서 효소액 20㎕ 대신 정제수 20㎕ (효소대조시험흡광도 C), 검액 100㎕ 대신 정제수 100㎕ (검액 대조시험 흡광도 A)를 넣고 흡광도 B 측정 방법과 동일한 양 및 조건으로 조작하여 흡광도 C와 A를 각각 측정하고 하기 수학식 2에 따라 엘라스타제 억제율 (%)을 구하였다.

결과는 표 4에 나타내었다.

엘라스타제 억제율 (%) = [1-(B-C)/A] × 100

※ A : 검액 대조시험 흡광도

B : 반응된 흡광도

C : 효소대조시험흡광도

본 발명의 비파엽 추출물의 농도(㎍/㎖)	엘라스타제 억제율(%)
0	0
50	23.98
100	40.94
250	53.51
500	54.26
1,000	58.64

표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 엘라스타제 억제율의 IC₅₀값이 269.66 ㎍/㎖로 나타남으로, 엘라스타제 억제효과가 우수함을 알 수 있다.

실험예 4 : 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 콜라게나제 억제효과 시험

본 발명에 따른 비파엽 추출물의 콜라게나제 억제효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예에서 제조한 비파엽 추출물 0.1g을 정확하게 달아 DMSO 10㎖에 넣고 완전히 용해시켰다. 이 용액의 농도가 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 500㎍/㎖, 1,000㎍/㎖가 되도록 정제수로 희석한 액을 검액으로 하였다. 아조콜(Azocoll) 5㎎을 정확하게 달아 튜브에 넣은 뒤 이를 100 mM 포타슘 포스페이트 (pH 7.8) 1㎖에 용해시켰다. 콜라게나제는 콜라게나제 타입-Ⅳ를 4 unit/㎕가 되도록 제조하였다. 대조군 및 대조군 공시험액은 기질을 용해한 완충액에 정제수 1,000㎕를 첨가하고, 검액 및 검액의 공시험액은 기질을 용해한 완충액에 시료를 500㎕, 정제수를 500㎕ 첨가하였다. 이를 37℃에서 10분간 예비배양(pre-incubation)한 다음 대조군 및 검액에 용해한 콜라게나제 10㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 가끔 흔들면서 배양하였다. 냉침으로 반응을 종료한 뒤 3,500 rpm에서 10분간 원심분리하여 기질을 침전시키고, 520㎚에서 흡광도를 측정하고, 하기 수학식 3에 따라 콜라제나제 억제율 (%)을 구하였다.

결과는 표 5에 나타내었다.

콜라게나제 억제율 (%) = [1-(B-C)/(A-D)] × 100

※ A : 대조군의 흡광도

B : 검액의 흡광도

C : 검액 공시험액의 흡광도

D : 대조군 공시험액의 흡광도

본 발명의 비파엽 추출물의 농도(㎍/㎖)	콜라게나제 억제율(%)
0	0
100	15.57
500	93.35
1,000	96.39

표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 콜라게나제 억제율의 IC₅₀값이 209.7㎍/㎖로 나타남으로, 콜라게나제 억제효과가 우수함을 알 수 있다.

실험예 5 : 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 MMP-1, MMP-2, MMP-9 발현 억제 시험

본 발명에 따른 비파엽 추출물의 MMP-1, MMP-2, MMP-9 발현 억제 정도를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

MMP는 매트릭스 메탈로프로테아제(Matrix metalloproteinase)로서 현재까지 약 17종이 존재한는 것으로 알려져 있다. 피부의 주름과 직접적인 연관이 있는 것으로 추정되는 MMP는 MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-12, MMP-13 으로 알려져 있다. 그 중 MMP-1은 섬유아세포-타입(fibroblast-type)이며, MMP-2와 MMP-9은 콜라겐 타입 Ⅳ를 분해하는 겔라티나제 A(Gelatinase A)와 겔라티나아제 B(Gelatinase B)로 알려져 있으며, 시험관내 분석(in vitro assay)에서 가장 많이 이용되고 있다.

사람의 섬유아세포를 1 × 10⁶ cell/㎖로 살포(seeding)하고 1일 후 상기 실시예에서 제조한 비파엽 추출물을 일정 농도로 첨가하였다. 24시간 후 세포의 배지를 제거하고, 트리졸(trizol) 1㎖를 첨가하여 실온에서 5분, 클로로포름 200㎕를 첨가하여 실온에서 5분을 방치한 후, 13,000 rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 새로운 시험관으로 옮긴 뒤 이소프로필 알콜 500㎕를 첨가하여 실온에서 5분간 방치한 후 13,000 rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리하여 이소프로필 알콜을 제거하고, 75% 에탄올 1㎖를 첨가한 후 볼텍스(vortex)한 다음 10,000 rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리한 후 에탄올을 제거하였다. 상온에서 펠렛(pellet)이 완전히 건조되면 DEPC 1㎖/3차 정제수 1ℓ로 RNAse 불활성화(inactivation), 121℃에서 25분간 멸균하여 제조한 DEPC-DW 20㎕를 첨가한 후 RNA를 정량하였다.

