KR20240032637A - 세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법 - Google Patents
세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
일 양상은 세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 나노소낭은 세포막으로부터 유래하여 면역 반응 및 독성이 없으며, 원하는 세포의 타겟팅이 가능하고, 기존의 물질 전달에 사용되는 전달체들에 비해 핵산의 세포 내 전달 효율 및 핵산의 발현 효율이 현저히 우수하다. 또한, 상기 나노소낭이 표적하는 종양 세포로 이동함으로써, 종양 세포의 크기를 감소시킬 수 있음을 직접 확인하였는 바, 상기 나노소낭은 암의 예방, 개선 및/또는 치료에 활용될 수 있으며, 나아가, 생체 내 핵산의 전달 및 발현이 필요한 다양한 분야에 활용될 수 있다.
Description
세포막 유래 핵산 전달용 나노소낭 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
교모세포종은 원발성 뇌 종양의 대부분을 나타내고, 전세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나이다. 뇌로부터 다른 기관으로의 전이가 드물게 보고되지만, 교모세포종의 환자의 평균 생존율은 지금까지 절망적이다. 현재, 교아종의 임상 옵션은 외과적 절제 또는 방사선/화학요법이 있으나, 이들은 5년 생존율을 유의하게 개선하지 못하였다. 이러한 상태 때문에, 교모세포종에 대한 효율적인 치료를 개발하기 위한 다양한 연구 노력이 이루어졌다. 교모세포종에 대한 치료 유전자로서, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(HSVtk: herpes simplex virus thymidine kinase) 유전자가 전임상 및 임상 환경에서 조사되었다. HSVtk 유전자 요법은 동물 실험에서 긍정적인 효과를 나타내었다. 또한, HSVtk 유전자 요법을 평가하는 임상 시험을 화학요법 및 방사선요법과 조합하여 수행하였다. 그러나, 시험 결과는 만족스럽지 않았다. 또 다른 예로서, 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 교모세포종 유전자 요법에 대해 조사하였다. siRNA 녹다운에 대해 표적화된 다양한 널리 보고된 유전자가 리뷰 논문에 기재되어 있고, 5개 중 일부는 혈관 내피 성장 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor), 저산소증 유도 인자(HIF-1α: hypoxia-inducible factor-1α) 및 열 충격 단백질 70(HSP70: heat shock protein 70) 유전자를 포함한다. 이들 유전자는 저산소 조건 하에서 종양 세포의 생존에 관여한다. 이들 siRNA의 효능이 동물 연구에서 잘 확립되어 있지만, 추가의 연구가 임상 적용에 필요하다.
급성폐손상(Acute Lung Injury)은 감염, 외상, 출혈 등으로 인해 폐속의 모세혈관이나 폐포가 손상을 받음으로써, 폐에서 호흡이 원활하게 이루어지지 않아 생명이 위험하게 된 상태를 말한다. 중증의 경우 급성호흡곤란증후군(Acute Respiratory Distress Syndrome)라고 한다. 국내에서는 사망률이 71.9%에 이르고 있으며, 최근 COVID-19 감염 등 급성폐손상의 발생이 크게 증가하였다. 급성폐손상은 사망률이 30~40%에 이르는 질병으로 인공호흡기와 같은 산소공급이 주된 치료 방법이며, 항염증제와 같은 약물치료는 연구단계에 머무르고 있는 실정이다.
급성폐손상 치료를 위해서 급성폐손상을 유발한 기저질환에 대한 치료, 인공호흡기 등 기계호흡을 이용한 가스교환 유지, 체외막형 산소섭취법 등을 적용하고 있으며, - 스테로이드 항염증제, 계면활성제 등 약물요법이 연구되었지만, 생존률 증가가 입증되지 않았다. 고용량 스테로이드의 사용은 감염 위험성을 높여, 환자 사망률을 높였다는 보고가 있다.
최근 항염증 효과를 가진 치료유전자인 heme oxygenase-1 (HO-1), adiponectin, antisense miRNA-155 등을 투여하여, 치료효과를 유도하는 기술이 개발되고 있다. 또한, 최근 나노입자 기술을 응용하여, 핵산/약물의 전달효율을 개선하는 기술이 개발되고 있다. 그러나, 나노입자를 이용한 핵산/약물 전달 기술은 현재까지 전달의 효율성이 낮고, 나노입자의 안전성 및 면역원성 등 해결해야 할 여러문제들을 가지고 있어서, 임상 시험에 진입하지 못하고 있다. 따라서, 생체막유래의 나노소낭을 기반으로 하는 신규 핵산 전달 기술은 위의 문제를 해결할 수 있는 새로운 전달기술의 가능성이 높다.
비교적 최근에, 마이크로RNA(miRNA: microRNA)가 종양 세포 생존에 관여한다는 것이 제안되었다. 일부 miRNA가 종양 조직에서 유도되었고 종양 세포의 증식 및 생존을 촉진하였다. 구체적으로, miRNA 중 miR-21은 세포 사멸-관련 유전자, 예컨대 포스파타제(phosphatase), 텐신 상동체(PTEN: tensin homolog) 및 프로그램화된 세포 사멸 단백질 4(PDCD4: programmed cell death protein 4)의 mRNA 분해를 용이하게 하고, 항-miR-21 올리고뉴클레오티드(AMO21: anti-miR-21 oligonucleotide) 전달은 miR-21 수준을 감소시키고 결과적으로 종양 조직에서 PTEN 및 PDCD4의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다.
AMO21은 교모세포종 내로의 전달 효율에 의존하고, 초기-단계 연구에서, 정맥내 AMO21 투여는 동물 모델에서 항-종양 효과를 나타낸다. 그러나, 네이키드 AMO21(naked AMO21)의 전달 효율은 혈액-뇌 장벽 (BBB: blood-brain barrier)으로 인해 매우 효율적이지 않았고, 이는 높은 수준의 투여가 요구된다는 것을 시사한다. 뇌에 들어가는 분자를 여과하는 BBB로 인해, 뇌 질환에 대한 효율적인 약물 전달 플랫폼을 개발하는 것이 매우 어렵다. BBB를 피하거나 우회하기 위해, 다양한 접근법이 사용되어 왔다. 예를 들어, 정위 장비를 사용한 국소 주사 또는 비강내 투여가 코에서 뇌의 전달에 대해 평가하였다. 그러나, 직접 주사는 주사 바늘로 인해 정상 뇌 조직뿐만 아니라 종양 조직에 대한 추가의 손상을 야기할 수 있고, 비강내 투여에 의한 전달 효율은 일관되지 않고 용량 제어에 어렵다. 또한, 투여에 이용가능한 비교적 작은 부피 및 짧은 체류 시간은 비강 전달에 대한 주요 단점이다. 비교적 최근에, 뇌-표적화된 엑소좀이 AMO21을 뇌로 전달하기 위해 개발되고, T7-펩티드-장식된 엑소좀(T7-exo)은 BBB를 통한 뇌로의 AMO21 전달을 용이하게 하고 종양 크기를 감소시켰다. 엑소좀 자체는 BBB를 통해 뇌 내로 침투할 수 있지만, T7 펩타이드로 표면 장식을 하면 뇌 종양 부위 내로의 AMO21의 전달 효율이 증가된다.
그러나, 엑소좀은 뇌로의 치료 시약의 전달을 위한 유망한 세포외 소포이지만, 일부 장애물이 다루어진다. 첫째, 동물 세포로부터의 엑소좀의 생산 효율은 효율적이지 않다. 둘째, 엑소좀 함량은 제어될 수 없고, 엑소좀은 그의 공급원 세포에 따라 달라질 수 있다. 엑소좀 공급원의 신중한 선택은 부작용을 감소시킬 수 있지만, 상기와 같은 문제는 아직까지 완전히 완화하기 어려운 실정이었다.
이에, 교모세포종 및 급성폐손상의 치료에 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 핵산의 전달 및 발현에 활용될 수 있는 전달체의 개발의 필요성이 대두되었고, 본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 세포막으로부터 분리된 인지질을 이용하여, 엑소좀-모방 세포막 나노소낭(CMNV: cell membrane nanovesicles)를 개발하기에 이르렀다.
일 양상은 세포막 유래 인지질 이중층;
상기 인지질 이중층의 소수성 부위에 결합된 표적화 물질; 및
상기 인지질 이중층의 소수성 부위에 결합된 핵산을 포함하는 핵산 전달용 나노소낭을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 포함하는 핵산 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 핵산 전달용 나노소낭의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 세포의 세포막을 분리하여 인지질들을 얻는 단계;
상기 인지질들과 소수성 물질이 결합된 표적화 물질을 혼합하여 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계; 및
상기 인지질 이중층과 소수성 물질이 결합된 핵산을 혼합하여 상기 표적화 물질과 상기 핵산이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계를 포함하는 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 세포막 유래 인지질 이중층;
상기 인지질 이중층의 소수성 부위에 결합된 표적화 물질; 및
상기 인지질 이중층의 소수성 부위에 결합된 핵산을 포함하는 핵산 전달용 나노소낭을 제공한다.
상기 용어 “세포막(cell membrane)”이란 모든 세포가 가지고 있으며, 세포 내부와 외부를 서로 구분해주는 구성요소를 의미한다. 상기 세포막은 인지질 및 단백질 분자로 구성된 얇고 구조적인 인지질 이중층으로 되어 있으며, 선택적인 투과성을 지닌다.
일 양상에 있어서, 상기 세포막은 다양한 세포로부터 유래하는 세포막일 수 있고, 암 세포로부터 유래되는 세포막일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포막은 교아종, 신경아세포종, 인간 배아 신장 세포, 뇌 세포, 인간 섬유아세포 또는 비소세포성 폐암 세포로부터 유래되는 세포막일 수 있다.
상기 용어 “인지질(phospholipid)”이란 당지질, 콜레스테롤, 단백질과 함께 생체막의 주요 성분으로 인을 포함하는 지질의 일종을 의미하고, 상기 인지질은 소수성 부위(꼬리)와 친수성 부위(머리)로 이루어져 있다.
상기 용어 “친수성(Hydrophile)”이란 물 분자, 구체적으로 극성 분자와 쉽게 결합되는 성질을 의미하며, 상기 용어 “소수성(Hydrophobe)”이란 물 분자, 구체적으로 극성 분자와 쉽게 결합되지 못하는 성질을 의미하고, 일반적으로 극성을 띠지 않으면 소수성을 띤다.
상기 용어 “인지질 이중층(phospholipid bilayer)”이란 상기 인지질의 소수성 부위(꼬리)가 서로를 마주보고, 친수성 부위(머리)가 각각 인지질 이중층의 내부 및 외부와 접하거나, 상기 인지질의 친수성 부위(머리)가 서로를 마주보고, 소수성 부위(꼬리)가 각각 인지질 이중층의 내부 및 외부와 접하는 이중 구조를 의미한다. 구체적으로, 상기 인지질은 극성(친수성) 또는 비극성(소수성) 용매 하에서 이중층을 형성할 수 있고, 보다 구체적으로 상기 인지질이 존재하는 환경이 소수성인 경우, 상기 인지질의 친수성 부위가 서로를 마주보고 소수성 부위가 인지질 이중층의 내부 및 외부와 접하고, 상기 인지질이 존재하는 환경이 친수성인 경우, 상기 인지질의 소수성 부위가 서로를 마주보고 친수성 부위가 인지질 이중층의 내부 및 외부와 접하도록 이중 구조가 형성된다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질 이중층은 세포의 세포막으로부터 유래되며, 상기 세포의 세포막에 존재하는 막단백질, 당지질 등 다양한 구성 요소가 포함될 수 있다.
상기 용어 “표적화(targeting)”란 물질이 세포 내부나 세포 외부의 적절한 목적지로 수송되는 생물학적 메커니즘을 의미하고, 상기 표적화 물질은 상기 표적화에 도움을 주는 물질을 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 표적화 물질은 T7 펩티드(T7 peptide), RAGE 부착 펩티드 (Receptor for advanced glycation end products binding peptide), 클로로톡신(Chlorotoxin), 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2) 및 광견병 바이러스 글라이코단백질(Rabies virus glycoprotein)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 T7 펩티드(T7 peptide), RAGE 부착 펩티드 (Receptor for advanced glycation end products binding peptide), 클로로톡신(Chlorotoxin), 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2) 또는 광견병 바이러스 글라이코단백질(Rabies virus glycoprotein)일 수 있고, 보다 구체적으로는 T7 펩티드(T7 peptide)일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 표적화 물질은 소수성 물질이 결합된 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 소수성 물질은 콜레스테롤(cholesterol), 팔미트산(Palmitic acid), 토코페롤(Tocopherol) 및 올레산(Oleic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 콜레스테롤(cholesterol), 팔미트산(Palmitic acid), 토코페롤(Tocopherol) 또는 올레산(Oleic acid)일 수 있고, 보다 구체적으로는 콜레스테롤(cholesterol)일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 표적화 물질은 상기 인지질 이중층 내부의 친수성 부위 및 상기 인지질 이중층 외부의 친수성 부위에 존재하는 것일 수 있다.
