WO2024024972A1 - チョウザメ飼育方法、チョウザメ生産方法、並びにチョウザメ用固形飼料 - Google Patents

チョウザメ飼育方法、チョウザメ生産方法、並びにチョウザメ用固形飼料 Download PDF

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WO2024024972A1
WO2024024972A1 PCT/JP2023/027864 JP2023027864W WO2024024972A1 WO 2024024972 A1 WO2024024972 A1 WO 2024024972A1 JP 2023027864 W JP2023027864 W JP 2023027864W WO 2024024972 A1 WO2024024972 A1 WO 2024024972A1
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sturgeon
genistein
solid feed
feed
soybean
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PCT/JP2023/027864
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成保 井尻
博之 稲葉
藍 内山
良子 高野
勝正 山下
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国立大学法人北海道大学
愛知県
共立製薬株式会社
株式会社フジキン
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    • A01K61/00—Culture of aquatic animals
    • A01K61/10—Culture of aquatic animals of fish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
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    • A23K10/30—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
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    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs

Definitions

  • the present invention provides a method for raising sturgeon in which a solid feed containing soybean isoflavones containing genistein is mixed almost uniformly, a method for producing sturgeon including the same process, and a method for producing sturgeons in which a soybean isoflavones containing material containing genistein is mixed almost uniformly.
  • a method for raising sturgeon in which a solid feed containing soybean isoflavones containing genistein is mixed almost uniformly
  • a method for producing sturgeon including the same process and a method for producing sturgeons in which a soybean isoflavones containing material containing genistein is mixed almost uniformly.
  • Sturgeon is a general term for teleost fish that belong to the order Sturgeon (scientific name ⁇ Acipenseriformes''), and is composed of two families: Sturgeon (scientific name ⁇ Polyodontidae'') and Helicopteridae (scientific name ⁇ Acipenseriformes'').
  • Sturgeon scientific name ⁇ Polyodontidae''
  • Helicopteridae scientificific name ⁇ Acipenseriformes''
  • Most species have two pairs of barbels on the sides of their downward facing mouths, which they use to search for food on the bottom.
  • sturgeon Known species of sturgeon include the giant sturgeon, Siberian sturgeon, Russian sturgeon, Sturgeon sturgeon, Mikado sturgeon, Daurian sturgeon, and Amur sturgeon.
  • the giant sturgeon is found in the Caspian Sea and the Black Sea, and although it can reach up to 6 meters in length, it is long-lived and grows slowly, taking 15 to 20 years to reach sexual maturity.
  • the Sturgeon is a relatively small sturgeon that inhabits the Eurasian continent, and its total length is usually around 40 cm, but it matures early, taking only 4 to 5 years to reach sexual maturity. Sturgeon were once distributed in Japan, but are now considered extinct.
  • the Rikado sturgeon, Daurian sturgeon, and Amur sturgeon are northern sturgeon that come to Japan (Hokkaido).
  • the Bestel species which is a hybrid of the Sturgeon and Sturgeon, is widely used for aquaculture.
  • the Bestel variety is relatively early maturing, with an initial maturation period of 6 to 9 years.
  • Salted sturgeon eggs are known as caviar, a luxury food ingredient. Generally, the larger the eggs, the higher the brand value of the caviar. Sturgeon eggs have large eggs and are known as caviar with the highest brand value. The Mikado sturgeon and Daurian sturgeon also have large eggs, while the Amur sturgeon has medium-sized eggs. On the other hand, although Sturgeon matures early, the size of its eggs is small. In addition, the Bestel breed, which is a hybrid breed, has medium-sized eggs even though it matures relatively early.
  • Patent Document 1 describes a system for raising sturgeon that consists of a sturgeon fertilized egg, a translucent bag or container containing breeding water, a sturgeon breeding tank, a thermostat, a lighting device, and a transport container.
  • a sturgeon breeding kit is described that is characterized by:
  • soybean isoflavones will be explained below.
  • Soybean isoflavones are a general term for flavonoid compounds with isoflavone as the basic skeleton, which are mainly contained in soybean germs.
  • Soybean isoflavones are glycoside type (glycoside; structure covalently bonded to sugar), aglycone type (non-glycoside; structure in which the sugar moiety of glycoside is removed), acetylated form of glycoside, and It is classified into four types of malonylated glycosides. Three types of compounds are known in each category, and a total of 12 types of compounds are known as soy isoflavones.
  • the three glycoside-type soybean isoflavones are genistin, daidzin, and glycitin, and their aglycone types (from which the sugar moiety has been removed) are genistein, daidzein, and glycitein, respectively.
  • the composition and content of each compound varies depending on the type of raw soybean, etc., and the extraction, purification, and processing methods.
  • Patent Document 2 describes a method for producing isoflavone compounds by extracting and concentrating soybean germ with a water-soluble organic solvent, removing lipophilic components with a hydrophobic organic solvent, concentrating again, purifying and drying.
  • Patent Document 3 discloses a method for increasing the concentration of isoflavone aglycones, including a step of defatting soybeans hydrolyzed by fermentation using microorganisms with a non-polar solvent and extracting the dried defatted product with a polar solvent.
  • Patent Document 4 describes a method for producing an isoflavone compound concentrate, in which the isoflavone compound is extracted from soy sauce lees or soy sauce oil using an organic solvent.
  • Patent Document 5 discloses a method for separating high-purity genistein from an isoflavone mixture using a solvent
  • Patent Document 6 discloses a method for separating high-purity genistein from an isoflavone mixture using a solvent.
  • a method for obtaining a high isoflavone composition is described in Patent Document 7, in which a malonyl isoflavone glycoside solution obtained from an aqueous soybean extract is heated and/or treated with alkali to obtain an isoflavone glycoside solution, which is then treated with an acid.
  • enzymatic treatment to produce isoflavone aglycones is disclosed.
  • Soy isoflavones have a chemical structure similar to that of female hormones (estrogen), and are also called phytoestrogens. Soybean isoflavones, which are in the aglycone form, have estrogen-like effects and are said to be effective in preventing heart disease, menopausal disorders, osteoporosis, breast cancer, etc.
  • Non-Patent Document 1 describes that when Russian sturgeon were fed 500 mg/kg feed of genistein from 100 days after hatching, 27 out of 30 became female.
  • Patent No. 4377312 Japanese Patent Application Publication No. 11-263786 WO1999/025138 Japanese Patent Application Publication No. 5-170756 Japanese Patent Application Publication No. 7-173148 Japanese Patent Publication No. 2000-95792 Japanese Patent Application Publication No.
  • an object of the present invention is to provide a means for mass-producing female sturgeon simply, inexpensively, and efficiently.
  • the present invention provides a method for raising sturgeons in which they are fed a solid feed in which a soybean isoflavone-containing substance containing genistein is almost uniformly mixed, and a sturgeon is ingested in a solid feed in which a soybean isoflavone-containing substance containing genistein is substantially uniformly mixed in.
  • a sturgeon production method including a process, a solid feed for sturgeon in which a soybean isoflavone-containing substance containing genistein is almost uniformly mixed, and the like.
  • Approximately half of the genetically female sturgeon can be allowed to grow as they are by feeding them solid feed and raising them. Furthermore, by including a soybean isoflavone-containing substance containing genistein in the solid feed, it is possible to induce feminization of the remaining genetically male sturgeon, which is about half of the population. In other words, it is possible to raise almost all of the farmed individuals, which were genetically half male and half, as females or feminization-induced individuals. It becomes possible to efficiently produce individuals in which genetic males are induced to become feminized (the same applies hereinafter).
  • the present invention uses solid feed mixed with soybean isoflavone-containing substances, it is possible to simultaneously rear many individuals over a long period of time and to induce feminization of many genetically male individuals easily and efficiently. It can be carried out. Thereby, female sturgeon can be mass-produced easily and efficiently.
  • soybean isoflavone-containing material containing genistein is mixed into the solid feed rather than purified genistein, the solid feed can be produced relatively easily and at low cost. This makes it possible to easily and inexpensively mass-produce female sturgeon.
  • genistein or soy isoflavones
  • soy isoflavone-containing material containing genistein is mixed almost uniformly, so the solid feed containing soy isoflavones is not spread on the surface of the solid feed.
