WO2024049164A1 - 세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법 - Google Patents

세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2024049164A1
WO2024049164A1 PCT/KR2023/012789 KR2023012789W WO2024049164A1 WO 2024049164 A1 WO2024049164 A1 WO 2024049164A1 KR 2023012789 W KR2023012789 W KR 2023012789W WO 2024049164 A1 WO2024049164 A1 WO 2024049164A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cmnv
nucleic acid
cancer
amo21c
nanovesicles
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/012789
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이민형
이영기
Original Assignee
한양대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020230110110A external-priority patent/KR20240032637A/ko
Application filed by 한양대학교 산학협력단 filed Critical 한양대학교 산학협력단
Publication of WO2024049164A1 publication Critical patent/WO2024049164A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Definitions

  • nanovesicles for delivering cell membrane-derived nucleic acids and methods for producing the same.
  • Glioblastoma represents the majority of primary brain tumors and is one of the leading causes of death worldwide. Although metastases from the brain to other organs are rarely reported, the average survival rate for patients with glioblastoma is so far dismal. Currently, clinical options for glioblastoma include surgical resection or radiation/chemotherapy, but these have not significantly improved the 5-year survival rate. Because of this condition, various research efforts have been made to develop effective treatments for glioblastoma. As a therapeutic gene for glioblastoma, The herpes simplex virus thymidine kinase (HSVtk) gene has been identified in preclinical and clinical settings. was investigated. HSVtk gene therapy has shown positive effects in animal experiments.
  • HSVtk herpes simplex virus thymidine kinase
  • siRNA small interfering RNA
  • HSVtk small interfering RNA
  • shRNA small interfering RNA
  • HFP70 heat shock protein 70
  • Acute lung injury refers to a life-threatening condition in which the capillaries or alveoli in the lungs are damaged due to infection, trauma, bleeding, etc., preventing smooth breathing in the lungs. In severe cases, it is called Acute Respiratory Distress Syndrome. In Korea, the mortality rate has reached 71.9%, and the incidence of acute lung injury, such as COVID-19 infection, has recently increased significantly. Acute lung injury is a disease with a mortality rate of 30-40%.
  • the main treatment method is oxygen supply such as artificial respirator, and drug treatment such as anti-inflammatory drugs is still in the research stage.
  • nucleic acid/drug delivery technology based on biological membrane-derived nanovesicles has high potential as a new delivery technology that can solve the above problems.
  • miRNAs are involved in tumor cell survival. It has been suggested. Some miRNAs were induced in tumor tissues and promoted tumor cell proliferation and survival. Specifically, among the miRNAs, miR-21 is involved in cell death-related genes, such as Facilitates mRNA degradation of phosphatase, tensin homolog (PTEN), and programmed cell death protein 4 (PDCD4), and anti-miR-21 oligonucleotide (AMO21: anti). -miR-21 oligonucleotide) delivery was shown to reduce the levels of miR-21 and consequently the expression of PTEN and PDCD4 in tumor tissues.
  • PTEN tensin homolog
  • PDCD4 programmed cell death protein 4
  • AMO21 anti-miR-21 oligonucleotide
  • AMO21 depends on the efficiency of delivery into glioblastoma, and in early-phase studies, intravenous AMO21 administration shows anti-tumor effects in animal models. However, the delivery efficiency of naked AMO21 was not very efficient due to the blood-brain barrier (BBB), suggesting that high levels of administration were required. With the BBB filtering molecules entering the brain, developing efficient drug delivery platforms for brain diseases is highly challenging. difficult. To avoid or bypass the BBB, various approaches have been used. For example, local injection or intranasal administration using stereotactic equipment may be effective for delivery from the nose to the brain. evaluated. However, direct injection may cause additional damage to normal brain tissue as well as tumor tissue due to the injection needle, and delivery efficiency by intranasal administration is inconsistent and dose control is difficult.
  • BBB blood-brain barrier
  • T7-peptide-decorated exosomes facilitate AMO21 delivery to the brain through the BBB and reduce tumor size. decreased.
  • exosomes themselves can penetrate into the brain through the BBB surface decoration with T7 peptide increases the delivery efficiency of AMO21 into brain tumor sites.
  • exosomes are promising extracellular vesicles for the delivery of therapeutic reagents to the brain, some obstacles are addressed.
  • CMNV cell membrane nanovesicles
  • One aspect is a cell membrane derived phospholipid bilayer
  • a targeting agent bound to a hydrophobic region of the phospholipid bilayer A targeting agent bound to a hydrophobic region of the phospholipid bilayer
  • the aim is to provide nanovesicles for nucleic acid delivery containing nucleic acid bound to the hydrophobic portion of the phospholipid bilayer.
  • Another aspect is to provide a composition for nucleic acid delivery comprising the nanovesicles for nucleic acid delivery.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the nanovesicles for delivering nucleic acids.
  • Another aspect is to provide a method for preventing or treating cancer, comprising administering the nanovesicle for nucleic acid delivery to an individual in need thereof.
  • Another aspect is to provide the use of the nanovesicles for nucleic acid delivery for the production of drugs for preventing or treating cancer.
  • Another aspect is to provide a health functional food for preventing or improving cancer containing the nanovesicles for delivering nucleic acids.
  • Another aspect includes obtaining phospholipids by separating the cell membrane of a cell isolated from an individual;
  • To provide a method for producing nanovesicles for nucleic acid delivery including the step of mixing the phospholipid bilayer and a nucleic acid bound to a hydrophobic material to obtain a phospholipid bilayer bound to the targeting substance and the nucleic acid.
  • One aspect is a cell membrane derived phospholipid bilayer
  • a targeting agent bound to a hydrophobic region of the phospholipid bilayer A targeting agent bound to a hydrophobic region of the phospholipid bilayer
  • nanovesicle for nucleic acid delivery containing a nucleic acid bound to a hydrophobic portion of the phospholipid bilayer.
  • cell membrane refers to a component that all cells have and that distinguishes the inside and outside of the cell.
  • the cell membrane is made of a thin, structural phospholipid bilayer composed of phospholipids and protein molecules, and has selective permeability.
  • the cell membrane may be a cell membrane derived from various cells, or may be a cell membrane derived from a cancer cell.
  • the cell membrane may be a cell membrane derived from glioblastoma, neuroblastoma, human embryonic kidney cells, brain cells, human fibroblasts, or non-small cell lung cancer cells.
  • phospholipid refers to a type of lipid that contains phosphorus as a major component of biological membranes along with glycolipids, cholesterol, and proteins, and the phospholipid consists of a hydrophobic portion (tail) and a hydrophilic portion (head).
  • Hydrophilic refers to the property of being easily combined with water molecules, specifically polar molecules
  • Hydrophobic refers to the property of not being easily combined with water molecules, specifically polar molecules. , in general, if it is not polar, it is hydrophobic.
  • phospholipid bilayer means that the hydrophobic portions (tails) of the phospholipids face each other and the hydrophilic portions (heads) are in contact with the inside and outside of the phospholipid bilayer, respectively, or the hydrophilic portions (heads) of the phospholipids are in contact with each other. refers to a double structure in which the sides face each other and the hydrophobic portions (tails) are in contact with the inside and outside of the phospholipid bilayer, respectively.
  • the phospholipids can form a double layer in a polar (hydrophilic) or non-polar (hydrophobic) solvent.
  • the hydrophilic portions of the phospholipids face each other and the hydrophobic portions is in contact with the inside and outside of the phospholipid bilayer
  • a double structure is formed so that the hydrophobic parts of the phospholipids face each other and the hydrophilic parts are in contact with the inside and outside of the phospholipid bilayer.
  • the phospholipid bilayer is derived from the cell membrane of the cell, and may include various components such as membrane proteins and glycolipids present in the cell membrane.
  • targeting refers to a biological mechanism by which a substance is transported to an appropriate destination inside or outside the cell, and the targeting substance refers to a substance that aids in targeting.
  • the targeting agent is T7 peptide, RAGE attachment peptide (Receptor for advanced glycation end products binding peptide), chlorotoxin, Angiopoietin-2, and rabies virus. It may be one or more selected from the group consisting of glycoproteins (Rabies virus glycoprotein), specifically, T7 peptide, RAGE attachment peptide (Receptor for advanced glycation end products binding peptide), chlorotoxin, and anji. It may be Angiopoietin-2 or Rabies virus glycoprotein, and more specifically, it may be T7 peptide.
  • the targeting material may be a hydrophobic material combined.
  • the hydrophobic material may be one or more selected from the group consisting of cholesterol, palmitic acid, tocopherol, and oleic acid, and specifically, cholesterol. , it may be palmitic acid, tocopherol, or oleic acid, and more specifically, it may be cholesterol.
  • the targeting substance may be present in a hydrophilic region inside the phospholipid bilayer and a hydrophilic region outside the phospholipid bilayer.
  • the hydrophobic material when the hydrophobic material is bound to the targeting agent, the hydrophobic material interacts with a hydrophobic site inside the phospholipid bilayer (for example, van der Waals bond), and the hydrophobic material binds to the phospholipid. It exists in a hydrophobic portion of the bilayer (between phospholipid bilayers), and the targeting agent may exist in a hydrophilic portion inside the phospholipid bilayer and a hydrophilic portion outside the phospholipid bilayer.
  • a hydrophobic site inside the phospholipid bilayer for example, van der Waals bond
  • nucleic acid refers to a biopolymer or small biomolecule essential to all known life forms and is composed of nucleotide units.
  • a nucleotide is a unit composed of three components: phosphate, pentose, and nucleobase. means.
  • the nucleic acid is one selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, anti-miRNA oligonucleotides, miRNA, mRNA, siRNA, tRNA, sgRNA, shRNA, and variants thereof. It may be more than one, and specifically, it may be antisense oligonucleotides, anti-miRNA oligonucleotides, miRNA, mRNA, siRNA, tRNA, sgRNA, or shRNA, and more specifically, it may be miRNA. , for example, AMO21 (Anti-microRNA-21 oligonucleotides).
  • the nucleic acid may be a hydrophobic substance bound.
  • the hydrophobic material may be one or more selected from the group consisting of cholesterol, palmitic acid, tocopherol, and oleic acid, and specifically, cholesterol. , it may be palmitic acid, tocopherol, or oleic acid, and more specifically, it may be cholesterol.
  • the hydrophobic material when the hydrophobic material is bound to the nucleic acid, the hydrophobic material interacts with a hydrophobic site inside the phospholipid bilayer (for example, van der Waals bond), and the hydrophobic material interacts with the hydrophobic site inside the phospholipid bilayer. It exists in a hydrophobic region (between phospholipid bilayers), and the nucleic acid may exist in a hydrophilic region inside the phospholipid bilayer and a hydrophilic region outside the phospholipid bilayer.
  • the nucleic acid may be modified so that it is not degraded by nucleases, and specifically, the nucleic acid may be modified with a methyl group, and more specifically, the nucleic acid may be modified with a methyl group. may be modified into a methyl group at the 2'-position.
  • the nucleic acid When the nucleic acid is modified with a methyl group, it can be stably delivered without being degraded by nucleases in serum.
  • nanovesicle refers to a nano-sized vesicle.
  • a nanovesicle is a type of artificial exosome or exosome whose characteristics and shape are similar to nano-sized exosomes naturally produced within cells. Although it is somewhat like an endoplasmic reticulum, it is different from exosomes extracted from cells.
  • cell membrane-derived nanovesicles can be produced relatively easily by separating the cell membrane and extruding, and are efficient because they do not contain intracellular contents.
  • T7-CMNV cell membrane nanovesicles
  • T7c T7 cholesterol
  • AMO21 Anti-microRNA-21 oligonucleotides
  • AMO21c Anti-microRNA-21 oligonucleotides cholesterol
  • AMO21c is conjugated with a hydrophobic interaction. Loaded onto vesicles. As a result, it was confirmed that AMO21c was modified with a methyl group at the 2'-position and was not degraded by nucleases in serum (see Example 2.(1)).
  • the nanovesicles contain nucleic acid, phospholipid, and targeting agent in a ratio of 1:5:5, 1:10:10, 2:5:5, 2:5:10, 1:10:5, 2:10: It may exist in a mass ratio of 5 or 1:5:10.
  • the nanovesicles are 200 ⁇ g to 280 ⁇ g, 200 ⁇ g to 265 ⁇ g, 200 ⁇ g to 250 ⁇ g, 215 ⁇ g to 280 ⁇ g, 215 ⁇ g to 265 ⁇ g, 215 ⁇ g to 250 ⁇ g, and 230 ⁇ g per kg of administration target. It may be administered at a nucleic acid dose of 280 ⁇ g to 280 ⁇ g, 230 ⁇ g to 265 ⁇ g, or 230 ⁇ g to 250 ⁇ g.
  • the nanovesicles when the nanovesicles are administered at a dose of less than 200 ⁇ g of nucleic acid per 1 kg of the administered subject, the targeted effect of the nucleic acid may not be effectively achieved, and the nanovesicles may not be effective if the nucleic acid is administered at a dose of less than 200 ⁇ g per kg of the administered subject.
  • cytotoxicity When administered at doses of nucleic acid, cytotoxicity may be induced.
  • body weight, AST, ALT and BUN were measured to evaluate the possible toxicity of CMNV and T7-CMNV in vivo. As a result, it was confirmed that CMNV and T7-CMNV did not cause noticeable toxicity in animals (see Example 2.(3)).
  • T7-CMNV/Cy5.5-AMO21c was injected intravenously via the tail vein at a dose of 60 ⁇ g AMO21c per rat.
  • RT-PCR was performed to amplify miR-21.
  • the level of miR-21 was decreased after injection of CMNV/AMO21c and T7-CMNV/AM021c, and the decrease in miR-21 by T7-CMNV/AMO21c was higher than that of CMNV/AM021c, and T7-CMNV was higher than CMNV.
  • orthotopic glioblastoma models were prepared to confirm the tumor targeting delivery and therapeutic effect of AMO21c using T7-CMNV, and T7-CMNV/AMO21c was injected intravenously through the tail vein. As a result, it was confirmed that the level of miR-21 was decreased after injection of CMNV/AMO21c and T7-CMNV/AM021c (see Example 2(4)).
  • Ki67 expression was assessed in rat brain through immunohistochemistry. As a result, it was confirmed that lipofectamine/AM021c, CMNV/AMO21c and scrT7-CMNV/AM021c reduced Ki67 expression, but Ki67 expression was reduced more efficiently by T7-CMNV/AMO21c (see Example 2(4) ).
  • tumor size of the samples was evaluated through Nissl staining. As a result, tumor size across all groups treated with AMO21c was reduced. In particular, T7-CMNV/AMO21c was confirmed to reduce tumor size most efficiently compared to other samples (see Example 2(4)).
  • the phospholipid and the targeting agent are 1:2 to 2:1, 1:2 to 3:2, 1:2 to 4:3, 2:3 to 2:1, 2:3 to 3: 2, 2:3 to 4:3, 3:4 to 2:1, 3:4 to 3:2, or 3:4 to 4:3.
  • the amount of the phospholipid when the amount of the phospholipid is greater than the targeting material than the mass ratio of the phospholipid and the targeting material of 2:1, the amount of the targeting material bound to the phospholipid bilayer is small, and sufficient targeting of cells is achieved. It may not be supported, and if the amount of phospholipid is less than the targeting material than the mass ratio of 1:2 between the phospholipid and the targeting material, the amount of targeting material not bound to the phospholipid bilayer may increase, reducing efficiency. .
  • the phospholipid and the nucleic acid are 10:1 to 1:1, 8:1 to 1:1, 6:1 to 1:1, 10:1 to 2:1, 8:1 to 2:1. , 6:1 to 2:1, 10:1 to 4:1, 8:1 to 4:1, or 6:1 to 4:1.
  • the amount of the phospholipid when the amount of the phospholipid is greater than the amount of the nucleic acid than the mass ratio of the phospholipid and the nucleic acid is 10:1, the amount of nucleic acid bound to the phospholipid bilayer is small, and the effect targeted by the nucleic acid is effective. It may not appear clearly, and if the amount of the nucleic acid is greater than the amount of the phospholipid than the mass ratio of the phospholipid and the nucleic acid is 1:1, the amount of nucleic acid not bound to the phospholipid bilayer may increase, reducing efficiency. there is.
  • the diameter of the nanovesicles is 155 nm to 195 nm, 155 nm to 190 nm, 155 nm to 185 nm, 160 nm to 195 nm, 160 nm to 190 nm, 160 nm to 185 nm, 165 nm to 165 nm. It may be 195 nm, 165 nm to 190 nm or 165 nm to 185 nm.
  • the amount of nucleic acid and/or target material bound to the nanovesicle may be small, resulting in low nucleic acid delivery efficiency or low stability, and the nanovesicle may have low nucleic acid delivery efficiency or low stability. If the diameter is greater than 185 nm, the nanovesicles may not penetrate cells and the nucleic acid delivery efficiency may be low.
  • size evaluation was attempted after loading AMO21c on CMNV.
  • the ratio between CMNV and AMO21c was fixed at 5:1 based on cell uptake studies, and the particle size of the produced CMNV was measured using dynamic light scattering. As a result, it was confirmed that the particle size did not increase after loading AMO21c for both CMNV and T7-CMNV (see Example 2.(1)).
  • the transduction efficiency of CMNV and T7-CMNV was evaluated with Cy5-labeled AMO21c.
  • T7-CMNV had the highest cellular uptake efficiency of AMO21c into C6 glioblastoma cells, and lipofectamine, CMNV, and scrambled T7-CMNV (scrT7-CNV) had similar uptake efficiencies.
  • scrT7-CMNV did not increase the transmission efficiency compared to CNMV, suggesting that the increase in T7-CMNV transmission may be due to the effect of the T7 peptide, and the results were confirmed by fluorescence microscopy. (See Example 2.(2)).
  • T7-CMNV had a higher transmission efficiency than CMNV and ScrT7-CNV, and CMNV and scrT7-CMNV were observed to have similar transmission efficiency to N2A cells. , which confirmed that the higher efficiency of T7-CMNV was due to the effect of the T7 peptide (see Example 2.(2)).
  • T7-CMNV transduction efficiency of T7-CMNV was evaluated using HEK293 cells and Cy5-labeled AMO21c as non-cancer cells. As a result, it was confirmed that T7-CMNV did not induce AMO21c cell uptake compared to CMNV and scrT7-CMNV, HEK293 cells did not express transferrin receptor at a significant level, and the transfer efficiency of T7 peptide to HEK 293 cells was confirmed. The effect on T7-CMNV was limited (see Example 2.(2)).
  • the delivery efficiency of T7-CMNV was evaluated through biodistribution studies. As a result, most of AMO21c was observed in the liver and kidney, and it was confirmed that lipofectamine/AMO21c was more highly absorbed into the liver than CMNV using AMO21C, and the fluorescence signal of Cy5.5-AMO21c in the brain was observed in CMNV, scrT7-CMNV, and It was confirmed that it was increased by T7-CMV compared to lipofectamine (see Example 2.(3)).
  • the nanovesicles are derived from the cell membrane, enable targeting of desired cells without an immune response, are not toxic, and have an efficiency of intracellular delivery of nucleic acids and expression of nucleic acids compared to carriers used for existing material delivery. This is significantly superior.
  • composition for nucleic acid delivery comprising the nanovesicles for nucleic acid delivery.
  • nucleic acid “nanovesicle”, etc. may be within the above-mentioned range.
  • the composition may be administered or ingested to an individual, where “administration” means introducing a predetermined substance into the subject in an appropriate manner, and “ingestion” means introducing a predetermined substance into the subject for biological action. It refers to a method that can deliver to the required area, and “individual” refers to all living things, including rats, mice, and livestock, including humans. As a specific example, it may be a mammal, including humans.
  • the composition can be used in various fields, for example, as a pharmaceutical composition, a health functional food composition, or a cosmetic composition.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or lung disease, including the nanovesicle for nucleic acid delivery.