일 양상에 따르면, 상기 표적화 물질에 상기 소수성 물질이 결합된 경우, 상기 소수성 물질이 상기 인지질 이중층 내부의 소수성 부위와 상호작용(예를 들어, 반데르발스 결합)하는 바, 상기 소수성 물질은 상기 인지질 이중층의 소수성 부위(인지질 이중층 사이)에 존재하며, 상기 표적화 물질이 상기 인지질 이중층 내부의 친수성 부위 및 상기 인지질 이중층 외부의 친수성 부위에 존재할 수 있다.
상기 용어 “핵산(nucleic acid)”이란 알려져 있는 모든 생명체에 필수적인 생체고분자 또는 작은 생체분자를 의미하고, 뉴클레오타이드 단위체로 구성되어 있으며, 뉴클레오타이드는 인산, 5탄당, 핵염기의 3가지 구성 성분으로 이루어진 단위체를 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotides), 항-miRNA 올리고뉴클레오타이드(anti-microRNA oligonucleotides), miRNA, mRNA, siRNA, tRNA, sgRNA, shRNA 및 이들의 변형체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotides), 항-miRNA 올리고뉴클레오타이드(anti-microRNA oligonucleotides), miRNA, mRNA, siRNA, tRNA, sgRNA 또는 shRNA일 수 있고, 보다 구체적으로는 miRNA일 수 있으며, 예를 들어, AMO21(Anti-microRNA-21 oligonucleotides)일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 핵산은 소수성 물질이 결합된 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 소수성 물질은 콜레스테롤(cholesterol), 팔미트산(Palmitic acid), 토코페롤(Tocopherol) 및 올레산(Oleic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 콜레스테롤(cholesterol), 팔미트산(Palmitic acid), 토코페롤(Tocopherol) 또는 올레산(Oleic acid)일 수 있고, 보다 구체적으로는 콜레스테롤(cholesterol)일 수 있다.
일 양상에 따르면, 상기 핵산에 상기 소수성 물질이 결합된 경우, 상기 소수성 물질이 상기 인지질 이중층 내부의 소수성 부위와 상호작용(예를 들어, 반데르발스 결합)하는 바, 상기 소수성 물질은 상기 인지질 이중층의 소수성 부위(인지질 이중층 사이)에 존재하며, 상기 핵산이 상기 인지질 이중층 내부의 친수성 부위 및 상기 인지질 이중층 외부의 친수성 부위에 존재할 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 핵산은 뉴클레아제(nucleases)에 의해 분해되지 않도록 변형된 것일 수 있고, 구체적으로 상기 핵산은 메틸기(methyl group)로 변형된 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 상기 핵산은 2’-위치에서 메틸기(methyl group)로 변형된 것일 수 있다.
상기 핵산이 메틸기(methyl group)로 변형된 경우, 혈청 내의 뉴클레아제(nucleases)에 의해 분해되지 않고 안정적으로 전달될 수 있다.
상기 용어 “나노소낭(nanovesicle)”이란 나노 크기의 소낭을 의미하는 것으로, 일 양상에 따른 나노소낭은 세포내에서 자연적으로 만들어지는 나노 크기의 엑소좀과 특징 및 형태가 유사한 일종의 인공 엑소좀 또는 엑소좀 모사 소포체이나, 세포에서 추출한 엑소좀(exosome)과는 상이하다.
본 명세서에서 세포막 유래 나노소낭은 세포막을 분리하여, 압출을 통하여 상대적으로 쉽게 생산할 수 있으며, 세포내 내용물을 포함하지 않아 효율적이다.
일 실시예에서는 T7-CMNV(cell membrane nanovesicles)의 입자 크기가 CMNV 및 T7c(T7 cholesterol)의 비율과 함께 증가하는 경향이 있음을 확인하였고, 입자 크기의 증가는 T7의 콜레스테롤과의 소수성 상호작용 및 T7 펩티드와의 리간드-수용체 상호작용인 2개의 상호작용을 통해 C6 세포막과 상호작용할 수 있음을 확인하였다(실시예 2.(1) 참조).
일 실시예에서는 T7-CMNV를 제조한 후, AMO21(Anti-microRNA-21 oligonucleotides)을 콜레스테롤 모이어티와 접합시켜, AMO21c(Anti-microRNA-21 oligonucleotides cholesterol)를 생성하고, AMO21c를 소수성 상호작용에 의해 소낭 상에 로딩하였다. 그 결과, AMO21c는 2’-위치에서 메틸기(methyl group)로 변형되어, 혈청 내의 뉴클레아제(nucleases)에 의해 분해되지 않음을 확인하였다(실시예 2.(1) 참조).
일 양상에 있어서, 상기 나노소낭은 핵산, 인지질 및 표적화 물질이 1:5:5, 1:10:10, 2:5:5, 2:5:10, 1:10:5, 2:10:5 또는 1:5:10의 질량비로 존재하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 나노소낭은 투여 대상 1 kg 당 200 μg 내지 280 μg, 200 μg 내지 265 μg, 200 μg 내지 250 μg, 215 μg 내지 280 μg, 215 μg 내지 265 μg, 215 μg 내지 250 μg, 230 μg 내지 280 μg, 230 μg 내지 265 μg 또는 230 μg 내지 250 μg의 핵산 용량으로 투여되는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 나노소낭이 투여 대상 1 kg 당 200 μg 미만의 핵산 용량으로 투여되는 경우, 핵산이 목표하는 효과가 유효하게 나타나지 않을 수 있고, 상기 나노소낭이 투여 대상 1 kg 당 280 μg 초과의 핵산 용량으로 투여되는 경우, 세포 독성이 유발될 수 있다.
일 실시예에서는 생체내 CMNV 및 T7-CMNV의 가능한 독성을 평가하기 위해 체중, AST, ALT 및 BUN을 측정하였다. 그 결과, CMNV 및 T7-CMNV가 동물에서 눈에 띄는 독성을 유발하지 않음을 확인하였다(실시예 2.(3) 참조).
다른 실시예에서는 T7-CMNV/Cy5.5-AMO21c를 래트 당 60 μg의 AMO21c 용량으로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. AMO21c 전달의 효과를 평가하기 위해, RT-PCR을 수행하여 miR-21을 증폭시켰다. 그 결과, miR-21 수준이 CMNV/AMO21c 및 T7-CMNV/AM021c의 주사 후 감소됨을 확인하였고, T7-CMNV/AMO21c에 의한 miR-21의 감소는 CMNV/AM021c보다 높았고, T7-CMNV가 CMNV에 비해 뇌로의 AMO21c의 전달 효율을 증진시켰다는 것을 의미한다(실시예 2.(4) 참조).
또 다른 실시예에서는 T7-CMNV를 사용한 AMO21c의 종양 표적화 전달 및 치료 효과를 확인하기 위해 동소 교모세포종 모델(Orthotopic glioblastoma models)을 제조하고, T7-CMNV/AMO21c를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 그 결과, miR-21 수준이 CMNV/AMO21c 및 T7-CMNV/AM021c의 주사 후 감소됨을 확인하였다(실시예 2(4) 참조).
또한, AMO21c 전달의 항-종양 효과를 평가하기 위해, 면역조직화학을 통해 래트 뇌에서 Ki67 발현을 평가하였다. 그 결과, 리포펙타민/AM021c, CMNV/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AM021c는 Ki67 발현을 감소시켰으나, Ki67 발현은 T7-CMNV/AMO21c에 의해 보다 효율적으로 감소됨을 확인하였다(실시예 2(4) 참조).
또한, 샘플의 종양 크기를 니슬 염색을 통해 평가하였다. 그 결과, AMO21c로 처리된 모든 군에 걸친 종양 크기는 감소되었다. 특히, T7-CMNV/AMO21c는 다른 샘플과 비교하여 종양 크기를 가장 효율적으로 감소시킴을 확인하였다(실시예 2(4) 참조).
일 양상에 있어서, 상기 인지질과 상기 표적화 물질은 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 3:2, 1:2 내지 4:3, 2:3 내지 2:1, 2:3 내지 3:2, 2:3 내지 4:3, 3:4 내지 2:1, 3:4 내지 3:2 또는 3:4 내지 4:3의 질량비로 존재하는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질과 상기 표적화 물질이 2:1의 질량비 보다 상기 인지질의 양이 상기 표적화 물질 대비 많은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합된 표적화 물질의 양이 적어, 세포의 표적화가 충분하게 이루어지지 않을 수 있고, 상기 인지질과 상기 표적화 물질이 1:2의 질량비보다 인지질의 양이 상기 표적화 물질 대비 적은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합되지 않은 표적화 물질의 양이 증가하여, 효율성이 저하될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질과 상기 핵산은 10:1 내지 1:1, 8:1 내지 1:1, 6:1 내지 1:1, 10:1 내지 2:1, 8:1 내지 2:1, 6:1 내지 2:1, 10:1 내지 4:1, 8:1 내지 4:1 또는 6:1 내지 4:1의 질량비로 존재하는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질과 상기 핵산이 10:1의 질량비보다 상기 인지질의 양이 상기 핵산의 양 대비 많은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합된 핵산의 양이 적어, 상기 핵산이 목표하는 효과가 유효하게 나타나지 않을 수 있고, 상기 인지질과 상기 핵산이 1:1의 질량비보다 상기 핵산의 양이 상기 인지질의 양 대비 많은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합되지 않은 핵산의 양이 증가하여, 효율성이 저하될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 나노소낭의 직경은 155 nm 내지 195 nm, 155 nm 내지 190 nm, 155 nm 내지 185 nm, 160 nm 내지 195 nm, 160 nm 내지 190 nm, 160 nm 내지 185 nm, 165 nm 내지 195 nm, 165 nm 내지 190 nm 또는 165 nm 내지 185 nm일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 나노소낭의 직경이 165 nm 미만인 경우, 상기 나노소낭에 결합되어 있는 핵산 및/또는 표적 물질의 양이 적어 핵산 전달 효율이 낮거나, 안정성이 낮을 수 있고, 상기 나노소낭의 직경이 185 nm 초과인 경우, 상기 나노소낭이 세포에 침투하지 못하여 핵산 전달 효율이 낮을 수 있다.
일 실시예에서는 CMNV 상에 AMO21c를 로딩한 후 크기 평가를 하고자 하였다. CMNV와 AMO21c 사이의 비율은 세포 흡수 연구에 기초하여 5:1로 고정하였고, 생성된 CMNV의 입자 크기를 동적 광산란(dynamic light scattering)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, CMNV와 T7-CMNV 모두에 대해 AMO21c 로딩 후 입자 크기가 증가하지 않음을 확인하였다(실시예 2.(1) 참조).
또한, 입자 크기는 약력학에 상당한 영향을 미치고, 200 nm 초과의 직경을 갖는 입자가 혈액뇌장벽(BBB: blood-brain barrier)을 침투하는 것이 어렵기 때문에, T7c와 CMNV 사이의 비율은 1:1로 고정하였다. 그 결과, T7-CMNV/AMO21c의 평균 크기는 176.96 nm ± 0.65임을 확인하였다(실시예 2.(1) 참조).
다른 실시예에서는 CMNV 및 T7-CMNV의 전달 효율을 Cy5-표지된 AMO21c로 평가하였다. 그 결과, T7-CMNV가 C6 교모세포종 세포로의 AMO21c의 가장 높은 세포 흡수 효율을 가짐을 확인하였고, 리포펙타민(lipofectamine), CMNV 및 스크램블된 T7-CMNV (scrT7-CNV)는 유사한 흡수 효율을 가짐을 확인하였으며, scrT7-CMNV는 CNMV에 비해 전달 효율을 증가시키지 않았고, 이는 T7-CMNV 전달의 증가가 T7 펩티드의 효과로 인한 것일 수 있음을 시사하며, 상기 결과는 형광 현미경 검사에 의해 확인하였다(실시예 2.(2) 참조).