  • soy isoflavones are almost uniformly mixed into solid feed, compared to cases where genistein (or soy isoflavones) is spread on the surface of solid feed, when the feed is submerged in water during feeding, Since the diffusion and loss of genistein can be minimized, it has the advantage of being able to efficiently supply genistein to sturgeon without wasting it.
  • a soybean isoflavone-containing material obtained by hydrolyzing an ethanol extract of crushed soybean seeds with an aqueous acid solution and then drying the resulting product may be used.
  • the raw material is ground soybean seeds themselves, the raw material can be easily and inexpensively procured.
  • the step itself of hydrolyzing the ethanol extract of crushed soybean seeds with an aqueous acid solution can be performed using relatively simple equipment and procedures, and in the case of this step, large-scale preparation is also possible.
  • glycoside-type soybean isoflavones can be easily, inexpensively, and efficiently converted into aglycone-type soybean isoflavones, and the proportion of aglycone-type soybean isoflavones can be significantly increased. . Therefore, it is possible to easily, inexpensively, and efficiently prepare large amounts of soybean isoflavone-containing products containing genistein, and thereby, solid feed containing genistein can be produced relatively easily and inexpensively. This makes it possible to mass-produce female sturgeon easily and inexpensively.
  • the soy isoflavone-containing product obtained by this method contains aglycon-type soy isoflavones including genistein as the main component, and also contains other components such as proteins and carbohydrates without being completely removed.
  • soybean isoflavone-containing composition genetic male sturgeon can be sufficiently and favorably cultivated without using highly purified isoflavone compositions as in the past. It can induce feminization and does not affect the sturgeon's preference for food, the nutritional quality of the food, or the growth of the sturgeon.
  • soybean isoflavone-containing material obtained in the present invention is highly safe because it is basically all components originally contained in soybean seeds.
  • this soybean isoflavone-containing material retains components such as proteins and carbohydrates, so it has a correspondingly high nutritional value. Therefore, by mixing this soybean isoflavone-containing material into the solid feed, not only soybean isoflavones including genistein but also other nutritional components can be mixed into the solid feed at the same time. This also has the advantage of increasing the nutrients in solid feed and promoting the growth of sturgeon.
  • the solid feed sinks to the bottom of the water after feeding. Sturgeons eat food on the bottom of the water, so using a sinking solid feed will make it easier for sturgeons to find food, ensure proper feeding and supply of genistein, and prevent water deterioration due to uneaten food. .
  • female sturgeon can be mass-produced easily, inexpensively, and efficiently.
  • the present invention broadly encompasses solid feed and the like in which a soybean isoflavone-containing substance containing genistein is mixed substantially uniformly.
  • the solid feed according to the present invention can be used for sturgeon (raising sturgeon, inducing feminization of sturgeon, producing sturgeon, etc.), but is not narrowly limited to this, and can be used as appropriate depending on the purpose and use. It may be used as solid feed for fish or solid feed for fish farming.
  • a powder containing soybean isoflavones containing genistein can be obtained by hydrolyzing an ethanol extract of crushed soybean seeds with an aqueous acid solution and then drying the resulting product.
  • a step of pulverizing soybean seeds (2) a step of extracting a soybean isoflavone-containing substance containing genistein from the pulverized product by ethanol extraction, and (3) the extract or its concentration.
  • It can be prepared by a method that includes at least the steps of: (4) drying the hydrolyzate or its concentrate to obtain a powder of a soybean isoflavone-containing product containing genistein.
  • the present invention is not narrowly limited, for example, by including other steps and means.
  • the soybean seeds used as raw materials are not particularly limited, as long as they contain at least genistein, and a wide variety of known seeds can be used.
  • the method of pulverizing soybean seeds is not particularly limited, as long as the soybean seeds are pulverized at least to the extent that ethanol extraction is easy, and a wide variety of known methods can be employed. Further, the soybean seeds used as the raw material may be subjected to removal of foreign substances, washing, drying, etc., as appropriate.
  • Ethanol extraction is a process of extracting components including genistein and the like from crushed soybean seeds, and it is not particularly limited as long as the desired components can be extracted, and a wide range of known means can be employed. For example, by immersing crushed soybean seeds in ethanol under predetermined conditions to elute the target component, and then collecting the residual solid component, an ethanol solution in which the target component has been eluted can be obtained. Conditions for ethanol extraction are not particularly limited, and a wide variety of known means can be employed. Furthermore, ethanol extraction may be performed multiple times under predetermined conditions. The obtained ethanol extract may be concentrated by known means.
  • glycoside-type soybean isoflavones By hydrolyzing an ethanol extract or its concentrate with an acid aqueous solution, glycoside-type soybean isoflavones can be easily, inexpensively, and efficiently converted into aglycone-type soybean isoflavones, and the proportion of aglycone-type soybean isoflavones can be greatly increased.
  • the acid aqueous solution is not particularly limited as long as it can hydrolyze glycoside-type soybean isoflavones.
  • an aqueous hydrochloric acid solution may be used.
  • the obtained hydrolyzate may be subjected to, for example, aqueous ethanol extraction to extract and remove glycosides. Further, the obtained hydrolyzate (or glycoside removed product) may be concentrated by known means.
  • the obtained hydrolyzate or its concentrate is dried by known means, for example, after purification washing and filtration.
  • the dried product may be ground to produce a powder containing soybean isoflavones containing genistein.
  • the genistein content in the solid feed is preferably 100 to 3,500 mg/kg of feed, more preferably 200 to 3,000 mg/kg of feed, and most preferably 300 to 2,500 mg/kg of feed. It is. If the amount exceeds 3,500mg per kg of feed, feminization may be induced excessively, causing abnormalities in egg yolk tissue, etc.Also, even when soybean isoflavones are mixed almost uniformly, they may cause fatigue and damage to the digestive system. It is possible to give
  • soybean isoflavone-containing substances are mixed almost uniformly. This makes it possible to suppress the shedding, alteration, and deterioration of genistein, and even if feed is produced in large quantities at once, it can be stored for a long period of time. Furthermore, it is possible to minimize the diffusion and loss of genistein when feed is put into water during feeding.
  • the method of substantially uniformly mixing the soybean isoflavone-containing material into the solid feed is not particularly limited, and a wide variety of known methods can be employed.
  • a powdered soybean isoflavone-containing material may be added to the raw material of solid feed, stirred and pulverized with a mixer, and then compression molded into pellets, dried, and added with oil or fat.
  • the solid feed according to the present invention is not particularly limited as long as the soybean isoflavone-containing material is mixed substantially uniformly and the shape is maintained, and a wide variety of known forms can be adopted.
  • forms such as granules, crumbles, dry pellets, and extruder pellets
  • forms such as semi-solid feed, hydrous feed, and unformed feed are also included in the solid feed according to the present invention.
  • powdered soy isoflavones are added to the raw material of the solid feed, stirred and crushed with a mixer, and then pelletized using a granulator (extruder) under high temperature and high pressure.
  • the solid feed When forming the solid feed into pellets, the solid feed may be manufactured so that it becomes sedimentary.
  • the means for producing the sedimentary solid feed a wide variety of known means can be employed and there is no particular limitation.
  • the use of sedimentary solid feed makes it easier for sturgeon to find food, allows for proper feeding, and prevents water from deteriorating due to leftover food.
  • Components other than soybean isoflavones in the solid feed are not particularly limited, as long as they are preferred by the fish species to which they are applied and are suitable for the purpose and use, such as growth and growth, and a wide range of known components can be used.
  • animal feed fish meal, krill meal, etc.
  • grains wheat flour, starch, dextrin, processed soybeans, etc.
  • vegetable oil meal soybean oil meal, corn gluten meal, etc.
  • grains rice bran oil meal, etc.
  • oils and fats Contains 40-60% crude protein, 2-15% crude fat, 1-8% crude fiber, 5-20% crude ash, 0.5-4.0% calcium, 0.5-4.0% phosphorus, etc.
  • the composition may include.
  • the fish meal in the feed a wide variety of known ones can be used, and it is not particularly limited, but for example, it may be a powder obtained by processing sardines, mackerel, herring, horse mackerel, etc.
  • the fishmeal of other fish species may be used, or a mixture of fishmeal of a plurality of fish species may be used. It can be selected appropriately by considering the species of fish, the type of sturgeon, the growth condition, the cost, etc.