  • nucleic acid “nanovesicle”, etc. may be within the above-mentioned range.
  • cancer refers to a class of diseases characterized by the development of abnormal cells that grow uncontrollably and have the ability to invade and destroy normal body tissues.
  • the cancer is glioblastoma, brain tumor, head and neck cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, appendix cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, anal cancer, renal cancer, and ureteral cancer.
  • It may be one or more selected from the group consisting of bladder cancer, prostate cancer, penile cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, vulvar cancer, vaginal cancer, and skin cancer, and specifically, glioblastoma, brain tumor, breast cancer, lung cancer, colon cancer, and liver cancer.
  • lung disease may be a respiratory disease, and the respiratory disease may be any one of acute lung injury, pneumonia, asthma, chronic bronchitis, pneumoconiosis, tuberculosis, emphysema, chronic obstructive pulmonary disease, and cystic fibrosis.
  • Alveoli-capillaries are composed of alveolar epithelial cells and capillary endothelial cells, and the permeability of the alveolar-capillary barrier is increased, allowing osmotic fluid to enter the alveoli. Damage to endothelial cells increases vascular permeability, causing edema.
  • the loss of epithelial cells has important consequences: it causes the infiltration of osmotic fluid into the alveoli, and the mechanisms that remove accumulated edema may also be impaired. In addition, it causes surfactant abnormalities, and if epithelial cell damage is severe, pulmonary fibrosis may progress due to insufficient repair action.
  • inflammatory cytokines initiate and amplify the inflammatory response.
  • advanced glycation end products such as S100B and HMGB1 bind to the receptor for advanced glycation end-products (RAGE), which is specifically expressed in type 2 epithelial cells, increasing the expression of inflammatory cytokines. You can do it.
  • RAGE advanced glycation end-products
  • prevention may refer to any action that suppresses or delays the onset of cancer or lung disease in an individual by administering a pharmaceutical composition according to one aspect.
  • treatment may refer to any action in which symptoms of cancer or lung disease in an individual are improved or beneficially changed by administration of a pharmaceutical composition according to one aspect.
  • the pharmaceutical composition may contain the active ingredient alone, or may be provided as a pharmaceutical composition including one or more pharmaceutically acceptable excipients or diluents.
  • the pharmaceutical composition When the pharmaceutical composition is formulated, it may be prepared using commonly used diluents or excipients such as lubricants, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants. You can.
  • Solid preparations for oral administration may include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations may contain at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, or sucrose. ) or it can be prepared by mixing lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc can also be used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • suppositories As a base for suppositories, witepsol, macrogol, tween 61, cacao, laurin, glycerogeratin, etc. can be used, and when manufacturing in the form of eye drops, known diluents or excipients can be used. there is.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutical composition for preventing or treating other cancers or lung diseases.
  • the pharmaceutical composition may be provided in combination with a conventionally known pharmaceutical composition for the prevention or treatment of other cancers or lung diseases, or an existing pharmaceutical composition for the prevention or treatment of other cancers or lung diseases, and may be provided in combination with the other cancers or lung diseases.
  • Pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of lung diseases include conventionally known pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of other cancers or lung diseases, existing pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of other cancers or lung diseases, or newly developed pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of other cancers. Alternatively, it may be a pharmaceutical composition for preventing or treating lung disease.
  • the pharmaceutical composition further includes a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of other cancers or lung diseases, it is important to mix the amount to obtain the maximum effect in the minimum amount without side effects, which can be easily done by those skilled in the art. can be decided.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with a known composition having an effect for preventing or treating cancer or lung disease or a pharmaceutical composition for preventing or treating other cancer or lung disease, and may be administered simultaneously, separately, or sequentially. It can be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition can be administered orally or parenterally, and when administered parenterally, it is administered externally to the skin or intraperitoneally, intrarectally, subcutaneously, intravenously, intramuscularly, intraarterially, intramedullaryly, or intracardially. , intrathecal injection, transdermal injection, intranasal injection, enteral injection, local injection, sublingual injection, intrarectal injection, or intrathoracic injection.
  • the pharmaceutical composition is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type and severity of the patient's disease, the activity of the drug, and the drug's effect. sensitivity, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field. For example, nanovesicles in the pharmaceutical composition are subject to administration.
  • the pharmaceutical composition may be administered once a day or may be administered several times. For example, it may be administered every other day, or it may be administered once a week.
  • Another aspect provides a method for preventing or treating cancer or lung disease, comprising administering the nanovesicle for nucleic acid delivery to an individual in need thereof.
  • the method may be administered in combination with a known composition or other anticancer agent that has the effect of preventing or treating cancer or lung disease, may be administered simultaneously, separately, or sequentially, and may be administered single or multiple times. . Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • Another aspect provides the use of the nanovesicles for nucleic acid delivery for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of cancer or lung disease.
  • cancer cardiovascular disease
  • prevention prevention
  • treatment treatment
  • nucleic acid etc. may be within the scope described above.
  • Another aspect includes obtaining phospholipids by separating the cell membrane of a cell isolated from an individual;
  • It provides a method for producing nanovesicles for nucleic acid delivery, including the step of mixing the phospholipid bilayer and a nucleic acid bound to a hydrophobic material to obtain a phospholipid bilayer bound to the targeting material and the nucleic acid.
  • the “entity”, “cell membrane”, “phospholipid”, “hydrophobicity”, “targeting”, “phospholipid bilayer”, “nucleic acid”, “nanovesicle”, etc. may be within the above-mentioned range.
  • the step of separating the cell membrane of the manufacturing method includes sonication of the cells
  • sonication refers to various purposes such as extracting or breaking down various substances, and according to one aspect, the sonication is used to break down the cell membrane of the cell.
  • centrifugation refers to the separation of solid particles or fine particles in a liquid by centrifugal force. Since centrifugation has a superior separation power compared to separation by gravity, the density difference is small or separation is generally difficult. Even substances can be separated.
  • phospholipids can be obtained by separating (separating) the decomposed product of the cell membrane obtained through the ultrasonic treatment.
  • the centrifugation may be performed by one or more separation methods selected from the group consisting of differential centrifugation, sequential centrifugation, and ultracentrifuge, specifically.
  • the centrifugation may be performed using all of differential centrifugation, sequential centrifugation, and ultracentrifuge.
  • differential centrifugation refers to separating substances according to differences in height of a certain standard.
  • centrifugation refers to the separation of materials based on density in a centrifuge according to the centrifugal force experienced by the components of the sample.
  • the term “ultracentrifuge” refers to separating substances by rotating a tube containing a solution at ultra-high speed to generate a high gravitational field and increase the sedimentation rate of the solute.
  • the step of obtaining a phospholipid bilayer to which the targeting agent is bound is by mixing the targeting agent to which the phospholipids and a hydrophobic material are bound, so that the phospholipids form a phospholipid bilayer and at the same time, the hydrophobic material bound to the targeting material is mixed.
  • the substance interacts with the hydrophobic portion of the phospholipid (eg, van der Waals bond), causing the hydrophobic substance to exist in the hydrophobic portion of the bilayer of the phospholipid (between the phospholipid bilayers).
  • the targeting substance may exist in a hydrophilic region inside the phospholipid bilayer and in a hydrophilic region outside the phospholipid bilayer.
  • obtaining a phospholipid bilayer to which the targeting material is bound may include mixing the phospholipids and the targeting material and then extruding.
  • extrusion refers to a process used to create objects of fixed cross-sectional contour.
  • the step of obtaining a phospholipid bilayer to which the targeting material is bound includes mixing the phospholipids and the targeting material and then extruding, the targeting material does not induce aggregation of the phospholipid bilayers. It can prevent the diameter of the bound phospholipid bilayer from increasing and facilitate the binding of the targeting substance to the phospholipid bilayer.
  • T7c and cell membrane were extruded in the T7-CMNV manufacturing process. As a result, it was confirmed that it does not induce aggregation of T7c and the cell membrane, can limit the increase in size of T7-CMNV, and facilitates integration of T7 into the membrane (see Example 2(1)) .
  • the phospholipid and the targeting material are mixed in a ratio of 1:2 to 2:1, 1:2 to 3:2, 1:2 to 4:3, 2:3. to 2:1, 2:3 to 3:2, 2:3 to 4:3, 3:4 to 2:1, 3:4 to 3:2 or 3:4 to 4:3. You can.
  • the targeting material bound to the phospholipid bilayer because the amount is small, targeting of cells may not be sufficient, and if the amount of phospholipid is less than the targeting material compared to the mass ratio of 1:2 between the phospholipid and the targeting material, the targeting material that is not bound to the phospholipid bilayer may be As the amount increases, efficiency may decrease.
  • the phospholipid bilayer and the nucleic acid are mixed in a ratio of 10:1 to 1:1, 8:1 to 1:1, 6:1 to 1:1, and 10:1. to 2:1, 8:1 to 2:1, 6:1 to 2:1, 10:1 to 4:1, 8:1 to 4:1 or 6:1 to 4:1. You can.
  • the nucleic acid bound to the phospholipid bilayer If the amount of the nucleic acid is small, the target effect of the nucleic acid may not be effectively displayed, and if the amount of the nucleic acid is greater than the amount of the phospholipid than the mass ratio of the phospholipid bilayer and the nucleic acid is 1:1, it binds to the phospholipid bilayer. As the amount of unprocessed nucleic acid increases, efficiency may decrease.
  • Nanovesicles for nucleic acid delivery manufactured according to one aspect are derived from cell membranes, enable targeting of desired cells without an immune response, are not toxic, and have higher intracellular delivery efficiency of nucleic acids compared to carriers used for existing material delivery. The expression efficiency is significantly excellent.
  • Nanovesicles according to one aspect are derived from cell membranes, have no immune response or toxicity, can target desired cells, and have significantly improved intracellular delivery efficiency and nucleic acid expression efficiency compared to carriers used for existing material delivery. great.
  • the nanovesicles can reduce the size of tumor cells by moving to the target tumor cells, and the nanovesicles can be used for the prevention, improvement and/or treatment of cancer, and further, It can be used in various fields that require delivery and expression of nucleic acids in vivo.
  • Figure 1 is a schematic diagram illustrating AMO21c delivery using T7-CMNV in orthotopic rat glioblastoma models via intravenous (IV) injection.
  • Figure 2 is a diagram showing the physical characteristics of CMNV (cell membrane nanovesicles) and T7-CMNV. Specifically, Figure 2A is a diagram showing the results of analyzing the particle size of CMNV and T7-CMNV, and Figure 2B is a diagram showing the results of analyzing the particle size of CMNV/AMO21c. and T7-CMNV/AMO21c, Figure 2c shows the results of analyzing the zeta potential of nanovesicles, and Figure 2d shows the results of analyzing the stability of CMNV and T7-CMNV in aqueous solution.
  • Figure 2e is a diagram showing the results of analyzing the form of CMNV using transmission electron microscopy (TEM)
  • Figure 2f is a diagram showing the results of nano-vesicles to reconfirm the results from DLS and TEM.
  • This is a diagram showing the results of analysis using nano tracking (left panel: size distribution of CMNV, right panel: video frame).
  • Figure 3 is a diagram showing the results of analyzing the optimization of the ratio between CMNV and AMO21c.
  • Figure 4 is a diagram showing the results of analyzing the cytotoxicity of CMNV and T7-CMNV. Specifically, Figure 4A is a diagram showing the results of the MTT analysis, and Figure 4B is a diagram showing the results of the hemolysis analysis.
  • Figure 5 is a diagram showing the results of analyzing the in vitro AMO21c delivery efficiency.
  • Figure 5a is a diagram showing the results of analyzing the AMO21c delivery efficiency to C6 cells through flow cytometry (*** * P ⁇ 0.0001 compared to other groups)
  • Figure 5b shows the results of analyzing the delivery efficiency of AMO21c to C6 cells through fluorescence microscopy
  • Figure 5c shows the results of analyzing the delivery efficiency of AMO21c to N2A cells. (*P ⁇ 0.05, compared to other groups)
  • Figure 5D is a diagram showing the results of analyzing the delivery efficiency of AMO21c to HEK293 cells (n.s.: not statistically significant compared to each other).
  • Figure 6 shows the results of analyzing the transcytosis ability of T7-CMNV. Specifically, Figure 6a shows the results of measuring cell uptake of bEND.3 cells after 6 hours of culture using flow cytometry. Figure 6b shows the results of measuring the average fluorescence intensity of the basolateral medium after 6 hours of culture using a microplate reader, and Figure 6c shows the cell uptake of bEND.3 cells after 24 hours of culture using flow cytometry.
  • Figure 6d is a diagram showing the results of measuring the average fluorescence intensity of the basolateral medium after 24 hours of culture using a microplate reader (****P ⁇ 0.0001, **P ⁇ 0.01, *P ⁇ 0.05 compared to other groups (n.s.: not statistically significant compared to each other).
  • Figure 7 shows the results of AMO21c delivery to the brain of an animal model. Specifically, Figure 7a shows representative fluorescence images of organs, and Figure 7b shows relative signals of Cy5.5-AMO21c in the brain. ) is a diagram showing the results of analysis (*P ⁇ 0.05 compared to other groups), and Figure 7c is a diagram showing a representative image of the brain (*P ⁇ 0.05 compared to other groups).
  • Figure 8 is a diagram showing the results of in vivo toxicity evaluation of nanovesicles and Lipofectamine.
  • Figure 8a is a diagram showing the results of analyzing the toxicity of nanovesicles and Lipofectamine evaluated by body weight.
  • 8B is a diagram showing the results of analyzing the toxicity of aspartate aminotransferase (AST)
  • Figure 8C is a diagram showing the results of analyzing the toxicity of alanine transaminase (ALT: alanine transaminase).
  • Figure 8d is a diagram showing the results of analyzing the toxicity of blood urea nitrogen (BUN).
  • Figure 9 is a diagram showing the results confirming the inhibition of miR-21 by AMO21c delivery in an animal model (*P ⁇ 0.05 compared to the control group, lipofectamine/AMO21c and scrT7-CMNV/AMO21c groups).
  • Figure 10 shows the results of confirming the induction of PDCD4 and PTEN by AMO21c delivery in an animal model.
  • Figure 10a shows the results of immunohistochemistry with anti-PDCD4
  • Figure 10b shows the results of immunohistochemistry with anti-PDCD4.
  • Diagram showing the results of immunohistochemistry with anti-PTEN antibody (**** P ⁇ 0.0001 compared with other groups, * P ⁇ 0.05 compared with the CMNV/AMO21c and scrT7-CMNV/AMO21c groups).
  • Figure 11 is a diagram showing the results of confirming the size of the tumor (*P ⁇ 0.05 compared to the control group, lipofectamine/AMO21c and CMNV/AMO21c groups).
  • Figure 12 shows the results of analysis of the shape and size of nanovesicles using transmission electron microscopy (TEM).
  • TEM transmission electron microscopy
  • Figure 13 shows the results of measuring CMNV and exosomes loaded with AMO155c using a dynamic light scattering assay.
  • Figure 14 shows the results of measuring nucleic acid delivery efficiency by preparing AMO155c/CMNV and AMO155c/exosome at various ratios and administering them to LA4 cells.
  • Figure 15 shows the results of measuring the amounts of IL-1beta and IL-6 in bronchopulmonary lavage fluid and lung tissue 24 hours after treating AMO155c-loaded CMNV and exosomes in an acute lung injury animal model.
  • Figure 16 shows the results confirming that the inflammatory response is most effectively reduced in the case of AMO155c/CMNV through H&E staining.
  • C6 rat glioblastoma, N2a mouse neuroblastoma, HEK293 (Human embryonic kidney 293 cells), and bEND.3 cells were obtained from Korea.
  • Cell lines were purchased from Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea).
  • Fetal bovine serum (FBS) and Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) were purchased from Welgene (Seoul, Korea).
  • AMO21 Anti-microRNA-21 oligonucleotides
  • Cy5-AMO-21 were synthesized using Bioneer (Daejeon, Korea).
  • Cholesterol-modified T7 T7c, HAIYPRH-cholesterol
  • scrT7dc IRHPHYA-cholesterol
  • Bicinchoninic acid (BCA) assay kit 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bomide (MTT: 3-[4,5-dimethylthiazol- 2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbormide) and lipofectamine2000 were purchased from Thermo Scientific (Rockford, IL). Extruder kits were purchased from Avanti (Birmingham, AL). Cy5.5 NHS ester, anti-Ki67 antibody and The in situ BrdU-Red DNA fragmentation transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay kit was purchased from Abcam (Waltham, MA).
  • Anti-PDCD4 antibody was purchased from Bethyl (Montgomery, TX), and PTEN antibody was purchased from Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX).
  • the miRNeasy FFPE kit was purchased from Qiagen (Valencia, CA), the Iscript cDNA synthesis kit was purchased from Bio-Rad (Hercules, CA), and the SensiFAST SYBR No-ROX kit was purchased from Bioline (Boston, MA).
  • T7-CMNV was prepared with C6 cell membranes to provide delivery of AMO21 to the brain.
  • the manufacturing schematic is shown in Figure 1, and the specific method is as follows.
  • C6 cell membranes were isolated by differential centrifugation. Afterwards, the cell membrane was mixed with T7c, and the mixture was extruded to prepare CMNV (cell membrane nanovesicles).
  • T7 peptide is a well-known ligand that binds to transferrin receptors on endothelial cells in blood vessels or tumor cells, and is overexpressed on tumor cell membranes, including C6 cell membranes. After binding, it facilitates transcytosis, resulting in passage through the blood-brain barrier (BBB).
  • BBB blood-brain barrier
  • T7-CMNV can cross the BBB and target C6 tumor cells in the brain.
  • this advantage of the T7 peptide may hinder T7-CMNV production.
  • T7c has two moieties that can interact with CMNV. Cholesterol can interact with CMNV by hydrophobic interactions, and T7 can interact with the transferrin receptor of CMNV produced on C6 cell membranes because the membrane contains the transferrin receptor. Therefore, T7c may contribute to inter-CMNV interactions, and accumulation of these interactions may lead to aggregation. Indeed, preparation of T7-CMNV without extrusion induced aggregation in our studies, and extrusion appears to be necessary to prepare nano-sized membrane vesicles with T7c.
  • the method for manufacturing nanovesicles for the treatment of acute lung injury is the same as the method for producing nanovesicles for the treatment of glioblastoma.
  • Cell membranes were separated from 293 cells and LA4 mouse lung epitheal cells and used for cell and animal experiments, respectively. The cell membrane was separated using a differential centrifugation method like the nanovesicles previously applied to the brain tumor model.
  • CMNV was manufactured using extrusion from the separated cell membrane. Since nucleic acid drug delivery to the lungs uses a direct delivery method through inhalation, it was used without additional attachment of a targeting ligand.
  • Cell membranes were as previously described. It was isolated. Briefly, C6 cells were cultured in 10% FBS containing DMEM until confluency reached nearly 100%. Cells were washed twice with DPBS and harvested with scrapers. After resuspension in DPBS, cells were treated with protease inhibitor cocktail and lysed using sonication for 3 minutes. Internal cellular components were removed through sequential centrifugation at 3,500 g for 10 minutes and 20,000 g for 25 minutes at 4°C. Afterwards, the supernatant was centrifuged at 100,000 g for 50 minutes at 4°C. The resulting pellet contained cell membrane.
  • CMNV Cell membrane nanovesicles
  • T7-CMNV Cell membrane nanovesicles
  • CMNV and T7-CMNV were stored at 4°C and measured every 3 days. Additionally, nano-tracking analysis was performed to collect complementary information on the characteristics of CMNV and its actual concentration within the Nanosight system (Malvern Instruments, Malvern, UK).
  • AMO155c was used as a nucleic acid treatment to inhibit miRNA-155, whose expression is increased in acute lung injury tissue.