또한, CMNV 및 T7-CMNV의 전달 효율을 상이한 유형의 세포에서 비교하였다. 그 결과, N2A 신경아세포종 세포를 사용한 전달 분석에서 T7-CMNV는 CMNV 및 ScrT7-CNV보다 더 높은 전달 효율을 가짐을 확인하였고, CMNV 및 scrT7-CMNV는 N2A 세포에 대한 유사한 전달 효율을 갖는 것으로 관찰되었으며, 이는 T7-CMNV의 더 높은 효율이 T7 펩티드의 효과로 인한 것임을 확인하였다(실시예 2.(2) 참조)..
또한, 비-암 세포(non-cancer cells)로서, HEK293 세포, Cy5-표지된 AMO21c를 사용하여 T7-CMNV의 전달 효율을 평가하였다. 그 결과, T7-CMNV가 CMNV 및 scrT7-CMNV에 비해 AMO21c 세포 흡수를 유도하지 않았음을 확인하였고, HEK293 세포는 트랜스페린 수용체를 유의한 수준으로 발현하지 않으며, T7 펩티드가 HEK 293 세포로의 전달 효율 T7-CMNV에 미치는 효과는 제한되었다(실시예 2.(2) 참조).
또 다른 실시예에서는 T7-CMNV의 전달 효율를 생체분포(biodistribution) 연구를 통해 평가하였다. 그 결과, 대부분의 AMO21c는 간 및 신장에서 관찰되었고, 리포펙타민/AMO21c는 AMO21C를 사용한 CMNV보다 더 고도로 간에 흡수됨을 확인하였고, 뇌에서 Cy5.5-AMO21c의 형광 신호는 CMNV, scrT7-CMNV 및 리포펙타민에 비해 T7-CMV에 의해 증가됨을 확인하였다(실시예 2.(3) 참조).
일 양상에 따르면, 상기 나노소낭은 세포막으로부터 유래하여 면역 반응 없이 원하는 세포의 타겟팅이 가능하고, 독성이 없으며, 기존의 물질 전달에 사용되는 전달체들에 비해 핵산의 세포 내 전달 효율 및 핵산의 발현 효율이 현저히 우수하다.
다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 포함하는 핵산 전달용 조성물을 제공한다.
상기 "핵산", "나노소낭" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 조성물은 개체에 투여되거나 섭취되는 것일 수 있고, “투여”란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하고, “섭취”란 개체에게 소정의 물질을 생물 작용에 필요한 부위로 전달할 수 있는 방법을 의미하며, “개체”란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 생물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 조성물은 다양한 분야에 활용될 수 있고, 예를 들어, 약학적 조성물, 건강기능식품용 조성물 또는 화장료 조성물로 활용될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 포함하는 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 "핵산", "나노소낭" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 용어 "암(cancer)"은 제어 불가능하게 증식하며 정상적인 신체 조직을 침투하고 파괴하는 능력을 갖는 비정상적인 세포의 발생을 특징으로 하는 질병의 부류를 지칭한다.
일 양상에 있어서, 상기 암은 교모세포종, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 충수암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 항문암, 신암, 수뇨관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소암, 자궁암, 난소암, 외음암, 질암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 교모세포종, 뇌종양, 유방암, 폐암, 대장암, 간암, 췌장암, 자궁암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 보다 구체적으로는 교모세포종 또는 폐암일 수 있다.
상기 용어 "폐 질환"은 호흡기 질환일 수 있으며, 상기 호흡기 질환은 급성폐손상, 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 진폐증, 결핵, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 낭포성 섬유증 중 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에서 "급성폐손상(Acute Lung Injury)"은 감염, 외상, 출혈 등으로 인해 폐속의 모세혈관이나 폐포가 손상을 받음으로써, 폐에서 호흡이 원활하게 이루어지지 않아 생명이 위험하게 된 상태를 의미한다. 폐포-모세혈관은 폐포 상피세포와 모세혈관 내피세포로 구성되어 있는데, 이 폐포-모세혈관 장벽의 투과성이 증가되어 삼투액이 폐포 안으로 들어오는 것이 특징이다. 내피세포의 손상은 혈관 투과성을 증가시켜 부종을 유발함. 특히, 상피세포의 손실은 중요한 결과를 유발하는데, 폐포 내로 삼투액의 침투를 유발하며, 고인 부종을 제거하는 기전도 장애를 받을 수 있다. 또한, 계면활성제의 이상을 초래하며, 상피세포의 손상이 심한 경우에는 불충분한 복구작용으로 폐섬유화가 진행될 수 있다.
한편, 급성폐손상에서 각종 염증성 사이토카인들이 염증 반응을 개시하고 증폭시킨다. 특히, 제2형 상피세포에 특이적으로 발현되는 최종당화산물수용체(receptor for advanced glycation end-products, RAGE)에 증가된 S100B, HMGB1 등의 최종당화산물이 결합하여, 염증성 사이토카인의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 용어 “예방”은 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 암 또는 폐 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 용어 “치료”는 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 암 또는 폐 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 희석제 등을 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 제제화될 경우에는 통상적으로 사용하는 윤활제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있고, 점안제 형태로 제조 시 공지의 희석제 또는 부형제 등이 사용될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물은 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 기존의 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 혼합되어 제공될 수 있고, 상기 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 기존의 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 새롭게 개발되는 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물이 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 더 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 병행하여 투여될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 동맥내 주사, 골수내 주사, 심장내 주사, 경막내 주사, 경피주사, 비강내 주사, 장관내 주사, 국소주사, 설하 주사, 직장내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있고, 예를 들어, 상기 약학적 조성물 내 나노소낭은 투여 대상 1 kg 당 200 μg 내지 280 μg, 200 μg 내지 265 μg, 200 μg 내지 250 μg, 215 μg 내지 280 μg, 215 μg 내지 265 μg, 215 μg 내지 250 μg, 230 μg 내지 280 μg, 230 μg 내지 265 μg 또는 230 μg 내지 250 μg의 핵산 용량으로 투여되는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여는 하루에 한 번 투여되는 것일 수도 있고, 수 회 나누어 투여되는 것일 수도 있다. 예를 들어, 격일로 투여되는 것일 수도 있으며, 일주일에 하루 투여되는 것일 수도 있다.
또 다른 양상은 상기 핵산 전달용 나노소낭을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 "핵산", "나노소낭", "개체", "투여", "암", "폐 질환", "예방", "치료" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 방법은 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 항암제와 병행하여 투여하는 것일 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여하는 것일 수 있으며, 단일 또는 다중 투여하는 것일 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 다른 양상은 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 핵산 전달용 나노소낭의 용도를 제공한다.
상기 "암", "폐 질환", "예방", "치료", "핵산" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 세포의 세포막을 분리하여 인지질들을 얻는 단계;
상기 인지질들과 소수성 물질이 결합된 표적화 물질을 혼합하여 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계; 및
상기 인지질 이중층과 소수성 물질이 결합된 핵산을 혼합하여 상기 표적화 물질과 상기 핵산이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계를 포함하는 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법을 제공한다.
상기 "개체", "세포막", "인지질", "소수성", "표적화", "인지질 이중층", "핵산", "나노소낭" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 제조방법의 상기 세포막을 분리하는 단계는 상기 세포에 초음파 처리(sonication)하는 단계; 및
상기 세포를 원심분리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 용어 “초음파 처리(sonication)”란 여러 물질을 추출하거나, 분해하는 것과 같은 다양한 목적을 위한 것으로, 일 양상에 따르면, 상기 초음파 처리는 상기 세포의 세포막을 분해하기 위해 사용된다.
상기 용어 “원심분리(centrifugation)”란 원심력에 의해 액체 중의 고체입자나 액체의 미립자를 분리하는 것을 의미하고, 중력에 의한 분리보다 원심분리가 분리력이 우수하기 때문에 밀도차가 작거나 일반적으로 분리가 어려운 물질들까지도 분리할 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 세포막을 분리하는 단계가 상기 세포를 원심분리하는 단계를 포함하는 경우, 상기 초음파 처리를 통해 얻어진 세포막의 분해물을 분리(구분)하여 인지질들을 얻을 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 원심분리는 차등 원심분리(differential centrifugation), 순차적 원심분리(sequential centrifugation) 및 초원심분리(ultracentrifuge)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 분리 방법으로 수행되는 것일 수 있고, 구체적으로 상기 원심분리는 차등 원심분리(differential centrifugation), 순차적 원심분리(sequential centrifugation) 및 초원심분리(ultracentrifuge)을 모두 사용하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 용어 “차등 원심분리(differential centrifugation)”란 어떤 기준이 되는 것의 높낮이 차이에 따라 물질을 분리하는 것을 의미한다.
상기 용어 “순차적 원심분리(sequential centrifugation)”란 샘플의 성분이 경험하는 원심력에 따라 원심분리기에서 밀도를 기준으로 물질을 분리하는 것을 의미한다.
상기 용어” 초원심분리(ultracentrifuge)”란 용액이 들어 있는 튜브를 초고속으로 회전시킴으로써 높은 중력장을 발생시켜 용질의 침강속도를 높여 물질을 분리하는 것을 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계는 상기 인지질들과 소수성 물질이 결합된 표적화 물질을 혼합함으로써, 상기 인지질들이 인지질 이중층을 형성함과 동시에, 상기 표적화 물질에 결합된 소수성 물질과 인지질의 소수성 부위가 상호작용(예를 들어 반데르발스 결합)하여, 상기 소수성 물질이 상기 인지질의 이중층 소수성 부위(인지질 이중층 사이)에 존재하게 된다. 이에 따라, 상기 표적화 물질이 상기 인지질 이중층 내부의 친수성 부위 및 상기 인지질 이중층 외부의 친수성 부위에 존재할 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계는 상기 인지질들과 상기 표적화 물질을 혼합한 후 압출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 용어 “압출(extrusion)”이란 고정 단면 윤곽의 물체를 만들기 위해 사용하는 공정을 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계가 상기 인지질들과 상기 표적화 물질을 혼합한 후 상기 압출하는 단계를 포함하는 경우, 상기 인지질 이중층들의 응집을 유도하지 않고, 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층의 직경이 증가되는 것을 방지할 수 있고, 상기 표적화 물질의 인지질 이중층으로의 결합을 용이하게 할 수 있다.
일 실시예에서는 T7-CMNV 제조 공정에서 T7c 및 세포막을 압출하였다. 그 결과, T7c 및 세포막의 응집(aggregation)을 유도하지 않고, T7-CMNV의 크기 증가를 제한할 수 있고, T7의 막 내로의 통합을 용이하게 함을 확인하였다(실시예 2(1) 참조).
일 양상에 있어서, 상기 인지질과 상기 표적화 물질을 혼합하는 단계에서 상기 인지질과 상기 표적화 물질은 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 3:2, 1:2 내지 4:3, 2:3 내지 2:1, 2:3 내지 3:2, 2:3 내지 4:3, 3:4 내지 2:1, 3:4 내지 3:2 또는 3:4 내지 4:3의 질량비로 혼합되는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질과 상기 표적화 물질을 혼합하는 단계에서 상기 인지질과 상기 표적화 물질이 2:1의 질량비 보다 상기 인지질의 양이 상기 표적화 물질 대비 많은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합된 표적화 물질의 양이 적어, 세포의 표적화가 충분하게 이루어지지 않을 수 있고, 상기 인지질과 상기 표적화 물질이 1:2의 질량비보다 인지질의 양이 상기 표적화 물질 대비 적은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합되지 않은 표적화 물질의 양이 증가하여, 효율성이 저하될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질 이중층과 상기 핵산을 혼합하는 단계에서 상기 인지질 이중층과 상기 핵산은 10:1 내지 1:1, 8:1 내지 1:1, 6:1 내지 1:1, 10:1 내지 2:1, 8:1 내지 2:1, 6:1 내지 2:1, 10:1 내지 4:1, 8:1 내지 4:1 또는 6:1 내지 4:1의 질량비로 혼합되는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 인지질 이중층과 상기 핵산을 혼합하는 단계에서 상기 인지질 이중층과 상기 핵산이 10:1의 질량비보다 상기 인지질 이중층의 양이 상기 핵산의 양 대비 많은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합된 핵산의 양이 적어, 상기 핵산이 목표하는 효과가 유효하게 나타나지 않을 수 있고, 상기 인지질 이중층과 상기 핵산이 1:1의 질량비보다 상기 핵산의 양이 상기 인지질의 양 대비 많은 경우, 상기 인지질 이중층에 결합되지 않은 핵산의 양이 증가하여, 효율성이 저하될 수 있다.