  • vitamin A such as vitamin A, vitamin D3 , vitamin E , vitamin B1, vitamin B2 , vitamin B6 , vitamin B12 , vitamin C, vitamin K3 , pantothenic acid, nicotinic acid, biotin, folic acid, choline, inositol , ferrous fumarate, copper sulfate, zinc sulfate, manganese sulfate, cobalt sulfate, magnesium sulfate, calcium iodate, calcium phosphate, sodium dihydrogen phosphate, astaxanthin, BHT, ethoxyquin, yeast extract, betaine, kelp powder, green tea powder , licorice extract, marigold petal extract, lactic acid bacteria, butyric acid bacteria, digestive enzymes, dried vegetables, and other ingredients that enhance the growth efficiency of sturgeon may be appropriately contained.
  • the present invention includes at least all of the sturgeon breeding methods in which the sturgeon ingests the solid feed described above. It also includes all sturgeon production methods that include at least the step of ingesting the solid feed described above, as well as methods of inducing feminization of genetic male sturgeons that include the step of ingesting the solid feed described above.
  • the time to start feeding the solid feed described above is not particularly limited as long as it is a time when it is possible to induce feminization of genetic males by making the sturgeon ingest genistein.
  • the period of feeding the solid feed described above is not particularly limited as long as it is a period in which genetic male sturgeon can be induced to become female by ingesting genistein.
  • the feeding method and frequency are not particularly limited, as long as the feeding can be continued without interruption during the feeding period, and a wide range of known feeding methods can be adopted. For example, use a food timer to feed the fish 1 to 15 times per day, 3 to 7 days a week, at a daily feeding rate of 2 to 3% of the fish's body weight (for example, 210 mg to 7,200 mg per day). may be fed.
  • the type of sturgeon that is the object of the present invention is not particularly limited as long as it belongs to the order Sturgeon (scientific name: "Acipenseri formes").
  • the sturgeon according to the present invention includes Sturgeon sturgeon, Siberian sturgeon, Russian sturgeon, Sturgeon sturgeon, Mikado sturgeon, Daurian sturgeon, Amur sturgeon, and the like.
  • the Bestel species matures relatively early and has medium-sized eggs, making it possible to mass-produce female sturgeon and caviar easily and efficiently. can.
  • the sturgeon is any of the Rikado sturgeon, Daurian sturgeon, or Amur sturgeon, it is a species that comes to Japan (Hokkaido), and the size of the egg grain is medium to large, so it is also possible to There is a possibility that unique species can be easily and efficiently reproduced and even mass-produced.
  • the sturgeon is a Siberian sturgeon, it matures relatively quickly and is relatively easy to raise and breed, so female sturgeon and caviar can be mass-produced easily and efficiently. Instead, it is possible to mass-produce original species of sturgeon that are in high demand.
  • Example 1 an attempt was made to produce a solid feed in which soybean isoflavones containing genistein were almost uniformly mixed.
  • a soybean isoflavone-containing product was produced from soybean seeds. After removing foreign matter from the soybean seeds, washing them, and drying them in the sun, the seeds were ground and sieved through an 8 mm mesh to obtain a generally uniform ground soybean seeds.
  • the pulverized product was immersed in an ethanol solution at 70°C for 2 hours to extract the eluted components, and the extraction procedure was repeated four times to obtain an ethanol extract.
  • the ethanol extract was placed in an evaporator, and the temperature inside the evaporator was adjusted to 60 to 65°C while the atmospheric pressure was lowered to 630 mmHg or less to evaporate ethanol and the like, thereby concentrating the ethanol extract.
  • the concentrated ethanol extract was hydrolyzed by adding aqueous hydrochloric acid to a final concentration of 10% under conditions of 50 to 55°C, followed by aqueous ethanol extraction with 70% ethanol and passing through a 5 ⁇ m filter.
  • the soybean isoflavone extract was placed in an evaporator, and while the temperature inside the evaporator was adjusted to 60 to 65°C, the atmospheric pressure was lowered to 630 mmHg or less to evaporate ethanol and other substances and concentrate.
  • the obtained concentrated soy isoflavone extract is washed with pure water, filtered, vacuum dried at 80 to 90°C, and the dried product is crushed to obtain a soy isoflavone-containing powder with a weight of approximately 1/180 of the raw material (soybean seeds). was gotten.
  • Analysis of the obtained soybean isoflavone-containing material revealed that more than 80% by weight of the powder components were soybean isoflavones, all of which were in the aglycone type. Furthermore, the amount of genistein contained in the obtained soybean isoflavone-containing material was 40% by weight.
  • the energy content in 100g of the obtained soybean isoflavone content is 395kcal, protein 5.4g, fat 0.4g, soybean isoflavone and carbohydrate 92.4g, sodium 22mg, salt 0.1g (sodium conversion method), moisture 1.0g, ash 0.8g Met.
  • the solid feed for sturgeon is formed into approximately spherical shapes, and the solid feed with genistein content of 500 mg/kg and 1,500 mg/kg is made into small diameter (approximately 1.5 mm) and medium diameter (approximately 1.5 mm) and medium diameter ( Three sizes were manufactured: approximately 2.0 mm) and large diameter (approximately 3.4 mm).
  • Example 2 the genistein content of the solid feed produced in Example 1 was measured immediately after production and 6 months after production.
  • Example 1 each solid feed with a genistein content of 500 mg/kg and 1,500 mg/kg, which was molded into a small diameter (about 1.5 mm) and a medium diameter (about 2.0 mm), was tested after 6 months from production. The genistein content was measured.
  • the genistein content immediately after manufacture is 520 mg/kg for both small and medium diameter products with genistein adjusted to a low concentration (theoretical value: 500 mg/kg), and 520 mg/kg when genistein is adjusted to a high concentration.
  • the adjusted value (theoretical value: 1,500 mg/kg) was 1,500 mg/kg. From this result, it was confirmed that no reduction in genistein content occurred during the manufacturing process, and that a solid feed containing the desired amount of genistein could be manufactured by the solid feed manufacturing method by incorporating soybean isoflavones.
  • Example 3 the solid feed produced in Example 1 was fed to sturgeon to test whether genetic male sturgeon could be induced to become female.
  • the gonad morphology was histologically observed, and the developmental stage of the gonads was determined.
  • signs of ovarian lamina formation were observed in six genetic males in the group fed 500 mg/kg of genistein, with the exception of one individual that could not be observed.
  • Feminization induction was suggested in 6 animals.
  • the ovary formation process was observed in the other four individuals, except for one individual that could not be observed, and four of the five genetic males were observed. This suggested that feminization was induced.
  • Example 4 the dissolution of genistein into water in the solid feed produced in Example 1 was investigated.
  • Example 1 As a solid feed, in addition to (1) the solid feed produced in Example 1 (a solid feed (mixed feed) in which soybean isoflavones containing genistein are almost uniformly mixed), (2) genistein was mixed with ethanol as a comparative example. (3) Solid feed in which the soybean isoflavone-containing material in Example 1 was spread with ethanol, (4) Solid feed in which the soybean isoflavone-containing material in Example 1 was spread in water, (5) Example 1 A solid feed containing soybean isoflavones was prepared. Both were prepared as small diameter (approximately 1.5 mm) feeds with the same ingredients except soy isoflavones or genistein, and the genistein content was 1,500 mg/kg.
  • Example 5 changes over time in blood genistein levels of sturgeon fed the solid feed produced in Example 1 were verified.
  • Example 1 solid feed (mixed feed) in which soybean isoflavones containing genistein were mixed almost uniformly
  • soybean isoflavone-containing material in Example 1 was powdered.
  • a spread solid feed (spread feed) was prepared.
  • Bestel sturgeon (average fish weight 321 g) were divided into two groups, one group received mixed feed, and the other group (comparative example) received spread feed, each containing 37.5 mg of soy isoflavones/kg fish weight.
  • Feed a soy isoflavone mixed feed containing 0.375% soy isoflavone/feed to give a weight of 1% of the fish
  • collect blood at a predetermined time after the complete meal collect 1, 3, 6, Blood samples were obtained after 12, 24, and 48 hours.
  • blood samples were obtained from individuals fed a diet to which no soy isoflavones were added.
  • Figure 1 is a graph showing the change over time in the amount of genistein in the blood when the solid feed produced in Example 1 was fed.
  • the vertical axis represents the amount of genistein in the blood (unit: ⁇ g/mL)
  • the line for "mixed feed” represents the amount of genistein in the blood when fed the solid feed produced in Example 1.