  • Various amounts of AMO155c were mixed with a fixed amount of CMNV and left for 30 minutes at room temperature.
  • AMO155c was loaded onto CMNV by hydrophobic interactions between the cholesterol of AMO155c and the cell membrane. Loading of AMO155c into exosomes was also performed in the same manner.
  • CMNV and T7-CMNV were prepared in the presence or absence of AMO21c.
  • Mesh copper grids (Ted Pell, Redding, CA) were washed with droplets of distilled water. Afterwards, samples were loaded onto grids and incubated for 30 minutes at room temperature. The droplets of the sample were soaked in absorbent paper and dried in a vacuum chamber. For negative staining, 2% tungstic acid was used, and samples were observed using TEM (JEM-2100F, JEOL, Tokyo, Japan).
  • CMNV sulfate-polyacrylamide gel
  • C6 lysates were prepared using sonication of C6 cells for 3 minutes with protease inhibitor cocktail treatment. Samples were analyzed using SDS-PAGE on 12% gel.
  • Flow cytometry was performed to evaluate cellular uptake of nanovesicles under various conditions.
  • C6, N2a and HEK293 cells were incubated at 5% CO at 37°C.
  • Cells were seeded in a 12-well microassay plate at a density of 2 Incubation was performed in a CO 2 incubator for 24 hours.
  • Culture medium was freshly replaced before transfection.
  • Cy5-AMO21c-loaded T7-CMNVs (T7-CNV/Cy5-AMO21c) were prepared at an optimal ratio and added to cells. The amount of Cy5-AMO21c was fixed at 0.2 ⁇ g/well.
  • C6 cells per well They were seeded on a chamber slide at a density of 1 ⁇ 10 5 cells. T7-CMNV/Cy5-AMO21c was transfected into cells as described above. Cells were washed twice with DPBS, and nuclei were stained with DAPI. The stained sections were mounted and observed using AxioScan, a Z1 digital slide scanner (ZEISS, Oberkochen, Germany).
  • nanovesicles were analyzed using transmission electron microscopy (TEM).
  • TEM transmission electron microscopy
  • AMO155c nucleic acid:carrier weight ratio 1:3
  • CMNV CMNV
  • CMNV and exosomes loaded with fluorescently labeled therapeutic nucleic acids were each administered to cultured LA4 mouse lung epithelial cells (1 ⁇ g AMO155c/1 ⁇ 10 5 cells), and after a certain period of time, the therapeutic nucleic acids transferred into the cells were analyzed through flow cytometry. The amount was measured.
  • bEND.3 mouse endothelial cells were grown in 12-well transwell plates (Corning, New York, NY) with 10% FBS containing DMEM. The apical side of the region was seeded at a density of 4 ⁇ 10 5 cells per well to mimic the BBB in vitro. When the TEER value reached >200 ⁇ cm 2 , T7-CMNV/Cy5.5-AMO21c was added after medium replacement. After 6 and 24 hours of incubation, bEND.3 cells and medium from the basolateral side were obtained. Average fluorescence intensity was measured from bEND.3 cells using FACS or from medium using a microplate reader.
  • C6 cells were seeded per well in 96-well microassay plates as described above. Seeded at a density of 1 ⁇ 10 4 cells. CMNV and T7-CMNV were added to the cells after medium replacement and ranged from 5 ⁇ g/well to 39 ng/well by two-fold serial dilution. Lipofectamine was used as a control, and after 4 hours of incubation, the culture medium was replaced and the cells were incubated at 37°C for an additional 20 hours. Afterwards, 10 ⁇ g of MTT per well was added to the cells and incubated for an additional 4 hours at 37°C.
  • SD Sprague Dawley rats and centrifuged in EDTA-containing tubes at 500 g for 3 minutes. Plasma was removed, and red blood cells (RBC) were washed three times with DPBS. The resuspended RBCs were transferred to microtubes and incuba
  • C6 glioblastoma cells (1x10 5 cells in 10 ⁇ l of PBS per animal) were injected into 7-week-old male SD rats with stereotaxic equipment under anesthesia. The coordinates of the injection were 3.0 mm lateral to bregma and 4.0 mm deep from the skull surface. Injection was performed at a rate of 0.9 ⁇ l/min.
  • T7-CMNV/AMO21c was injected intravenously through the tail vein at a dose of 60 ⁇ g APMO21c in 900 ⁇ l DPBS.
  • the APMO21c was administered in an average amount of 60 ⁇ g based on an average weight of 250 g using 6-week-old male SD rats, and was administered in an amount of about 240 ⁇ g per kg, and in the case of nanovesicles (phospholipids) and T7 , an amount equivalent to 5 times that of AMO21c (1200 ⁇ g of nanovesicles (phospholipids) and T7 per kg) was administered based on weight ratio. Rats were sacrificed one week after intravenous injection, and brains were obtained. The tissue was fixed with 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin.
  • An acute lung injury animal model was prepared by administering a certain amount (20 ⁇ g/animal) of LPS through the airway.
  • AMO155c/CMNV and AMO155c/exosome were loaded at a weight ratio of 1:3.
  • CMNV and exosomes loaded with AMO155c were administered intratracheal administration. 5 ⁇ g of AMO155c was administered to each animal.
  • Paraffin-embedded brain tissues were cut into 5- ⁇ m-thick sections. Sections were stained with 0.1% cresyl violet, destained with 70% ethanol and 10% acetic acid, and dehydrated with 100% ethanol and xylene. Images of the sections were analyzed using Image J software.
  • the sequences of the miR-21 primers used were as follows: forward primer, 5'-GCCCGCTAGCTTTATCAGACTGATG-3' (SEQ ID NO: 2) and reverse primer, 5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' (SEQ ID NO: 3).
  • sequences of the GAPDH primers used were as follows: forward primer, 5'-AGACAGCCGCATCTTCT TGT-3' (SEQ ID NO: 4) and reverse primer, 5-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3' (SEQ ID NO: 5).
  • Paraffin-embedded brain tissue was cut into 5- ⁇ m-thick sections. Sections were deparaffinized and sequentially rehydrated. Samples were washed twice for 5 minutes with 0.05% PBST and blocked with PBS containing 10% goat serum and 1% BSA for 2 hours at room temperature. Rabbit anti-PDCD4 antibody, mouse anti-PTEN antibody, or mouse anti-Ki67 antibody was diluted 1:500 in PBS containing 1% BSA. Sections were incubated with antibodies overnight at 4°C. Samples were washed twice and visualized with AxioScan. TUNel analysis was performed with the Deadend TUNEL system kit according to the manufacturer's manual for detection of cell death.
  • T7-CMNV/Cy5.5-AMO21c was injected intravenously into rats via the tail vein. Fluorescence distribution of Cy5.5-AMO21c The investigation was conducted using an in vivo imaging system (FOBI system, Neo Science, Suwon, Korea). The rat glioblastoma model was prepared as described above and T7-CMNV/Cy5.5-AMO21c was injected at a dose of 60 ⁇ g of AMO21c per rat.
  • the APMO21c was administered in an average amount of 60 ⁇ g based on an average weight of 250 g using 6-week-old male SD rats, and was administered in an amount of about 240 ⁇ g per kg, and in the case of nanovesicles (phospholipids) and T7 , an amount equivalent to 5 times that of AMO21c (1200 ⁇ g of nanovesicles (phospholipids) and T7 per kg) was administered based on weight ratio. Rats were sacrificed 2 or 18 hours after injection, and ex vivo fluorescence images were analyzed using NEOimage software (Neoscience, Suwon, Korea).
  • AMO21c was loaded onto the vesicles by hydrophobic interaction. Loading of oligonucleotides into nanovesicles was performed using electroporation, sonication, or transfection reagents. However, the loading efficiency of oligonucleotides into nanovesicles is not good, while the loading efficiency by electroporation is about 1 to 5%. Therefore, most of the oligonucleotides were not loaded, resulting in poor delivery efficiency. In this study, AMO21 was conjugated with a cholesterol moiety to generate AMO21c. AMO21c was mixed with CMNV and AMO21c was loaded onto CMNV by hydrophobic interactions.
  • CMNV complementary metal-oxide-semiconductor
  • AMO21c was modified with a methyl group at the 2'-position and was not degraded by nucleases in serum. Additionally, the loading efficiency of AMO21c against CMNV and T7-CMNV was measured. Cy5-labeled AMO21c was prepared and mixed with nanovesicles. Nanovesicles were isolated by ultracentrifugation. The results were 14.58 ⁇ 3.08% and 15.1 ⁇ 1.97% for CMNV and T7-CMNV, respectively. Electroporation has been widely performed to load microRNAs (miRNAs) into nanovesicles, but it is diffusion-dependent, which limits its efficiency. Therefore, hydrophobic modification for loading of miRNAs may be an option to increase efficiency.
  • miRNAs microRNAs
  • T7-CMNV tended to increase with the ratio of CMNV and T7c ( Figure 2a).
  • the increase in particle size can be induced by two causes.
  • T7c can interact with the C6 cell membrane through two interactions, a hydrophobic interaction with cholesterol and a ligand-receptor interaction with the T7 peptide, as described above. These interactions enable interparticle interactions and contribute to the increase in particle size.
  • extrusion may limit the size increase of T7-CMNV, and particle size was not found to increase significantly at 1:4 compared to other tested ratios (Figure 2a).
  • CMNV surface decoration using T7 peptide can increase particle size.
  • T7c and cell membrane in the T7-CMNV preparation process facilitated the incorporation of T7 into the membrane. Some may be located on the outside of the CMNV, on its surface, while others may make it inside the CMNV. Therefore, the T7 peptide on the surface of CMNV may contribute to the increase in particle size.
  • CMNV Interaction between CMNVs by T7c may contribute more significantly to the increase in size than the other two possible explanations. This guess was based on size assessment after loading AMO21c on CMNV. AMO21c was incubated with T7-CMNV or CMNV and loaded on the surface by hydrophobic interaction with cholesterol. The ratio between CMNV and AMO21c was fixed at a mass ratio of 5:1 based on cell uptake studies ( Figure 3). In the case of CMNV, the protein concentration bound to the CMNV membrane was quantified, and the number of nanovesicles per weight was measured at a protein concentration of 6.15 x 10 11 ⁇ 1.16 x 10 11 particles per 1 mg. The particle size of the generated CMNV was measured using dynamic light scattering.
  • the ratio between T7c and CMNV was fixed at a mass ratio of 1:1, where the average size of T7-CMNV/AMO21c was 176.96 nm ⁇ 0.65. .
  • CMNV and exosomes loaded with AMO155c were measured using a dynamic light scattering assay.
  • a dynamic light scattering assay As a result, when only naked AMO155c was present, micelles of unstable size were generated, but as the ratio of CMNV and exosomes increased, the size gradually became stable. In particular, CMNA showed a smaller size (see Figure 13).
  • CMNV The zeta potential of CMNV was confirmed to be approximately -13 mV because the cell membrane is negatively charged (Figure 2c).
  • CMNV and T7-CMNV are also important for therapeutic applications.
  • nanovesicles were incubated at 4°C for up to 21 days. Their stability was evaluated using dynamic light scattering. As a result, it was confirmed that the size of CMNV did not change significantly during incubation (Figure 2d).
  • the shape of CMNV was evaluated using TEM, and it was confirmed to be spherical ( Figure 2e).
  • NTA nanovesicles were again measured by NTA ( Figure 2f). Additionally, by comparing the NTA results with those of a routine bicinchoninic acid assay, the concentration of CMNV was accurately estimated: approximately 6.15 x 1 mg protein. 10 11 ⁇ 1.16 x 10 11 particles.
  • CMNV and T7-CMNV were assessed using MTT and hemolysis assays.
  • lipofectamine was used as a control for the AMO21c carrier.
  • the MTT assay confirmed that CMNV and T7-CMNV did not induce detectable toxicity in cells up to a concentration of 5 ⁇ g/ml ( Figure 4A). However, it was confirmed that toxicity in cells treated with lipofectamine increased significantly starting from 2.5 ⁇ g/ml ( Figure 4a).
  • the toxicity of cationic lipids may be due to charge interaction with the negatively charged cell membrane, and the charge interaction of the cationic gene carrier on the surface of the cell membrane may induce aggregation and cell membrane rupture, thereby reducing cell viability. Therefore, the toxicity of lipofectamine may be due to its cationic charge. In the case of CMNV and T7-CMNV, the surface charge is negative and there is no charge interaction with the cell membrane.
  • CMNV and T7-CMNV were evaluated through hemolysis studies.
  • AMO21c-loaded CMNV or T7-CMNV was evaluated in terms of toxicity.
  • CMNV/AMO21c and T7-CMNV/AM021c did not induce hemolysis ( Figure 4b).
  • lipofectamine/AMO21c significantly induced hemolysis ( Figure 4b). Lipofectamine/AMO21c may be less toxic than lipofectamine alone because the surface charge of lipofectamine is masked by the negative charge of AMO21c.
  • lipofectamine/AMO21c interacted with red blood cell membranes and induced hemolysis. These results are related to circulation time after intravenous (IV) injection. Lipofectamine aggregation with serum proteins may facilitate the uptake of lipofectamine/AMO21c by Kupffer cells in the liver, where they are rapidly eliminated. Therefore, compared to CMNV, aggregated particles such as lipofectamine are likely to accumulate in the liver instead of the brain, causing hepatotoxicity.
  • CMNV and T7-CMNV were assessed with Cy5-labeled AMO21c.
  • AMO21c-loaded CMNV CMNV/AMO21C
  • AMO2lc-loaded T7-CMNv T7-CCNV/AMO21c
  • T7-CCNV/AMO21c were added to C6 cells.
  • Naked AMO21c and Lipofectamine/AMO 21c were used as controls.
  • the cellular uptake efficiency of each sample was measured using flow cytometry. As a result, it was confirmed that T7-CMNV had the highest cellular uptake efficiency of AMO21c into C6 glioblastoma cells ( Figure 5a).
  • CMNV Lipofectamine, CMNV, and scrambled T7-CMNV (scrT7-CNV) were confirmed to have similar uptake efficiencies (Figure 5a).
  • the scrambled T7-CMNV is a CMNV using T7 that has the same sequence (composition) as the previously known T7 peptide, but has a different peptide sequence, and scrT7-CMNV did not increase the transfer efficiency compared to CNMV, which is due to the T7 -Suggesting that the increase in CMNV transmission may be due to the effect of the T7 peptide, this result was confirmed by fluorescence microscopy (Figure 5b).
  • T7-CMNV transduction efficiency of CMNV and T7-CMNV was compared in different types of cells.
  • Transduction assay using N2A neuroblastoma cells confirmed that T7-CMNV had higher transduction efficiency than CMNV and ScrT7-CNV ( Figure 5c).
  • Neuroblastoma is known to express transferrin receptors at higher levels than normal cells. It has been reported. Therefore, T7-CMNV may have a higher transduction efficiency in neuroblastoma cells due to more interactions with the transferrin receptor.
  • CMNV and scrT7-CMNV were observed to have similar transduction efficiencies to N2A cells. This confirmed that the higher efficiency of T7-CMNV was due to the effect of T7 peptide.
  • HEK293 cells were used to evaluate the transduction efficiency of T7-CMNV.
  • the same transfer study was performed with Cy5-AMO21c.
  • T7-CMNV did not induce AMO21c cell uptake compared to CMNV and scrT7-CMNV ( Figure 5d).
  • HEK293 cells do not express transferrin receptors at significant levels, and the effect of T7 peptide on the transduction efficiency of T7-CMNV to HEK 293 cells was limited.
  • Transferrin receptor is overexpressed both on glioblastoma cells and endothelial cells of the BBB. Accordingly, ligands for the transferrin receptor have been extensively studied for glioblastoma targeting and transcytosis across the BBB to the brain. Thereby, BBB transcytosis and cancer targeting can be achieved simultaneously with a single targeting ligand. there is.
  • transwell experiments using CMNV and T7-CNV were performed.
  • bEND.3 mouse endothelial cells were seeded on the apical side of the transwell and cultured for the endothelial layer.
  • Cy5-AMO21c-loaded CMNV or T7-CMNV was added to bEND.3 cells, and lipofectamine/Cy5-AMO21c was used as a control.
  • positive fluorescent signals in bEND.3 cells on transwells and medium from the basolateral side of the microassay plate were measured using flow cytometry and a microplate reader. After 6 hours of incubation, the fluorescence signal in bEND.3 cells increased after addition of T7-CMINV/AMO21c, compared to CMNV/AMO21c and scrT7-CMNv/AM021c ( Figure 6a).
  • T7-CMNV The delivery efficiency of T7-CMNV was evaluated through biodistribution studies. Lipofectamine, CMNV and ScrT7-CMNV were used as negative controls. Cy5.5-AMO21c was loaded onto CMNV, T7-CMNV and scrT7-CMNV by hydrophobic interaction. Additionally, lipofectamine/Cy5.5-AMO21c was prepared through charge interaction. Eighteen hours after intravenous injection of samples into the tail vein, organs were harvested and fluorescence signals were observed in the image box. Most AMO21c was observed in liver and kidney. In particular, lipofectamine/AMO21c was confirmed to be more highly absorbed into the liver than CMNV using AMO21C (FIG. 7a).
  • CMNV may have tumor-targeting effects associated with isoform targets.
  • this effect was not observed in this study, and the delivery efficiency of CMNV and ScrT7-CMNV was similar to lipofectamine without the brain targeting moiety. This may be because CMNV cannot enter the brain through the BBB and brain-targeting ligands, such as T7 peptide, are unavoidable.
  • Orthotopic glioblastoma models were prepared by injecting C6 cells into the rat brain.
  • T7-CMNV/AMO21c was inoculated into the tail vein. It was injected intravenously. Lipofectamine/AM021c, CMNV/AMO21c and scrT7-CMNV/AM021c were injected as controls. Seven days after injection, animals were sacrificed and brains were collected.
  • RT-PCR was performed to amplify miR-21. As a result, it was confirmed that the level of miR-21 was decreased after injection of CMNV/AMO21c and T7-CMNV/AM021c ( Figure 9). In particular, the reduction of miR-21 by T7-CMNV/AMO21c was higher than that by CMNV/AM021c, and this result means that T7-CMNV improved the delivery efficiency of AMO21c to the brain compared to CMNV.
  • PDCD4 and PTEN expression were assessed in brain samples to assess target gene expression.
  • PDCD4 and PTEN are target genes of miR-21 and have miR-21 recognition sites within their three 5'-UTRs.
  • Down-regulation of PDCD4 and PTEN was closely associated with high survival rate of tumor cells in the tumor environment. Therefore, AMO21c delivery can inhibit miR-21 and increase PDCD4 and PTEN expression, and it was confirmed that PDCD4 expression was increased by T7-CMNV/AMO21c, as shown in Figure 10a.
  • T7-CMNV/AMO21c increased PDCD4 expression more efficiently than other samples, such as CMNV/AM021c and scrT7-CMNV/AM021c ( Figure 10A), and as shown in Figure 7, CMNV/AMO21c increased T7 -It did not penetrate the brain as efficiently as CMNV/AM021c, suggesting that T7 peptide increased the delivery efficiency of AMO21C to the brain. Therefore, facilitated delivery of AMO21c by the T7 peptide of T7-CMNV can enhance PDCD4 expression in the brain, and results similar to the above were observed in PTEN immunohistochemistry. It was confirmed that PTEN expression was most efficiently induced by intravenous administration of T7-CMNV/AMO21c (FIG. 10b).
  • Ki67 expression is largely proportional to cancer severity.
  • the enhanced reduction of Ki67 by T7-CMNV/AMO21c may be due to more efficient delivery of AMO21C into the brain by T7-CNV, which suggests that the T7 peptide on the surface of T7-CCNV induces AMO2lc into the brain through the BBB.