일 양상에 따라 제조된 핵산 전달용 나노소낭은 세포막으로부터 유래하여 면역 반응 없이 원하는 세포의 타겟팅이 가능하고, 독성이 없으며, 기존의 물질 전달에 사용되는 전달체들에 비해 핵산의 세포 내 전달 효율 및 핵산의 발현 효율이 현저히 우수하다.
일 양상에 따른 나노소낭은 세포막으로부터 유래하여 면역 반응 및 독성이 없으며, 원하는 세포의 타겟팅이 가능하고, 기존의 물질 전달에 사용되는 전달체들에 비해 핵산의 세포 내 전달 효율 및 핵산의 발현 효율이 현저히 우수하다. 또한, 상기 나노소낭이 표적하는 종양 세포로 이동함으로써, 종양 세포의 크기를 감소시킬 수 있음을 직접 확인하였는 바, 상기 나노소낭은 암의 예방, 개선 및/또는 치료에 활용될 수 있으며, 나아가, 생체 내 핵산의 전달 및 발현이 필요한 다양한 분야에 활용될 수 있다.
도 1은 정맥(IV: intravenous) 주사를 통한 동소성 래트 교모세포종 모델(orthotopic rat glioblastoma models)에서 T7-CMNV를 사용한 AMO21c 전달을 설명하는 개략도이다.
도 2는 CMNV(cell membrane nanovesicles) 및 T7-CMNV의 물리적 특성을 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 2a는 CMNV 및 T7-CMNV의 입자 크기를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2b는 CMNV/AMO21c 및 T7-CMNV/AMO21c의 입자 크기를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2c는 나노소낭의 제타 전위를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2d는 수용액에서 CMNV 및 T7-CMNV의 안정성을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2e는 CMNV의 형태를 투과 전자 현미경(TEM: Transmission electron microscopy)을 이용하여 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2f는 DLS 및 TEM으로부터의 결과를 재확인하기 위해, 나노 소낭을 나노 트래킹(tracking)으로 분석한 결과(왼쪽 패널: CMNV의 크기 분포, 오른쪽 패널: 비디오 프레임)를 나타내는 도이다.
도 3은 CMNV와 AMO21c 간의 비율의 최적화를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 CMNV 및 T7-CMNV의 세포독성을 분석한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 4a는 MTT 분석의 결과를 나타내는 도이고, 도 4b는 용혈 분석의 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 시험관 내 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 5a는 유세포 분석(Flow cytometry)을 통한 C6 세포로의 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과를 나타내는 도이고(**** 다른 그룹과 비교하여 P<0.0001), 도 5b는 형광 현미경을 통한 C6 세포로의 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 5c는 N2A 세포로의 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과를 나타내는 도이고(*P<0.05, 다른 그룹과 비교), 도 5d는 HEK293 세포로의 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과(n.s.: 서로 비교하여 통계적으로 유의하지 않음)를 나타내는 도이다.
도 6은 T7-CMNV의 트랜스사이토시스(transcytosis) 능력을 분석한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 6a는 6시간 배양후 bEND.3 세포의 세포 흡수를 유세포 분석기를 통해 측정한 결과를 나타내는 도이고, 도 6b는 6시간 배양 후 기저측 배지의 평균 형광 강도를 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)로 측정한 결과를 나타내는 도이고, 도 6c는 24시간 배양후 bEND.3 세포의 세포 흡수를 유세포 분석기를 통해 측정한 결과를 나타내는 도이고, 도 6d는 24시간 배양 후 기저측 배지의 평균 형광 강도를 마이크로플레이트 판독기로 측정한 결과를 나타내는 도이다(****P<0.0001, **P<0.01, *P<0.05로 다른 군과 비교함. n.s.: 서로 비교하여 통계적으로 유의하지 않음).
도 7은 동물 모델의 뇌로 AMO21c 전달한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 7a는 기관(organs)의 대표적인 형광 이미지를 나타내는 도이고, 도 7b는 뇌에서 Cy5.5-AMO21c의 상대적 신호(Relative signals)를 분석한 결과(*P<0.05 다른 그룹과 비교)를 나타내는 도이고, 도 7c는 뇌의 대표적인 이미지를 나타내는 도이다(*P<0.05 05 다른 그룹과 비교).
도 8은 나노소낭 및 리포펙타민(Lipofectamine)의 생체 내 독성 평가의 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 8a는 체중에 의해 평가된 나노소낭 및 리포펙타민의 독성을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 8b는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST: aspartate aminotransferase)의 독성을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 8c는 알라닌 트랜스아미나제(ALT: alanine transaminase)의 독성을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 8d는 혈액 요소 질소(BUN: blood urea nitrogen)의 독성을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 동물 모델에서 AMO21c 전달에 의한 miR-21 억제를 확인한 결과를 나타내는 도이다(* 대조군, 리포펙타민/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AMO21c 그룹과 비교하여 P<0.05).
도 10은 동물 모델에서 AMO21c 전달에 의한 PDCD4 및 PTEN의 유도를 확인한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로 도 10a는 항-PDCD4로 면역조직화학(Immunohistochemistry)을 수행한 결과를 나타내는 도이고, 도 10b는 항-PTEN 항체로 면역조직화학을 수행한 결과를 나타내는 도이다(**** 다른 그룹과 비교하여 P<0.0001, * CMNV/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AMO21c 그룹과 비교하여 P<0.05).
도 11은 종양의 크기를 확인한 결과를 나타내는 도이다(* 대조군, 리포펙타민/AMO21c 및 CMNV/AMO21c 그룹과 비교하여 P<0.05).
도 12는 투과전자현미경(TEM: transmission electron microscopy)를 이용한 나노소낭의 형태 및 크기 분석 결과이다.
도 13은 AMO155c가 로딩된 CMNV와 exosome를 dynamic light scattering assay로 측정한 결과이다.
도 14는 다양한 비율로 AMO155c/CMNV와 AMO155c/exosome을 준비하고, LA4 세포에 투여하여 핵산의 전달효율을 측정한 결과이다.
도 15는 급성폐손상 동물모델에 AMO155c가 로딩된 CMNV와 exosome을 처리한 후, 24시간 후에 기관지폐세척액과 폐조직에서 IL-1beta와 IL-6의 양을 측정한 결과이다.
도 16은 H&E 염색을 통하여, AMO155c/CMNV의 경에 가장 효과적으로 염증반응을 줄이는 것을 확인한 결과이다.
도 2는 CMNV(cell membrane nanovesicles) 및 T7-CMNV의 물리적 특성을 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 2a는 CMNV 및 T7-CMNV의 입자 크기를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2b는 CMNV/AMO21c 및 T7-CMNV/AMO21c의 입자 크기를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2c는 나노소낭의 제타 전위를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2d는 수용액에서 CMNV 및 T7-CMNV의 안정성을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2e는 CMNV의 형태를 투과 전자 현미경(TEM: Transmission electron microscopy)을 이용하여 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 2f는 DLS 및 TEM으로부터의 결과를 재확인하기 위해, 나노 소낭을 나노 트래킹(tracking)으로 분석한 결과(왼쪽 패널: CMNV의 크기 분포, 오른쪽 패널: 비디오 프레임)를 나타내는 도이다.
도 3은 CMNV와 AMO21c 간의 비율의 최적화를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 CMNV 및 T7-CMNV의 세포독성을 분석한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 4a는 MTT 분석의 결과를 나타내는 도이고, 도 4b는 용혈 분석의 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 시험관 내 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 5a는 유세포 분석(Flow cytometry)을 통한 C6 세포로의 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과를 나타내는 도이고(**** 다른 그룹과 비교하여 P<0.0001), 도 5b는 형광 현미경을 통한 C6 세포로의 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 5c는 N2A 세포로의 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과를 나타내는 도이고(*P<0.05, 다른 그룹과 비교), 도 5d는 HEK293 세포로의 AMO21c 전달 효율을 분석한 결과(n.s.: 서로 비교하여 통계적으로 유의하지 않음)를 나타내는 도이다.
도 6은 T7-CMNV의 트랜스사이토시스(transcytosis) 능력을 분석한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 6a는 6시간 배양후 bEND.3 세포의 세포 흡수를 유세포 분석기를 통해 측정한 결과를 나타내는 도이고, 도 6b는 6시간 배양 후 기저측 배지의 평균 형광 강도를 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)로 측정한 결과를 나타내는 도이고, 도 6c는 24시간 배양후 bEND.3 세포의 세포 흡수를 유세포 분석기를 통해 측정한 결과를 나타내는 도이고, 도 6d는 24시간 배양 후 기저측 배지의 평균 형광 강도를 마이크로플레이트 판독기로 측정한 결과를 나타내는 도이다(****P<0.0001, **P<0.01, *P<0.05로 다른 군과 비교함. n.s.: 서로 비교하여 통계적으로 유의하지 않음).
도 7은 동물 모델의 뇌로 AMO21c 전달한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 7a는 기관(organs)의 대표적인 형광 이미지를 나타내는 도이고, 도 7b는 뇌에서 Cy5.5-AMO21c의 상대적 신호(Relative signals)를 분석한 결과(*P<0.05 다른 그룹과 비교)를 나타내는 도이고, 도 7c는 뇌의 대표적인 이미지를 나타내는 도이다(*P<0.05 05 다른 그룹과 비교).
도 8은 나노소낭 및 리포펙타민(Lipofectamine)의 생체 내 독성 평가의 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로, 도 8a는 체중에 의해 평가된 나노소낭 및 리포펙타민의 독성을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 8b는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST: aspartate aminotransferase)의 독성을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 8c는 알라닌 트랜스아미나제(ALT: alanine transaminase)의 독성을 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 8d는 혈액 요소 질소(BUN: blood urea nitrogen)의 독성을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 동물 모델에서 AMO21c 전달에 의한 miR-21 억제를 확인한 결과를 나타내는 도이다(* 대조군, 리포펙타민/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AMO21c 그룹과 비교하여 P<0.05).
도 10은 동물 모델에서 AMO21c 전달에 의한 PDCD4 및 PTEN의 유도를 확인한 결과를 나타내는 도로서, 구체적으로 도 10a는 항-PDCD4로 면역조직화학(Immunohistochemistry)을 수행한 결과를 나타내는 도이고, 도 10b는 항-PTEN 항체로 면역조직화학을 수행한 결과를 나타내는 도이다(**** 다른 그룹과 비교하여 P<0.0001, * CMNV/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AMO21c 그룹과 비교하여 P<0.05).
도 11은 종양의 크기를 확인한 결과를 나타내는 도이다(* 대조군, 리포펙타민/AMO21c 및 CMNV/AMO21c 그룹과 비교하여 P<0.05).
도 12는 투과전자현미경(TEM: transmission electron microscopy)를 이용한 나노소낭의 형태 및 크기 분석 결과이다.
도 13은 AMO155c가 로딩된 CMNV와 exosome를 dynamic light scattering assay로 측정한 결과이다.
도 14는 다양한 비율로 AMO155c/CMNV와 AMO155c/exosome을 준비하고, LA4 세포에 투여하여 핵산의 전달효율을 측정한 결과이다.
도 15는 급성폐손상 동물모델에 AMO155c가 로딩된 CMNV와 exosome을 처리한 후, 24시간 후에 기관지폐세척액과 폐조직에서 IL-1beta와 IL-6의 양을 측정한 결과이다.
