WO2023249046A1 - ヒアルロン酸の構造を維持するための剤 - Google Patents

ヒアルロン酸の構造を維持するための剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2023249046A1
WO2023249046A1 PCT/JP2023/022912 JP2023022912W WO2023249046A1 WO 2023249046 A1 WO2023249046 A1 WO 2023249046A1 JP 2023022912 W JP2023022912 W JP 2023022912W WO 2023249046 A1 WO2023249046 A1 WO 2023249046A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
added
cells
test
extract
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/022912
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
ボロン ビスワス カザール
晃明 桝谷
有香 河合
イダマルゴダ アルナシリ
Original Assignee
一丸ファルコス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 一丸ファルコス株式会社 filed Critical 一丸ファルコス株式会社
Publication of WO2023249046A1 publication Critical patent/WO2023249046A1/ja

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/28Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
    • A61K36/282Artemisia, e.g. wormwood or sagebrush
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789Magnoliopsida [dicotyledons]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00Drugs for dermatological disorders
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61QSPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00Preparations for care of the skin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61QSPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08Anti-ageing preparations
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines

Definitions

  • the present invention relates to, for example, compositions (cosmetics, etc.) for maintaining the structure of hyaluronic acid in human skin, etc., and/or materials (agents) added thereto.
  • the skin plays an important role in maintaining the internal environment of the living body. Therefore, although the function of the skin does not completely stop, its function gradually declines with age, exposure to ultraviolet rays, skin exposure to chemical substances, etc., and aging such as wrinkles, spots, dullness, and sagging appear. Symptoms become apparent.
  • Hyaluronic acid is a linear mucopolysaccharide consisting of a repeating structure of D-glucuronic acid and N-acetyl D-glucosamine.
  • hyaluronic acid is widely present in the skin, eyes, cartilage, synovium, synovial fluid, etc.
  • Hyaluronic acid in the skin is present in the dermis and contributes to skin moisture retention and elasticity.
  • BACKGROUND ART Conventionally, hyaluronic acid and materials that suppress its decomposition have been used in cosmetics and the like for the purpose of moisturizing the skin and anti-aging (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 Examples of the decomposition mode of hyaluronic acid in living bodies such as humans (including the dermis of the skin) include a KIAA1199 (HYBID)-dependent hyaluronic acid decomposition mode (Non-Patent Document 2).
  • TMEM2 cell surface hyaluronidase TMEM2 is essential for systemic hyaluronan Catabolism and turnove PNAS March 18, 2013 110 (14) 5612-5617 KIAA1199, a deafness gene of unknown function, is a new hyaluronan binding protein involved in hyaluronan depolymerization
  • the problem to be solved by the present invention is, for example, to find a substance of natural origin (natural product) that has the effect of suppressing the decomposition of hyaluronic acid (the effect of suppressing HYBID) in the dermis of human skin, etc.
  • the purpose of the present invention is to provide an agent for maintaining the structure of hyaluronic acid. This maintenance is thought to contribute to maintaining the structure of the extracellular matrix of the dermis of the skin.
  • the inventor of the present invention completed the present invention as a result of extensive research into searching for a substance that has the activity of suppressing the decomposition of hyaluronic acid.
  • the present invention includes, for example, the following.
  • the hyaluronic acid has a molecular weight of 600 to 2000 kDa.
  • the present invention can provide compositions (cosmetics, etc.) for maintaining the structure of hyaluronic acid in human skin, etc., and/or materials (agents) to be mixed therein.
  • FIG. 5 is a diagram showing an outline of the skin monitor test of Experiment 5-1.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of Test 8.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of Test 11.
  • Hyaluronic acid in the present invention is a polysaccharide having a structure in which disaccharide units of glucuronic acid and N-acetylglucosamine are linked.
  • the salt of hyaluronic acid is not particularly limited, and any salt that is food or pharmaceutically acceptable may be used, and examples thereof include sodium salt, potassium salt, calcium salt, zinc salt, magnesium salt, ammonium salt, and the like.
  • the molecular weight of hyaluronic acid can be used without any particular limitation.
  • hyaluronic acid examples include those obtained by extracting from chicken combs or other animal or plant tissues, concentrated production or enzyme treatment, or those produced by fermentation with hyaluronic acid-producing microorganisms such as Streptococcus microorganisms; Both can be used.
  • hyaluronic acid of the present invention either a crude extract or a purified product may be used, but hyaluronic acid with a purity of 90% or more can be used because it has little coloring or off-odor when stored.
  • the lower limit of the molecular weight is preferably 600 kDa, more preferably 1200 kDa, -
  • the upper limit of the molecular weight is preferably 2000 kDa, more preferably 1600 kDa, That's true. An experiment showing this is shown below in Test 1.
  • HYBID binds to high molecular size (>1000 kDa) hyaluronic acid and breaks it down into intermediate sized fragments with a molecular weight of 10 kDa.
  • Compositae (Kawara mugwort) Artemisia capillaris Thunb. (Compositae) belongs to the family Asteraceae (Compositae).