  • the tumor size of the samples was assessed through Nissl staining. Tumor size across all groups treated with AMO21c was reduced. In particular, T7-CMNV/AMO21c was confirmed to reduce tumor size most efficiently compared to other samples (FIG. 12). The other group also reduced tumor size by about 40%, but the effect was not as significant as T7-CMNV/AMO21c. Specifically, CMNV/AMO21c and scrT7-CMNV/AM021c had a lower effect than T7-CMNV and AMO21C on tumor size, further suggesting the effect of T7 peptides on tumor-targeted delivery across the BBB.
  • AMO155c/CMNV and AMO155c/exosome were prepared at various ratios and administered to LA4 cells to measure nucleic acid delivery efficiency.
  • excellent transfer efficiency was shown at a ratio of 1:3, and almost similar efficiency was shown at ratios above that. Therefore, a ratio of 1:3 was used in animal experiments.
  • the transfer efficiency was improved in the case of exosomes, the transfer efficiency was much improved in the case of CMNV (see Figure 14).
  • the effect of treating acute lung injury was measured by measuring the amount of IL-1beta and IL-6 in bronchopulmonary lavage fluid and lung tissue 24 hours after treating AMO155c-loaded CMNV and exosomes in an animal model of acute lung injury (see Figure 15). ).
  • polyethylenimine 25 kDa, PEI25k
  • a cationic polymer was also used as a carrier.
  • AMO155c/CMNV could most effectively reduce IL-1beta and IL-6 (A, B measured in bronchopulmonary lavage fluid, C, D measured in lung tissue extract).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

일 양상은 세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 나노소낭은 세포막으로부터 유래하여 면역 반응 및 독성이 없으며, 원하는 세포의 타겟팅이 가능하고, 기존의 물질 전달에 사용되는 전달체들에 비해 핵산의 세포 내 전달 효율 및 핵산의 발현 효율이 현저히 우수하다. 또한, 상기 나노소낭이 표적하는 종양 세포로 이동함으로써, 종양 세포의 크기를 감소시킬 수 있음을 직접 확인하였는 바, 상기 나노소낭은 암의 예방, 개선 및/또는 치료에 활용될 수 있으며, 나아가, 생체 내 핵산의 전달 및 발현이 필요한 다양한 분야에 활용될 수 있다.

Description

세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법
세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
교모세포종은 원발성 뇌 종양의 대부분을 나타내고, 전세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나이다. 뇌로부터 다른 기관으로의 전이가 드물게 보고되지만, 교모세포종의 환자의 평균 생존율은 지금까지 절망적이다. 현재, 교아종의 임상 옵션은 외과적 절제 또는 방사선/화학요법이 있으나, 이들은 5년 생존율을 유의하게 개선하지 못하였다. 이러한 상태 때문에, 교모세포종에 대한 효율적인 치료를 개발하기 위한 다양한 연구 노력이 이루어졌다. 교모세포종에 대한 치료 유전자로서, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(HSVtk: herpes simplex virus thymidine kinase) 유전자가 전임상 및 임상 환경에서 조사되었다. HSVtk 유전자 요법은 동물 실험에서 긍정적인 효과를 나타내었다. 또한, HSVtk 유전자 요법을 평가하는 임상 시험을 화학요법 및 방사선요법과 조합하여 수행하였다. 그러나, 시험 결과는 만족스럽지 않았다. 또 다른 예로서, 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 교모세포종 유전자 요법에 대해 조사하였다. siRNA 녹다운에 대해 표적화된 다양한 널리 보고된 유전자가 리뷰 논문에 기재되어 있고, 5개 중 일부는 혈관 내피 성장 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor), 저산소증 유도 인자(HIF-1α: hypoxia-inducible factor-1α) 및 열 충격 단백질 70(HSP70: heat shock protein 70) 유전자를 포함한다. 이들 유전자는 저산소 조건 하에서 종양 세포의 생존에 관여한다. 이들 siRNA의 효능이 동물 연구에서 잘 확립되어 있지만, 추가의 연구가 임상 적용에 필요하다.
급성폐손상(Acute Lung Injury)은 감염, 외상, 출혈 등으로 인해 폐속의 모세혈관이나 폐포가 손상을 받음으로써, 폐에서 호흡이 원활하게 이루어지지 않아 생명이 위험하게 된 상태를 말한다. 중증의 경우 급성호흡곤란증후군(Acute Respiratory Distress Syndrome)라고 한다. 국내에서는 사망률이 71.9%에 이르고 있으며, 최근 COVID-19 감염 등 급성폐손상의 발생이 크게 증가하였다. 급성폐손상은 사망률이 30~40%에 이르는 질병으로 인공호흡기와 같은 산소공급이 주된 치료 방법이며, 항염증제와 같은 약물치료는 연구단계에 머무르고 있는 실정이다.
급성폐손상 치료를 위해서 급성폐손상을 유발한 기저질환에 대한 치료, 인공호흡기 등 기계호흡을 이용한 가스교환 유지, 체외막형 산소섭취법 등을 적용하고 있으며, - 스테로이드 항염증제, 계면활성제 등 약물요법이 연구되었지만, 생존률 증가가 입증되지 않았다. 고용량 스테로이드의 사용은 감염 위험성을 높여, 환자 사망률을 높였다는 보고가 있다.
최근 항염증 효과를 가진 치료유전자인 heme oxygenase-1 (HO-1), adiponectin, antisense miRNA-155 등을 투여하여, 치료효과를 유도하는 기술이 개발되고 있다. 또한, 최근 나노입자 기술을 응용하여, 핵산/약물의 전달효율을 개선하는 기술이 개발되고 있다. 그러나, 나노입자를 이용한 핵산/약물 전달 기술은 현재까지 전달의 효율성이 낮고, 나노입자의 안전성 및 면역원성 등 해결해야 할 여러문제들을 가지고 있어서, 임상 시험에 진입하지 못하고 있다. 따라서, 생체막유래의 나노소낭을 기반으로 하는 신규 핵산 전달 기술은 위의 문제를 해결할 수 있는 새로운 전달기술의 가능성이 높다.
비교적 최근에, 마이크로RNA(miRNA: microRNA)가 종양 세포 생존에 관여한다는 것이 제안되었다. 일부 miRNA가 종양 조직에서 유도되었고 종양 세포의 증식 및 생존을 촉진하였다. 구체적으로, miRNA 중 miR-21은 세포 사멸-관련 유전자, 예컨대 포스파타제(phosphatase), 텐신 상동체(PTEN: tensin homolog) 및 프로그램화된 세포 사멸 단백질 4(PDCD4: programmed cell death protein 4)의 mRNA 분해를 용이하게 하고, 항-miR-21 올리고뉴클레오티드(AMO21: anti-miR-21 oligonucleotide) 전달은 miR-21 수준을 감소시키고 결과적으로 종양 조직에서 PTEN 및 PDCD4의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다.
AMO21은 교모세포종 내로의 전달 효율에 의존하고, 초기-단계 연구에서, 정맥내 AMO21 투여는 동물 모델에서 항-종양 효과를 나타낸다. 그러나, 네이키드 AMO21(naked AMO21)의 전달 효율은 혈액-뇌 장벽 (BBB: blood-brain barrier)으로 인해 매우 효율적이지 않았고, 이는 높은 수준의 투여가 요구된다는 것을 시사한다. 뇌에 들어가는 분자를 여과하는 BBB로 인해, 뇌 질환에 대한 효율적인 약물 전달 플랫폼을 개발하는 것이 매우 어렵다. BBB를 피하거나 우회하기 위해, 다양한 접근법이 사용되어 왔다. 예를 들어, 정위 장비를 사용한 국소 주사 또는 비강내 투여가 코에서 뇌의 전달에 대해 평가하였다. 그러나, 직접 주사는 주사 바늘로 인해 정상 뇌 조직뿐만 아니라 종양 조직에 대한 추가의 손상을 야기할 수 있고, 비강내 투여에 의한 전달 효율은 일관되지 않고 용량 제어에 어렵다. 또한, 투여에 이용가능한 비교적 작은 부피 및 짧은 체류 시간은 비강 전달에 대한 주요 단점이다. 비교적 최근에, 뇌-표적화된 엑소좀이 AMO21을 뇌로 전달하기 위해 개발되고, T7-펩티드-장식된 엑소좀(T7-exo)은 BBB를 통한 뇌로의 AMO21 전달을 용이하게 하고 종양 크기를 감소시켰다. 엑소좀 자체는 BBB를 통해 뇌 내로 침투할 수 있지만, T7 펩타이드로 표면 장식을 하면 뇌 종양 부위 내로의 AMO21의 전달 효율이 증가된다.
그러나, 엑소좀은 뇌로의 치료 시약의 전달을 위한 유망한 세포외 소포이지만, 일부 장애물이 다루어진다. 첫째, 동물 세포로부터의 엑소좀의 생산 효율은 효율적이지 않다. 둘째, 엑소좀 함량은 제어될 수 없고, 엑소좀은 그의 공급원 세포에 따라 달라질 수 있다. 엑소좀 공급원의 신중한 선택은 부작용을 감소시킬 수 있지만, 상기와 같은 문제는 아직까지 완전히 완화하기 어려운 실정이었다.
이에, 교모세포종 및 급성폐손상의 치료에 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 핵산의 전달 및 발현에 활용될 수 있는 전달체의 개발의 필요성이 대두되었고, 본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 세포막으로부터 분리된 인지질을 이용하여, 엑소좀-모방 세포막 나노소낭(CMNV: cell membrane nanovesicles)를 개발하기에 이르렀다.
일 양상은 세포막 유래 인지질 이중층;
상기 인지질 이중층의 소수성 부위에 결합된 표적화 물질; 및
상기 인지질 이중층의 소수성 부위에 결합된 핵산을 포함하는 핵산 전달용 나노소낭을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 포함하는 핵산 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 핵산 전달용 나노소낭의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 세포의 세포막을 분리하여 인지질들을 얻는 단계;
상기 인지질들과 소수성 물질이 결합된 표적화 물질을 혼합하여 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계; 및
상기 인지질 이중층과 소수성 물질이 결합된 핵산을 혼합하여 상기 표적화 물질과 상기 핵산이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계를 포함하는 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 세포막 유래 인지질 이중층;
상기 인지질 이중층의 소수성 부위에 결합된 표적화 물질; 및
상기 인지질 이중층의 소수성 부위에 결합된 핵산을 포함하는 핵산 전달용 나노소낭을 제공한다.
상기 용어 “세포막(cell membrane)”이란 모든 세포가 가지고 있으며, 세포 내부와 외부를 서로 구분해주는 구성요소를 의미한다. 상기 세포막은 인지질 및 단백질 분자로 구성된 얇고 구조적인 인지질 이중층으로 되어 있으며, 선택적인 투과성을 지닌다.
일 양상에 있어서, 상기 세포막은 다양한 세포로부터 유래하는 세포막일 수 있고, 암 세포로부터 유래되는 세포막일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포막은 교아종, 신경아세포종, 인간 배아 신장 세포, 뇌 세포, 인간 섬유아세포 또는 비소세포성 폐암 세포로부터 유래되는 세포막일 수 있다.
상기 용어 “인지질(phospholipid)”이란 당지질, 콜레스테롤, 단백질과 함께 생체막의 주요 성분으로 인을 포함하는 지질의 일종을 의미하고, 상기 인지질은 소수성 부위(꼬리)와 친수성 부위(머리)로 이루어져 있다.
상기 용어 “친수성(Hydrophile)”이란 물 분자, 구체적으로 극성 분자와 쉽게 결합되는 성질을 의미하며, 상기 용어 “소수성(Hydrophobe)”이란 물 분자, 구체적으로 극성 분자와 쉽게 결합되지 못하는 성질을 의미하고, 일반적으로 극성을 띠지 않으면 소수성을 띤다.
상기 용어 “인지질 이중층(phospholipid bilayer)”이란 상기 인지질의 소수성 부위(꼬리)가 서로를 마주보고, 친수성 부위(머리)가 각각 인지질 이중층의 내부 및 외부와 접하거나, 상기 인지질의 친수성 부위(머리)가 서로를 마주보고, 소수성 부위(꼬리)가 각각 인지질 이중층의 내부 및 외부와 접하는 이중 구조를 의미한다. 구체적으로, 상기 인지질은 극성(친수성) 또는 비극성(소수성) 용매 하에서 이중층을 형성할 수 있고, 보다 구체적으로 상기 인지질이 존재하는 환경이 소수성인 경우, 상기 인지질의 친수성 부위가 서로를 마주보고 소수성 부위가 인지질 이중층의 내부 및 외부와 접하고, 상기 인지질이 존재하는 환경이 친수성인 경우, 상기 인지질의 소수성 부위가 서로를 마주보고 친수성 부위가 인지질 이중층의 내부 및 외부와 접하도록 이중 구조가 형성된다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질 이중층은 세포의 세포막으로부터 유래되며, 상기 세포의 세포막에 존재하는 막단백질, 당지질 등 다양한 구성 요소가 포함될 수 있다.
상기 용어 “표적화(targeting)”란 물질이 세포 내부나 세포 외부의 적절한 목적지로 수송되는 생물학적 메커니즘을 의미하고, 상기 표적화 물질은 상기 표적화에 도움을 주는 물질을 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 표적화 물질은 T7 펩티드(T7 peptide), RAGE 부착 펩티드 (Receptor for advanced glycation end products binding peptide), 클로로톡신(Chlorotoxin), 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2) 및 광견병 바이러스 글라이코단백질(Rabies virus glycoprotein)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 T7 펩티드(T7 peptide), RAGE 부착 펩티드 (Receptor for advanced glycation end products binding peptide), 클로로톡신(Chlorotoxin), 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2) 또는 광견병 바이러스 글라이코단백질(Rabies virus glycoprotein)일 수 있고, 보다 구체적으로는 T7 펩티드(T7 peptide)일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 표적화 물질은 소수성 물질이 결합된 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 소수성 물질은 콜레스테롤(cholesterol), 팔미트산(Palmitic acid), 토코페롤(Tocopherol) 및 올레산(Oleic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 콜레스테롤(cholesterol), 팔미트산(Palmitic acid), 토코페롤(Tocopherol) 또는 올레산(Oleic acid)일 수 있고, 보다 구체적으로는 콜레스테롤(cholesterol)일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 표적화 물질은 상기 인지질 이중층 내부의 친수성 부위 및 상기 인지질 이중층 외부의 친수성 부위에 존재하는 것일 수 있다.
일 양상에 따르면, 상기 표적화 물질에 상기 소수성 물질이 결합된 경우, 상기 소수성 물질이 상기 인지질 이중층 내부의 소수성 부위와 상호작용(예를 들어, 반데르발스 결합)하는 바, 상기 소수성 물질은 상기 인지질 이중층의 소수성 부위(인지질 이중층 사이)에 존재하며, 상기 표적화 물질이 상기 인지질 이중층 내부의 친수성 부위 및 상기 인지질 이중층 외부의 친수성 부위에 존재할 수 있다.
상기 용어 “핵산(nucleic acid)”이란 알려져 있는 모든 생명체에 필수적인 생체고분자 또는 작은 생체분자를 의미하고, 뉴클레오타이드 단위체로 구성되어 있으며, 뉴클레오타이드는 인산, 5탄당, 핵염기의 3가지 구성 성분으로 이루어진 단위체를 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotides), 항-miRNA 올리고뉴클레오타이드(anti-microRNA oligonucleotides), miRNA, mRNA, siRNA, tRNA, sgRNA, shRNA 및 이들의 변형체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotides), 항-miRNA 올리고뉴클레오타이드(anti-microRNA oligonucleotides), miRNA, mRNA, siRNA, tRNA, sgRNA 또는 shRNA일 수 있고, 보다 구체적으로는 miRNA일 수 있으며, 예를 들어, AMO21(Anti-microRNA-21 oligonucleotides)일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 핵산은 소수성 물질이 결합된 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 소수성 물질은 콜레스테롤(cholesterol), 팔미트산(Palmitic acid), 토코페롤(Tocopherol) 및 올레산(Oleic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 콜레스테롤(cholesterol), 팔미트산(Palmitic acid), 토코페롤(Tocopherol) 또는 올레산(Oleic acid)일 수 있고, 보다 구체적으로는 콜레스테롤(cholesterol)일 수 있다.
일 양상에 따르면, 상기 핵산에 상기 소수성 물질이 결합된 경우, 상기 소수성 물질이 상기 인지질 이중층 내부의 소수성 부위와 상호작용(예를 들어, 반데르발스 결합)하는 바, 상기 소수성 물질은 상기 인지질 이중층의 소수성 부위(인지질 이중층 사이)에 존재하며, 상기 핵산이 상기 인지질 이중층 내부의 친수성 부위 및 상기 인지질 이중층 외부의 친수성 부위에 존재할 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 핵산은 뉴클레아제(nucleases)에 의해 분해되지 않도록 변형된 것일 수 있고, 구체적으로 상기 핵산은 메틸기(methyl group)로 변형된 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 상기 핵산은 2’-위치에서 메틸기(methyl group)로 변형된 것일 수 있다.
상기 핵산이 메틸기(methyl group)로 변형된 경우, 혈청 내의 뉴클레아제(nucleases)에 의해 분해되지 않고 안정적으로 전달될 수 있다.
상기 용어 “나노소낭(nanovesicle)”이란 나노 크기의 소낭을 의미하는 것으로, 일 양상에 따른 나노소낭은 세포내에서 자연적으로 만들어지는 나노 크기의 엑소좀과 특징 및 형태가 유사한 일종의 인공 엑소좀 또는 엑소좀 모사 소포체이나, 세포에서 추출한 엑소좀(exosome)과는 상이하다.
본 명세서에서 세포막 유래 나노소낭은 세포막을 분리하여, 압출을 통하여 상대적으로 쉽게 생산할 수 있으며, 세포내 내용물을 포함하지 않아 효율적이다.
일 실시예에서는 T7-CMNV(cell membrane nanovesicles)의 입자 크기가 CMNV 및 T7c(T7 cholesterol)의 비율과 함께 증가하는 경향이 있음을 확인하였고, 입자 크기의 증가는 T7의 콜레스테롤과의 소수성 상호작용 및 T7 펩티드와의 리간드-수용체 상호작용인 2개의 상호작용을 통해 C6 세포막과 상호작용할 수 있음을 확인하였다(실시예 2.(1) 참조).
일 실시예에서는 T7-CMNV를 제조한 후, AMO21(Anti-microRNA-21 oligonucleotides)을 콜레스테롤 모이어티와 접합시켜, AMO21c(Anti-microRNA-21 oligonucleotides cholesterol)를 생성하고, AMO21c를 소수성 상호작용에 의해 소낭 상에 로딩하였다. 그 결과, AMO21c는 2’-위치에서 메틸기(methyl group)로 변형되어, 혈청 내의 뉴클레아제(nucleases)에 의해 분해되지 않음을 확인하였다(실시예 2.(1) 참조).
일 양상에 있어서, 상기 나노소낭은 핵산, 인지질 및 표적화 물질이 1:5:5, 1:10:10, 2:5:5, 2:5:10, 1:10:5, 2:10:5 또는 1:5:10의 질량비로 존재하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 나노소낭은 투여 대상 1 kg 당 200 μg 내지 280 μg, 200 μg 내지 265 μg, 200 μg 내지 250 μg, 215 μg 내지 280 μg, 215 μg 내지 265 μg, 215 μg 내지 250 μg, 230 μg 내지 280 μg, 230 μg 내지 265 μg 또는 230 μg 내지 250 μg의 핵산 용량으로 투여되는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 나노소낭이 투여 대상 1 kg 당 200 μg 미만의 핵산 용량으로 투여되는 경우, 핵산이 목표하는 효과가 유효하게 나타나지 않을 수 있고, 상기 나노소낭이 투여 대상 1 kg 당 280 μg 초과의 핵산 용량으로 투여되는 경우, 세포 독성이 유발될 수 있다.