도 16은 H&E 염색을 통하여, AMO155c/CMNV의 경에 가장 효과적으로 염증반응을 줄이는 것을 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 실험재료 및 방법
(1) 재료 준비
C6 래트 교아종(C6 rat glioblastoma), N2a 마우스 신경아세포종(N2a mouse neuroblastoma), HEK293(인간 배아 신장 293 세포, Human embryonic kidney 293 cells) 및 bEND.3 세포(BALB/c 마우스 유래 뇌 세포주)를 한국 세포주 뱅크(Korean Cell Line Bank)(Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 소 태아 혈청 (FBS: Fetal bovine serum) 및 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)을 Welgene(Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 2'-O-메틸-(2'-O-methyl) 및 콜레스테롤-TEG-변형된 AMO21(cholesterol-TEG-modified AMO21(Anti-microRNA-21 oligonucleotides))(AMO21c 및 5'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3(서열번호 1)) 및 Cy5-AMO-21를 Bioneer(Daejeon, Korea)를 이용하여 합성하였다. 콜레스테롤-변형된 T7(Cholesterol-modified T7) (T7c, HAIYPRH-cholesterol) 및 콜레스테롤-변이된 스크램블드(cholesterol-modified scrambled) T7(scrT7dc, IRHPHYA- cholesterol)는 펩트론(Peptron)(Daejeon, Korea)을 이용하여 합성하였다. 비신코닌산(BCA: bicinchoninic acid) 분석 키트, 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨보미드 (MTT: 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbormide) 및 리포펙타민2000(lipofectamine2000)을 Thermo Scientific(Rockford, IL)로부터 구입하였다. 압출기 키트(Extruder kits)는 Avanti(Birmingham, AL)로부터 구입하였다. Cy5.5 NHS 에스테르(Cy5.5 NHS ester), 항-Ki67 항체(anti-Ki67 antibody) 및 원래 위치에서(in situ) BrdU-Red DNA 단편화 트랜스퍼라제 dUTP 닉 말단 표지화 (TUNEL: BrdU-Red DNA fragmentation transferase dUTP nick end labeling) 분석 키트는 Abcam(Waltham, MA)으로부터 구입하였다. 항-PDCD4 항체(Anti-PDCD4 antibody)는 Bethyl (Montgomery, TX)로부터 구입하였고, PTEN 항체(PTEN antibody)는 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX)로부터 구입하였다. miRNeasy FFPE 키트는 Qiagen (Valencia, CA)으로부터 구입하였고, Iscript cDNA 합성 키트는 Bio-Rad (Hercules, CA)로부터 구입하였으며, SensiFAST SYBR No-ROX 키트는 Bioline (Boston, MA)으로부터 구입하였다.
(2) CMNV(cell membrane nanovesicles)의 제조
1) 교모세포종 치료용 나노소낭 제조
T7-CMNV를 C6 세포 막으로 제조하여 뇌로의 AMO21 전달을 제공하였다. 제조 도식은 도 1에 나타내었고, 구체적인 방법은 다음과 같다. C6 세포막을 차등 원심분리(differential centrifugation)에 의해 단리하였다. 그 후, 세포막을 T7c와 혼합하고, 혼합물을 압출(extrusion)하여 CMNV(cell membrane nanovesicles)를 제조하였다. T7 펩티드는 혈관 내의 내피 세포 또는 종양 세포 상의 트랜스페린 수용체(transferrin receptors)에 결합하는 널리 공지된 리간드(ligand)이며, C6 세포 막을 비롯한 종양 세포 막 상에서 과발현된다. 결합 후에는 트랜스사이토시스(transcytosis)를 용이하게 하여 혈액뇌장벽(BBB: blood-brain barrier)을 통한 통과를 초래한다. 따라서, T7-CMNV는 뇌에서 BBB 및 표적 C6 종양 세포를 통과할 수 있다. 그러나, T7 펩티드의 이러한 이점은 T7-CMNV 생성을 방해할 수 있다. T7c는 CMNV와 상호작용할 수 있는 2개의 모이어티(moieties)를 갖는다. 콜레스테롤은 소수성 상호작용에 의해 CMNV와 상호작용할 수 있고, T7은 막이 트랜스페린 수용체를 함유하기 때문에 C6 세포 막으로 제조된 CMNV의 트랜스페린 수용체와 상호작용할 수 있다. 따라서, T7c는 inter-CMNV 상호작용에 기여할 수 있고, 이들 상호작용의 축적은 응집(aggregation)을 유도할 수 있다. 실제로, 압출이 없는 T7-CMNV의 제조는 본 발명자들의 연구에서 응집을 유도하였고, T7c를 갖는 나노-크기 막 소낭을 제조하기 위해서는 압출이 필요한 것으로 보인다.
2) 급성폐손상 치료용 나노소낭 제조
급성폐손상 치료용 나노소낭 제조방법은 상기 교모세포종 치료용 나노소낭 제조방법과 동일하다. 세포막 분리는 293세포와 LA4 mouse lung epitheal 세포에서 분리하여, 각각 세포실험과 동물실험에 이용하였다. 세포막분리는 앞에서 뇌종양 모델에 적용된 나노소낭과 같이 분별원심분리법으로 분리하였다. 분리된 세포막으로 extrusion(압출기)를 이용한 CMNV을 제조하였다. 폐로의 핵산약물 전달은 흡입을 통하여 직접 전달하는 방법을 이용하므로, 표적형 리간드를 추가로 부착하지 않고 이용하였다.
(3) 암-유래 나노소낭(nanovesicles)의 제조
세포막을 이전에 기재된 바와 같이 단리하였다. 간략하게, C6 세포를 컨플루언시(confluency)가 거의 100%에 도달할 때까지 DMEM을 함유하는 10% FBS에서 배양하였다. 세포를 DPBS로 2회 세척하고, 스크레이퍼(scrapers)로 획득하였다. DPBS 중에 재현탁시킨 후, 세포를 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)로 처리하고, 3분 동안 초음파처리를 이용하여 용해시켰다. 내부 세포 성분을 3,500 g에서 10분 및 20,000 g에서 25분 동안 4℃에서 순차적 원심분리(sequential centrifugation)를 통해 제거하였다. 그 후, 상층액을 100,000 g에서 50분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 생성된 펠릿(pellet)은 세포막을 함유하였다. 펠릿을 DPBS에 재현탁시키고, 3분 동안 초음파처리하고, 0.4 μm 폴리카보네이트 필터(polycarbonate filter)를 통해 여과하여 오염을 방지하고 응집물을 제거하였다. 세포막에서의 단백질 농도를 BCA 분석으로 측정하였다. CMNV(cell membrane nanovesicles) 및 T7-CMNV는 1 m 및 0.2 m 폴리카보네이트 멤브레인(polycarbonate membranes)을 통한 10회의 연속 압출을 통해 제조하였다.
(4) 동적 광산란(Dynamic light scattering) 및 나노 트래킹(tracking) 분석
유체역학적 크기(Hydrodynamic size) 및 제타 전위(zeta potential)는 Zetasizer Nano ZS system (Malvern Instruments, Malvern, UK)을 이용하여 측정하였다. 안정성 및 팽윤(swelling) 특성을 평가하기 위해, 4℃에서 CMNV 및 T7-CMNV를 저장하고, 3일마다 측정하였다. 또한, 나노 트랙킹(tracking) 분석을 수행하여, CMNV의 특성 및 Nanosight system (Malvern Instruments, Malvern, UK) 내의 실제 농도에 대한 상보적 정보를 수집하였다.
(5) 나노소낭으로의 치료 핵산 로딩
1) AMO21의 CMMV로의 로딩
다양한 양의 AMO21c를 고정된 양의 CMNV와 혼합하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. AMO21c를 콜레스테롤과 세포막 사이의 소수성 상호작용에 의해 CMNV 상에 로딩하였다. 로딩 효율을 계산하기 위해, 제조사 매뉴얼에 따라 Cy5.5 NHS 에스테르를 사용하여 AM021c를 표지하였다. Cy5.5-AMO21c를 CMNV 또는 T7-CMNV와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 샘플을 100,000 g에서 50분 동안 초원심분리하였다. 이어서, 펠렛을 DPBS에 재현탁하고, 형광은 마이크로플레이트 판독기(microplate reader) (excitation/emission = 673/707 nm)로 측정하였다. 표준 검량선(standard calibration curve)을 작성하고, 로딩효율은 다음과 같이 계산하였다: 로딩효율(%) = (강수(precipitation) 후 측정된 AMO21c의 양)/(AMO21c의 총량) X 100.
2) AMO155c의 CMMV로의 로딩
급성폐손상 조직에서 발현이 증가되는 miRNA-155를 억제하기 위한 핵산치료제로 AMO155c를 이용하였다. 다양한 양의 AMO155c를 고정된 양의 CMNV와 혼합하고, 실온에서 30분 방치하였다. AMO155c의 콜레스테롤과 세포막 사이의 소수성 상호작용에 의해 CMNV 상에 AMO155c가 로딩하였다. Exosome으로의 AMO155c의 로딩도 동일한 방법으로 실시하였다.
(6) 투과 전자 현미경(TEM: Transmission electron microscopy)을 이용한 나노소낭의 형태 및 크기 분석
투과 전자 현미경(TEM: Transmission electron microscopy)을 이용하여 나노소낭의 형태 및 크기를 분석하였다. CMNV 및 T7-CMNV를 AMO21c의 존재 또는 부존재하에 제조하였다. Mesh copper grids (Ted Pell, Redding, CA)를 증류수의 비말(droplets)로 세척하였다. 그 후, 샘플을 그리드(grids) 상에 로딩하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플의 비말(droplets)을 흡수 종이(absorbent paper)로 침지시키고, 진공 챔버에서 건조시켰다. 음성 염색(negative staining)은 2% 텅스텐산(tungstic acid)을 사용하였고, 샘플은 TEM(JEM-2100F, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였다.
(7) 나트륨 도데실(Sodium dodecyl) 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE: sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을 이용한 단백질 분석
CMNV 및 C6 용해물 내의 단백질 프로파일(profiles)을 설페이트-폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE: sulfate-polyacrylamide gel)을 이용하여 비교하였다. CMNV를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. C6 용해물은 프로테아제 억제제 칵테일 처리(protease inhibitor cocktail treatment)와 함께 3분 동안 C6 세포의 초음파처리를 이용하여 제조하였다. 샘플을 12% 겔 상에서 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.
(8) 나노소낭의 세포 흡수 평가를 위한 유세포 분석(Flow cytometry)
다양한 조건에서 나노소낭의 세포 흡수를 평가하기 위해 유동 유세포 분석(Flow cytometry)을 수행하였다. C6, N2a 및 HEK293 세포를 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 DMEM을 함유하는 10% FBS에서 배양하였다. 세포를 12-웰 마이크로분석 플레이트(12-well microassay plate)에 웰 당 2 X 105개 세포의 밀도로 시딩하고(seeded), 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지는 형질감염 전에 새로 교체하였다. Cy5-AMO21c-적재된 T7-CMNV(Cy5-AMO21c-loaded T7-CMNVs) (T7-CNV/Cy5-AMO21c)를 최적 비율로 제조하고, 세포에 첨가하였다. Cy5-AMO21c의 양을 0.2 μg/well로 고정시켰다. 4시간 후, 세포를 DPBS로 2회 세척하고, Tris-EDTA 완충액에서 획득하였다. 세포를 1,000 g에서 3분 동안 원심분리하고, FACS 튜브에서 DPBS로 재현탁하였다. Cy5-양성 세포의 비율(%) 및 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity)를 유세포분석(BD FACS CaliburTM, BD Biosciences Immunocytometry Systems, San Jose, CA)를 이용하여 분석하였다.
(9) 형광 현미경(Fluorescence microscopy)을 이용한 세포 이미지
1) 교모세포종
C6 세포를 웰 당 1 X 105개 세포의 밀도로 챔버 슬라이드(chamber slide) 상에 시딩하였다. T7-CMNV/Cy5-AMO21c를 상기 기재된 바와 같이 세포 내로 형질 감염하였다. 세포를 DPBS로 2회 세척하고, 핵(nuclei)을 DAPI로 염색하였다. 염색된 섹션을 장착하고, Z1 digital slide scanner(ZEISS, Oberkochen, Germany)인 AxioScan을 이용하여 관찰하였다.
2) 급성폐손상
투과전자현미경(TEM: transmission electron microscopy)를 이용한 나노소낭의 형태 및 크기 분석하였다. exosome과 CMNV에 각각 AMO155c (핵산:전달체의 무게비 1:3)을 로딩하고, 투과전자현미경으로 관찰하였다. 그 결과, exosome과 CMNV에서는 막구조의 형태가 관찰되었다 (도 12 참조).
또한, 배양된 LA4 마우스폐상피세포에 형광표지된 치료핵산이 로딩된 CMNV과 exosome을 각각 투여(1 ㎍ AMO155c/1×105 세포) 하고, 일정 시간 후에 flowcytometry를 통하여 세포에 이입된 치료핵산의 양을 측정하였다.