  • mugwort flowers including, for example, flower heads, flower spikes, and/or flower bands
  • examples of extracts of Kawara mugwort flowers include Falcolex Kawara mugwort B (Ichimaru Falcos) and Falcolex Kawara mugwort E (Ichimaru Falcos).
  • a mugwort flower extract is produced, for example, by pulverizing raw or dried material, pulverizing the raw or dried material, and then extracting with a solvent.
  • a solvent for example, according to the following production example, an extract of mugwort flowers is produced.
  • the extract of Kawara mugwort flower used in the following examples was manufactured according to the following manufacturing example.
  • Example of manufacturing mugwort flower extract A dried product is produced by drying the flower heads of Kawara mugwort under predetermined conditions. 100 g of this dried product is immersed in 10 kg of 50% 1,3-butylene glycol solution. This immersion is carried out for 5 to 10 days at room temperature (about 10° C. to about 30° C.) with occasional stirring. The solution obtained through this immersion was purified using a synthetic adsorption resin, such as Diaion HP-20, to prepare the extract. The solid content contained in this crude extract is 0.2%.
  • extraction solvent used in the production of mugwort flower extract
  • the extraction solvent include lower alcohols or water-containing lower alcohols such as water, methanol, ethanol, propyl alcohol, isopropyl alcohol, butanol, isobutanol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, 1,2-butylene glycol, 1 , 4-butylene glycol, 1,5-pentanediol, 1,2-pentanediol, 1,3-pentanediol, 1,4-pentanediol, 1,3,5-pentanediol, glycerin, polyethylene glycol (molecular weight 100 -100,000) or hydrous polyhydric alcohols, acetone, ethyl acetate, diethyl ether, dimethyl ether, ethyl methyl ether, dioxane, acetonitrile, xylene, benzene, chloroform, carbon te
  • the Kawara mugwort flower extract used in the present invention can be further subjected to an appropriate purification operation, if necessary.
  • Purification operations include, for example, decomposition by adding acids (hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, organic acids, etc.) or alkalis (sodium hydroxide, calcium hydroxide, ammonia, etc.), fermentation or metabolic conversion by microorganisms, ion exchange resins, etc.
  • Component adsorption using activated carbon, diatomaceous earth, etc., fractionation using chromatography with various separation modes ion exchange, hydrophilic adsorption, hydrophobic adsorption, size exclusion, ligand exchange, affinity, etc.
  • filter paper and membrane.
  • separation modes ion exchange, hydrophilic adsorption, hydrophobic adsorption, size exclusion, ligand exchange, affinity, etc.
  • filter paper and membrane.
  • honeysuckle leaves and honeysuckle flowers are used as materials.
  • honeysuckle extracts include the following. - Falcolex Honeysuckle FB: Honeysuckle flower extract, extract prepared using 1,3-butylene glycol solution as a solvent, Ichimaru Falcos Co., Ltd. - Falcolex Honeysuckle FE: Honeysuckle flower extract, extract prepared using ethanol solution as a solvent, Ichimaru Falcos Co., Ltd. - Falcolex Honeysuckle SB: Honeysuckle leaf extract, extract prepared using 1,3-butylene glycol solution as a solvent, Ichimaru Falcos Co., Ltd.
  • Examples of the oral composition according to the present invention include beverages, foods, pharmaceuticals, and quasi-drugs.
  • the skin external preparation according to the present invention includes 1) pharmaceuticals, 2) quasi-drugs, in an appropriate form for use such as ampoules, capsules, powders, granules, liquids, gels, bubbles, emulsions, sheets, mist, and sprays.
  • Topical or systemic skin preparations for example, basic cosmetics such as lotion, milky lotion, cream, ointment, lotion, oil, pack, etc., facial cleansers and skin cleansing such as bar soap, liquid soap, hand wash, etc.
  • Make-up cosmetics such as cosmetics, massage agents, cleansing agents, hair removal agents, depilatory agents, shaving agents, aftershave lotions, pre-show lotions, shaving creams, foundations, lipsticks, blushers, eyeshadows, eyeliners, mascara, etc.
  • Medicinal products applied to the scalp and hair e.g.
  • oils and fats avocado oil, almond oil, fennel oil, perilla oil, olive oil, orange oil, orange laffa oil, sesame oil, cacao butter, chamomile oil, carrot oil, cucumber oil, beef tallow fatty acid, kukui nut oil, safflower oil , shea butter, liquid shea butter, soybean oil, camellia oil, corn oil, rapeseed oil, persic oil, castor oil, cottonseed oil, peanut oil, turtle oil, mink oil, egg yolk oil, palm oil, palm kernel oil, Japanese oak, palm oil Oil, beef tallow, lard, squalene, squalane, pristane, hydrogenated products of these fats and oils (hardened oil, etc.), etc.
  • Alcohols Natural alcohols such as ethanol, isopropanol, lauryl alcohol, cetanol, stearyl alcohol, oleyl alcohol, lanolin alcohol, cholesterol, phytosterol, phenoxyethanol, synthetic alcohols such as 2-hexyldecanol, isostearyl alcohol, 2-octyldodecanol, etc. .