일 실시예에서는 생체내 CMNV 및 T7-CMNV의 가능한 독성을 평가하기 위해 체중, AST, ALT 및 BUN을 측정하였다. 그 결과, CMNV 및 T7-CMNV가 동물에서 눈에 띄는 독성을 유발하지 않음을 확인하였다(실시예 2.(3) 참조).
다른 실시예에서는 T7-CMNV/Cy5.5-AMO21c를 래트 당 60 μg의 AMO21c 용량으로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. AMO21c 전달의 효과를 평가하기 위해, RT-PCR을 수행하여 miR-21을 증폭시켰다. 그 결과, miR-21 수준이 CMNV/AMO21c 및 T7-CMNV/AM021c의 주사 후 감소됨을 확인하였고, T7-CMNV/AMO21c에 의한 miR-21의 감소는 CMNV/AM021c보다 높았고, T7-CMNV가 CMNV에 비해 뇌로의 AMO21c의 전달 효율을 증진시켰다는 것을 의미한다(실시예 2.(4) 참조).
또 다른 실시예에서는 T7-CMNV를 사용한 AMO21c의 종양 표적화 전달 및 치료 효과를 확인하기 위해 동소 교모세포종 모델(Orthotopic glioblastoma models)을 제조하고, T7-CMNV/AMO21c를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 그 결과, miR-21 수준이 CMNV/AMO21c 및 T7-CMNV/AM021c의 주사 후 감소됨을 확인하였다(실시예 2(4) 참조).
또한, AMO21c 전달의 항-종양 효과를 평가하기 위해, 면역조직화학을 통해 래트 뇌에서 Ki67 발현을 평가하였다. 그 결과, 리포펙타민/AM021c, CMNV/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AM021c는 Ki67 발현을 감소시켰으나, Ki67 발현은 T7-CMNV/AMO21c에 의해 보다 효율적으로 감소됨을 확인하였다(실시예 2(4) 참조).
또한, 샘플의 종양 크기를 니슬 염색을 통해 평가하였다. 그 결과, AMO21c로 처리된 모든 군에 걸친 종양 크기는 감소되었다. 특히, T7-CMNV/AMO21c는 다른 샘플과 비교하여 종양 크기를 가장 효율적으로 감소시킴을 확인하였다(실시예 2(4) 참조).
일 양상에 있어서, 상기 인지질과 상기 표적화 물질은 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 3:2, 1:2 내지 4:3, 2:3 내지 2:1, 2:3 내지 3:2, 2:3 내지 4:3, 3:4 내지 2:1, 3:4 내지 3:2 또는 3:4 내지 4:3의 질량비로 존재하는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질과 상기 표적화 물질이 2:1의 질량비 보다 상기 인지질의 양이 상기 표적화 물질 대비 많은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합된 표적화 물질의 양이 적어, 세포의 표적화가 충분하게 이루어지지 않을 수 있고, 상기 인지질과 상기 표적화 물질이 1:2의 질량비보다 인지질의 양이 상기 표적화 물질 대비 적은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합되지 않은 표적화 물질의 양이 증가하여, 효율성이 저하될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질과 상기 핵산은 10:1 내지 1:1, 8:1 내지 1:1, 6:1 내지 1:1, 10:1 내지 2:1, 8:1 내지 2:1, 6:1 내지 2:1, 10:1 내지 4:1, 8:1 내지 4:1 또는 6:1 내지 4:1의 질량비로 존재하는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질과 상기 핵산이 10:1의 질량비보다 상기 인지질의 양이 상기 핵산의 양 대비 많은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합된 핵산의 양이 적어, 상기 핵산이 목표하는 효과가 유효하게 나타나지 않을 수 있고, 상기 인지질과 상기 핵산이 1:1의 질량비보다 상기 핵산의 양이 상기 인지질의 양 대비 많은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합되지 않은 핵산의 양이 증가하여, 효율성이 저하될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 나노소낭의 직경은 155 nm 내지 195 nm, 155 nm 내지 190 nm, 155 nm 내지 185 nm, 160 nm 내지 195 nm, 160 nm 내지 190 nm, 160 nm 내지 185 nm, 165 nm 내지 195 nm, 165 nm 내지 190 nm 또는 165 nm 내지 185 nm일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 나노소낭의 직경이 165 nm 미만인 경우, 상기 나노소낭에 결합되어 있는 핵산 및/또는 표적 물질의 양이 적어 핵산 전달 효율이 낮거나, 안정성이 낮을 수 있고, 상기 나노소낭의 직경이 185 nm 초과인 경우, 상기 나노소낭이 세포에 침투하지 못하여 핵산 전달 효율이 낮을 수 있다.
일 실시예에서는 CMNV 상에 AMO21c를 로딩한 후 크기 평가를 하고자 하였다. CMNV와 AMO21c 사이의 비율은 세포 흡수 연구에 기초하여 5:1로 고정하였고, 생성된 CMNV의 입자 크기를 동적 광산란(dynamic light scattering)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, CMNV와 T7-CMNV 모두에 대해 AMO21c 로딩 후 입자 크기가 증가하지 않음을 확인하였다(실시예 2.(1) 참조).
또한, 입자 크기는 약력학에 상당한 영향을 미치고, 200 nm 초과의 직경을 갖는 입자가 혈액뇌장벽(BBB: blood-brain barrier)을 침투하는 것이 어렵기 때문에, T7c와 CMNV 사이의 비율은 1:1로 고정하였다. 그 결과, T7-CMNV/AMO21c의 평균 크기는 176.96 nm ± 0.65임을 확인하였다(실시예 2.(1) 참조).
다른 실시예에서는 CMNV 및 T7-CMNV의 전달 효율을 Cy5-표지된 AMO21c로 평가하였다. 그 결과, T7-CMNV가 C6 교모세포종 세포로의 AMO21c의 가장 높은 세포 흡수 효율을 가짐을 확인하였고, 리포펙타민(lipofectamine), CMNV 및 스크램블된 T7-CMNV (scrT7-CNV)는 유사한 흡수 효율을 가짐을 확인하였으며, scrT7-CMNV는 CNMV에 비해 전달 효율을 증가시키지 않았고, 이는 T7-CMNV 전달의 증가가 T7 펩티드의 효과로 인한 것일 수 있음을 시사하며, 상기 결과는 형광 현미경 검사에 의해 확인하였다(실시예 2.(2) 참조).
또한, CMNV 및 T7-CMNV의 전달 효율을 상이한 유형의 세포에서 비교하였다. 그 결과, N2A 신경아세포종 세포를 사용한 전달 분석에서 T7-CMNV는 CMNV 및 ScrT7-CNV보다 더 높은 전달 효율을 가짐을 확인하였고, CMNV 및 scrT7-CMNV는 N2A 세포에 대한 유사한 전달 효율을 갖는 것으로 관찰되었으며, 이는 T7-CMNV의 더 높은 효율이 T7 펩티드의 효과로 인한 것임을 확인하였다(실시예 2.(2) 참조)..
또한, 비-암 세포(non-cancer cells)로서, HEK293 세포, Cy5-표지된 AMO21c를 사용하여 T7-CMNV의 전달 효율을 평가하였다. 그 결과, T7-CMNV가 CMNV 및 scrT7-CMNV에 비해 AMO21c 세포 흡수를 유도하지 않았음을 확인하였고, HEK293 세포는 트랜스페린 수용체를 유의한 수준으로 발현하지 않으며, T7 펩티드가 HEK 293 세포로의 전달 효율 T7-CMNV에 미치는 효과는 제한되었다(실시예 2.(2) 참조).
또 다른 실시예에서는 T7-CMNV의 전달 효율를 생체분포(biodistribution) 연구를 통해 평가하였다. 그 결과, 대부분의 AMO21c는 간 및 신장에서 관찰되었고, 리포펙타민/AMO21c는 AMO21C를 사용한 CMNV보다 더 고도로 간에 흡수됨을 확인하였고, 뇌에서 Cy5.5-AMO21c의 형광 신호는 CMNV, scrT7-CMNV 및 리포펙타민에 비해 T7-CMV에 의해 증가됨을 확인하였다(실시예 2.(3) 참조).
일 양상에 따르면, 상기 나노소낭은 세포막으로부터 유래하여 면역 반응 없이 원하는 세포의 타겟팅이 가능하고, 독성이 없으며, 기존의 물질 전달에 사용되는 전달체들에 비해 핵산의 세포 내 전달 효율 및 핵산의 발현 효율이 현저히 우수하다.
다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 포함하는 핵산 전달용 조성물을 제공한다.
상기 "핵산", "나노소낭" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 조성물은 개체에 투여되거나 섭취되는 것일 수 있고, “투여”란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하고, “섭취”란 개체에게 소정의 물질을 생물 작용에 필요한 부위로 전달할 수 있는 방법을 의미하며, “개체”란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 생물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 조성물은 다양한 분야에 활용될 수 있고, 예를 들어, 약학적 조성물, 건강기능식품용 조성물 또는 화장료 조성물로 활용될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 포함하는 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 "핵산", "나노소낭" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 용어 "암(cancer)"은 제어 불가능하게 증식하며 정상적인 신체 조직을 침투하고 파괴하는 능력을 갖는 비정상적인 세포의 발생을 특징으로 하는 질병의 부류를 지칭한다.
일 양상에 있어서, 상기 암은 교모세포종, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 충수암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 항문암, 신암, 수뇨관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소암, 자궁암, 난소암, 외음암, 질암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 교모세포종, 뇌종양, 유방암, 폐암, 대장암, 간암, 췌장암, 자궁암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 보다 구체적으로는 교모세포종 또는 폐암일 수 있다.
상기 용어 "폐 질환"은 호흡기 질환일 수 있으며, 상기 호흡기 질환은 급성폐손상, 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 진폐증, 결핵, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 낭포성 섬유증 중 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에서 "급성폐손상(Acute Lung Injury)"은 감염, 외상, 출혈 등으로 인해 폐속의 모세혈관이나 폐포가 손상을 받음으로써, 폐에서 호흡이 원활하게 이루어지지 않아 생명이 위험하게 된 상태를 의미한다. 폐포-모세혈관은 폐포 상피세포와 모세혈관 내피세포로 구성되어 있는데, 이 폐포-모세혈관 장벽의 투과성이 증가되어 삼투액이 폐포 안으로 들어오는 것이 특징이다. 내피세포의 손상은 혈관 투과성을 증가시켜 부종을 유발함. 특히, 상피세포의 손실은 중요한 결과를 유발하는데, 폐포 내로 삼투액의 침투를 유발하며, 고인 부종을 제거하는 기전도 장애를 받을 수 있다. 또한, 계면활성제의 이상을 초래하며, 상피세포의 손상이 심한 경우에는 불충분한 복구작용으로 폐섬유화가 진행될 수 있다.
한편, 급성폐손상에서 각종 염증성 사이토카인들이 염증 반응을 개시하고 증폭시킨다. 특히, 제2형 상피세포에 특이적으로 발현되는 최종당화산물수용체(receptor for advanced glycation end-products, RAGE)에 증가된 S100B, HMGB1 등의 최종당화산물이 결합하여, 염증성 사이토카인의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 용어 “예방”은 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 암 또는 폐 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 용어 “치료”는 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 암 또는 폐 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 희석제 등을 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 제제화될 경우에는 통상적으로 사용하는 윤활제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있고, 점안제 형태로 제조 시 공지의 희석제 또는 부형제 등이 사용될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물은 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 기존의 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 혼합되어 제공될 수 있고, 상기 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 기존의 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 새롭게 개발되는 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물이 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 더 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 병행하여 투여될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 동맥내 주사, 골수내 주사, 심장내 주사, 경막내 주사, 경피주사, 비강내 주사, 장관내 주사, 국소주사, 설하 주사, 직장내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있고, 예를 들어, 상기 약학적 조성물 내 나노소낭은 투여 대상 1 kg 당 200 μg 내지 280 μg, 200 μg 내지 265 μg, 200 μg 내지 250 μg, 215 μg 내지 280 μg, 215 μg 내지 265 μg, 215 μg 내지 250 μg, 230 μg 내지 280 μg, 230 μg 내지 265 μg 또는 230 μg 내지 250 μg의 핵산 용량으로 투여되는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여는 하루에 한 번 투여되는 것일 수도 있고, 수 회 나누어 투여되는 것일 수도 있다. 예를 들어, 격일로 투여되는 것일 수도 있으며, 일주일에 하루 투여되는 것일 수도 있다.
또 다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 "핵산", "나노소낭", "개체", "투여", "암", "폐 질환", "예방", "치료" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 방법은 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 항암제와 병행하여 투여하는 것일 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여하는 것일 수 있으며, 단일 또는 다중 투여하는 것일 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 다른 양상은 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 핵산 전달용 나노소낭의 용도를 제공한다.
상기 "암", "폐 질환", "예방", "치료", "핵산" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 세포의 세포막을 분리하여 인지질들을 얻는 단계;
상기 인지질들과 소수성 물질이 결합된 표적화 물질을 혼합하여 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계; 및
상기 인지질 이중층과 소수성 물질이 결합된 핵산을 혼합하여 상기 표적화 물질과 상기 핵산이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계를 포함하는 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법을 제공한다.
상기 "개체", "세포막", "인지질", "소수성", "표적화", "인지질 이중층", "핵산", "나노소낭" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 제조방법의 상기 세포막을 분리하는 단계는 상기 세포에 초음파 처리(sonication)하는 단계; 및
상기 세포를 원심분리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 용어 “초음파 처리(sonication)”란 여러 물질을 추출하거나, 분해하는 것과 같은 다양한 목적을 위한 것으로, 일 양상에 따르면, 상기 초음파 처리는 상기 세포의 세포막을 분해하기 위해 사용된다.
상기 용어 “원심분리(centrifugation)”란 원심력에 의해 액체 중의 고체입자나 액체의 미립자를 분리하는 것을 의미하고, 중력에 의한 분리보다 원심분리가 분리력이 우수하기 때문에 밀도차가 작거나 일반적으로 분리가 어려운 물질들까지도 분리할 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 세포막을 분리하는 단계가 상기 세포를 원심분리하는 단계를 포함하는 경우, 상기 초음파 처리를 통해 얻어진 세포막의 분해물을 분리(구분)하여 인지질들을 얻을 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 원심분리는 차등 원심분리(differential centrifugation), 순차적 원심분리(sequential centrifugation) 및 초원심분리(ultracentrifuge)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 분리 방법으로 수행되는 것일 수 있고, 구체적으로 상기 원심분리는 차등 원심분리(differential centrifugation), 순차적 원심분리(sequential centrifugation) 및 초원심분리(ultracentrifuge)을 모두 사용하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 용어 “차등 원심분리(differential centrifugation)”란 어떤 기준이 되는 것의 높낮이 차이에 따라 물질을 분리하는 것을 의미한다.
상기 용어 “순차적 원심분리(sequential centrifugation)”란 샘플의 성분이 경험하는 원심력에 따라 원심분리기에서 밀도를 기준으로 물질을 분리하는 것을 의미한다.
상기 용어” 초원심분리(ultracentrifuge)”란 용액이 들어 있는 튜브를 초고속으로 회전시킴으로써 높은 중력장을 발생시켜 용질의 침강속도를 높여 물질을 분리하는 것을 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계는 상기 인지질들과 소수성 물질이 결합된 표적화 물질을 혼합함으로써, 상기 인지질들이 인지질 이중층을 형성함과 동시에, 상기 표적화 물질에 결합된 소수성 물질과 인지질의 소수성 부위가 상호작용(예를 들어 반데르발스 결합)하여, 상기 소수성 물질이 상기 인지질의 이중층 소수성 부위(인지질 이중층 사이)에 존재하게 된다. 이에 따라, 상기 표적화 물질이 상기 인지질 이중층 내부의 친수성 부위 및 상기 인지질 이중층 외부의 친수성 부위에 존재할 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계는 상기 인지질들과 상기 표적화 물질을 혼합한 후 압출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 용어 “압출(extrusion)”이란 고정 단면 윤곽의 물체를 만들기 위해 사용하는 공정을 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계가 상기 인지질들과 상기 표적화 물질을 혼합한 후 상기 압출하는 단계를 포함하는 경우, 상기 인지질 이중층들의 응집을 유도하지 않고, 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층의 직경이 증가되는 것을 방지할 수 있고, 상기 표적화 물질의 인지질 이중층으로의 결합을 용이하게 할 수 있다.
일 실시예에서는 T7-CMNV 제조 공정에서 T7c 및 세포막을 압출하였다. 그 결과, T7c 및 세포막의 응집(aggregation)을 유도하지 않고, T7-CMNV의 크기 증가를 제한할 수 있고, T7의 막 내로의 통합을 용이하게 함을 확인하였다(실시예 2(1) 참조).
일 양상에 있어서, 상기 인지질과 상기 표적화 물질을 혼합하는 단계에서 상기 인지질과 상기 표적화 물질은 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 3:2, 1:2 내지 4:3, 2:3 내지 2:1, 2:3 내지 3:2, 2:3 내지 4:3, 3:4 내지 2:1, 3:4 내지 3:2 또는 3:4 내지 4:3의 질량비로 혼합되는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질과 상기 표적화 물질을 혼합하는 단계에서 상기 인지질과 상기 표적화 물질이 2:1의 질량비 보다 상기 인지질의 양이 상기 표적화 물질 대비 많은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합된 표적화 물질의 양이 적어, 세포의 표적화가 충분하게 이루어지지 않을 수 있고, 상기 인지질과 상기 표적화 물질이 1:2의 질량비보다 인지질의 양이 상기 표적화 물질 대비 적은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합되지 않은 표적화 물질의 양이 증가하여, 효율성이 저하될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질 이중층과 상기 핵산을 혼합하는 단계에서 상기 인지질 이중층과 상기 핵산은 10:1 내지 1:1, 8:1 내지 1:1, 6:1 내지 1:1, 10:1 내지 2:1, 8:1 내지 2:1, 6:1 내지 2:1, 10:1 내지 4:1, 8:1 내지 4:1 또는 6:1 내지 4:1의 질량비로 혼합되는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질 이중층과 상기 핵산을 혼합하는 단계에서 상기 인지질 이중층과 상기 핵산이 10:1의 질량비보다 상기 인지질 이중층의 양이 상기 핵산의 양 대비 많은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합된 핵산의 양이 적어, 상기 핵산이 목표하는 효과가 유효하게 나타나지 않을 수 있고, 상기 인지질 이중층과 상기 핵산이 1:1의 질량비보다 상기 핵산의 양이 상기 인지질의 양 대비 많은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합되지 않은 핵산의 양이 증가하여, 효율성이 저하될 수 있다.
일 양상에 따라 제조된 핵산 전달용 나노소낭은 세포막으로부터 유래하여 면역 반응 없이 원하는 세포의 타겟팅이 가능하고, 독성이 없으며, 기존의 물질 전달에 사용되는 전달체들에 비해 핵산의 세포 내 전달 효율 및 핵산의 발현 효율이 현저히 우수하다.
일 양상에 따른 나노소낭은 세포막으로부터 유래하여 면역 반응 및 독성이 없으며, 원하는 세포의 타겟팅이 가능하고, 기존의 물질 전달에 사용되는 전달체들에 비해 핵산의 세포 내 전달 효율 및 핵산의 발현 효율이 현저히 우수하다. 또한, 상기 나노소낭이 표적하는 종양 세포로 이동함으로써, 종양 세포의 크기를 감소시킬 수 있음을 직접 확인하였는 바, 상기 나노소낭은 암의 예방, 개선 및/또는 치료에 활용될 수 있으며, 나아가, 생체 내 핵산의 전달 및 발현이 필요한 다양한 분야에 활용될 수 있다.
도 1은 정맥(IV: intravenous) 주사를 통한 동소성 래트 교모세포종 모델(orthotopic rat glioblastoma models)에서 T7-CMNV를 사용한 AMO21c 전달을 설명하는 개략도이다.