  • the ⁇ spread feed'' line represents the change over time in the amount of genistein in the blood when the solid feed in which the soybean isoflavone-containing material was powder-spread in Example 1 was fed.
  • Example 6 the solid feed produced in Example 1 (solid feed in which soybean isoflavones containing genistein were mixed almost uniformly (mixed feed)) and the solid feed prepared by powder-spreading the soybean isoflavone-containing material in Example 1 were prepared. The feminization inducing efficiency of feed (spread feed) for sturgeon was compared.
  • Bestel sturgeon were fed a soybean isoflavone-mixed diet for about 6 months, 6 days a week, starting when the fish weighed approximately 6 to 7g, and then switched to a regular diet (feed that does not contain soybean isoflavones). The breeding was continued until the fish grew to a weight of approximately 300 g.
  • the soybean isoflavone mixed feed contained the solid feed produced in Example 1 (mixed feed, small diameter (approximately 1.5 mm) and medium diameter (approximately 2.0 mm), genistein content 500 mg/kg), or as a comparative example, A solid feed prepared by spreading the soybean isoflavone-containing material in Example 1 (spread feed, small diameter (approximately 1.5 mm) and medium diameter (approximately 2.0 mm), genistein content 500 mg/kg) was used.
  • genomic DNA was sequentially extracted from each fin in the same manner as in Example 3, and genetic sex was determined using the PCR method.
  • the morphology of the gonads was histologically observed, and the sexes were determined based on the developmental stage of the gonads.
  • Example 5 is a graph showing changes over time in blood genistein levels when the solid feed produced in Example 1 was fed in Example 5.

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Abstract

【課題】簡易、低廉かつ効率的に雌チョウザメを大量生産する手段の提供。　【解決手段】、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物が略均一に混ぜ込まれた固形飼料を摂取させるチョウザメ飼育方法を提供する。この固形飼料を、孵化後14～120日目の時期から2～10か月の期間に亘って摂取させることにより、遺伝的に雌雄約半数ずつであった養殖個体のほぼ全個体を雌又は雌化誘導された個体として飼育することができるため、キャビア生産の利用価値の高い雌チョウザメ（遺伝的雌の個体及び遺伝的雄が雌化誘導された個体）を効率的に生産することが可能となる。

Description

チョウザメ飼育方法、チョウザメ生産方法、並びにチョウザメ用固形飼料
　本発明は、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物が略均一に混ぜ込まれた固形飼料を摂取させるチョウザメ飼育方法、同工程を含むチョウザメ生産方法、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物が略均一に混ぜ込まれたチョウザメ用固形飼料などに関連する。
　チョウザメは、チョウザメ目（学名「Acipenseriformes」）に属する硬骨魚類の総称で、チョウザメ科（学名「Polyodontidae」）、ヘラチョウザメ科（学名「Acipenseriformes」）の2科で構成される。条鰭魚類の中でも原始的な一群で、しばしば古代魚として扱われ、ロシア、ヨーロッパ、アジア北中部、北アメリカなどで、主に河川に生息し、湖に下る種と海に下る種とに分かれる。ほとんどの種では、下向きに付いている口の横に左右2対のヒゲがあり、このヒゲで底の餌を探して食べる。
　チョウザメには、オオチョウザメ、シベリアチョウザメ、ロシアチョウザメ、コチョウザメ、ミカドチョウザメ、ダウリアチョウザメ、アムールチョウザメなどの種が知られる。このうち、オオチョウザメは、カスピ海、黒海などで見られ、体長6mにも達するが長寿でゆっくり成長し、性成熟までにも15～20年かかる。一方、コチョウザメは、ユーラシア大陸に生息する比較的小型のチョウザメで、全長は通常40cm程度であるが、性成熟まで4～5年と早熟である。なお、チョウザメは、かつて日本にも分布していたが、現在は絶滅したとされる。ミカドチョウザメ、ダウリアチョウザメ、アムールチョウザメは、日本（北海道）に来遊する北方系チョウザメである。その他、養殖用として、オオチョウザメとコチョウザメの交雑種であるベステル種が広く普及している。ベステル種は、初回成熟期間が6～9年と比較的早熟である。
　チョウザメの卵（卵巣をほぐしたもの）の塩漬けは、高級食材・キャビアとして知られる。一般的に、卵の粒が大きい方が、キャビアのブランド的価値は高い。オオチョウザメの卵は、卵の粒が大きく、ブランド的価値が最も高いキャビアとして知られる。ミカドチョウザメ、ダウリアチョウザメも、卵の粒が大きく、アムールチョウザメは卵の粒の大きさは中程度である。一方、コチョウザメは、早熟であるものの、卵の粒の大きさは小さい。なお、交雑種であるベステル種は、比較的早熟であるにもかかわらず、卵の粒の大きさは中程度である。
　キャビアは、トリュフ、フォアグラと並び、世界三大珍味の一つであり、高級食材として世界的に人気が高い一方、現在、チョウザメ目の種は全てワシントン条約の規制対象となっており、野生チョウザメの捕獲が禁止されている。そのため、世界各国では、キャビアを生産するため、チョウザメの飼育・養殖が広く行われている。例えば、特許文献1には、チョウザメの受精卵と、飼育水の入った透光性の袋又は容器と、チョウザメ飼育用水槽と、サーモスタットと、照明器具、及び搬送容器とからなる、チョウザメを飼育することを特徴とするチョウザメ飼育キットが記載されている。
　ここで、本発明に関わる事項として、大豆イソフラボンについて、以下説明する。
　大豆イソフラボンは、主に大豆の胚芽などに多く含まれる、イソフラボンを基本骨格としたフラボノイド系化合物の総称である。大豆イソフラボンは、グリコシド型（配糖体；糖と共有結合した構造）、アグリコン型（非配糖体；配糖体の糖部分が脱離した構造）、配糖体のアセチル化体、及び、配糖体のマロニル化体の4つに分類される。各分類にそれぞれ3種類の化合物が知られ、大豆イソフラボンとして、合計12種類の化合物が知られている。そのうち、グリコシド型の3つの大豆イソフラボンが、ゲニスチン、ダイジン、グリシチンであり、それらのアグリコン型（糖部分が脱離したもの）が、それぞれ、ゲニステイン、ダイゼイン、グリシテインである。原料大豆などの種類、抽出・精製・処理方法などにより、各化合物の組成・含有量は変動する。
　大豆イソフラボンの製造方法として、例えば、特許文献2には、大豆胚芽を水溶性有機溶媒により抽出濃縮後、疎水性有機溶媒により親油性成分を除去し、再び濃縮、精製及び乾燥するイソフラボン化合物の製造法が、特許文献3には、微生物を用いた発酵により加水分解された大豆を非極性溶媒により脱脂し、その乾燥脱脂生成物を極性溶媒で抽出する工程などを含む、イソフラボンアグリコン濃度を高めたイソフラボン化合物濃縮物の製造法が、特許文献4には、醤油粕又は醤油油から有機溶媒でイソフラボン化合物を抽出するイソフラボン化合物の製造法が、それぞれ記載されている。また、大豆イソフラボン中の特定の化合物を分離する手段として、例えば、特許文献5には、溶剤を用いてイソフラボン混合物から高純度のゲニステインを分離する手段が、特許文献6には、ゲニスチン含有率の高いイソフラボン組成物を得る方法が、特許文献7には、大豆の水抽出液から取得したマロニルイソフラボン配糖体溶液を加熱処理及び／又はアルカリ処理してイソフラボン配糖体溶液とし、これを酸処理又は酵素処理してイソフラボンアグリコンとすることが、それぞれ開示されている。
　大豆イソフラボンは、女性ホルモン（エストロゲン）と化学構造が近似しており、植物性エストロゲンとも呼ばれる。そして、アグリコン型となっている大豆イソフラボンは、エストロゲン様の作用を有し、心臓病、更年期障害、骨粗鬆症、乳癌などの予防に効果があるとされている。
　その他、非特許文献1には、ロシアチョウザメに、ふ化の100日後からゲニステイン500mg/kg　feedを給餌した結果、30尾中27尾が雌となったことが記載されている。
特許4377312号公報 特開平11-263786号公報 WO1999/025138 特開平5-170756号公報 特開平7-173148号公報 特開2000-95792号公報 特開平8-283283号公報 Magdalena　Fajkowskaa,　et　al,　" Effect　of　genistein,　daidzein　and　coumestrol　on　sex-related　genes　expression　in　Russian　sturgeon　(Acipenser　gueldenstaedtii)",　Aquaculture　530　(2021)　735872.