  • Esters Isopropyl myristate, Isopropyl palmitate, Butyl stearate, Hexyl laurate, Myristyl myristate, Oleyl oleate, Decyl oleate, Octyldodecyl myristate, Hexyldecyl dimethyloctoate, Cetyl lactate, Myristyl lactate, Diethyl phthalate, dibutyl phthalate, lanolin acetate, ethylene glycol monostearate, propylene glycol monostearate, propylene glycol dioleate, etc.
  • Metal soaps Aluminum stearate, magnesium stearate, zinc stearate, calcium stearate, zinc palmitate, magnesium myristate, zinc laurate, zinc undecylenate, etc.
  • Gummies sugars or water-soluble polymer compounds Gum arabic, benzoin gum, gum dammar, guaiac butter, Irish moss, gum karaya, gum tragacanth, gum carob, quinseed, agar, casein, lactose, fructose, sucrose or its ester, Trehalose or its derivatives, dextrin, gelatin, pectin, starch, carrageenan, carboxymethyl chitin or chitosan, hydroxyalkyl (C 2 -C 4 ) chitin or chitosan to which alkylene (C 2 -C 4 ) oxide such as ethylene oxide is added , low molecular weight chitin or chitosan, chitosan salt, sulfated chitin or chitosan, phosphorylated chitin or chitosan, alginic acid or its salt, hyaluronic acid or its salt, chondroit
  • Surfactant Anionic surfactant (alkyl carboxylate, alkyl sulfonate, alkyl sulfate, alkyl phosphate), cationic surfactant (alkyl amine salt, alkyl quaternary ammonium salt), amphoteric Surfactants: Carboxylic acid type amphoteric surfactants (amino type, betaine type), sulfate ester type amphoteric surfactants, sulfonic acid type amphoteric surfactants, phosphate ester type amphoteric surfactants, nonionic surfactants ( Ether type nonionic surfactants, ether ester type nonionic surfactants, ester type nonionic surfactants, block polymer type nonionic surfactants, nitrogen-containing type nonionic surfactants), other surfactants ( natural surfactants, protein hydrolyzate derivatives, polymer surfactants, surfactants containing titanium and silicon, fluorocarbon surfactants), etc.
  • Vitamin A group retinol, retinal (vitamin A1), dehydroretinal (vitamin A2), carotene, lycopene (provitamin A), vitamin B group: thiamine hydrochloride, thiamine sulfate (vitamin B1), Riboflavin (vitamin B2), pyridoxine (vitamin B6), cyanocobalamin (vitamin B12), folic acids, nicotinic acids, pantothenic acids, biotin, choline, inositols, vitamin C group: vitamin C acid or its derivatives, vitamin D group: Ergocalciferol (vitamin D2), cholecalciferol (vitamin D3), dihydrotachysterol, vitamin E group: vitamin E or its derivatives, ubiquinones, vitamin K group: phytonadione (vitamin K1), menaquinone (vitamin K2), menadione (vitamin K3), menadio
  • Additives Processes that are conventionally performed depending on the type and form of the product to be added (e.g., crushing, milling, washing, hydrolysis, fermentation, purification, squeezing, extraction, fractionation, filtration, drying, etc.)
  • the material may be optionally selected from a variety of materials and provided by optionally selecting or combining treatments such as powdering, granulation, dissolution, sterilization, pH adjustment, deodorization, and decolorization.
  • the solvent used for extraction may be selected after taking into account the purpose and type of the product to be used, as well as the subsequent processing, but usually water, methanol, ethanol, propyl alcohol, isopropyl alcohol, and butanol are used. , lower alcohols or hydrous lower alcohols such as isobutanol, polyhydric alcohols or hydrous polyhydric alcohols such as propylene glycol, 1,3-butylene glycol, glycerin, acetone, and various organic solvents such as ethyl acetate. Alternatively, it is desirable to use a mixture of two or more types. However, if the inclusion of an organic solvent is undesirable depending on the application, it is sufficient to use only water, or to use ethanol, which is easy to remove after extraction, and to use it alone or in any mixture with water. It may be something extracted through exploitation.
  • additives derived from plant or animal raw materials in systemic or topical external preparations or cosmetics they may be used to protect the skin and hair, moisturize, improve feel/texture, impart flexibility, and stimulate. Relief of stress with fragrance, cell activation (prevention of cell aging), suppression of inflammation, improvement of skin and hair quality, prevention and improvement of rough skin, hair growth, hair growth, prevention of hair loss, imparting luster, cleansing effect,
  • cosmetic effects such as alleviating fatigue, promoting blood flow, and warming bath effects, it can also be expected to have effects such as scenting, deodorizing, thickening, preservative, and buffering.
  • HA hyaluronic acid
  • HA was added to the replaced NB cells at a final concentration of 10 ⁇ g/mL to produce the following groups.