도 2는 CMNV(cell membrane nanovesicles) 및 T7-CMNV의 물리적 특성을 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 2a는 CMNV 및 T7-CMNV의 입자 크기를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2b는 CMNV/AMO21c 및 T7-CMNV/AMO21c의 입자 크기를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2c는 나노소낭의 제타 전위를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2d는 수용액에서 CMNV 및 T7-CMNV의 안정성을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2e는 CMNV의 형태를 투과 전자 현미경(TEM: Transmission electron microscopy)을 이용하여 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2f는 DLS 및 TEM으로부터의 결과를 재확인하기 위해, 나노 소낭을 나노 트래킹(tracking)으로 분석한 결과(왼쪽 패널: CMNV의 크기 분포, 오른쪽 패널: 비디오 프레임)를 나타내는 도이다.
도 3은 CMNV와 AMO21c 간의 비율의 최적화를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 CMNV 및 T7-CMNV의 세포독성을 분석한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 4a는 MTT 분석의 결과를 나타내는 도이고, 도 4b는 용혈 분석의 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 시험관 내 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 5a는 유세포 분석(Flow cytometry)을 통한 C6 세포로의 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과를 나타내는 도이고(**** 다른 그룹과 비교하여 P<0.0001), 도 5b는 형광 현미경을 통한 C6 세포로의 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 5c는 N2A 세포로의 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과를 나타내는 도이고(*P<0.05, 다른 그룹과 비교), 도 5d는 HEK293 세포로의 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과(n.s.: 서로 비교하여 통계적으로 유의하지 않음)를 나타내는 도이다.
도 6은 T7-CMNV의 트랜스사이토시스(transcytosis) 능력을 분석한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 6a는 6시간 배양후 bEND.3 세포의 세포 흡수를 유세포 분석기를 통해 측정한 결과를 나타내는 도이고, 도 6b는 6시간 배양 후 기저측 배지의 평균 형광 강도를 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)로 측정한 결과를 나타내는 도이고, 도 6c는 24시간 배양후 bEND.3 세포의 세포 흡수를 유세포 분석기를 통해 측정한 결과를 나타내는 도이고, 도 6d는 24시간 배양 후 기저측 배지의 평균 형광 강도를 마이크로플레이트 판독기로 측정한 결과를 나타내는 도이다(****P<0.0001, **P<0.01, *P<0.05로 다른 군과 비교함. n.s.: 서로 비교하여 통계적으로 유의하지 않음).
도 7은 동물 모델의 뇌로 AMO21c 전달한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 7a는 기관(organs)의 대표적인 형광 이미지를 나타내는 도이고, 도 7b는 뇌에서 Cy5.5-AMO21c의 상대적 신호(Relative signals)를 분석한 결과(*P<0.05 다른 그룹과 비교)를 나타내는 도이고, 도 7c는 뇌의 대표적인 이미지를 나타내는 도이다(*P<0.05 05 다른 그룹과 비교).
도 8은 나노소낭 및 리포펙타민(Lipofectamine)의 생체 내 독성 평가의 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 8a는 체중에 의해 평가된 나노소낭 및 리포펙타민의 독성을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 8b는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST: aspartate aminotransferase)의 독성을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 8c는 알라닌 트랜스아미나제(ALT: alanine transaminase)의 독성을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 8d는 혈액 요소 질소(BUN: blood urea nitrogen)의 독성을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 동물 모델에서 AMO21c 전달에 의한 miR-21 억제를 확인한 결과를 나타내는 도이다(* 대조군, 리포펙타민/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AMO21c 그룹과 비교하여 P<0.05).
도 10은 동물 모델에서 AMO21c 전달에 의한 PDCD4 및 PTEN의 유도를 확인한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로 도 10a는 항-PDCD4로 면역조직화학(Immunohistochemistry)을 수행한 결과를 나타내는 도이고, 도 10b는 항-PTEN 항체로 면역조직화학을 수행한 결과를 나타내는 도이다(**** 다른 그룹과 비교하여 P<0.0001, * CMNV/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AMO21c 그룹과 비교하여 P<0.05).
도 11은 종양의 크기를 확인한 결과를 나타내는 도이다(* 대조군, 리포펙타민/AMO21c 및 CMNV/AMO21c 그룹과 비교하여 P<0.05).
도 12는 투과전자현미경(TEM: transmission electron microscopy)를 이용한 나노소낭의 형태 및 크기 분석 결과이다.
도 13은 AMO155c가 로딩된 CMNV와 exosome를 dynamic light scattering assay로 측정한 결과이다.
도 14는 다양한 비율로 AMO155c/CMNV와 AMO155c/exosome을 준비하고, LA4 세포에 투여하여 핵산의 전달효율을 측정한 결과이다.
도 15는 급성폐손상 동물모델에 AMO155c가 로딩된 CMNV와 exosome을 처리한 후, 24시간 후에 기관지폐세척액과 폐조직에서 IL-1beta와 IL-6의 양을 측정한 결과이다.
도 16은 H&E 염색을 통하여, AMO155c/CMNV의 경에 가장 효과적으로 염증반응을 줄이는 것을 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 실험재료 및 방법
(1) 재료 준비
C6 래트 교아종(C6 rat glioblastoma), N2a 마우스 신경아세포종(N2a mouse neuroblastoma), HEK293(인간 배아 신장 293 세포, Human embryonic kidney 293 cells) 및 bEND.3 세포(BALB/c 마우스 유래 뇌 세포주)를 한국 세포주 뱅크(Korean Cell Line Bank)(Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 소 태아 혈청 (FBS: Fetal bovine serum) 및 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)을 Welgene(Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 2'-O-메틸-(2'-O-methyl) 및 콜레스테롤-TEG-변형된 AMO21(cholesterol-TEG-modified AMO21(Anti-microRNA-21 oligonucleotides))(AMO21c 및 5'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3(서열번호 1)) 및 Cy5-AMO-21를 Bioneer(Daejeon, Korea)를 이용하여 합성하였다. 콜레스테롤-변형된 T7(Cholesterol-modified T7) (T7c, HAIYPRH-cholesterol) 및 콜레스테롤-변이된 스크램블드(cholesterol-modified scrambled) T7(scrT7dc, IRHPHYA- cholesterol)는 펩트론(Peptron)(Daejeon, Korea)을 이용하여 합성하였다. 비신코닌산(BCA: bicinchoninic acid) 분석 키트, 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨보미드 (MTT: 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbormide) 및 리포펙타민2000(lipofectamine2000)을 Thermo Scientific(Rockford, IL)로부터 구입하였다. 압출기 키트(Extruder kits)는 Avanti(Birmingham, AL)로부터 구입하였다. Cy5.5 NHS 에스테르(Cy5.5 NHS ester), 항-Ki67 항체(anti-Ki67 antibody) 및 원래 위치에서(in situ) BrdU-Red DNA 단편화 트랜스퍼라제 dUTP 닉 말단 표지화 (TUNEL: BrdU-Red DNA fragmentation transferase dUTP nick end labeling) 분석 키트는 Abcam(Waltham, MA)으로부터 구입하였다. 항-PDCD4 항체(Anti-PDCD4 antibody)는 Bethyl (Montgomery, TX)로부터 구입하였고, PTEN 항체(PTEN antibody)는 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX)로부터 구입하였다. miRNeasy FFPE 키트는 Qiagen (Valencia, CA)으로부터 구입하였고, Iscript cDNA 합성 키트는 Bio-Rad (Hercules, CA)로부터 구입하였으며, SensiFAST SYBR No-ROX 키트는 Bioline (Boston, MA)으로부터 구입하였다.
(2) CMNV(cell membrane nanovesicles)의 제조
1) 교모세포종 치료용 나노소낭 제조
T7-CMNV를 C6 세포 막으로 제조하여 뇌로의 AMO21 전달을 제공하였다. 제조 도식은 도 1에 나타내었고, 구체적인 방법은 다음과 같다. C6 세포막을 차등 원심분리(differential centrifugation)에 의해 단리하였다. 그 후, 세포막을 T7c와 혼합하고, 혼합물을 압출(extrusion)하여 CMNV(cell membrane nanovesicles)를 제조하였다. T7 펩티드는 혈관 내의 내피 세포 또는 종양 세포 상의 트랜스페린 수용체(transferrin receptors)에 결합하는 널리 공지된 리간드(ligand)이며, C6 세포 막을 비롯한 종양 세포 막 상에서 과발현된다. 결합 후에는 트랜스사이토시스(transcytosis)를 용이하게 하여 혈액뇌장벽(BBB: blood-brain barrier)을 통한 통과를 초래한다. 따라서, T7-CMNV는 뇌에서 BBB 및 표적 C6 종양 세포를 통과할 수 있다. 그러나, T7 펩티드의 이러한 이점은 T7-CMNV 생성을 방해할 수 있다. T7c는 CMNV와 상호작용할 수 있는 2개의 모이어티(moieties)를 갖는다. 콜레스테롤은 소수성 상호작용에 의해 CMNV와 상호작용할 수 있고, T7은 막이 트랜스페린 수용체를 함유하기 때문에 C6 세포 막으로 제조된 CMNV의 트랜스페린 수용체와 상호작용할 수 있다. 따라서, T7c는 inter-CMNV 상호작용에 기여할 수 있고, 이들 상호작용의 축적은 응집(aggregation)을 유도할 수 있다. 실제로, 압출이 없는 T7-CMNV의 제조는 본 발명자들의 연구에서 응집을 유도하였고, T7c를 갖는 나노-크기 막 소낭을 제조하기 위해서는 압출이 필요한 것으로 보인다.
2) 급성폐손상 치료용 나노소낭 제조
급성폐손상 치료용 나노소낭 제조방법은 상기 교모세포종 치료용 나노소낭 제조방법과 동일하다. 세포막 분리는 293세포와 LA4 mouse lung epitheal 세포에서 분리하여, 각각 세포실험과 동물실험에 이용하였다. 세포막분리는 앞에서 뇌종양 모델에 적용된 나노소낭과 같이 분별원심분리법으로 분리하였다. 분리된 세포막으로 extrusion(압출기)를 이용한 CMNV을 제조하였다. 폐로의 핵산약물 전달은 흡입을 통하여 직접 전달하는 방법을 이용하므로, 표적형 리간드를 추가로 부착하지 않고 이용하였다.
(3) 암-유래 나노소낭(nanovesicles)의 제조
세포막을 이전에 기재된 바와 같이 단리하였다. 간략하게, C6 세포를 컨플루언시(confluency)가 거의 100%에 도달할 때까지 DMEM을 함유하는 10% FBS에서 배양하였다. 세포를 DPBS로 2회 세척하고, 스크레이퍼(scrapers)로 획득하였다. DPBS 중에 재현탁시킨 후, 세포를 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)로 처리하고, 3분 동안 초음파처리를 이용하여 용해시켰다. 내부 세포 성분을 3,500 g에서 10분 및 20,000 g에서 25분 동안 4℃에서 순차적 원심분리(sequential centrifugation)를 통해 제거하였다. 그 후, 상층액을 100,000 g에서 50분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 생성된 펠릿(pellet)은 세포막을 함유하였다. 펠릿을 DPBS에 재현탁시키고, 3분 동안 초음파처리하고, 0.4 μm 폴리카보네이트 필터(polycarbonate filter)를 통해 여과하여 오염을 방지하고 응집물을 제거하였다. 세포막에서의 단백질 농도를 BCA 분석으로 측정하였다. CMNV(cell membrane nanovesicles) 및 T7-CMNV는 1 m 및 0.2 m 폴리카보네이트 멤브레인(polycarbonate membranes)을 통한 10회의 연속 압출을 통해 제조하였다.
(4) 동적 광산란(Dynamic light scattering) 및 나노 트래킹(tracking) 분석
유체역학적 크기(Hydrodynamic size) 및 제타 전위(zeta potential)는 Zetasizer Nano ZS system (Malvern Instruments, Malvern, UK)을 이용하여 측정하였다. 안정성 및 팽윤(swelling) 특성을 평가하기 위해, 4℃에서 CMNV 및 T7-CMNV를 저장하고, 3일마다 측정하였다. 또한, 나노 트랙킹(tracking) 분석을 수행하여, CMNV의 특성 및 Nanosight system (Malvern Instruments, Malvern, UK) 내의 실제 농도에 대한 상보적 정보를 수집하였다.
(5) 나노소낭으로의 치료 핵산 로딩
1) AMO21의 CMMV로의 로딩
다양한 양의 AMO21c를 고정된 양의 CMNV와 혼합하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. AMO21c를 콜레스테롤과 세포막 사이의 소수성 상호작용에 의해 CMNV 상에 로딩하였다. 로딩 효율을 계산하기 위해, 제조사 매뉴얼에 따라 Cy5.5 NHS 에스테르를 사용하여 AM021c를 표지하였다. Cy5.5-AMO21c를 CMNV 또는 T7-CMNV와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 샘플을 100,000 g에서 50분 동안 초원심분리하였다. 이어서, 펠렛을 DPBS에 재현탁하고, 형광은 마이크로플레이트 판독기(microplate reader) (excitation/emission = 673/707 nm)로 측정하였다. 표준 검량선(standard calibration curve)을 작성하고, 로딩효율은 다음과 같이 계산하였다: 로딩효율(%) = (강수(precipitation) 후 측정된 AMO21c의 양)/(AMO21c의 총량) X 100.
2) AMO155c의 CMMV로의 로딩
급성폐손상 조직에서 발현이 증가되는 miRNA-155를 억제하기 위한 핵산치료제로 AMO155c를 이용하였다. 다양한 양의 AMO155c를 고정된 양의 CMNV와 혼합하고, 실온에서 30분 방치하였다. AMO155c의 콜레스테롤과 세포막 사이의 소수성 상호작용에 의해 CMNV 상에 AMO155c가 로딩하였다. Exosome으로의 AMO155c의 로딩도 동일한 방법으로 실시하였다.
(6) 투과 전자 현미경(TEM: Transmission electron microscopy)을 이용한 나노소낭의 형태 및 크기 분석
투과 전자 현미경(TEM: Transmission electron microscopy)을 이용하여 나노소낭의 형태 및 크기를 분석하였다. CMNV 및 T7-CMNV를 AMO21c의 존재 또는 부존재하에 제조하였다. Mesh copper grids (Ted Pell, Redding, CA)를 증류수의 비말(droplets)로 세척하였다. 그 후, 샘플을 그리드(grids) 상에 로딩하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플의 비말(droplets)을 흡수 종이(absorbent paper)로 침지시키고, 진공 챔버에서 건조시켰다. 음성 염색(negative staining)은 2% 텅스텐산(tungstic acid)을 사용하였고, 샘플은 TEM(JEM-2100F, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였다.
(7) 나트륨 도데실(Sodium dodecyl) 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE: sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을 이용한 단백질 분석
CMNV 및 C6 용해물 내의 단백질 프로파일(profiles)을 설페이트-폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE: sulfate-polyacrylamide gel)을 이용하여 비교하였다. CMNV를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. C6 용해물은 프로테아제 억제제 칵테일 처리(protease inhibitor cocktail treatment)와 함께 3분 동안 C6 세포의 초음파처리를 이용하여 제조하였다. 샘플을 12% 겔 상에서 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.
(8) 나노소낭의 세포 흡수 평가를 위한 유세포 분석(Flow cytometry)
다양한 조건에서 나노소낭의 세포 흡수를 평가하기 위해 유동 유세포 분석(Flow cytometry)을 수행하였다. C6, N2a 및 HEK293 세포를 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 DMEM을 함유하는 10% FBS에서 배양하였다. 세포를 12-웰 마이크로분석 플레이트(12-well microassay plate)에 웰 당 2 X 105개 세포의 밀도로 시딩하고(seeded), 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지는 형질감염 전에 새로 교체하였다. Cy5-AMO21c-적재된 T7-CMNV(Cy5-AMO21c-loaded T7-CMNVs) (T7-CNV/Cy5-AMO21c)를 최적 비율로 제조하고, 세포에 첨가하였다. Cy5-AMO21c의 양을 0.2 μg/well로 고정시켰다. 4시간 후, 세포를 DPBS로 2회 세척하고, Tris-EDTA 완충액에서 획득하였다. 세포를 1,000 g에서 3분 동안 원심분리하고, FACS 튜브에서 DPBS로 재현탁하였다. Cy5-양성 세포의 비율(%) 및 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity)를 유세포분석(BD FACS CaliburTM, BD Biosciences Immunocytometry Systems, San Jose, CA)를 이용하여 분석하였다.
(9) 형광 현미경(Fluorescence microscopy)을 이용한 세포 이미지
1) 교모세포종
C6 세포를 웰 당 1 X 105개 세포의 밀도로 챔버 슬라이드(chamber slide) 상에 시딩하였다. T7-CMNV/Cy5-AMO21c를 상기 기재된 바와 같이 세포 내로 형질 감염하였다. 세포를 DPBS로 2회 세척하고, 핵(nuclei)을 DAPI로 염색하였다. 염색된 섹션을 장착하고, Z1 digital slide scanner(ZEISS, Oberkochen, Germany)인 AxioScan을 이용하여 관찰하였다.
2) 급성폐손상
투과전자현미경(TEM: transmission electron microscopy)를 이용한 나노소낭의 형태 및 크기 분석하였다. exosome과 CMNV에 각각 AMO155c (핵산:전달체의 무게비 1:3)을 로딩하고, 투과전자현미경으로 관찰하였다. 그 결과, exosome과 CMNV에서는 막구조의 형태가 관찰되었다 (도 12 참조).
또한, 배양된 LA4 마우스폐상피세포에 형광표지된 치료핵산이 로딩된 CMNV과 exosome을 각각 투여(1 ㎍ AMO155c/1×105 세포) 하고, 일정 시간 후에 flowcytometry를 통하여 세포에 이입된 치료핵산의 양을 측정하였다.
(10) 트랜스웰 모델 분석(transwell model assay)을 통한 트랜스사이토시스(Transcytosis) 평가
시험관내 트랜스웰 모델 분석(transwell model assay)을 수행하여 T7-CMNV 트랜스사이토시스(Transcytosis)를 평가하였다. bEND.3 마우스 내피 세포를 12-웰 트랜스웰 플레이트(Corning, New York, NY)에서 DMEM을 함유하는 10% FBS로 시험관내에서 BBB를 모방하기 위해 영역의 정점 측에서 웰당 4 X 105개 세포의 밀도로 시딩하였다. TEER 값이 200 Ω cm2 초과에 도달하면, T7-CMNV/Cy5.5-AMO21c를 배지 교체한 후에 첨가하였다. 6시간 및 24시간의 인큐베이션 후, 기저측면 측의 bEND.3 세포 및 배지를 획득하였다. 평균 형광 강도는 FACS를 이용하여 bEND.3 세포로부터 측정하거나 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 배지로부터 측정하였다.
(11) MTT 분석
C6 세포를 상기 기재된 바와 같이 96-웰 마이크로분석 플레이트(96-well microassay plate)에 웰당 1 X 104개 세포의 밀도로 시딩하였다. CMNV 및 T7-CMNV를 배지 교체 후 세포에 첨가하였고, 2배 연속 희석에 의해 5 μg/well 내지 39 ng/well 범위의 배지 교체 후 세포에 추가하였다. 리포펙타민(Lipofectamine)은 대조군으로서 사용하였고, 4시간의 인큐베이션 후, 배양 배지를 교체하고, 세포를 37℃에서 추가로 20시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 웰당 10 μg의 MTT를 세포에 첨가하고, 37℃에서 추가로 4시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지를 제거하고, 100 μl의 DMSO를 세포에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율을 다음과 같이 계산하였다: 세포 생존율(%) = (OD570(샘플))/OD570(대조군)의 평균) X 100.