　チョウザメの雌は、性成熟の後、卵をキャビアに供することができるため、利用価値が非常に高いのに対し、雄は、利用価値が低い。しかし、チョウザメの遺伝的性決定は強固であり、養殖した場合、種苗の性比はほぼ1:1となる。
　また、一般的に、チョウザメは長寿であるが性分化が遅く、バイオプシーで生殖腺を目視しても、性の判別が可能になるまでに、凡そ1年位かかる。外観からの雌雄判別もできない。
　そのため、チョウザメを養殖する場合、雄の利用価値が低いにもかかわらず、長期間にわたって、雄雌両方をほぼ同数ずつ養殖する必要がある。
　一方、キャビア生産のため、チョウザメの養殖が広く行われているが、キャビアは依然として高価である。キャビアをより安価に市場に供給するためには、簡易、低廉かつ効率的に雌チョウザメを大量生産する手段が必要である。
　そこで、本発明では、簡易、低廉かつ効率的に雌チョウザメを大量生産する手段を提供することなどを目的とする。
　本発明では、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物が略均一に混ぜ込まれた固形飼料を摂取させるチョウザメ飼育方法、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物が略均一に混ぜ込まれた固形飼料を摂取させる工程を含むチョウザメ生産方法、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物が略均一に混ぜ込まれたチョウザメ用固形飼料などを提供する。
　固形飼料を供給して飼育することにより、約半数の遺伝的雌のチョウザメをそのまま成長させることができる。また、固形飼料に、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物を含有させることにより、残りの約半数の遺伝的雄のチョウザメも雌化誘導できる。即ち、遺伝的に雌雄約半数ずつであった養殖個体のほぼ全個体を雌又は雌化誘導された個体として飼育することができるため、キャビア生産の利用価値の高い雌チョウザメ（遺伝的雌の個体及び遺伝的雄が雌化誘導された個体、以下同じ）を効率的に生産することが可能となる。
　また、本発明では、大豆イソフラボン含有物が混ぜ込まれた固形飼料を用いるため、長期間にわたる多数個体の同時飼育、及び、多数の遺伝的雄の個体の雌化誘導を、簡易かつ効率的に行うことができる。これにより、簡易かつ効率的に雌チョウザメを大量生産することができる。
　さらに、精製されたゲニステインではなく、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物を固形飼料に混ぜ込むため、固形飼料を比較的簡易かつ安価に製造することができる。これにより、簡易かつ低廉に雌チョウザメを大量生産することができる。
　本発明では、固形飼料の表面にゲニステイン（又は大豆イソフラボン）を展着するのではなく、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物を略均一に混ぜ込む形態であるため、大豆イソフラボンを含有した固形飼料を簡易かつ大量に製造できる。これにより、雌化誘導を実現しつつ飼料コストを低減できるため、雌チョウザメの大量生産も低廉化することができる。
　また、ゲニステインなどを展着するのではなく、略均一に混ぜ込む形態の場合、給餌の際に、ゲニステインなどを展着させるなどの養殖現場での追加の作業は必要ない。従って、ゲニステインを含有する大豆イソフラボン含有物を予め固形飼料に混ぜ込むことにより、養殖現場では、ゲニステインを供与しない場合と同程度の作業負担で効率的に給餌でき、かつゲニステインなどを展着させる場合と比較して、余計な作業負担を増やすことなく、効率的に、チョウザメにゲニステインを供与することができる。
　その他、大豆イソフラボン含有物を固形飼料に略均一に混ぜ込む形態の場合、飼料製造後の保管時に、ゲニステインがあまり外気に曝されないため、固形飼料の表面にゲニステイン（又は大豆イソフラボン）を展着させた場合と比較して、ゲニステインの脱落・変質・劣化を抑制でき、飼料を一度に大量製造しても、長期間保存できる有利性がある。加えて、大豆イソフラボンを固形飼料に略均一に混ぜ込む形態の場合、固形飼料の表面にゲニステイン（又は大豆イソフラボン）を展着させた場合と比較して、給餌時に飼料を水中に入れた際におけるゲニステインの拡散・ロスを極力低減できるため、ゲニステインを無駄なく効率的にチョウザメに供給できる有利性もある。
　本発明では、粉砕大豆種子のエタノール抽出物を酸水溶液で加水分解させた後乾燥させることによって得られた大豆イソフラボン含有物を利用してもよい。その場合、原料に大豆種子自体を粉砕したものを用いるため、原料を簡易かつ安価に調達することが可能である。また、粉砕大豆種子のエタノール抽出物を酸水溶液で加水分解させる工程自体も比較的簡易な設備・手順で行うことができ、かつこの工程の場合、大量調製も可能である。さらに、エタノール抽出物を酸水溶液で加水分解させることにより、グリコシド型の大豆イソフラボンを簡易、低廉かつ効率的にアグリコン型に変換させることができ、アグリコン型大豆イソフラボンの割合を大幅に高めることができる。従って、簡易、低廉かつ効率的に、ゲニステインを含有する大豆イソフラボン含有物を大量調製することが可能であり、それにより、ゲニステインを含有した固形飼料を比較的簡易かつ安価に製造することが可能であり、簡易かつ低廉に雌チョウザメを大量生産することが可能となる。
　この方法で得られた大豆イソフラボン含有物では、ゲニステインを含むアグリコン型大豆イソフラボンが主成分として含有し、他にタンパク質・炭水化物などの成分も、完全に除去されずに含有する。本発明者らの検討結果によれば、従来のように高度精製されたイソフラボン組成物を用いなくても、この大豆イソフラボン含有物を採用することで、充分かつ良好に、遺伝的雄のチョウザメを雌化誘導でき、チョウザメの餌への嗜好性、餌の栄養性、チョウザメの成長などにも別段影響を与えない。従って、この大豆イソフラボン含有物を採用することで、精製などの手順を大幅に簡略化でき、雌化誘導できる固形飼料を非常に簡易かつ安価に製造できる。また、本発明で得られた大豆イソフラボン含有物は、原則的に全て大豆種子に元々含まれていた成分であるため、安全性が高い。加えて、この大豆イソフラボン含有物には、タンパク質・炭水化物などの成分が残存するため、その分、栄養価も高い。従って、この大豆イソフラボン含有物を固形飼料に混ぜ込むことにより、ゲニステインを含む大豆イソフラボンだけでなく、その他の栄養成分も固形飼料に同時に混ぜ込むことができる。これにより、固形飼料中の栄養分を増強させ、チョウザメの成長を促進させることができる有利性もある。
　その他、チョウザメは一度に食べる量が少なく、給餌しても餌を残しやすいが、固形飼料で供給することで、餌を残すことなく、摂食させることができるため、給餌及びゲニステインの供給を適正に行うことができ、食べ残しによる水の劣化も抑止できる利点がある。
　また、沈降性の固形飼料を採用する場合、給餌後、固形飼料が水底に沈む。チョウザメは、水底の餌を食べるため、沈降性の固形飼料にすることにより、チョウザメが餌を見つけやすくなり、給餌及びゲニステインの供給を適正に行うことができ、食べ残しによる水の劣化も抑止できる。
　本発明により、簡易、低廉かつ効率的に雌チョウザメを大量生産できる。
　＜本発明に係るチョウザメ用固形飼料について＞
　本発明は、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物が略均一に混ぜ込まれた固形飼料などを広く包含する。
　例えば、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物が略均一に混ぜ込まれたチョウザメ用固形飼料を、孵化後14～120日目の時期から一定期間に亘って給餌することで、チョウザメの遺伝的雄の雌化を誘導することができる。なお、本発明に係る固形飼料は、チョウザメ用（チョウザメの飼育、チョウザメの雌化誘導、チョウザメ生産など）として適用可能であるが、それのみに狭く限定されず、目的・用途に応じて、適宜、魚類用固形飼料若しくは養魚用固形飼料として利用してもよい。