(10) 트랜스웰 모델 분석(transwell model assay)을 통한 트랜스사이토시스(Transcytosis) 평가
시험관내 트랜스웰 모델 분석(transwell model assay)을 수행하여 T7-CMNV 트랜스사이토시스(Transcytosis)를 평가하였다. bEND.3 마우스 내피 세포를 12-웰 트랜스웰 플레이트(Corning, New York, NY)에서 DMEM을 함유하는 10% FBS로 시험관내에서 BBB를 모방하기 위해 영역의 정점 측에서 웰당 4 X 105개 세포의 밀도로 시딩하였다. TEER 값이 200 Ω cm2 초과에 도달하면, T7-CMNV/Cy5.5-AMO21c를 배지 교체한 후에 첨가하였다. 6시간 및 24시간의 인큐베이션 후, 기저측면 측의 bEND.3 세포 및 배지를 획득하였다. 평균 형광 강도는 FACS를 이용하여 bEND.3 세포로부터 측정하거나 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 배지로부터 측정하였다.
(11) MTT 분석
C6 세포를 상기 기재된 바와 같이 96-웰 마이크로분석 플레이트(96-well microassay plate)에 웰당 1 X 104개 세포의 밀도로 시딩하였다. CMNV 및 T7-CMNV를 배지 교체 후 세포에 첨가하였고, 2배 연속 희석에 의해 5 μg/well 내지 39 ng/well 범위의 배지 교체 후 세포에 추가하였다. 리포펙타민(Lipofectamine)은 대조군으로서 사용하였고, 4시간의 인큐베이션 후, 배양 배지를 교체하고, 세포를 37℃에서 추가로 20시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 웰당 10 μg의 MTT를 세포에 첨가하고, 37℃에서 추가로 4시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지를 제거하고, 100 μl의 DMSO를 세포에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율을 다음과 같이 계산하였다: 세포 생존율(%) = (OD570(샘플))/OD570(대조군)의 평균) X 100.
(12) 혈액 적합성(Hemo-compatibility) 분석
Sprague Dawley (SD) 래트(rat)로부터 혈액 샘플을 획득하고, 500 g에서 3분 동안 EDTA-함유 튜브에서 원심분리하였다. 혈장(Plasma)을 제거하고, 적혈구(RBC: red blood cells)를 DPBS로 3회 세척하였다. 재현탁된 RBC를 마이크로튜브(microtubes)로 옮기고, 1 μg의 네이키드 AMO21c(naked AMO21c), 리포펙타민/AMO21C(lipofectamine/AMO21c), CMNV/AM021c, T7-CMNV(AMO21c) 또는 ScrT7-CMV/AM021c와 함께 인큐베이션하였다. 대조군을 음성 대조군으로 DPBS로 처리하였다. 인큐베이션 1분 후, 샘플을 적절한 양의 DPBS로 희석하고, 관찰을 위해 유리 슬라이드 상에 탑재하였다.
(13) 동물모델 실험
1) 래트 교모세포종(Rat glioblastoma) 모델의 제작
모든 실험 동물 프로토콜은 한양 대학교(Hanyang University)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)에 의해 승인되었다(수행 번호: 2019-0205). C6 교모세포종 세포 (동물당 PBS 10 μl에 1x105 cells)를 마취 하에 정위 장치(stereotaxic equipme)를 갖는 7주령 수컷 SD 래트에 주사하였다. 주사의 좌표는 브레그마(bregma)로부터 3.0 mm 측면 및 두개골 표면으로부터 4.0 mm 깊이였다. 주입은 0.9 μl/min의 속도로 수행하였다. 일주일 후, T7-CMNV/AMO21c는 900 μl DPBS에 60 μg APMO21c의 용량으로 꼬리 정맥을 통해 정맥주사 하였다. 구체적으로, 상기 APMO21c는 수컷 SD rat 기준 6주령을 사용하여 평균적으로 250 g의 무게를 기준으로 60 μg을 투여하였고, kg 당 240 μg 정도의 양을 투여하였으며, 나노소낭(인지질) 및 T7의 경우, 무게 비율 기준으로 AMO21c의 5배에 해당하는 양(kg당 1200 μg의 나노소낭(인지질) 및 T7)을 투여하였다. 래트를 정맥내 주사 후 일주일 후에 희생(sacrificed)시키고, 뇌를 획득하였다. 조직을 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시키고 파라핀(paraffin)으로 넣었다(embedded).
2) 급성폐손상 동물모델의 제작
일정한 양(20 ㎍/마리)의 LPS를 기도를 통하여 투여하여 급성폐손상 동물모델을 제조하였다. AMO155c/CMNV, AMO155c/exosome을 1:3의 무게비로 로딩하였다. AMO155c가 로딩된 CMNV와 exosome을 intratracheal administration (기도투여)를 실시하였다. 각 동물 당 5 ㎍의 AMO155c를 투여하였다.
(14) 니슬 염색(Nissl staining)
파라핀-포매된 뇌 조직(paraffin-embedded brain tissues)을 5-μm-두께 절편으로 절단하였다. 절편을 0.1% 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색하고, 70% 에탄올(ethanol) 및 10% 아세트산(acetic acid)으로 탈색하고, 100% 에탄올 및 자일렌(xylene)으로 탈수시켰다. 절편의 이미지는 Image J software를 이용하여 분석하였다.
(15) miRNA-21에 대한 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR: Reverse transcription-polymerase chain reaction) 수행
miRNAeasy FFPE 키트를 사용하여 파라핀-포매된 뇌 절편으로부터 총 RNA를 추출하였다. cDNA는 SensiFAST SYBR-Lo-ROX 키트(Meridian Bioscience, Mamphis, TN, USA)를 이용하여 합성하였다. 샘플은 Applied Biosystems 7500 RT-PCR System (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)을 이용하여 분석하였다. 사용된 miR-21 프라이머의 서열은 다음과 같다: 정방향 프라이머, 5'-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3'(서열번호 2) 및 역방향 프라이머, 5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'(서열번호 3). 사용된 GAPDH 프라이머의 서열은 다음과 같다: 정방향 프라이머, 5'-AGACAGCCGCATCTTCT TGT-3'(서열번호 4) 및 역방향 프라이머, 5-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3'(서열번호 5).
(16) 샘플의 면역조직화학(Immunohistochemistry) 검사
파라핀-포매된 뇌 조직을 5-μm-두께 절편으로 절단하였다. 절편을 탈파라핀화(deparaffinized)하고, 순차적으로 재수화(rehydrated)하였다. 샘플을 0.05% PBST로 5분 동안 2회 세척하고, 10% 염소 혈청(goat serum) 및 1% BSA를 함유하는 PBS로 실온에서 2시간 동안 차단(blocked)하였다. 토끼 항PDCD4 항체, 마우스 항PTEN 항체 또는 마우스 항Ki67 항체를 1% BSA를 함유하는 PBS 중에 1:500으로 희석하였다. 절편은 항체와 함께 4℃에서 밤새(overnight) 인큐베이션하였다. 샘플을 2회 세척하고, AxioScan으로 시각화하였다. 세포 사멸의 검출을 위한 제조사 매뉴얼에 따라 Deadend TUNEL system kit로 TUNel 분석을 수행하였다.
(17) 샘플의 생체분포(Biodistribution) 분석
T7-CMNV/Cy5.5-AMO21c를 꼬리 정맥을 통해 래트 내로 정맥내 주사하였다. Cy5.5-AMO21c의 분포를 형광 생체내 영상화 시스템(FOBI system, Neo Science, Suwon, Korea)을 이용하여 조사하였다. 래트 교모세포종 모델을 상기 기재된 바와 같이 제조하고, T7-CMNV/Cy5.5-AMO21c를 래트 당 60 μg의 AMO21c 용량으로 주사하였다. 구체적으로, 상기 APMO21c는 수컷 SD rat 기준 6주령을 사용하여 평균적으로 250 g의 무게를 기준으로 60 μg을 투여하였고, kg 당 240 μg 정도의 양을 투여하였으며, 나노소낭(인지질) 및 T7의 경우, 무게 비율 기준으로 AMO21c의 5배에 해당하는 양(kg당 1200 μg의 나노소낭(인지질) 및 T7)을 투여하였다. 래트를 주사로부터 2시간 또는 18시간 후에 희생시키고, 생체외 형광 이미지는 NEOimage software(Neoscience, Suwon, Korea)를 이용하여 분석하였다.
(18) 샘플의 혈액 분석
혈액 샘플은 희생 당시 래트로부터 채취하였다. 샘플을 500 g에서 3분 동안 원심분리하고, 혈청을 수집하였다. 혈청 샘플은 Automated Chemistry Analyzer(Fujifilm NX700, Tokyo, Japan)로 분석하였다.
(19) 통계 분석
데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시되고, 그룹들 사이의 차이는 ANOVA와 Tukey의 다중 비교 시험(Tukey's multiple comparisons test)을 통해 결정하였다. 0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
2. 실험 결과
(1) CMNV, T7-CMNV 및 AMO21c 또는 AMO155c가 로딩된 CMNV의 특성화
상기 실시예 1-(2)에서 CMNV를 제조한 후, AMO21c를 소수성 상호작용에 의해 소낭 상에 로딩하였다. 나노소낭 내로의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)의 로딩은 전기천공(electroporation), 초음파처리(sonication) 또는 형질감염 시약(transfection reagents)을 이용하여 수행하였다. 그러나 올리고뉴클레오티드의 나노소낭 내로의 로딩 효율은 좋지 않은 반면 전기천공에 의한 로딩 효율은 1 내지 5% 정도이다. 따라서 대부분의 올리고뉴클레오티드가 로딩되지 않아 전달 효율이 좋지 않았다. 본 연구에서는 AMO21을 콜레스테롤 모이어티와 접합시켜, AMO21c를 생성하였다. AMO21c는 CMNV와 혼합되어 AMO21c는 소수성 상호작용에 의해 CMNV 상에 로딩되었다. 대부분은 CMNV의 표면 상에 로딩되었지만, AMO21c는 2'-위치에서 메틸기(methyl group)로 변형되어, 혈청 내의 뉴클레아제(nucleases)에 의해 분해되지 않았다. 또한, CMNV 및 T7-CMNV에 대한 AMO21c의 로딩 효율을 측정하였다. Cy5-표지된 AMO21c를 제조하고, 나노소낭과 혼합하였다. 초원심분리를 수행하여 나노소낭을 단리하였다. 그 결과, CMNV 및 T7-CMNV에 대해 각각 14.58 ± 3.08% 및 15.1 ± 1.97%였다. 전기천공은 miRNA(microRNA)를 나노소낭 내로 로딩하기 위해 널리 수행되었으나, 효율성을 제한하는 확산-의존성(diffusion-dependen)이다. 따라서, miRNA의 로딩을 위한 소수성 변형은 효율을 증가시키는 옵션일 수 있다.
T7-CMNV의 입자 크기는 CMNV 및 T7c의 비율과 함께 증가하는 경향이 있음을 확인하였다(도 2a). 입자 크기의 증가는 두 가지 원인에 의해 유도될 수 있다. 첫째, T7c는 상기 기재된 바와 같이 콜레스테롤과의 소수성 상호작용 및 T7 펩티드와의 리간드-수용체 상호작용인 2개의 상호작용을 통해 C6 세포막과 상호작용할 수 있다. 이들 상호작용은 입자간 상호작용을 가능하게 하고 입자 크기의 증가에 기여한다. 그러나, 압출은 T7-CMNV의 크기 증가를 제한할 수 있고, 입자 크기는 다른 시험된 비율(도 2a)과 비교하여 1:4에서 유의하게 증가하지 않는 것을 확인하였다. 둘째, T7 펩티드를 사용한 CMNV 표면 장식은 입자 크기를 증가시킬 수 있다. T7-CMNV 제조 공정에서 T7c 및 세포막을 사용한 압출은 T7의 막 내로의 통합을 용이하게 하였다. 일부는 CMNV의 외부에 그의 표면 상에 위치할 수 있는 반면, 다른 것들은 CMNV의 내부에 이를 만들 수 있다. 따라서, CMNV의 표면 상의 T7 펩티드는 입자 크기의 증가에 기여할 수 있다.