  • Example group HA was not added ⁇ H2 addition group: H2 was added ⁇ M2 addition group: M2 was added ⁇ S2 addition group: S2 was added ⁇ U2 addition group: U2 was added group
  • the group was prepared, it was further cultured for 1 to 2 hours at 37°C in a CO 2 incubator. After culturing for 1 to 2 hours, TNF- ⁇ was added to the above groups (including the control group) at a final concentration of 1 ng/mL in order to bring the cells into an inflammatory state. After the addition, the cells were cultured at 37° C. for 6 hours in a CO 2 incubator.
  • Quantification of mRNA mRNA was purified from the cells after 6 hours of culture.
  • QIAshreder and RNeasy Mini Kit sold by QIAGEN were used to purify mRNA.
  • RNA was purified using PrimeScript RT master Mix sold by TaKaRa to synthesize cDNA.
  • RT-PCR was performed using primer pairs corresponding to each target factor shown in Table 1 below, and changes in expression levels were analyzed by relative quantification.
  • TB Green Premix Ex Taq sold by TaKaRa was used for RT-PCR.
  • RPS18 ribosomal protein S18
  • MMP matrix metalloprotease
  • Test results mRNA quantification results
  • Table 2 The results are shown as values when the value of the control group (expression level change in the relative quantification) is set to 1. These values are values rounded to the second decimal place. ** indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) compared to the value of the control group in Dunnett's test. *** indicates a significant difference (p ⁇ 0.001) compared with the value of the control group in Dunnett's test.
  • the lower limit of the molecular weight is preferably 600 kDa, and the upper limit of the molecular weight is preferably 2000 kDa.
  • RT-PCR After producing the group, it was further cultured at 37°C for 24 hours in a CO 2 incubator. mRNA was purified from the cells after 24 hours of culture. QIAshreder and RNeasy Mini Kit sold by QIAGEN were used to purify mRNA.
  • RNA was purified using PrimeScript RT master Mix sold by TaKaRa to synthesize cDNA.
  • RT-PCR was performed using primer pairs corresponding to each target factor shown in Table 3 below, and changes in expression levels were analyzed by relative quantification.
  • TB Green Premix Ex Taq sold by TaKaRa was used for RT-PCR.
  • RPS18 ribosomal protein S18
  • Test results RT-PCR results
  • Table 4 The results are shown as values when the value of the non-added group (expression level change in the relative quantification) is set to 1. These values are values rounded to the third decimal place. ** indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) compared with the value of the non-added group in Dunnett's test. The mark *** indicates a significant difference (p ⁇ 0.001) compared with the value of the non-added group in Dunnett's test.
  • Quantification of mRNA mRNA was purified from the cells after culturing for 24 hours.
  • QIAshreder and RNeasy Mini Kit sold by QIAGEN were used to purify mRNA.
  • RNA was purified using PrimeScript RT master Mix sold by TaKaRa to synthesize cDNA.
  • RT-PCR was performed using primer pairs corresponding to each target factor shown in Table 5 below, and changes in expression levels were analyzed by relative quantification.
  • TB Green Premix Ex Taq sold by TaKaRa was used for RT-PCR.
  • RPS18 ribosomal protein S18
  • Test results mRNA quantification results
  • Table 6 The results are shown as values when the value of the non-added group (expression level change in the relative quantification) is set to 1. These values are values rounded to the third decimal place.
  • * indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) compared to the value of the control group in Dunnett's test. ** indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) compared to the value of the control group in Dunnett's test. *** indicates a significant difference (p ⁇ 0.001) compared with the value of the control group in Dunnett's test.
  • MicroRNA is a short chain (20 to 25 bases) of RNA (non-coding RNA) that does not produce proteins. MicroRNA binds to the messenger RNA (mRNA) of a gene that has the same sequence as itself, and suppresses the expression of that gene by degrading the mRNA or inhibiting its translation into protein. miR-600, which is one of microRNAs, is an inhibitor of HYBID (Non-Patent Document 3).
  • RNA complementary DNA was extracted from the total RNA using Mir-X TM miRNA First-Strand Synthesis Kit (Clontech Laboratories (Takara Bio), 638313, Takara Bio Code: Z8313N).
  • a (cDNA) was synthesized. Thereafter, Mir-X TM miRNA qRT-PCR SYBR Kit (Clontech), the primers listed in Table 7, and Thermal Cycler Dice Real Time System TP800 (Clontech Laboratories (Takara Bio)) were used. RT-PCR was performed using Differences in miRNA expression between different experimental groups were compared by Delta-delta-CT method.
  • thermal cycling conditions for the RT-PCR are as follows. - Step 1: 40 cycles of two-step PCR were performed at 95°C for 30 seconds, 95°C for 5 seconds, and 60°C for 30 seconds. - Step 2: After Step 1, one cycle of dissociation steps of 15 seconds at 95°C, 30 seconds at 60°C, and 15 seconds at 95°C was performed.
  • Example 1 Preparation of lotion A lotion used in the following monitor test was prepared as follows. As shown in Table 9, a lotion (Table 9 lotion) containing 1% of Kawara mugwort flower extract was prepared. As shown in Table 10, a placebo lotion (a lotion that does not contain the product) was prepared.