RT-PCR 과정에서 PCR 프라이머(primer)인 MMP-2, MMP-9, 액틴(Actin)은 바이오니아(한국)로부터 구입하여 사용하였다.

MMP-2는 센스 5'-GGCGGATCCATGGCGCCGTCGCCCATCATC-3', 안티센스 5'-GCCGTCGACTACAATGTCCTGTTTGCAGAT-3'으로 50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화하고 94℃에서 1분, 70℃에서 1분, 72℃에서 1분간 29 주기로 PCR 반응하였다.

MMP-9은 센스 5'-CGGGACGGCAATGCTGAT-3', 안티센스 5'-AGGGCGAGGACCATAGAGG-3'으로 50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화하고, 95℃에서 1분, 57℃에서 1분, 72℃에서 1분간 28 주기로 PCR 반응하였다.

액틴은 센스 5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3', 안티센스 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3'으로 50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화하고 94℃에서 1분, 62℃에서 1분, 72℃에서 1분간 22 주기로 PCR 반응하였다.

RT-PCR은 하기 표 6의 조건으로 혼합물을 제조(all-in-one RT-PCR kit)하여 RT-PCR을 실시하였다. 1.5% 아가로스겔에서 전기영동방법으로 확인하였다.

결과는 표 7 및 도 4에 나타내었다.

RT-PCR을 위한 혼합물 성분	반응 부피	최종 농도
템플레이트(RNA)	1㎍
DEPC-DW	(12.5-RNA) ㎕
RT-PCR 효소 혼합물	1㎕
5×RT-PCR 완충액	5㎕	1×
dNTP 혼합물	3㎕	300μM
전방 프라이머	3㎕	0.6μM
후방 프라이머	3㎕	0.6μM
총	25㎕

시료의 농도	MMP-1 발현 정도 (%)	MMP-2 발현 정도 (%)	MMP-9 발현 정도 (%)
대조군	100	-	120.03
SNP(소듐 니트로프루씨드) 50μM	92.28	100	100
SNP+비파엽 추출물(50㎍/㎖)	100	97.32	100.3
SNP+비파엽 추출물(100㎍/㎖)	105.27	94.02	96.11
SNP+비파엽 추출물(250㎍/㎖)	100.22	44.77	53.92
SNP+EGCG 25μM	97.03	63.68	54.99
SNP+바이칼레인 25μM	103.56	72.38	88.06

※ MMP-1, MMP-2, MMP-9의 발현 정도(%)는 모두 액틴에 대해 보정한 값이다.

표 7에 나타난 바와 같이, MMP-1을 제외한 MMP-2와 MMP-9에서 본 발명에 따른 비파엽 추출물을 처리한 부분의 MMP 발현 정도가 비파엽 추출물의 처리 농도가 증가할수록 감소하였다. 이는 비파엽 추출물의 처리에 의하여 MMP-2와 MMP-9의 발현이 억제된다는 것을 의미한다.

상기 결과들로부터 본 발명에 따른 비파엽 추출물은 세포외 기질 성분인 콜라겐 타입 Ⅳ를 분해하는 MMP-2(겔라티나제 A)와 MMP-9(겔라티나제 A)의 발현을 억제하여 세포외 기질 성분인 콜라겐 타입 Ⅳ의 분해를 예방하는 효과가 우수한 것으로 확인되었다. 또한 이들 결과들은 상기 시험한 콜라게나제 억제 효과와도 부합되는 시험 결과라 할 수 있다.

실험예 6 : 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 피부주름개선 효과

본 발명에 따른 비파엽 추출물의 피부주름개선 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 30세 이상의 여성 10명을 2그룹으로 나누고, A그룹에는 비교 제제예의 화장료 조성물(로션)을, B그룹에는 본 발명에 따른 제제예의 화장료 조성물(로션)을 주름이 있는 눈가를 중심으로 12주간 도포한 후, 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가를 하기의 7 단계로 분류하여 평가하였다.

<피부 주름 개선 평가 기준>

결과는 표 8에 나타내었다.

표 8에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 화장료 조성물의 경우 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가가 각각 2.6과 2.8로 나타나, 비교 제제예의 화장료 조성물의 0.2와 0.6에 비하여 주름 개선 효과가 매우 우수한 것으로 평가되었다. 따라서, 본 발명에 따른 비파엽 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물은 피부 주름 개선에 매우 효과적임을 알 수 있다.