(12) 혈액 적합성(Hemo-compatibility) 분석
Sprague Dawley (SD) 래트(rat)로부터 혈액 샘플을 획득하고, 500 g에서 3분 동안 EDTA-함유 튜브에서 원심분리하였다. 혈장(Plasma)을 제거하고, 적혈구(RBC: red blood cells)를 DPBS로 3회 세척하였다. 재현탁된 RBC를 마이크로튜브(microtubes)로 옮기고, 1 μg의 네이키드 AMO21c(naked AMO21c), 리포펙타민/AMO21C(lipofectamine/AMO21c), CMNV/AM021c, T7-CMNV(AMO21c) 또는 ScrT7-CMV/AM021c와 함께 인큐베이션하였다. 대조군을 음성 대조군으로 DPBS로 처리하였다. 인큐베이션 1분 후, 샘플을 적절한 양의 DPBS로 희석하고, 관찰을 위해 유리 슬라이드 상에 탑재하였다.
(13) 동물모델 실험
1) 래트 교모세포종(Rat glioblastoma) 모델의 제작
모든 실험 동물 프로토콜은 한양 대학교(Hanyang University)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)에 의해 승인되었다(수행 번호: 2019-0205). C6 교모세포종 세포 (동물당 PBS 10 μl에 1x105 cells)를 마취 하에 정위 장치(stereotaxic equipme)를 갖는 7주령 수컷 SD 래트에 주사하였다. 주사의 좌표는 브레그마(bregma)로부터 3.0 mm 측면 및 두개골 표면으로부터 4.0 mm 깊이였다. 주입은 0.9 μl/min의 속도로 수행하였다. 일주일 후, T7-CMNV/AMO21c는 900 μl DPBS에 60 μg APMO21c의 용량으로 꼬리 정맥을 통해 정맥주사 하였다. 구체적으로, 상기 APMO21c는 수컷 SD rat 기준 6주령을 사용하여 평균적으로 250 g의 무게를 기준으로 60 μg을 투여하였고, kg 당 240 μg 정도의 양을 투여하였으며, 나노소낭(인지질) 및 T7의 경우, 무게 비율 기준으로 AMO21c의 5배에 해당하는 양(kg당 1200 μg의 나노소낭(인지질) 및 T7)을 투여하였다. 래트를 정맥내 주사 후 일주일 후에 희생(sacrificed)시키고, 뇌를 획득하였다. 조직을 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시키고 파라핀(paraffin)으로 넣었다(embedded).
2) 급성폐손상 동물모델의 제작
일정한 양(20 ㎍/마리)의 LPS를 기도를 통하여 투여하여 급성폐손상 동물모델을 제조하였다. AMO155c/CMNV, AMO155c/exosome을 1:3의 무게비로 로딩하였다. AMO155c가 로딩된 CMNV와 exosome을 intratracheal administration (기도투여)를 실시하였다. 각 동물 당 5 ㎍의 AMO155c를 투여하였다.
(14) 니슬 염색(Nissl staining)
파라핀-포매된 뇌 조직(paraffin-embedded brain tissues)을 5-μm-두께 절편으로 절단하였다. 절편을 0.1% 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색하고, 70% 에탄올(ethanol) 및 10% 아세트산(acetic acid)으로 탈색하고, 100% 에탄올 및 자일렌(xylene)으로 탈수시켰다. 절편의 이미지는 Image J software를 이용하여 분석하였다.
(15) miRNA-21에 대한 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR: Reverse transcription-polymerase chain reaction) 수행
miRNAeasy FFPE 키트를 사용하여 파라핀-포매된 뇌 절편으로부터 총 RNA를 추출하였다. cDNA는 SensiFAST SYBR-Lo-ROX 키트(Meridian Bioscience, Mamphis, TN, USA)를 이용하여 합성하였다. 샘플은 Applied Biosystems 7500 RT-PCR System (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)을 이용하여 분석하였다. 사용된 miR-21 프라이머의 서열은 다음과 같다: 정방향 프라이머, 5'-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3'(서열번호 2) 및 역방향 프라이머, 5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'(서열번호 3). 사용된 GAPDH 프라이머의 서열은 다음과 같다: 정방향 프라이머, 5'-AGACAGCCGCATCTTCT TGT-3'(서열번호 4) 및 역방향 프라이머, 5-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3'(서열번호 5).
(16) 샘플의 면역조직화학(Immunohistochemistry) 검사
파라핀-포매된 뇌 조직을 5-μm-두께 절편으로 절단하였다. 절편을 탈파라핀화(deparaffinized)하고, 순차적으로 재수화(rehydrated)하였다. 샘플을 0.05% PBST로 5분 동안 2회 세척하고, 10% 염소 혈청(goat serum) 및 1% BSA를 함유하는 PBS로 실온에서 2시간 동안 차단(blocked)하였다. 토끼 항PDCD4 항체, 마우스 항PTEN 항체 또는 마우스 항Ki67 항체를 1% BSA를 함유하는 PBS 중에 1:500으로 희석하였다. 절편은 항체와 함께 4℃에서 밤새(overnight) 인큐베이션하였다. 샘플을 2회 세척하고, AxioScan으로 시각화하였다. 세포 사멸의 검출을 위한 제조사 매뉴얼에 따라 Deadend TUNEL system kit로 TUNel 분석을 수행하였다.
(17) 샘플의 생체분포(Biodistribution) 분석
T7-CMNV/Cy5.5-AMO21c를 꼬리 정맥을 통해 래트 내로 정맥내 주사하였다. Cy5.5-AMO21c의 분포를 형광 생체내 영상화 시스템(FOBI system, Neo Science, Suwon, Korea)을 이용하여 조사하였다. 래트 교모세포종 모델을 상기 기재된 바와 같이 제조하고, T7-CMNV/Cy5.5-AMO21c를 래트 당 60 μg의 AMO21c 용량으로 주사하였다. 구체적으로, 상기 APMO21c는 수컷 SD rat 기준 6주령을 사용하여 평균적으로 250 g의 무게를 기준으로 60 μg을 투여하였고, kg 당 240 μg 정도의 양을 투여하였으며, 나노소낭(인지질) 및 T7의 경우, 무게 비율 기준으로 AMO21c의 5배에 해당하는 양(kg당 1200 μg의 나노소낭(인지질) 및 T7)을 투여하였다. 래트를 주사로부터 2시간 또는 18시간 후에 희생시키고, 생체외 형광 이미지는 NEOimage software(Neoscience, Suwon, Korea)를 이용하여 분석하였다.
(18) 샘플의 혈액 분석
혈액 샘플은 희생 당시 래트로부터 채취하였다. 샘플을 500 g에서 3분 동안 원심분리하고, 혈청을 수집하였다. 혈청 샘플은 Automated Chemistry Analyzer(Fujifilm NX700, Tokyo, Japan)로 분석하였다.
(19) 통계 분석
데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시되고, 그룹들 사이의 차이는 ANOVA와 Tukey의 다중 비교 시험(Tukey's multiple comparisons test)을 통해 결정하였다.　0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
2. 실험 결과
(1) CMNV, T7-CMNV 및 AMO21c 또는 AMO155c가 로딩된 CMNV의 특성화
상기 실시예 1-(2)에서 CMNV를 제조한 후, AMO21c를 소수성 상호작용에 의해 소낭 상에 로딩하였다. 나노소낭 내로의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)의 로딩은 전기천공(electroporation), 초음파처리(sonication) 또는 형질감염 시약(transfection reagents)을 이용하여 수행하였다. 그러나 올리고뉴클레오티드의 나노소낭 내로의 로딩 효율은 좋지 않은 반면 전기천공에 의한 로딩 효율은 1 내지 5% 정도이다. 따라서 대부분의 올리고뉴클레오티드가 로딩되지 않아 전달 효율이 좋지 않았다. 본 연구에서는 AMO21을 콜레스테롤 모이어티와 접합시켜, AMO21c를 생성하였다. AMO21c는 CMNV와 혼합되어 AMO21c는 소수성 상호작용에 의해 CMNV 상에 로딩되었다. 대부분은 CMNV의 표면 상에 로딩되었지만, AMO21c는 2'-위치에서 메틸기(methyl group)로 변형되어, 혈청 내의 뉴클레아제(nucleases)에 의해 분해되지 않았다. 또한, CMNV 및 T7-CMNV에 대한 AMO21c의 로딩 효율을 측정하였다. Cy5-표지된 AMO21c를 제조하고, 나노소낭과 혼합하였다. 초원심분리를 수행하여 나노소낭을 단리하였다. 그 결과, CMNV 및 T7-CMNV에 대해 각각 14.58 ± 3.08% 및 15.1 ± 1.97%였다. 전기천공은 miRNA(microRNA)를 나노소낭 내로 로딩하기 위해 널리 수행되었으나, 효율성을 제한하는 확산-의존성(diffusion-dependen)이다. 따라서, miRNA의 로딩을 위한 소수성 변형은 효율을 증가시키는 옵션일 수 있다.
T7-CMNV의 입자 크기는 CMNV 및 T7c의 비율과 함께 증가하는 경향이 있음을 확인하였다(도 2a). 입자 크기의 증가는 두 가지 원인에 의해 유도될 수 있다. 첫째, T7c는 상기 기재된 바와 같이 콜레스테롤과의 소수성 상호작용 및 T7 펩티드와의 리간드-수용체 상호작용인 2개의 상호작용을 통해 C6 세포막과 상호작용할 수 있다. 이들 상호작용은 입자간 상호작용을 가능하게 하고 입자 크기의 증가에 기여한다. 그러나, 압출은 T7-CMNV의 크기 증가를 제한할 수 있고, 입자 크기는 다른 시험된 비율(도 2a)과 비교하여 1:4에서 유의하게 증가하지 않는 것을 확인하였다. 둘째, T7 펩티드를 사용한 CMNV 표면 장식은 입자 크기를 증가시킬 수 있다. T7-CMNV 제조 공정에서 T7c 및 세포막을 사용한 압출은 T7의 막 내로의 통합을 용이하게 하였다. 일부는 CMNV의 외부에 그의 표면 상에 위치할 수 있는 반면, 다른 것들은 CMNV의 내부에 이를 만들 수 있다. 따라서, CMNV의 표면 상의 T7 펩티드는 입자 크기의 증가에 기여할 수 있다.
T7c에 의한 CMNV 간 상호작용은 다른 두 가지 가능한 설명보다 크기 증가에 더 크게 기여할 수 있다. 이러한 추측은 CMNV 상에 AMO21c를 로딩한 후 크기 평가를 기초로 하였다. AMO21c를 T7-CMNV 또는 CMNV와 함께 인큐베이션하고, 콜레스테롤과의 소수성 상호작용에 의해 표면 상에 로딩되었다. CMNV와 AMO21c 사이의 비율은 세포 흡수 연구에 기초하여 5:1의 질량비로 고정하였다(도 3). CMNV의 경우, CMNV 막에 결합된 단백질 농도를 정량한 값을 기준으로 하였고, 무게당 나노소낭의 개수는 6.15 x 1011 ± 1.16 x 1011 particles per 1 mg 단백질 농도로 측정되었다. 생성된 CMNV의 입자 크기를 동적 광산란(dynamic light scattering)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, CMNV와 T7-CMNV 모두에 대해 AMO21c 로딩 후 입자 크기가 증가하지 않음을 확인하였다(도 2B). AMO21c의 크기가 T7c의 크기보다 더 크고, AMO21c로 CMNV 표면을 장식(decoration)해도 입자 크기가 증가하지 않는다는 점을 고려할 때 CMNV 표면의 T7 장식은 크기가 증가하지 않을 가능성이 높다. 따라서, T7c에 의한 크기 증가는 inter-CMNV 상호작용으로 인한 것일 수 있으며, 이는 응집으로 인한 크기 증가에 기여할 수 있다. 입자 크기는 약력학에 상당한 영향을 미친다. 200 nm 초과의 직경을 갖는 입자가 BBB를 침투하는 것이 어렵기 때문에, T7c와 CMNV 사이의 비율은 1:1의 질량비로 고정하였고, 이때, T7-CMNV/AMO21c의 평균 크기는 176.96 nm ± 0.65이다.
또한, AMO155c가 로딩된 CMNV와 exosome의 크기 측정을 dynamic light scattering assay로 측정하였다. 그 결과, Naked AMO155c만 존재할 때는 불안정한 크기의 마이셀이 생성되었으나, CMNV와 exosome의 비율이 증가할수록 점차 안정한 크기를 보여주었다. 특히, CMNA가 보다 작은 크기를 보여주었다 (도 13 참조).
CMNV의 제타 전위는 세포막이 음전하를 띠기 때문에 약 -13 mV인 것을 확인하였다(도 2c). T7-CMNV의 제타 전위는 CMNV보다 약간 더 높은 것으로 보였지만, 두 군 사이의 차이는 통계적으로 유의하지 않다. T7-CMNV는 T7c의 전하가 아르기닌 잔기(arginine residues)로 인해 양성이기 때문에 CMNV보다 더 높은 제타 전위를 가질 수 있다고 추측된다. T7-CMNV에 AMO21c를 로딩하면 T7c의 양전하를 마스킹하여 제타 전위를 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 2c). T7과 같은 양전하를 띤 펩티드가 없기 때문에 CMNV에서 명확하게 확인되지 않았다(도 2c). CMNV의 음의 표면 전하는 알부민(albumin)과 같은 음으로 하전된 혈청 단백질(serum proteins)과의 상호작용이 전하 반발로 인해 감소될 수 있기 때문에 순환에 도움이 될 수 있다.
CMNV 및 T7-CMNV의 안정성은 치료 응용 분야에서도 중요하다. CMNV 및 T7-CMNV를 제조한 후, 나노소낭을 4℃에서 최대 21일 동안 인큐베이션하였다. 이들의 안정성은 동적 광 산란을 이용하여 평가하였다. 그 결과, CMNV의 크기가 인큐베이션 동안 유의하게 변화되지 않았음을 확인하였다(도 2d). CMNV의 형태를 TEM을 이용하여 평가하였고, 구형 형태인 것을 확인하였다(도 2e). DLS 및 TEM으로부터의 결과를 재확인하기 위해, 나노소낭을 다시 NTA로 측정하였다(도 2f). 또한, NTA 결과를 일반적인 비신초닌산 분석(bicinchoninic acid assay)의 결과와 비교함으로써, CMNV의 농도를 정확하게 추측하였다: 1 mg 단백질 당 대략 6.15 x 1011 ± 1.16 x 1011 입자.
CMNV 및 T7-CMNV의 세포독성은 MTT 및 용혈 분석을 이용하여 평가하였다. AMO21c 담체에 대한 대조군으로서, 리포펙타민을 사용하였다. MTT 분석은 CMNV 및 T7-CMNV가 5 μg/ml 농도까지 세포에서 검출가능한 독성을 유도하지 않았음을 확인하였다(도 4a). 그러나, 리포펙타민이 처리된 세포에서의 독성은 2.5 μg/ml에서 시작하여 상당히 증가함을 확인하였다(도 4a). 양이온성 지질의 독성은 음전하를 띤 세포막과의 전하 상호작용 때문일 수 있고, 세포막의 표면 상의 양이온성 유전자 담체의 전하 상호작용이 응집 및 세포막 파열을 유도하여, 세포 생존율을 감소시키는 것일 수 있다. 따라서, 리포펙타민의 독성은 양이온성 전하 때문일 수 있다. CMNV 및 T7-CMNV의 경우에, 표면 전하가 음전하를 띠고, 세포막과 전하 상호작용이 없다.
또한, CMNV 및 T7-CMNV의 독성을 용혈 연구를 통해 평가하였다. 용혈 연구에서 AMO21c가 로딩된 CMNV 또는 T7-CMNV(CMNNV/AM021c 또는 T7 -CMNV/AM021c)를 독성의 관점에서 평가하였다. 그 결과, CMNV/AMO21c 및 T7-CMNV/AM021c가 용혈을 유도하지 않았음을 확인하였다(도 4b). 그러나, 리포펙타민/AMO21c는 용혈을 유의하게 유도함을 확인하였다(도 4b). 리포펙타민/AMO21c는 리포펙타민의 표면 전하가 AMO21c의 *?*음전하로 가려지기 때문에 리포펙타민 단독보다 독성이 낮을 수 있습니다. 그러나, 리포펙타민/AMO21c는 적혈구 세포막과 상호작용하여 용혈을 유도하였다. 이들 결과는 정맥내(IV: intravenous) 주사 후 순환 시간과 관련이 있다. 혈청 단백질과의 리포펙타민 응집은 간에서 쿠퍼 세포(Kupffer cells)에 의한 리포펙타민/AMO21c의 흡수를 용이하게 할 수 있고, 이들은 신속하게 제거된다. 따라서, CMNV에 비해 리포펙타민과 같은 응집 입자가 뇌 대신 간에 축적되어 간독성을 유발할 가능성이 있다.
(2) CMNV 및 T7-CMNV의 AMO 전달
CMNV 및 T7-CMNV의 전달 효율을 Cy5-표지된 AMO21c로 평가하였다. AMO21c-로딩된 CMNV(CMNV/AMO21C) 및 AMO2lc 로딩된 T7-CMNv(T7-CCNV/AMO21c)를 C6 세포에 첨가하였다. 네이키드 AMO21c(Naked AMO21c) 및 리포펙타민/AMO 21c를 대조군으로 사용하였다. 각각의 샘플의 세포 흡수 효율을 유세포 분석(flow cytometry)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, T7-CMNV가 C6 교모세포종 세포로의 AMO21c의 가장 높은 세포 흡수 효율을 가짐을 확인하였다(도 5a). 리포펙타민, CMNV 및 스크램블된 T7-CMNV (scrT7-CNV)는 유사한 흡수 효율을 가짐을 확인하였다(도 5a). 상기 스크램블된 T7-CMNV는 기존에 알려져 있는 T7 펩티드와 서열(구성)은 동일하나, 펩티드 서열의 순서가 상이한 T7을 이용한 CMNV이며, scrT7-CMNV는 CNMV에 비해 전달 효율을 증가시키지 않았고, 이는 T7-CMNV 전달의 증가가 T7 펩티드의 효과로 인한 것일 수 있음을 시사하며, 상기 결과는 형광 현미경 검사에 의해 확인하였다(도 5b).
또한, CMNV 및 T7-CMNV의 전달 효율을 상이한 유형의 세포에서 비교하였다. N2A 신경아세포종 세포를 사용한 전달 분석에서 T7-CMNV는 CMNV 및 ScrT7-CNV보다 더 높은 전달 효율을 가짐을 확인하였다(도 5c). 신경아세포종은 트랜스페린 수용체를 정상 세포보다 더 높은 수준으로 발현하는 것으로 보고되었다. 따라서, T7-CMNV는 트랜스페린 수용체와의 더 많은 상호작용으로 인해 신경아세포종 세포에서 더 높은 전달 효율을 가질 수 있다. 또한, CMNV 및 scrT7-CMNV는 N2A 세포에 대한 유사한 전달 효율을 갖는 것으로 관찰되었다. 이는 T7-CMNV의 더 높은 효율이 T7 펩티드의 효과로 인한 것임을 확인하였다.
비-암 세포(non-cancer cells)로서, HEK293 세포를 사용하여 T7-CMNV의 전달 효율을 평가하였다. 동일한 전달 연구를 Cy5-AMO21c로 수행하였다. 그 결과, T7-CMNV가 CMNV 및 scrT7-CMNV에 비해 AMO21c 세포 흡수를 유도하지 않았음을 확인하였다(도 5d). HEK293 세포는 트랜스페린 수용체를 유의한 수준으로 발현하지 않으며, T7 펩티드가 HEK 293 세포로의 전달 효율 T7-CMNV에 미치는 효과는 제한되었다. 상기 결과는 T7-CMNV가 AMO21c를 트랜스페린 수용체-발현 세포, 예컨대 암 세포 및 내피 세포로 전달할 수 있음을 나타낸다.