  • Example 5-1 Human skin monitor test, skin external preparation
  • a lotion having the composition shown in Table 9 was applied at predetermined intervals on one half of the subject's face, and a lotion shown in Table 10 was applied at predetermined intervals on the other half of the subject's face. This predetermined interval is twice a day (morning and evening) for four weeks.
  • the predetermined region is "the entire face.”
  • the weight shown in Figure 1 is a weight (5 g to 20 g). This weight was used in this experiment 5-1.
  • a weight and a clip were fixed with a string, and the clip side was hooked onto a stapler.
  • a weight was added to each subject in advance, and the weight was such that the cheek would move 1-2 mm due to gravity.
  • Example 5-2 Human skin monitor test part 2, external skin preparation
  • From January 31, 2022 by applying the lotion listed in Table 9 and the placebo lotion listed in Table 10 to the designated areas of the face of normal human subjects (13 men and women with an average age of 43.6 years). The test was conducted during March 4, 2022.
  • a lotion having the composition shown in Table 9 was applied at predetermined intervals on one half of the subject's face, and a lotion shown in Table 10 was applied at predetermined intervals on the other half of the subject's face. This predetermined interval is twice a day (morning and evening) for four weeks.
  • the predetermined region is "the entire face.”
  • ANTERA 3D registered trademark, Gadelius Medical Co., Ltd.
  • the measurements in Experiment 6 were performed by setting the average value of the measurement results of the subjects at week 0 of each application group to "100.00" and calculating the measurement results of the subjects at week 4 of each application group as relative values.
  • the value at week 0 (100.00) is calculated by measuring three times at one site per person, calculating the average value of the three measurements, and calculating the average value by 13 The average value was set as 100.
  • the 4th week measurement result and the 12th week measurement result are values obtained by calculating the rate of change compared to the value at 0 week.
  • Table 13 shows the results of measuring the presence or absence of eyelid wrinkles. Table 13 shows the measurement results for the four weeks. The * mark in Table 13 indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) in Wilcoxon Rank-Sum Test compared to the value of the lotion application group in Table 10 (assumed to be 100.00). In the measurement of wrinkles shown in Table 13, the size (total size) and depth of wrinkles were measured. As shown in Table 13, compared to applying the lotion having the composition shown in Table 10, the wrinkles were smaller in size and shallower in depth by applying the lotion having the composition shown in Table 9.
  • Example 5-3 Human skin monitor test 3, external skin preparation
  • From January 31, 2022 by applying the lotion listed in Table 9 and the placebo lotion listed in Table 10 to the designated areas of the face of normal human subjects (13 men and women with an average age of 43.6 years). The test was conducted during March 4, 2022.
  • a lotion having the composition shown in Table 9 was applied at predetermined intervals on one half of the subject's face, and a lotion shown in Table 10 was applied at predetermined intervals on the other half of the subject's face. This predetermined interval is twice a day (morning and evening) for four weeks.
  • the predetermined region is "the entire face.”
  • the value of the lotion application group in Table 9 is 107.73 (maintaining the prescribed skin moisture content) after 4 weeks.
  • the lotion application group in Table 10 had a score of 98.98.
  • Test 6 Confirmation of HYBID expression by histamine induction using NB cells (RT-PCR) This confirmation was performed using RT-PCR method. Unlike Test 2, in this Test 6, it was confirmed whether the expression of HYBID was suppressed by adding the extract of Artemisia communis or the extract of Honeysuckle.
  • the extracts used in Test 6 are as follows. ⁇ Falcolex Honeysuckle FB: Honeysuckle flower extract, Ichimaru Falcos Co., Ltd. ⁇ Falcolex Kawara Mugwort B: Kawara mugwort flower extract, Ichimaru Falcos Co., Ltd.
  • Non-addition group a group to which the extract and the following histamines were not added.
  • Control group a group to which the extract was not added, but the following histamines were added.
  • - 0.125 Honeysuckle FB addition group A group in which Falcolex Honeysuckle FB was added at a final concentration of 0.125%, and the following histamine was further added.
  • - 0.25 Honeysuckle FB addition group Group to which Falcolex Honeysuckle FB was added at a final concentration of 0.25%.
  • Honeysuckle FB addition group A group in which Falcolex Honeysuckle FB was added at a final concentration of 0.5%, and the following histamine was further added.
  • - 1.0 Honeysuckle FB addition group A group in which Falcolex Honeysuckle FB was added at a final concentration of 1.0%, and the following histamine was further added.
  • - 0.125 Kawara Mugwort B addition group A group to which Falcolex Kawara Mugwort B was added at a final concentration of 0.125%, and the following histamine was further added.
  • Kawara Mugwort B addition group A group to which Falcolex Kawara Mugwort B was added at a final concentration of 0.25%, and the following histamine was further added.
  • - 0.5 Kawara Mugwort B addition group A group to which Falcolex Kawara Mugwort B was added at a final concentration of 0.5%, and the following histamine was further added.