실험예 7 : 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 피부 안전성 실험

본 발명에 따른 비파엽 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물에 대한 피부 자극 정도를 알아보기 위하여, 하기와 같이 실험을 수행하였다.

피검자 10명을 대상으로 Haye's Test Chamber를 이용하여 상박의 피부 첩포 시험(patch test)을 실시하였다. 단, 건선, 습진, 여드름, 기타 피부 알러지 등의 경험이 있거나 임신, 수유모 또는 피임제, 항히스타민제 등을 복용하는 사람은 본 실험에서 제외하였다.

실험부위를 알콜로 닦아낸 뒤 건조시키고 상기 비교제제예와 제제예에서 제조한 화장료 조성물(로션)을 각각 15㎍씩 챔버(chamber)에 적하시킨 뒤, 실험 부위인 상박 부위에 얹어 고정하였다. 첩포 시간은 24시간 동안 도포하고 첩포를 제거한 후 마킹 펜(marking pen)으로 시험부위를 표시하여 각각 24시간 후에 시험 부위를 관찰하여 하기의 국제접촉피부염연구회의 판정 기준에 따라 평가하였다.

결과는 표 9에 나타내었다.

<피부 안전성 평가 기준>

판정 기준	평가 기준	부호	평균 점수
음성적	무자극	-	0
약간 반응 및 홍반	미소자극	±	0~0.9
홍반 + 경화	경자극	+	1.0~2.9
홍반 + 경화 +작은수포	중자극	++	3.0~4.9
홍반 + 경화 + 물집	강자극	+++	5.0 이상

표 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 제제예 및 비교 제제예의 화장료 조성물에서 모두 피부 자극 정도가 0으로 나타남으로, 본 발명에 따른 비파엽 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물이 피부에 자극이 없는 매우 안전한 화장료 조성물임을 알 수 있다.

실험예 8 : 본 발명에 따른 비파엽 추출물의 안정성 실험

본 발명에 따른 비파엽 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물에 대한 경시적 안정성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 비교 제제예 및 제제예의 화장료 조성물을 0℃, 25℃, 40℃, 50℃, 순환(cycle)의 항온기에 보관하면서 1주일 단위로 열 안정성을 하기의 평가 기준으로 평가하였다. 결과는 표 10에 나타내었다.

※ 평가기준 (○ : 양호, △ : 불안정, × : 분리)

표 10에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 제제예 및 비교 제제예의 화장료 조성물은 50℃의 보관 조건에서 미소한 차이가 있을 뿐 전반적으로 열 안정성이 우수하였다. 따라서, 본 발명에 따른 비파엽 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물은 장기 보존 안정성이 우수한 안정한 제형임을 알 수 있다.

본 발명에 따른 비파엽 추출물은 항산화능을 증가시키고, 세포독성이 없으며, 엘라스타제, 콜라게나제 및 MMP 발현 억제효과가 우수하고, 피부주름개선 효과 가 우수하며, 피부 안전성 및 경시적 안정성이 우수함으로, 주름개선용 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

1. 비파엽 추출물을 유효성분으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 비파엽 추출물은 비파엽을 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 또는 이의 수용액으로부터 선택된 1종 이상으로 추출하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 비파엽 추출물은 비파엽 추출물 총중량에 대하여 올레아놀산 0.01~3.50 중량% 및 우르솔산 0.01~7.00 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.
4. 제 2항에 있어서, 상기 비파엽 추출물을 물에 넣어 현탁시키고, 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트 중에서 선택된 1종으로 추출하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 비파엽 추출물은 비파엽 추출물 총중량에 대하여 올레아놀산 0.5~10.0 중량% 및 우르솔산 5.0~20.0 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.
6. 제 4항에 있어서, 상기 비파엽 추출물을 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올로 이루어진 극성 용매 및 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄, 클로로포름으로 이루어진 무극성 용매 중에서 선택된 2종 이상으로 이루어진 혼합용매를 이용하여 컬럼크로마토그래피로 분리, 정제하는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 비파엽 추출물은 비파엽 추출물 총중량에 대하여 올레아놀산 10.0~50.0 중량% 및 우르솔산 20.0~80.0 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.
8. 제 1항에 있어서, 상기 비파엽 추출물은 화장료 조성물 총중량에 대하여 0.001~20.00 중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물의 제형이 유연화장수(스킨), 수렴화장수, 영양화장수(로션), 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 겔, 팩, 파우더, 피부외용연고, 첩포제, 현탁액, 에멀젼, 스프레이, 또는 미용액인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

Images