T7c에 의한 CMNV 간 상호작용은 다른 두 가지 가능한 설명보다 크기 증가에 더 크게 기여할 수 있다. 이러한 추측은 CMNV 상에 AMO21c를 로딩한 후 크기 평가를 기초로 하였다. AMO21c를 T7-CMNV 또는 CMNV와 함께 인큐베이션하고, 콜레스테롤과의 소수성 상호작용에 의해 표면 상에 로딩되었다. CMNV와 AMO21c 사이의 비율은 세포 흡수 연구에 기초하여 5:1의 질량비로 고정하였다(도 3). CMNV의 경우, CMNV 막에 결합된 단백질 농도를 정량한 값을 기준으로 하였고, 무게당 나노소낭의 개수는 6.15 x 1011 ± 1.16 x 1011 particles per 1 mg 단백질 농도로 측정되었다. 생성된 CMNV의 입자 크기를 동적 광산란(dynamic light scattering)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, CMNV와 T7-CMNV 모두에 대해 AMO21c 로딩 후 입자 크기가 증가하지 않음을 확인하였다(도 2B). AMO21c의 크기가 T7c의 크기보다 더 크고, AMO21c로 CMNV 표면을 장식(decoration)해도 입자 크기가 증가하지 않는다는 점을 고려할 때 CMNV 표면의 T7 장식은 크기가 증가하지 않을 가능성이 높다. 따라서, T7c에 의한 크기 증가는 inter-CMNV 상호작용으로 인한 것일 수 있으며, 이는 응집으로 인한 크기 증가에 기여할 수 있다. 입자 크기는 약력학에 상당한 영향을 미친다. 200 nm 초과의 직경을 갖는 입자가 BBB를 침투하는 것이 어렵기 때문에, T7c와 CMNV 사이의 비율은 1:1의 질량비로 고정하였고, 이때, T7-CMNV/AMO21c의 평균 크기는 176.96 nm ± 0.65이다.
또한, AMO155c가 로딩된 CMNV와 exosome의 크기 측정을 dynamic light scattering assay로 측정하였다. 그 결과, Naked AMO155c만 존재할 때는 불안정한 크기의 마이셀이 생성되었으나, CMNV와 exosome의 비율이 증가할수록 점차 안정한 크기를 보여주었다. 특히, CMNA가 보다 작은 크기를 보여주었다 (도 13 참조).
CMNV의 제타 전위는 세포막이 음전하를 띠기 때문에 약 -13 mV인 것을 확인하였다(도 2c). T7-CMNV의 제타 전위는 CMNV보다 약간 더 높은 것으로 보였지만, 두 군 사이의 차이는 통계적으로 유의하지 않다. T7-CMNV는 T7c의 전하가 아르기닌 잔기(arginine residues)로 인해 양성이기 때문에 CMNV보다 더 높은 제타 전위를 가질 수 있다고 추측된다. T7-CMNV에 AMO21c를 로딩하면 T7c의 양전하를 마스킹하여 제타 전위를 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 2c). T7과 같은 양전하를 띤 펩티드가 없기 때문에 CMNV에서 명확하게 확인되지 않았다(도 2c). CMNV의 음의 표면 전하는 알부민(albumin)과 같은 음으로 하전된 혈청 단백질(serum proteins)과의 상호작용이 전하 반발로 인해 감소될 수 있기 때문에 순환에 도움이 될 수 있다.
CMNV 및 T7-CMNV의 안정성은 치료 응용 분야에서도 중요하다. CMNV 및 T7-CMNV를 제조한 후, 나노소낭을 4℃에서 최대 21일 동안 인큐베이션하였다. 이들의 안정성은 동적 광 산란을 이용하여 평가하였다. 그 결과, CMNV의 크기가 인큐베이션 동안 유의하게 변화되지 않았음을 확인하였다(도 2d). CMNV의 형태를 TEM을 이용하여 평가하였고, 구형 형태인 것을 확인하였다(도 2e). DLS 및 TEM으로부터의 결과를 재확인하기 위해, 나노소낭을 다시 NTA로 측정하였다(도 2f). 또한, NTA 결과를 일반적인 비신초닌산 분석(bicinchoninic acid assay)의 결과와 비교함으로써, CMNV의 농도를 정확하게 추측하였다: 1 mg 단백질 당 대략 6.15 x 1011 ± 1.16 x 1011 입자.
CMNV 및 T7-CMNV의 세포독성은 MTT 및 용혈 분석을 이용하여 평가하였다. AMO21c 담체에 대한 대조군으로서, 리포펙타민을 사용하였다. MTT 분석은 CMNV 및 T7-CMNV가 5 μg/ml 농도까지 세포에서 검출가능한 독성을 유도하지 않았음을 확인하였다(도 4a). 그러나, 리포펙타민이 처리된 세포에서의 독성은 2.5 μg/ml에서 시작하여 상당히 증가함을 확인하였다(도 4a). 양이온성 지질의 독성은 음전하를 띤 세포막과의 전하 상호작용 때문일 수 있고, 세포막의 표면 상의 양이온성 유전자 담체의 전하 상호작용이 응집 및 세포막 파열을 유도하여, 세포 생존율을 감소시키는 것일 수 있다. 따라서, 리포펙타민의 독성은 양이온성 전하 때문일 수 있다. CMNV 및 T7-CMNV의 경우에, 표면 전하가 음전하를 띠고, 세포막과 전하 상호작용이 없다.
또한, CMNV 및 T7-CMNV의 독성을 용혈 연구를 통해 평가하였다. 용혈 연구에서 AMO21c가 로딩된 CMNV 또는 T7-CMNV(CMNNV/AM021c 또는 T7 -CMNV/AM021c)를 독성의 관점에서 평가하였다. 그 결과, CMNV/AMO21c 및 T7-CMNV/AM021c가 용혈을 유도하지 않았음을 확인하였다(도 4b). 그러나, 리포펙타민/AMO21c는 용혈을 유의하게 유도함을 확인하였다(도 4b). 리포펙타민/AMO21c는 리포펙타민의 표면 전하가 AMO21c의 음전하로 가려지기 때문에 리포펙타민 단독보다 독성이 낮을 수 있습니다. 그러나, 리포펙타민/AMO21c는 적혈구 세포막과 상호작용하여 용혈을 유도하였다. 이들 결과는 정맥내(IV: intravenous) 주사 후 순환 시간과 관련이 있다. 혈청 단백질과의 리포펙타민 응집은 간에서 쿠퍼 세포(Kupffer cells)에 의한 리포펙타민/AMO21c의 흡수를 용이하게 할 수 있고, 이들은 신속하게 제거된다. 따라서, CMNV에 비해 리포펙타민과 같은 응집 입자가 뇌 대신 간에 축적되어 간독성을 유발할 가능성이 있다.
(2) CMNV 및 T7-CMNV의 AMO 전달
CMNV 및 T7-CMNV의 전달 효율을 Cy5-표지된 AMO21c로 평가하였다. AMO21c-로딩된 CMNV(CMNV/AMO21C) 및 AMO2lc 로딩된 T7-CMNv(T7-CCNV/AMO21c)를 C6 세포에 첨가하였다. 네이키드 AMO21c(Naked AMO21c) 및 리포펙타민/AMO 21c를 대조군으로 사용하였다. 각각의 샘플의 세포 흡수 효율을 유세포 분석(flow cytometry)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, T7-CMNV가 C6 교모세포종 세포로의 AMO21c의 가장 높은 세포 흡수 효율을 가짐을 확인하였다(도 5a). 리포펙타민, CMNV 및 스크램블된 T7-CMNV (scrT7-CNV)는 유사한 흡수 효율을 가짐을 확인하였다(도 5a). 상기 스크램블된 T7-CMNV는 기존에 알려져 있는 T7 펩티드와 서열(구성)은 동일하나, 펩티드 서열의 순서가 상이한 T7을 이용한 CMNV이며, scrT7-CMNV는 CNMV에 비해 전달 효율을 증가시키지 않았고, 이는 T7-CMNV 전달의 증가가 T7 펩티드의 효과로 인한 것일 수 있음을 시사하며, 상기 결과는 형광 현미경 검사에 의해 확인하였다(도 5b).
또한, CMNV 및 T7-CMNV의 전달 효율을 상이한 유형의 세포에서 비교하였다. N2A 신경아세포종 세포를 사용한 전달 분석에서 T7-CMNV는 CMNV 및 ScrT7-CNV보다 더 높은 전달 효율을 가짐을 확인하였다(도 5c). 신경아세포종은 트랜스페린 수용체를 정상 세포보다 더 높은 수준으로 발현하는 것으로 보고되었다. 따라서, T7-CMNV는 트랜스페린 수용체와의 더 많은 상호작용으로 인해 신경아세포종 세포에서 더 높은 전달 효율을 가질 수 있다. 또한, CMNV 및 scrT7-CMNV는 N2A 세포에 대한 유사한 전달 효율을 갖는 것으로 관찰되었다. 이는 T7-CMNV의 더 높은 효율이 T7 펩티드의 효과로 인한 것임을 확인하였다.
비-암 세포(non-cancer cells)로서, HEK293 세포를 사용하여 T7-CMNV의 전달 효율을 평가하였다. 동일한 전달 연구를 Cy5-AMO21c로 수행하였다. 그 결과, T7-CMNV가 CMNV 및 scrT7-CMNV에 비해 AMO21c 세포 흡수를 유도하지 않았음을 확인하였다(도 5d). HEK293 세포는 트랜스페린 수용체를 유의한 수준으로 발현하지 않으며, T7 펩티드가 HEK 293 세포로의 전달 효율 T7-CMNV에 미치는 효과는 제한되었다. 상기 결과는 T7-CMNV가 AMO21c를 트랜스페린 수용체-발현 세포, 예컨대 암 세포 및 내피 세포로 전달할 수 있음을 나타낸다.
트랜스페린 수용체는 교모세포종 세포 및 BBB의 내피 세포 둘 다에서 과발현된다. 따라서, 트랜스페린 수용체에 대한 리간드는 BBB를 통해 뇌로의 교모세포종 표적화 및 트랜스사이토시스에 대해 광범위하게 연구되어 왔다. 이에 의해, BBB 트랜스사이토시스 및 암 표적화는 단일 표적화 리간드와 동시에 달성될 수 있다. T7-CMNV의 트랜스페린 수용체 결합 및 트랜스시토시스 능력을 입증하기 위해, CMNV 및 T7-CNV를 사용한 트랜스웰(transwell) 실험을 수행하였다. bEND.3 마우스 내피 세포를 트랜스웰의 정점 측에 시딩하고, 내피층에 대해 배양하였다. Cy5-AMO21c-로딩된 CMNV 또는 T7-CMNV를 bEND.3 세포에 첨가하였고, 리포펙타민/Cy5-AMO21c를 대조군으로 사용하였다. 지정된 시간에, 트랜스웰 상의 bEND.3 세포 및 마이크로분석 플레이트의 기저측면 측으로부터의 배지 내의 양성 형광 신호를 유세포 분석 및 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다. 6시간의 인큐베이션 후, CMNV/AMO21c 및 scrT7-CMNv/AM021c와 비교하여, T7-CMINV/AMO21c의 첨가 후 bEND.3 세포에서의 형광 신호가 증가되었다(도 6a). 이러한 결과는 T7-CMNV 상의 T7 펩티드가 AMO21c의 bEND.3 세포로의 세포내 전달을 증가시켰음을 시사한다. 마이크로분석 웰의 바닥에서 배지는 T7-CMNV/AMO21c 군에서 가장 높은 형광 신호를 나타내었고, 이는 AMO21C가 bEND.3 세포층 내에서 트랜스사이토시스에 의해 C6 세포로 전달되었음을 확인하였다(도 6b). 24시간의 인큐베이션 후, T7-CMNV/AMO21c-처리된 bEND.3 세포의 형광 수준은 CMNV/AM021c 및 scrT7-CMV/AM021c의 형광 수준과 유사함을 확인하였다(도 6c). 또한, T7-CMNV/AMO21c 군의 배지 중 형광 수준을 추가로 증가시킴을 확인하였다(도 6d). 상기 결과는 세포 흡수 및 트랜스사이토시스 과정이 T7-CMNV에 의해 촉진되었음을 시사한다.