  • - 1.0 Kawara Mugwort B addition group A group to which Falcolex Kawara Mugwort B was added at a final concentration of 1.0%, and the following histamine was further added.
  • Quantification of mRNA mRNA was purified from the cells after culturing for 24 hours.
  • QIAshreder and RNeasy Mini Kit sold by QIAGEN were used to purify mRNA.
  • RNA was purified using PrimeScript RT master Mix sold by TaKaRa to synthesize cDNA.
  • RT-PCR was performed using primer pairs corresponding to each target factor shown in Table 14 below, and changes in expression levels were analyzed by relative quantification.
  • TB Green Premix Ex Taq sold by TaKaRa was used for RT-PCR.
  • RPS18 ribosomal protein S18
  • Test results mRNA quantification results
  • Table 15 The results are shown as values when the value of the non-added group (expression level change in the relative quantification) is set to 1. * indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) compared with the value of the non-added group in Dunnett's test.
  • Test 7 Confirmation of HYBID expression by induction of IL-1 ⁇ using NB cells (RT-PCR) This confirmation was performed using RT-PCR method. Unlike Test 2, in this Test 7, it was confirmed whether the expression of HYBID was suppressed by adding the extract of Artemisia communis or the extract of Honeysuckle.
  • the extracts used in Test 7 are as follows. ⁇ Falcolex Honeysuckle FB: Honeysuckle flower extract, Ichimaru Falcos Co., Ltd. ⁇ Falcolex Honeysuckle SB: Honeysuckle leaf extract, Ichimaru Falcos Co., Ltd. ⁇ Falcolex Kawara Mugwort B: Kawara mugwort flower extract, Ichimaru Falcos Co., Ltd. company
  • Non-addition group a group to which the extract and the IL-1 ⁇ listed below were not added.
  • Control group a group to which the extract was not added, but the IL-1 ⁇ listed below was not added.
  • - 1.0 Honeysuckle FB addition group A group in which Falcolex Honeysuckle FB was added at a final concentration of 1.0%, and the following IL-1 ⁇ was not added.
  • - 1.0 Honeysuckle SB addition group A group in which Falcolex Honeysuckle SB was added at a final concentration of 1.0%, and the following IL-1 ⁇ was not added.
  • - 1.0 Kawara Mugwort B addition group A group in which Falcolex Kawara Mugwort B was added at a final concentration of 1.0%, and the following IL-1 ⁇ was not added.
  • IL-1 ⁇ was added to the above groups (excluding the non-added group) at a final concentration of 50 ng/mL. After the addition, the cells were cultured at 37° C. for 24 hours in a CO 2 incubator. Note that histamine was added in order to enhance the expression of HYBID as described in Test 2 above.
  • Quantification of mRNA mRNA was purified from the cells after culturing for 24 hours.
  • QIAshreder and RNeasy Mini Kit sold by QIAGEN were used to purify mRNA.
  • RNA was purified using PrimeScript RT master Mix sold by TaKaRa to synthesize cDNA.
  • RT-PCR was performed using primer pairs corresponding to each target factor shown in Table 16 below, and changes in expression levels were analyzed by relative quantification.
  • TB Green Premix Ex Taq sold by TaKaRa was used for RT-PCR.
  • RPS18 ribosomal protein S18
  • Test results mRNA quantification results
  • Table 17 The results are shown as values when the value of the non-added group (expression level change in the relative quantification) is set to 1. ** indicates a significant difference (p ⁇ 0.01) compared with the value of the non-added group in Dunnett's test.
  • HA hyaluronic acid
  • Figure 2 shows the state of the experimental group (gel).
  • the gel in the U2-added group was smaller than that in the H2-added group, as indicated by the arrow in FIG.
  • the reason why the gel became smaller is that the U2-added group had a smaller ability to retain water molecules than the H2-added group, and was unable to maintain the structure of the water-soluble gel. Therefore, Test 8 suggested that the molecular weight of HA is an important requirement for maintaining the structure.
  • RT-PCR After producing the group, it was further cultured at 37°C for 3 hours in a CO 2 incubator. After culturing for 3 hours, the medium was replaced with fresh DMEM containing 0.25% FBS. The cells were cultured in a CO2 incubator at 37° C. for 24 hours using the replaced medium. mRNA was purified from the cells after 24 hours of culture. QIAshreder and RNeasy Mini Kit sold by QIAGEN were used to purify mRNA.
  • RNA was purified using PrimeScript RT master Mix sold by TaKaRa to synthesize cDNA.
  • RT-PCR was performed using primer pairs corresponding to each target factor shown in Table 18 below, and changes in expression levels were analyzed by relative quantification.
  • TB Green Premix Ex Taq sold by TaKaRa was used for RT-PCR.
  • RPS18 ribosomal protein S18
  • Test results RT-PCR results
  • Table 19 The results are shown as values when the value of the non-added group (expression level change in the relative quantification) is set to 1 (1.00). These values are values rounded to the third decimal place.