　例えば、粉砕大豆種子のエタノール抽出物を酸水溶液で加水分解させた後乾燥させることにより、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物の粉末を得ることができる。具体的には、例えば、(1)大豆種子を粉砕する工程、(2)その粉砕物からエタノール抽出により、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物を抽出する工程、(3)その抽出物又はその濃縮物を酸水溶液で加水分解させる工程、(4)その加水分解物又はその濃縮物を乾燥させ、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物の粉末を得る工程、を少なくとも含む方法により、調製することができる。なお、本発明は、例えばその他の工程・手段などが含まれることによっては、狭く限定されない。
　原料となる大豆種子は、少なくともゲニステインなどを含有した種子であればよく、公知のものを広く採用でき、特に限定されない。大豆種子を粉砕する方法も、少なくとも、エタノール抽出がしやすい程度に粉砕されていればよく、公知の手段を広く採用でき、特に限定されない。また、適宜、原料の大豆種子に、異物除去、洗浄、乾燥などを施してもよい。
　エタノール抽出は、ゲニステインなどを含む成分を粉砕大豆種子から抽出する工程であり、目的の成分が抽出できればよく、公知の手段を広く採用でき、特に限定されない。例えば、所定条件でエタノールに粉砕大豆種子を浸し、目的の成分を溶出させた後、残渣の固形成分を回収することで、目的の成分が溶出したエタノール溶液を得ることができる。エタノール抽出の条件は、公知の手段を広く採用でき、特に限定されない。また、所定条件でエタノール抽出を複数回行ってもよい。得られたエタノール抽出物を、公知の手段により、濃縮してもよい。
　エタノール抽出物又はその濃縮物を酸水溶液で加水分解することにより、簡易、低廉かつ効率的に、グリコシド型の大豆イソフラボンをアグリコン型に変換させ、アグリコン型大豆イソフラボンの割合を大幅に高めることができる。酸水溶液は、グリコシド型大豆イソフラボンを加水分解できるものであればよく、特に限定されない。例えば、塩酸水溶液を用いてもよい。得られた加水分解物を、例えば、水性エタノール抽出に供し、グリコシドを抽出除去してもよい。また、得られた加水分解物（又はグリコシド除去産物）を、公知の手段により、濃縮してもよい。
　得られた加水分解物又はその濃縮物は、例えば、純粋洗浄・ろ過などの後、公知の手段により乾燥させる。例えば、乾燥産物を粉砕し、ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物の粉末としてもよい。
　固形飼料中におけるゲニステイン含有量は、好適には、飼料1kg当たり100～3,500mgであり、より好適には、飼料1kg当たり200～3,000mgであり、最も好適には、飼料1kg当たり300～2,500mgである。飼料1kg当たり3,500mgを超えると、雌化誘導が過剰となり、卵黄組織などに異常をきたす場合があり、また、大豆イソフラボンが略均一に混ぜ込んだ場合であっても、消化器官に疲労・傷害を与える可能性がある。
　本発明に係る固形飼料では、大豆イソフラボン含有物が略均一に混ぜ込まれている。これにより、ゲニステインの脱落・変質・劣化を抑制でき、飼料を一度に大量製造しても、長期間保存できる。また、給餌時に飼料を水中に入れた際におけるゲニステインの拡散・ロスを極力低減できる。
　固形飼料に大豆イソフラボン含有物を略均一に混ぜ込む方法は、公知の手段を広く採用でき、特に限定されない。例えば、固形飼料の原料に、粉末状大豆イソフラボン含有物を添加し、ミキサーで撹拌・粉砕した後、ペレット状に圧縮成形し、乾燥処理、油脂添加を施し、製造してもよい。
　本発明に係る固形飼料は、大豆イソフラボン含有物が略均一に混ぜ込まれ、かつ形状が保持されたものであればよく、その形態は、公知のものを広く採用でき、特に限定されない。例えば、顆粒、クランブル、ドライペレット、エクストルーダーペレットなど形態の他、半固形飼料、含水飼料、不成型飼料などの形態も、本発明に係る固形飼料に含まれる。固形飼料がエクストルーダーペレットである場合、例えば、固形飼料の原料に、粉末状大豆イソフラボンを添加し、ミキサーで撹拌・粉砕した後、造粒機（エクストルーダー）を用いて高温・高圧下でペレット状に圧縮成形・造粒し、乾燥処理、油脂添加を施し、製造する。エクストルーダーペレットとすることにより、均質で高品質の固形飼料を簡易かつ低廉に大量製造できるほか、固形飼料の消化吸収性も高めることができる。
　固形飼料をペレット状に成型する際には、例えば、径0.2～4.0mmになるように成型する。これにより、遺伝雄のチョウザメを雌化誘導する時期におけるチョウザメの成長度合いに適した大きさの飼料を給餌できるため、餌を残すことなく給餌を適正に行うことができる。
　固形飼料をペレット状に成型する際、固形飼料が沈降性になるように製造してもよい。沈降性固形飼料の製造手段については、公知の手段を広く採用でき、特に限定されない。沈降性の固形飼料とすることにより、チョウザメが餌を見つけやすくなり、給餌を適正に行うことができ、食べ残しによる水の劣化も抑止できる。
　固形飼料中の大豆イソフラボン以外の成分については、適用する魚種が好んで食し、生育・成長など、目的・用途に適したものであればよく、公知のものを広く採用でき、特に限定されない。
　例えば、動物性飼料（魚粉、オキアミミールなど）、穀類（小麦粉、デンプン、デキストリン、加工処理大豆など）、植物性油粕類（大豆油粕、コーングルテンミールなど）、そうこう類（米ぬか油粕など）、油脂類（魚油など）などを含有し、粗タンパク質40～60％、粗脂肪2～15％、粗繊維1～8％、粗灰分5～20％、カルシウム0.5～4.0％、リン0.5～4.0％などを含む組成のものであってもよい。
　飼料中の魚粉については、公知のものを広く採用でき、特に限定されないが、例えば、イワシ、サバ、ニシン、アジなどを加工して得られた粉末であってもよい。また、それ以外の魚類の魚粉であってもよく、複数の魚種の魚粉が混合されたものであってもよい。魚種、チョウザメの種類、生育状態、コストなどを考慮し、適宜選択することができる。
　その他、例えば、ビタミンA、ビタミンD3、ビタミンE、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンK3、パントテン酸、ニコチン酸、ビオチン、葉酸、コリン、イノシトール、フマル酸第一鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸コバルト、硫酸マグネシウム、ヨウ素酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、アスタキサンチン、BHT、エトキシキン、酵母エキス、ベタイン、昆布粉末、緑茶粉末、甘草抽出物、マリーゴールド花弁抽出物、乳酸菌、酪酸菌、消化酵素、乾燥野菜など、チョウザメの生育効率を高める成分などが適宜含有されていてもよい。
　＜本発明に係るチョウザメ飼育・生産方法などについて＞
　本発明は、少なくとも、上述の固形飼料を摂取させるチョウザメ飼育方法をすべて包含する。また、少なくとも、上述の固形飼料を摂取させる工程を含むチョウザメ生産方法、並びに上述の固形飼料を摂取させる工程を含む、遺伝的雄のチョウザメの雌化誘導方法などもすべて包含する。
　上述の固形飼料を孵化後の所定の時期から一定期間摂取させることにより、チョウザメを飼育するとともに、遺伝的雄のチョウザメの雌化を誘導することができ、それにより、簡易、低廉かつ効率的に雌チョウザメを大量生産できる。
　上述の固形飼料の給餌開始時期は、チョウザメにゲニステインを摂取させることによって遺伝的雄個体を雌化誘導することが可能な時期であればよく、特に限定されない。例えば、孵化後14～120日目から給餌を開始するのが好適であり、孵化後28～100日目から給餌を開始するのがより好適である。
　上述の固形飼料の給餌期間は、チョウザメにゲニステインを摂取させることによって遺伝的雄個体を雌化誘導することが可能な期間であればよく、特に限定されない。例えば、給餌開始時期から2～10か月の期間に亘って摂取させるのが好適であり、給餌開始時期から4～8か月の期間に亘って摂取させるのが好適である。