트랜스페린 수용체는 교모세포종 세포 및 BBB의 내피 세포 둘 다에서 과발현된다. 따라서, 트랜스페린 수용체에 대한 리간드는 BBB를 통해 뇌로의 교모세포종 표적화 및 트랜스사이토시스에 대해 광범위하게 연구되어 왔다. 이에 의해, BBB 트랜스사이토시스 및 암 표적화는 단일 표적화 리간드와 동시에 달성될 수 있다. T7-CMNV의 트랜스페린 수용체 결합 및 트랜스시토시스 능력을 입증하기 위해, CMNV 및 T7-CNV를 사용한 트랜스웰(transwell) 실험을 수행하였다. bEND.3 마우스 내피 세포를 트랜스웰의 정점 측에 시딩하고, 내피층에 대해 배양하였다. Cy5-AMO21c-로딩된 CMNV 또는 T7-CMNV를 bEND.3 세포에 첨가하였고, 리포펙타민/Cy5-AMO21c를 대조군으로 사용하였다. 지정된 시간에, 트랜스웰 상의 bEND.3 세포 및 마이크로분석 플레이트의 기저측면 측으로부터의 배지 내의 양성 형광 신호를 유세포 분석 및 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다. 6시간의 인큐베이션 후, CMNV/AMO21c 및 scrT7-CMNv/AM021c와 비교하여, T7-CMINV/AMO21c의 첨가 후 bEND.3 세포에서의 형광 신호가 증가되었다(도 6a). 이러한 결과는 T7-CMNV 상의 T7 펩티드가 AMO21c의 bEND.3 세포로의 세포내 전달을 증가시켰음을 시사한다. 마이크로분석 웰의 바닥에서 배지는 T7-CMNV/AMO21c 군에서 가장 높은 형광 신호를 나타내었고, 이는 AMO21C가 bEND.3 세포층 내에서 트랜스사이토시스에 의해 C6 세포로 전달되었음을 확인하였다(도 6b). 24시간의 인큐베이션 후, T7-CMNV/AMO21c-처리된 bEND.3 세포의 형광 수준은 CMNV/AM021c 및 scrT7-CMV/AM021c의 형광 수준과 유사함을 확인하였다(도 6c). 또한, T7-CMNV/AMO21c 군의 배지 중 형광 수준을 추가로 증가시킴을 확인하였다(도 6d). 상기 결과는 세포 흡수 및 트랜스사이토시스 과정이 T7-CMNV에 의해 촉진되었음을 시사한다.
(3) 정맥내 투여 후 T7-CMNV의 생체분포
T7-CMNV의 전달 효율은 생체분포(biodistribution) 연구를 통해 평가하였다. 리포펙타민, CMNV 및 ScrT7-CMNV를 음성 대조군으로서 사용하였다. Cy5.5-AMO21c는 소수성 상호작용에 의해 CMNV, T7-CMNV 및 scrT7-CMNV 상에 로딩하였다. 또한, 리포펙타민/Cy5.5-AMO21c는 전하 상호작용을 통해 제조하였다. 꼬리 정맥 내로 샘플을 정맥내 주사한지 18시간 후에, 기관(organs)을 수거하고, 영상 상자(image box)에서 형광 신호를 관찰하였다. 대부분의 AMO21c는 간 및 신장에서 관찰되었다. 특히, 리포펙타민/AMO21c는 AMO21C를 사용한 CMNV보다 더 고도로 간에 흡수됨을 확인하였다(도 7a). 이는 양전하로 하전된 리포펙타민/AMO21c 입자가 CMNV보다 더 용이하게 쿠퍼 세포에 의해 흡수되었음을 나타낸다. 대조적으로, 음성 표면 전하를 갖는 CMNV는 쿠퍼 세포에 의한 클리어런스(clearance)를 감소시킬 수 있다. 뇌에서 Cy5.5-AMO21c의 형광 신호는 CMNV, scrT7-CMNV 및 리포펙타민에 비해 T7-CMV에 의해 증가됨을 확인하였다(도 7b 및 7c). 상기 결과는 T7 펩티드가 뇌로의 트랜스사이토시스 및 전달 효율을 촉진시킴을 확인시켜 주었다.
종양 세포 막-코팅된 나노입자가 동형 표적화 효과(homotypic targeting effects)를 갖는다는 것이 이전에 제안되었다. 따라서, CMNV는 동형 표적과 관련된 종양-표적화 효과를 가질 수 있다. 그러나, 이 효과는 본 연구에서 관찰되지 않았고, CMNV 및 ScrT7-CMNV의 전달 효율은 뇌 표적화 모이어티를 갖지 않는 리포펙타민과 유사하였다. 이는 CMNV가 BBB를 통해 뇌에 들어갈 수 없고, 뇌-표적화 리간드, 예컨대 T7 펩티드가 불가피하기 때문일 수 있다.
생체내 CMNV 및 T7-CMNV의 가능한 독성을 평가하기 위해 체중(도 8a), AST(도 8b), ALT(도 8c) 및 BUN(도 8d)을 측정하였다. 그 결과, CMNV 및 T7-CMNV가 동물에서 눈에 띄는 독성을 유발하지 않음을 확인하였다(도 8a 내지 도 8d).
(4) T7-CMNV를 사용한 AMO21c의 종양 표적화 전달 및 치료 효과
C6 세포를 래트의 뇌 내로 주사함으로써, 동소 교모세포종 모델(Orthotopic glioblastoma models)을 제조하였다. 이식 일주일 후, T7-CMNV/AMO21c를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 리포펙타민/AM021c, CMNV/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AM021c를 대조군으로서 주사하였다. 주사 7일 후, 동물을 희생시키고, 뇌를 채취하였다. AMO21c 전달의 효과를 평가하기 위해, RT-PCR을 수행하여 miR-21을 증폭시켰다. 그 결과, miR-21 수준이 CMNV/AMO21c 및 T7-CMNV/AM021c의 주사 후 감소됨을 확인하였다(도 9). 특히, T7-CMNV/AMO21c에 의한 miR-21의 감소는 CMNV/AM021c보다 높았고, 이러한 결과는 T7-CMNV가 CMNV에 비해 뇌로의 AMO21c의 전달 효율을 증진시켰다는 것을 의미한다.
miR-21의 감소는 이의 표적 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다. 표적 유전자 발현을 평가하기 위해 뇌 샘플에서 PDCD4 및 PTEN 발현을 평가하였다. PDCD4 및 PTEN은 miR-21의 표적 유전자이며, 이의 3개의 5'-UTR 내에 miR-21 인식 부위를 갖는다. PDCD4 및 PTEN의 하향-조절은 종양 환경에서 종양 세포의 높은 생존율과 밀접하게 관련되었다. 따라서, AMO21c 전달은 miR-21을 억제하여, PDCD4 및 PTEN 발현을 증가시킬 수 있고, 도 10a와 같이 PDCD4 발현이 T7-CMNV/AMO21c에 의해 증가되었음을 확인하였다. 특히, T7-CMNV/AMO21c는 다른 샘플, 예를 들어, CMNV/AM021c 및 scrT7-CMNV/AM021c보다 더 효율적으로 PDCD4 발현을 증가시켰고(도 10a), 도 7에 나타낸 바와 같이, CMNV/AMO21c는 T7-CMNV/AM021c만큼 효율적으로 뇌에 침투하지 않았고, 이는 T7 펩티드가 뇌로의 AMO21C의 전달 효율을 증가시켰음을 시사한다. 따라서, T7-CMNV의 T7 펩티드에 의한 AMO21c의 촉진 전달은 뇌에서의 PDCD4 발현을 증진시킬 수 있고, 상기와 유사한 결과가 PTEN 면역조직화학에서 관찰되었다. PTEN 발현은 T7-CMNV/AMO21c의 정맥내 투여에 의해 가장 효율적으로 유도됨을 확인하였다(도 10b).
몇몇 연구는 증식 마커 Ki67 발현이 암 중증도에 크게 비례하는 정도를 시사한다. AMO21c 전달의 항-종양 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 면역조직화학을 통해 래트 뇌에서 Ki67 발현을 평가하였고, 리포펙타민/AM021c, CMNV/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AM021c는 Ki67 발현을 감소시켰으나, Ki67 발현은 T7-CMNV/AMO21c에 의해 보다 효율적으로 감소됨을 확인하였다(도 11). 상기 T7-CMNV/AMO21c에 의한 Ki67의 증진된 감소는 T7-CNV에 의한 뇌 내로의 AMO21C의 보다 효율적인 전달로 인한 것일 수 있으며, 이는 T7-CCNV의 표면 상의 T7 펩티드가 BBB를 통한 뇌 내로의 AMO2lc의 침투를 용이하게 한다는 것을 시사하는 증거를 지지한다.
샘플의 종양 크기를 니슬 염색을 통해 평가하였다. AMO21c로 처리된 모든 군에 걸친 종양 크기는 감소되었다. 특히, T7-CMNV/AMO21c는 다른 샘플과 비교하여 종양 크기를 가장 효율적으로 감소시킴을 확인하였다(도 12). 다른 그룹도 종양 크기를 약 40% 감소시켰으나, 그 효과는 T7-CMNV/AMO21c만큼 유의하지 않았다. 구체적으로, CMNV/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AM021c는 종양 크기에 대해 T7-CMNV 및 AMO21C보다 더 낮은 효과를 가졌고, 이는 BBB를 통한 종양 표적화 전달에 대한 T7 펩티드의 효과를 추가로 시사한다.
(5) CMNV를 사용한 AMO155c의 표적화 전달 및 치료 효과
1) 핵산의 전달효율을 측정
다양한 비율로 AMO155c/CMNV와 AMO155c/exosome을 준비하고, LA4 세포에 투여하여 핵산의 전달효율을 측정하였다. 그 결과, CMNV의 경우에 1:3 의 비율에서 우수한 전달 효율을 보여주었으며, 그 이상의 비율에서는 거의 비슷한 효율을 보여주었다. 따라서, 동물실험에서는 1:3의 비율을 이용하였다. 또한, exosome의 경우에도 전달효율을 개선하기는 하였으나, CMNV의 경우가 전달 효율이 훨씬 개선되었다 (도 14 참조).
2) 치료 효과 확인
급성폐손상 치료 효과는 급성폐손상 동물모델에 AMO155c가 로딩된 CMNV와 exosome을 처리한 후, 24시간 후에 기관지폐세척액과 폐조직에서 IL-1beta와 IL-6의 양을 측정하였다 (도 15 참조). 대조군으로 양이온성 고분자인 polyethylenimine (25 kDa, PEI25k)도 전달체로 이용하였다. 그 결과 AMO155c/CMNV가 가장 효과적으로 IL-1beta와 IL-6를 줄일 수 있음이 확인되었다 (A, B는 기관지폐세척액에서 측정, C, D는 폐조직추출액에서 측정).
또한, hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 통하여, 염증반응 정도를 측정하였다. 그 결과, AMO155c/CMNV의 경에 가장 효과적으로 염증반응을 줄이는 것을 확인하였다 (도 16 참조).

Claims (22)

  1. 세포막 유래 인지질 이중층;
    상기 인지질 이중층의 소수성 부위에 결합된 표적화 물질; 및
    상기 인지질 이중층의 소수성 부위에 결합된 핵산을 포함하는, 핵산 전달용 나노소낭.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 표적화 물질은 소수성 물질이 결합된 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 소수성 물질이 결합된 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 소수성 물질은 콜레스테롤(cholesterol), 팔미트산(Palmitic acid), 토코페롤(Tocopherol) 및 올레산(Oleic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 핵산 전달용 나노소낭.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 표적화 물질은 상기 인지질 이중층 내부의 친수성 부위 및 상기 인지질 이중층 외부의 친수성 부위에 존재하는 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 표적화 물질은 T7 펩티드(T7 peptide), RAGE 부착 펩티드 (Receptor for advanced glycation end products binding peptide), 클로로톡신(Chlorotoxin), 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2) 및 광견병 바이러스 글라이코단백질(Rabies virus glycoprotein)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 핵산 전달용 나노소낭.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 메틸기(methyl group)로 변형된 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotides), 항-miRNA 올리고뉴클레오타이드(anti-microRNA oligonucleotides), miRNA, mRNA, siRNA, tRNA, sgRNA, shRNA 및 이들의 변형체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 핵산 전달용 나노소낭.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 나노소낭은 투여 대상 1 kg 당 200 μg 내지 280 μg의 핵산 용량으로 투여되는 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 인지질과 상기 표적화 물질은 1:2 내지 2:1의 질량비로 존재하는 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 인지질과 상기 핵산은 10:1 내지 1:1의 질량비로 존재하는 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 나노소낭의 직경은 165 nm 내지 185 nm인, 핵산 전달용 나노소낭.
  13. 청구항 1의 나노소낭을 포함하는 핵산 전달용 조성물.
  14. 청구항 1의 나노소낭을 포함하는 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 암은 교모세포종, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 충수암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 항문암, 신암, 수뇨관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소암, 자궁암, 난소암, 외음암, 질암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 폐 질환은 급성폐손상인, 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 개체로부터 분리된 세포의 세포막을 분리하여 인지질들을 얻는 단계;
    상기 인지질들과 소수성 물질이 결합된 표적화 물질을 혼합하여 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계; 및
    상기 인지질 이중층과 소수성 물질이 결합된 핵산을 혼합하여 상기 표적화 물질과 상기 핵산이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계를 포함하는 것인, 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 세포막을 분리하는 단계는 상기 세포에 초음파 처리(sonication)하는 단계; 및
    상기 세포를 원심분리하는 단계를 포함하는 것인, 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 원심분리는 차등 원심분리(differential centrifugation), 순차적 원심분리(sequential centrifugation) 및 초원심분리(ultracentrifuge)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 분리 방법으로 수행되는 것인, 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법.
  20. 청구항 17에 있어서, 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계는 상기 인지질들과 상기 표적화 물질을 혼합한 후 압출하는 단계를 포함하는 것인, 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법.
  21. 청구항 17에 있어서, 상기 인지질과 상기 표적화 물질을 혼합하는 단계에서 상기 인지질과 상기 표적화 물질은 1:2 내지 2:1의 질량비로 혼합되는 것인, 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법.
  22. 청구항 17에 있어서, 상기 인지질 이중층과 상기 핵산을 혼합하는 단계에서 상기 인지질 이중층과 상기 핵산은 10:1 내지 1:1의 질량비로 혼합되는 것인, 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법.
PCT/KR2023/012789 2022-08-30 2023-08-29 세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법 WO2024049164A1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20220109148 2022-08-30
KR10-2022-0109148 2022-08-30
KR1020230110110A KR20240032637A (ko) 2022-08-30 2023-08-22 세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법
KR10-2023-0110110 2023-08-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024049164A1 true WO2024049164A1 (ko) 2024-03-07

Family

ID=90098296

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2023/012789 WO2024049164A1 (ko) 2022-08-30 2023-08-29 세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024049164A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009158678A1 (en) * 2008-06-27 2009-12-30 Children's Hospital & Research Center At Oakland Lipophilic nucleic acid delivery vehicle and methods of use therefor
KR20120013336A (ko) * 2009-03-25 2012-02-14 노파르티스 아게 약물 및 ｓｉＲＮＡ를 함유하는 제약 조성물
KR20140119514A (ko) * 2013-04-01 2014-10-10 삼성전자주식회사 양이온성 지질을 포함하는 온도민감성 리포좀 및 그의 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009158678A1 (en) * 2008-06-27 2009-12-30 Children's Hospital & Research Center At Oakland Lipophilic nucleic acid delivery vehicle and methods of use therefor
KR20120013336A (ko) * 2009-03-25 2012-02-14 노파르티스 아게 약물 및 ｓｉＲＮＡ를 함유하는 제약 조성물
KR20140119514A (ko) * 2013-04-01 2014-10-10 삼성전자주식회사 양이온성 지질을 포함하는 온도민감성 리포좀 및 그의 용도

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIM GYEUNGYUN; KIM MINKYUNG; LEE YOUNGKI; BYUN JUNG WOO; HWANG DO WON; LEE MINHYUNG: "Systemic delivery of microRNA-21 antisense oligonucleotides to the brain using T7-peptide decorated exosomes", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 317, 12 November 2019 (2019-11-12), AMSTERDAM, NL , pages 273 - 281, XP086001782, ISSN: 0168-3659, DOI: 10.1016/j.jconrel.2019.11.009 *
LE QUOC-VIET, LEE JAIWOO, LEE HOBIN, SHIM GAYONG, OH YU-KYOUNG: "Cell membrane-derived vesicles for delivery of therapeutic agents", ACTA PHARMACEUTICA SINICA B, vol. 11, no. 8, 1 August 2021 (2021-08-01), pages 2096 - 2113, XP093072133, ISSN: 2211-3835, DOI: 10.1016/j.apsb.2021.01.020 *
LEE YOUNGKI, KIM MINKYUNG, HA JUNKYU, LEE MINHYUNG: "Brain‐targeted exosome‐mimetic cell membrane nanovesicles with therapeutic oligonucleotides elicit anti‐tumor effects in glioblastoma animal models", BIOENGINEERING & TRANSLATIONAL MEDICINE, vol. 8, no. 2, 18 March 2023 (2023-03-18), pages e10426, XP093145537, ISSN: 2380-6761, DOI: 10.1002/btm2.10426 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016013751A1 (ko) 생리활성 물질 또는 단백질 전달용 조성물 및 이의 용도
WO2014021678A1 (ko) 암의 진단 및 치료를 위한 마이크로버블-나노리포좀 복합체
WO2021145595A1 (ko) 생체 내 약물 전달을 위한 지질 나노입자 및 이의 용도
WO2013109057A1 (ko) 자성나노입자-samirna 복합체 및 그 제조방법
JP2023510308A (ja) 寛容原性樹状細胞を作る方法
WO2019066535A1 (ko) 암 치료용 신규 재조합 원형질막-기반 소포체
WO2022191431A1 (ko) Kras 및 p53 유전자의 편집 기능이 있는 나노 리포좀 전달체 조성물
KR20220070433A (ko) Stat6을 표적으로 하는 세포외 소포-aso 작제물
WO2019078611A1 (ko) Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물
KR20220070432A (ko) Cebp/베타를 표적으로 하는 세포외 소포-aso 작제물
CN111511713A (zh) 阳离子性脂质
Hoffmann et al. Changing the way of entrance: Highly efficient transfer of mRNA and siRNA via fusogenic nano-carriers
EP3019611A1 (en) LIVER CANCER RELATED GENES-SPECIFIC siRNA, DOUBLE-STRANDED OLIGO RNA MOLECULES COMPRISING THE siRNA, AND COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CANCER COMPRISING THE SAME
WO2024049164A1 (ko) 세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법
WO2023136688A1 (ko) 생분해성 이황화 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질 및 이를 포함하는 지질나노입자
WO2023136689A1 (ko) 생분해성 에스터 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질 및 이를 포함하는 지질나노입자
WO2009104896A2 (ko) 암 치료용 핵산 의약 조성물
KR20240032637A (ko) 세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법
WO2017155281A1 (ko) 아데노바이러스와 pamam-peg-erbitux 복합체 및 이의 용도
WO2017039311A1 (ko) 아데노바이러스 단백질 vi 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물
WO2023054849A1 (ko) 염증성 질환 치료용 약학 조성물
WO2022191567A1 (ko) Covid-19를 포함하는 호흡기 바이러스 감염증, 바이러스 감염에 의한 폐섬유증, 또는 호흡기 질환 예방 또는 치료를 위한 초음파 방식 연무식 흡입기를 이용한 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 투여용 조성물
WO2022186625A1 (ko) 키메릭 항원 수용체-대식 세포의 제조 방법 및 그 세포의 용도
WO2023277610A1 (ko) 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 약물이 탑재된 세포 유래 자연 또는 인공 나노소포체를 함유하는 약학 조성물
WO2012133997A1 (ko) 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체 및 이를 이용한 유전자 치료

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23860840

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1