  • RT-PCR After producing the group, it was further cultured at 37°C for 3 hours in a CO 2 incubator. After culturing for 3 hours, the medium was replaced with fresh DMEM containing 0.25% FBS. The cells were cultured in a CO2 incubator at 37° C. for 24 hours using the replaced medium. mRNA was purified from the cells after 24 hours of culture. QIAshreder and RNeasy Mini Kit sold by QIAGEN were used to purify mRNA.
  • RNA was purified using PrimeScript RT master Mix sold by TaKaRa to synthesize cDNA.
  • RT-PCR was performed using primer pairs corresponding to each target factor shown in Table 20 below, and changes in expression levels were analyzed by relative quantification.
  • TB Green Premix Ex Taq sold by TaKaRa was used for RT-PCR.
  • RPS18 ribosomal protein S18
  • Test results RT-PCR results
  • Table 21 The results are shown as values when the value of the NB-unadded group (expression level change in the relative quantification) is set to 1. These values are values rounded to the second decimal place.
  • the fluorescence intensity at the peak top of each group shown in FIG. 3 is shown in Table 22 below.
  • Table 22 the value (intensity) of the non-added group is shown as 100, and the values of other groups are shown rounded to the fourth decimal place.
  • the peak top was lower than in the non-addition group. This low value suggests that a certain number of hyaluronic acid was decomposed into fragments by HYBID in a state where HYBID was promoted by histamine.
  • the peak tops were higher in the groups to which Kawara mugwort flower extract was added (0.5 group, 1.0 group) compared to the control group. Therefore, it is suggested that the addition of the mugwort flower extract suppressed the action of HYBID and suppressed the decomposition of hyaluronic acid.
  • the present invention can be used, for example, in compositions (cosmetics, etc.) for maintaining the structure of hyaluronic acid in human skin, etc., and/or materials (agents) added thereto.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

【課題】ヒトなどの皮膚などにおけるヒアルロン酸の構造を維持するための組成物(化粧品等)、及び/又はこれらに配合する素材(剤)、などを提供する。 【解決手段】ヒアルロン酸の構造を維持するための剤であって、カワラヨモギの花の抽出物を含有し、当該ヒアルロン酸は分子量が600から2000kDaである、当該剤。

Description

ヒアルロン酸の構造を維持するための剤 クロスリファレンス
 本出願は、日本国において、2022年6月22日に出願された特願2022-099992号、および2023年2月13日に出願された特願2023-020008号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容はすべて参照によりそのまま本明細書に援用される。
 本発明は、例えば、ヒトなどの皮膚などにおけるヒアルロン酸の構造を維持するための組成物(化粧品等)、及び/又はこれらに配合する素材(剤)などに関する。
 皮膚は、外部環境から直接影響を受ける最前線として、生体の内部環境を維持する重要な機能を担う。そのため、皮膚の機能が全面的な停止に至ることはないが、加齢、紫外線被曝、化学物質への皮膚露出などに伴いその機能は徐々に低下し、シワ、シミ、くすみ、タルミ等の老化徴候が顕在化してくる。
 ヒアルロン酸(HA)は、D-グルクロン酸とN-アセチルD-グルコサミンとの繰り返し構造からなる直鎖のムコ多糖である。生体内において、ヒアルロン酸は、皮膚、眼、軟骨、滑膜、関節液等に広く存在する。皮膚のヒアルロン酸は真皮に存在し、皮膚の保湿や弾力性に寄与している。従来、皮膚の保湿やアンチエイジングを目的とした化粧品等にヒアルロン酸やその分解を抑制する素材が利用されている(特許文献1、非特許文献1)。
 ヒトなどの生体内(皮膚の真皮なども含む)において、ヒアルロン酸の分解様式として、例えばKIAA1199(HYBID)依存的なヒアルロン酸分解様式が挙げられる(非特許文献2)。
特開2018-135272