　給餌方法・頻度については、摂取させる期間中、間断なく摂取させ続けることができればよく、公知のものを広く採用でき、特に限定されない。例えば、フードタイマーなどを用いて、1週間のうちの3～7日、1日当たり1～15回、日間給餌率が魚体重の2～3%（例えば、1日当たり210mg～7,200mg）となるように給餌してもよい。
　なお、本発明の対象となるチョウザメの種類は、チョウザメ目（学名「Acipenseri　formes」）に属するものであればよく、特に限定されない。例えば、オオチョウザメ、シベリアチョウザメ、ロシアチョウザメ、コチョウザメ、ミカドチョウザメ、ダウリアチョウザメ、アムールチョウザメなども本発明に係るチョウザメに含まれる。例えば、前記チョウザメが、ベステル種である場合、ベステル種は比較的早熟であり、卵の粒の大きさも中程度であるため、簡易かつ効率的に雌チョウザメ、及び、キャビアを大量生産することができる。また、前記チョウザメが、ミカドチョウザメ、ダウリアチョウザメ、アムールチョウザメのいずれかである場合、日本（北海道）に来遊する種であり、卵の粒の大きさも中～大型であるため、日本及びその近隣固有の種を簡易かつ効率的に再生、さらには大量生産することができる可能性がある。前記チョウザメが、シベリアチョウザメである場合、成熟が比較的早く、飼育・繁殖も比較的容易であるため、簡易かつ効率的に雌チョウザメ、及び、キャビアを大量生産することができ、また、交雑種ではなくニーズの高い原種のチョウザメを大量生産できる。
　実施例1では、ゲニステインを含有した大豆イソフラボンが略均一に混ぜ込まれた固形飼料の製造を試みた。
　まず、大豆種子から大豆イソフラボン含有物を製造した。大豆種子から異物を除去し、それを洗浄し、日光乾燥した後、その種子を粉砕し、8mmメッシュでふるいにかけ、概ね均一な大豆種子粉砕物を得た。次に、その粉砕物を、70℃のエタノール液に2時間浸して溶出成分を抽出し、抽出手順を4回繰り返して、エタノール抽出物を得た。エタノール抽出物をエバポレーターに入れ、エバポレーター内の温度を60～65℃に調節しながら気圧を630mmHg以下に下げてエタノールなどを蒸発させ、エタノール抽出物を濃縮した。その濃縮エタノール抽出物に最終濃度10％となるように塩酸水溶液を加えて50～55℃条件下で加水分解し、70％エタノールで水性エタノール抽出し、5μmのフィルターを通過させた後、得られた大豆イソフラボンエキスを、エバポレーターに入れ、エバポレーター内の温度を60～65℃に調節しながら気圧を630mmHg以下に下げてエタノールなどを蒸発させ、濃縮した。得られた濃縮大豆イソフラボンエキスを純水で洗浄し、ろ過した後、80～90℃で真空乾燥し、乾燥物を粉砕し、原料（大豆種子）の約1/180重量の大豆イソフラボン含有物粉末が得られた。得られた大豆イソフラボン含有物を分析した結果、粉末成分中、80重量％以上が大豆イソフラボンで、全てアグリコン型であった。また、得られた大豆イソフラボン含有物に含まれるゲニステイン量は40重量％であった。その他、得られた大豆イソフラボン含有物100gにおけるエネルギー量は395kcal、タンパク質5.4g、脂質0.4g、大豆イソフラボン及び炭水化物92.4g、ナトリウム22mg、食塩0.1g（ナトリウム換算法）、水分1.0g、灰分0.8gであった。
　動物性飼料（魚粉50％）、植物性油粕類（大豆油粕、コーングルテンミール）21％、穀類（小麦粉、加熱処理大豆、デキストリン）17％、そうこう類（米ぬか油粕）7％、その他（魚油、昆布粉末、緑茶粉末、リン酸カルシウム）5％の配合割合で混合した後、ビタミンA、ビタミンD3、ビタミンE、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンK3、パントテン酸、ニコチン酸、ビオチン、葉酸、コリン、イノシトール、フマル酸第一鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸コバルト、硫酸マグネシウム、ヨウ素酸カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、アスタキサンチン、BHT、エトキシキンを微量ずつ添加し、さらに、ゲニステイン含有量が飼料1kg当たり500mg又は1,500mgになるように、得られた大豆イソフラボン含有物の粉末を添加した。
　それらの混合粉末をミキサーで撹拌・粉砕した後、造粒機（エクストルーダー）を用いて高温・高圧下でペレット状に圧縮成形・造粒し、乾燥処理し、植物性油脂を添加して、チョウザメ用の固形飼料を製造した。
　チョウザメ用の固形飼料は略球形に成形し、ゲニステイン含有量500mg／kgと1,500mg／kgの各固形飼料について、チョウザメの成長段階に合わせるため、それぞれ、小口径（約1.5mm）、中口径（約2.0mm）および大口径（約3.4mm）の3サイズを作製した。
　実施例2では、実施例1で製造した固形飼料について、製造直後、及び、製造から6か月経過時におけるゲニステイン含有量を測定した。
　実施例1において、小口径（約1.5mm）及び中口径（約2.0mm）に成形した、それぞれ、ゲニステイン含有量500mg／kgと1,500mg／kgの各固形飼料について、製造から6か月経過後におけるゲニステイン含有量を測定した。
　結果を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表1に示す通り、製造直後のゲニステイン含有量は、小口径・中口径のいずれも、ゲニステインを低濃度に調整したもの（理論値：500mg／kg）では、520mg／kg、ゲニステインを高濃度に調整したもの（理論値：1,500mg／kg）では、1,500mg／kgであった。この結果より、製造工程においてゲニステイン含有量の減少などは生じず、大豆イソフラボンを混ぜ込むことによる固形飼料製造方法によって、所望量のゲニステインを含有した固形飼料を製造できることを確認した。
　また、表1に示す通り、ゲニステイン含有量が低濃度の場合、製造から6か月経過後には、製造時の520mg／kgから500mg/kgへと、約4％の低下がみられたものの、製造から6か月経過しても、ゲニステイン含有量の減少はほとんど見られず、概ね安定していることが確認された。また、ゲニステイン含有量が高濃度の場合、製造から6か月経過しても、ゲニステイン含有量の減少は見られず、安定していることが確認された。
　この結果は、本発明に係る固形飼料が長期間保存できるものであることを示し、この固形飼料を簡易かつ低廉に大量製造できることを示唆する。
　実施例３では、実施例1で製造した固形飼料をチョウザメに給餌して、遺伝的雄のチョウザメを雌化誘導できるか、試験した。
　ふ化したベステル種のチョウザメ20匹を10匹ずつ二群に分け、各群に、ふ化から66日後から、それぞれゲニステイン含有量500mg／kg又は1,500mg／kgの固形飼料の給餌を開始した。給餌開始時におけるベステル種のチョウザメの平均全長は9cm、平均体重は4.1gであった。
　給餌開始から140日間、フードタイマーを用いて、1週間のうちの6日、1日10回、日間給餌率が魚体重の2～3%（1回あたり210mg～7,200mg）となるように給餌した。その結果、平均全長は25cm、体重は86gまで成長した。140日の飼育後、全個体から鰭及び生殖腺をサンプリングした。
　サンプリングした各鰭からゲノムDNAを抽出し、W染色体特異プライマーを使用してPCRを行い、遺伝的雌雄（ZW/ZZ）を判定した。その結果、ゲニステイン含有量500mg／kgを給餌した群では、10匹中7匹が、ゲニステイン含有量1,500mg／kgを給餌した群では、10匹中5匹が、遺伝的雄の個体であることが分かった。
　遺伝的雌雄判定により遺伝的雄と判定された個体について、その生殖腺の形態を組織学的に観察し、生殖腺の発達段階を判定した。その結果、ゲニステイン含有量500mg／kgを給餌した群の遺伝的雄は、観察できなかった1個体を除き、それ以外の6個体で、卵巣薄板形成の兆候が観察され、遺伝的雄7匹中6匹で、雌化誘導が示唆された。また、ゲニステイン含有量1,500mg／kgを給餌した群の遺伝的雄は、観察できなかった1個体を除き、それ以外の4個体で、卵巣形成過程が観察され、遺伝的雄5匹中4匹で、雌化誘導が示唆された。
　実施例４では、実施例1で製造した固形飼料におけるゲニステインの水への溶出性を検討した。