(3) 정맥내 투여 후 T7-CMNV의 생체분포
T7-CMNV의 전달 효율은 생체분포(biodistribution) 연구를 통해 평가하였다. 리포펙타민, CMNV 및 ScrT7-CMNV를 음성 대조군으로서 사용하였다. Cy5.5-AMO21c는 소수성 상호작용에 의해 CMNV, T7-CMNV 및 scrT7-CMNV 상에 로딩하였다. 또한, 리포펙타민/Cy5.5-AMO21c는 전하 상호작용을 통해 제조하였다. 꼬리 정맥 내로 샘플을 정맥내 주사한지 18시간 후에, 기관(organs)을 수거하고, 영상 상자(image box)에서 형광 신호를 관찰하였다. 대부분의 AMO21c는 간 및 신장에서 관찰되었다. 특히, 리포펙타민/AMO21c는 AMO21C를 사용한 CMNV보다 더 고도로 간에 흡수됨을 확인하였다(도 7a). 이는 양전하로 하전된 리포펙타민/AMO21c 입자가 CMNV보다 더 용이하게 쿠퍼 세포에 의해 흡수되었음을 나타낸다. 대조적으로, 음성 표면 전하를 갖는 CMNV는 쿠퍼 세포에 의한 클리어런스(clearance)를 감소시킬 수 있다. 뇌에서 Cy5.5-AMO21c의 형광 신호는 CMNV, scrT7-CMNV 및 리포펙타민에 비해 T7-CMV에 의해 증가됨을 확인하였다(도 7b 및 7c). 상기 결과는 T7 펩티드가 뇌로의 트랜스사이토시스 및 전달 효율을 촉진시킴을 확인시켜 주었다.
종양 세포 막-코팅된 나노입자가 동형 표적화 효과(homotypic targeting effects)를 갖는다는 것이 이전에 제안되었다. 따라서, CMNV는 동형 표적과 관련된 종양-표적화 효과를 가질 수 있다. 그러나, 이 효과는 본 연구에서 관찰되지 않았고, CMNV 및 ScrT7-CMNV의 전달 효율은 뇌 표적화 모이어티를 갖지 않는 리포펙타민과 유사하였다. 이는 CMNV가 BBB를 통해 뇌에 들어갈 수 없고, 뇌-표적화 리간드, 예컨대 T7 펩티드가 불가피하기 때문일 수 있다.
생체내 CMNV 및 T7-CMNV의 가능한 독성을 평가하기 위해 체중(도 8a), AST(도 8b), ALT(도 8c) 및 BUN(도 8d)을 측정하였다. 그 결과, CMNV 및 T7-CMNV가 동물에서 눈에 띄는 독성을 유발하지 않음을 확인하였다(도 8a 내지 도 8d).
(4) T7-CMNV를 사용한 AMO21c의 종양 표적화 전달 및 치료 효과
C6 세포를 래트의 뇌 내로 주사함으로써, 동소 교모세포종 모델(Orthotopic glioblastoma models)을 제조하였다. 이식 일주일 후, T7-CMNV/AMO21c를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 리포펙타민/AM021c, CMNV/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AM021c를 대조군으로서 주사하였다. 주사 7일 후, 동물을 희생시키고, 뇌를 채취하였다. AMO21c 전달의 효과를 평가하기 위해, RT-PCR을 수행하여 miR-21을 증폭시켰다. 그 결과, miR-21 수준이 CMNV/AMO21c 및 T7-CMNV/AM021c의 주사 후 감소됨을 확인하였다(도 9). 특히, T7-CMNV/AMO21c에 의한 miR-21의 감소는 CMNV/AM021c보다 높았고, 이러한 결과는 T7-CMNV가 CMNV에 비해 뇌로의 AMO21c의 전달 효율을 증진시켰다는 것을 의미한다.
miR-21의 감소는 이의 표적 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다. 표적 유전자 발현을 평가하기 위해 뇌 샘플에서 PDCD4 및 PTEN 발현을 평가하였다. PDCD4 및 PTEN은 miR-21의 표적 유전자이며, 이의 3개의 5'-UTR 내에 miR-21 인식 부위를 갖는다. PDCD4 및 PTEN의 하향-조절은 종양 환경에서 종양 세포의 높은 생존율과 밀접하게 관련되었다. 따라서, AMO21c 전달은 miR-21을 억제하여, PDCD4 및 PTEN 발현을 증가시킬 수 있고, 도 10a와 같이 PDCD4 발현이 T7-CMNV/AMO21c에 의해 증가되었음을 확인하였다. 특히, T7-CMNV/AMO21c는 다른 샘플, 예를 들어, CMNV/AM021c 및 scrT7-CMNV/AM021c보다 더 효율적으로 PDCD4 발현을 증가시켰고(도 10a), 도 7에 나타낸 바와 같이, CMNV/AMO21c는 T7-CMNV/AM021c만큼 효율적으로 뇌에 침투하지 않았고, 이는 T7 펩티드가 뇌로의 AMO21C의 전달 효율을 증가시켰음을 시사한다. 따라서, T7-CMNV의 T7 펩티드에 의한 AMO21c의 촉진 전달은 뇌에서의 PDCD4 발현을 증진시킬 수 있고, 상기와 유사한 결과가 PTEN 면역조직화학에서 관찰되었다. PTEN 발현은 T7-CMNV/AMO21c의 정맥내 투여에 의해 가장 효율적으로 유도됨을 확인하였다(도 10b).
몇몇 연구는 증식 마커 Ki67 발현이 암 중증도에 크게 비례하는 정도를 시사한다. AMO21c 전달의 항-종양 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 면역조직화학을 통해 래트 뇌에서 Ki67 발현을 평가하였고, 리포펙타민/AM021c, CMNV/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AM021c는 Ki67 발현을 감소시켰으나, Ki67 발현은 T7-CMNV/AMO21c에 의해 보다 효율적으로 감소됨을 확인하였다(도 11). 상기 T7-CMNV/AMO21c에 의한 Ki67의 증진된 감소는 T7-CNV에 의한 뇌 내로의 AMO21C의 보다 효율적인 전달로 인한 것일 수 있으며, 이는 T7-CCNV의 표면 상의 T7 펩티드가 BBB를 통한 뇌 내로의 AMO2lc의 침투를 용이하게 한다는 것을 시사하는 증거를 지지한다.
샘플의 종양 크기를 니슬 염색을 통해 평가하였다. AMO21c로 처리된 모든 군에 걸친 종양 크기는 감소되었다. 특히, T7-CMNV/AMO21c는 다른 샘플과 비교하여 종양 크기를 가장 효율적으로 감소시킴을 확인하였다(도 12). 다른 그룹도 종양 크기를 약 40% 감소시켰으나, 그 효과는 T7-CMNV/AMO21c만큼 유의하지 않았다. 구체적으로, CMNV/AMO21c 및 scrT7-CMNV/AM021c는 종양 크기에 대해 T7-CMNV 및 AMO21C보다 더 낮은 효과를 가졌고, 이는 BBB를 통한 종양 표적화 전달에 대한 T7 펩티드의 효과를 추가로 시사한다.
(5) CMNV를 사용한 AMO155c의 표적화 전달 및 치료 효과
1) 핵산의 전달효율을 측정
다양한 비율로 AMO155c/CMNV와 AMO155c/exosome을 준비하고, LA4 세포에 투여하여 핵산의 전달효율을 측정하였다. 그 결과, CMNV의 경우에 1:3 의 비율에서 우수한 전달 효율을 보여주었으며, 그 이상의 비율에서는 거의 비슷한 효율을 보여주었다. 따라서, 동물실험에서는 1:3의 비율을 이용하였다. 또한, exosome의 경우에도 전달효율을 개선하기는 하였으나, CMNV의 경우가 전달 효율이 훨씬 개선되었다 (도 14 참조).
2) 치료 효과 확인
급성폐손상 치료 효과는 급성폐손상 동물모델에 AMO155c가 로딩된 CMNV와 exosome을 처리한 후, 24시간 후에 기관지폐세척액과 폐조직에서 IL-1beta와 IL-6의 양을 측정하였다 (도 15 참조). 대조군으로 양이온성 고분자인 polyethylenimine (25 kDa, PEI25k)도 전달체로 이용하였다. 그 결과 AMO155c/CMNV가 가장 효과적으로 IL-1beta와 IL-6를 줄일 수 있음이 확인되었다 (A, B는 기관지폐세척액에서 측정, C, D는 폐조직추출액에서 측정).
또한, hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 통하여, 염증반응 정도를 측정하였다. 그 결과, AMO155c/CMNV의 경에 가장 효과적으로 염증반응을 줄이는 것을 확인하였다 (도 16 참조).
Claims (22)
- 세포막 유래 인지질 이중층;
상기 인지질 이중층의 소수성 부위에 결합된 표적화 물질; 및
상기 인지질 이중층의 소수성 부위에 결합된 핵산을 포함하는, 핵산 전달용 나노소낭.
- 청구항 1에 있어서, 상기 표적화 물질은 소수성 물질이 결합된 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
- 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 소수성 물질이 결합된 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
- 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 소수성 물질은 콜레스테롤(cholesterol), 팔미트산(Palmitic acid), 토코페롤(Tocopherol) 및 올레산(Oleic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 핵산 전달용 나노소낭.
- 청구항 1에 있어서, 상기 표적화 물질은 상기 인지질 이중층 내부의 친수성 부위 및 상기 인지질 이중층 외부의 친수성 부위에 존재하는 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
- 청구항 1에 있어서, 상기 표적화 물질은 T7 펩티드(T7 peptide), RAGE 부착 펩티드 (Receptor for advanced glycation end products binding peptide), 클로로톡신(Chlorotoxin), 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2) 및 광견병 바이러스 글라이코단백질(Rabies virus glycoprotein)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 핵산 전달용 나노소낭.
- 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 메틸기(methyl group)로 변형된 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
- 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotides), 항-miRNA 올리고뉴클레오타이드(anti-microRNA oligonucleotides), miRNA, mRNA, siRNA, tRNA, sgRNA, shRNA 및 이들의 변형체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 핵산 전달용 나노소낭.
- 청구항 1에 있어서, 상기 나노소낭은 투여 대상 1 kg 당 200 μg 내지 280 μg의 핵산 용량으로 투여되는 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
- 청구항 1에 있어서, 상기 인지질과 상기 표적화 물질은 1:2 내지 2:1의 질량비로 존재하는 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
- 청구항 1에 있어서, 상기 인지질과 상기 핵산은 10:1 내지 1:1의 질량비로 존재하는 것인, 핵산 전달용 나노소낭.
- 청구항 1에 있어서, 상기 나노소낭의 직경은 165 nm 내지 185 nm인, 핵산 전달용 나노소낭.
- 청구항 1의 나노소낭을 포함하는 핵산 전달용 조성물.
- 청구항 1의 나노소낭을 포함하는 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 14에 있어서, 상기 암은 교모세포종, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 충수암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 항문암, 신암, 수뇨관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소암, 자궁암, 난소암, 외음암, 질암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 14에 있어서, 상기 폐 질환은 급성폐손상인, 암 또는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 개체로부터 분리된 세포의 세포막을 분리하여 인지질들을 얻는 단계;
상기 인지질들과 소수성 물질이 결합된 표적화 물질을 혼합하여 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계; 및
상기 인지질 이중층과 소수성 물질이 결합된 핵산을 혼합하여 상기 표적화 물질과 상기 핵산이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계를 포함하는 것인, 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법.
- 청구항 17에 있어서, 상기 세포막을 분리하는 단계는 상기 세포에 초음파 처리(sonication)하는 단계; 및
상기 세포를 원심분리하는 단계를 포함하는 것인, 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 원심분리는 차등 원심분리(differential centrifugation), 순차적 원심분리(sequential centrifugation) 및 초원심분리(ultracentrifuge)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 분리 방법으로 수행되는 것인, 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법.
- 청구항 17에 있어서, 상기 표적화 물질이 결합된 인지질 이중층을 얻는 단계는 상기 인지질들과 상기 표적화 물질을 혼합한 후 압출하는 단계를 포함하는 것인, 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법.
- 청구항 17에 있어서, 상기 인지질과 상기 표적화 물질을 혼합하는 단계에서 상기 인지질과 상기 표적화 물질은 1:2 내지 2:1의 질량비로 혼합되는 것인, 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법.
- 청구항 17에 있어서, 상기 인지질 이중층과 상기 핵산을 혼합하는 단계에서 상기 인지질 이중층과 상기 핵산은 10:1 내지 1:1의 질량비로 혼합되는 것인, 핵산 전달용 나노소낭의 제조방법.
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| KR102036051B1 (ko) | 2017-02-15 | 2019-10-24 | 고려대학교 세종산학협력단 | 엑소좀 기반의 나노입자 복합체 및 이의 제조방법 |
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