　固形飼料として、(1)実施例1で製造した固形飼料（ゲニステインを含有した大豆イソフラボンが略均一に混ぜ込まれた固形飼料（混込飼料））のほか、比較例として、(2)ゲニステインをエタノール展着した固形飼料、(3)実施例1における大豆イソフラボン含有物をエタノール展着した固形飼料、(4)実施例1における大豆イソフラボン含有物を水展着した固形飼料、(5)実施例1における大豆イソフラボン含有物を粉末展着した固形飼料を準備した。いずれも大豆イソフラボン又はゲニステイン以外は同一成分の小口径（約1.5mm）の飼料として作製し、ゲニステイン含有量1,500mg／kgになるようにした。
　ビーカーに、水400mLと固形飼料30g（ゲニステイン含有量45mg）を入れて5分間撹拌し、その水を試料とした。試料とした水について、それぞれ、HPLCにより、ゲニステインの水中濃度を分析した（最大溶出理論値：水100g当たり11.25mg、定量下限値：水100g当たり0.5mg）。
　その結果を表2に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表2に示す通り、(1)の実施例1で製造した固形飼料の場合、水に入れて5分間撹拌した後も、固形成分中のゲニステインが水に溶出しなかった（定量下限値以下であった）のに対し、(2)のゲニステインを固形飼料に直接エタノール展着した場合には、水に入れて5分間撹拌したのみで、水100g換算で、1.4mg（固形飼料中のゲニステインの12.4％）が水に溶出し、(3)の大豆イソフラボンを固形飼料にエタノール展着した場合でも、0.7mg（固形飼料中のゲニステインの6.2％）が溶出した。
　この結果は、(2)と(3)の比較において、固形飼料にゲニステインを直接含有させるよりも、大豆イソフラボン含有物として含有させた方が、ゲニステイン成分の水への溶出を少なくでき、かつ固形飼料中にゲニステイン成分を長時間保持させることができることを示す。また、(1)と(3)～(5)の比較において、固形飼料にゲニステインを直接含有させるのではなく、大豆イソフラボン含有物として含有させる場合、大豆イソフラボン含有物を展着させた固形飼料よりも、大豆イソフラボンが略均一に混ぜ込まれた固形飼料の方が、ゲニステイン成分の水への溶出を極力少なくでき、かつゲニステイン成分を固形飼料中により長時間保持させることができることを示す。
　上述の通り、チョウザメは一度に食べる量が少なく、給餌しても餌を残しやすい性質を有するため、餌が水中に給餌されてからチョウザメがその餌を食べ終えるまで、比較的長時間、餌が水中に留まることが想定される。そのため、その間に飼料中の成分が極力水中に溶出しないことが好ましい。それに対し、本実施例により、大豆イソフラボンが略均一に混ぜ込まれた固形飼料の場合、ゲニステイン成分の水への溶出を極力少なくでき、かつゲニステイン成分を固形飼料中により長時間保持させることができることが実証され、さらに、この固形飼料を用いることにより、ゲニステイン（又は大豆イソフラボン）のロスを極力減らし、確実かつ有効に遺伝的雄を雌化誘導できることが示唆された。
　実施例5では、実施例1で製造した固形飼料を給餌したチョウザメの血中ゲニステイン量の経時的変化を検証した。
　餌として、実施例1で製造した固形飼料（ゲニステインを含有した大豆イソフラボンが略均一に混ぜ込まれた固形飼料（混込飼料））、及び、比較例として、実施例1における大豆イソフラボン含有物を粉末展着した固形飼料（展着飼料）を準備した。
　ベステル種のチョウザメ（平均魚体重321g）を2群に分け、一方の群には混込飼料を、他方の群（比較例）には展着飼料を、それぞれ、大豆イソフラボンとして37.5mg/kg魚体重（大豆イソフラボンを0.375%/飼料となるよう添加した大豆イソフラボン混合餌を、魚体重1％となるように）給餌し、完食から所定時間経過時に採血し、完食から1、3、6、12、24、48時間後の血液サンプルを得た。その他、陰性対照として、大豆イソフラボンを添加していない餌を給餌した個体の血液サンプルを得た。血液サンプルごとに、それぞれ、4℃、3000×gで15分間遠心して血漿を分離し、LC/MS/MSで血漿中におけるゲニステイン含有量を計測した（n=3～4、定量限界：0.0800μg/mL、検出限界：0.240μg/mL）。
　結果を図1に示す。図1は、実施例1で製造した固形飼料を給餌した場合における血中ゲニステイン量の経時的変化を表すグラフで、図中の横軸は餌完食の何時間後の血液サンプルであるかを表し（単位：h（時間））、縦軸は血中のゲニステイン量（単位：μg/mL）を表し、「混込飼料」の折れ線は実施例1で製造した固形飼料を給餌した場合における血中ゲニステイン量の経時的変化を、「展着飼料」の折れ線は実施例1における大豆イソフラボン含有物を粉末展着した固形飼料を給餌した場合における血中ゲニステイン量の経時的変化を、それぞれ表す。
　図1に示す通り、実施例1で製造した固形飼料（混込飼料）を給餌した場合、実施例1における大豆イソフラボン含有物を粉末展着した固形飼料（展着飼料）と比較して、血中ゲニステイン量が高く、特に完食から3時間経過後以降、顕著な差がみられた。この結果より、大豆イソフラボンが略均一に混ぜ込まれた固形飼料を給餌することで、チョウザメに確実かつ効率的にゲニステインを摂取させることができることが示された。
　実施例6では、実施例1で製造した固形飼料（ゲニステインを含有した大豆イソフラボンが略均一に混ぜ込まれた固形飼料（混込飼料））と実施例1における大豆イソフラボン含有物を粉末展着した固形飼料（展着飼料）のチョウザメに対する雌化誘導効率を比較した。
　ベステル種のチョウザメに、魚体重約6～7g時点から、大豆イソフラボン混合餌を、約6か月間、週6日投与して飼育し、その後、通常飼料（大豆イソフラボンを含まない飼料）に切り替えて、魚体重300g程度に成長するまで飼育を継続した。大豆イソフラボン混合餌には、実施例1で製造した固形飼料（混込飼料、小口径（約1.5mm）及び中口径（約2.0mm）、ゲニステイン含有量500mg／kg）、又は、比較例として、実施例1における大豆イソフラボン含有物を粉末展着した固形飼料（展着飼料、小口径（約1.5mm）及び中口径（約2.0mm）、ゲニステイン含有量500mg／kg））を用いた。
　魚体重300g程度にまで成長した個体について、順次、実施例3と同様、各鰭からゲノムDNAを抽出してPCR法により遺伝的雌雄判定をした。そして、遺伝的雄と判定された個体について、その生殖腺の形態を組織学的に観察し、生殖腺の発達段階より、雌雄を判定した。
　その結果、実施例1で製造した固形飼料（混込飼料）を投与したチョウザメの場合、遺伝的雄と判定された個体7匹のうち6匹が雌化誘導されており、雌化率は86％であったのに対し、展着飼料を投与したチョウザメの場合、遺伝的雄と判定された個体11匹のうち5匹が雌化誘導され、雌化率は45％にとどまった。この結果より、大豆イソフラボン含有物を展着させた固形飼料よりも、大豆イソフラボンが略均一に混ぜ込まれた固形飼料の方が、実際に、個体レベルにおいて、より効率的にチョウザメを雌化誘導できることが示された。
実施例5において、実施例1で製造した固形飼料を給餌した場合における血中ゲニステイン量の経時的変化を表すグラフ。

Claims (7)

  1. 　ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物が略均一に混ぜ込まれた固形飼料を摂取させるチョウザメ飼育方法。
  2. 　前記固形飼料1kg当たりの前記ゲニステイン含有量が100～3,500mgである請求項1記載のチョウザメ飼育方法。
  3. 　孵化後14～120日目の時期から2～10か月の期間に亘って摂取させる請求項2記載のチョウザメ飼育方法。
  4. 　前記大豆イソフラボン含有物が、粉砕大豆種子のエタノール抽出物を酸水溶液で加水分解させた後乾燥させることによって得られた請求項1記載のチョウザメ飼育方法。
  5. 　前記チョウザメが、ベステル種、ミカドチョウザメ、ダウリアチョウザメ、アムールチョウザメ、シベリアチョウザメのいずれかである請求項1記載のチョウザメ飼育方法。
  6. 　ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物が略均一に混ぜ込まれた固形飼料を摂取させる工程を含むチョウザメ生産方法。
  7. 　ゲニステインを含有した大豆イソフラボン含有物が略均一に混ぜ込まれたチョウザメ用固形飼料。
     
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