井上紳太郎、グルコサミン研究 5:4-10,2009 化学と生物55(2): 119-127 (2017) Journal of Experimental & Clinical Cancer Research volume 37、Article number: 106 (2018)、LncRNA TUG1 promoted KIAA1199 expression via miR-600 to accelerate cell metastasis and epithelial-mesenchymal transition in colorectal cancer Drug cytotoxicity screening using human intestinal organoids propagated with extensive cost-reduction strategies(URL:https://www.researchsquare.com/article/rs-2122762/vl) J. Biol. Chem. (2021) 297(5) 101281 The cell surface hyaluronidase TMEM2 is essential for systemic hyaluronan catabolism and turnove PNAS March 18, 2013 110 (14) 5612-5617 KIAA1199, a deafness gene of unknown function, is a new hyaluronan binding protein involved in hyaluronan depolymerization
 本発明が解決しようとする課題は、例えば、ヒト等の皮膚の真皮において、天然由来の物(天然物)からヒアルロン酸の分解を抑制する効果(HYBIDを抑制する効果)を有するものを見出し、ヒアルロン酸の構造を維持するための剤などを提供することである。当該維持は、当該皮膚の真皮の細胞外マトリクスの構造維持に寄与すると考えられる。
 そこで、本発明の発明者は、ヒアルロン酸の分解を抑制する活性を持つ物質の探索について鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成した。
 本発明は、例えば以下を含む。
(1)真皮などにおけるヒアルロン酸の分解を抑制するための剤であって、
カワラヨモギの花、スイカズラの葉Lonicera Japonica (Honeysuckle) Leaf Extractの抽出物及び/又はスイカズラの花の抽出物、を含有し、
当該ヒアルロン酸は分子量が600から2000kDaである、当該剤。
(2)当該ヒアルロン酸は分子量が1200から1600kDaである、(1)に記載の剤。
(3)(1)又は(2)に記載の剤を含有する、皮膚外用組成物。
 本発明により、ヒトなどの皮膚などにおけるヒアルロン酸の構造を維持するための組成物(化粧品等)、及び/又はこれらに配合する素材(剤)などを提供できる。
実験5-1の皮膚モニター試験の概要を示した図である。 試験8の結果を示した図である。 試験11の結果を示した図である。
 以下、本発明を実施するための形態について説明する。
(ヒアルロン酸)
 本発明におけるヒアルロン酸は、グルクロン酸とN-アセチルグルコサミンとの二糖単位が連結した構造をとる多糖類である。また、ヒアルロン酸の塩は、特に限定はなく、食品または薬学上許容しうる塩であればよく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。ヒアルロン酸の分子量は、特に限定せず使用することができる。
 ヒアルロン酸としては、例えば、鶏冠またはその他の動物、植物の組織より抽出し、濃縮生成又は酵素処理して得られたもの、あるいはストレプトコッカス属の微生物等のヒアルロン酸生産微生物による発酵で生成したもの、いずれも使用可能である。本発明のヒアルロン酸としては、粗抽出物あるいは精製物のいずれを用いてもよいが、保存した際に着色や異臭が少ないことから、純度が90%以上のものを使用することができる。
 ヒアルロン酸の構造を維持することは、
・分子量の下限が、好ましくは600kDa、より好ましくは1200kDa、であり、
・分子量の上限が、好ましくは2000kDa、より好ましくは1600kDa、である、
ことである。このことを示す実験を以下試験1で示す。
(HYBID)
 HYBIDは、高分子サイズ(1000kDa超)のヒアルロン酸に結合し、ヒアルロン酸を分子量10kDaの中間サイズの断片に分解する。
(カワラヨモギ)
 カワラヨモギは、キク科(Asteraceae(Compositae))のカワラヨモギ(Artemisia capillaris Thunb. (Compositae))である。
 本発明で用いる「カワラヨモギの花の抽出物」を製造する際には、材料としてカワラヨモギの花(例えば、頭花、花穂及び/又は帯花枝葉、を含む)を用いる。カワラヨモギの花の抽出物は、例えば、ファルコレックスカワラヨモギB(一丸ファルコス)、ファルコレックスカワラヨモギE(一丸ファルコス)、が挙げられる。
 カワラヨモギの花の抽出物は、例えば、材料を生のまま又は乾燥したものを粉砕作製、材料を生のまま又は乾燥したものを粉砕後溶媒で抽出して作製する。例えば、以下製造例により、カワラヨモギの花の抽出物を製造する。なお、以下実施例で用いるカワラヨモギの花の抽出物は、以下製造例に従い、製造された。
(カワラヨモギの花の抽出物の製造例)
 カワラヨモギの頭花を所定の条件で乾燥させ、乾燥物を作製する。この乾燥物100gを50%1,3-ブチレングリコール溶液10kgに浸漬する。室温(約10℃~約30℃)の環境で、時々攪拌しながら、5~10日間、この浸漬を行う。この浸漬を経て得られる溶液を、合成吸着樹脂、例えばダイヤイオンHP-20にて精製して、当該抽出物(抽出液)を作製した。この粗抽出物に含まれる固形分は、0.2%である。
(カワラヨモギの花の抽出物の製造の際に用いる抽出溶媒)
 抽出溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコール或いは含水低級アルコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、1,2-ブチレングリコール、1,4-ブチレングリコール、1,5-ペンタンジオール、1,2-ペンタンジオール、1,3-ペンタンジオール、1,4-ペンタンジオール、1,3,5-ペンタントリオール、グリセリン、ポリエチレングリコール(分子量100~10万)等の多価アルコール或いは含水多価アルコール、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、キシレン、ベンゼン、クロロホルム、四塩化炭素、フェノール、トルエン等の各種有機溶媒や、適宜規定度を調製した酸(塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ギ酸、酢酸等)やアルカリ(水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等)の中から選ばれる1種もしくは2種以上の混液が挙げられる。
(その他)
 本発明で用いるカワラヨモギの花の抽出物は、溶媒抽出後、必要に応じて、更に適宜精製操作を施すことも可能である。精製操作は、例えば、酸(塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、有機酸等)又はアルカリ(水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等)添加による分解、微生物による発酵又は代謝変換、イオン交換樹脂や活性炭、ケイ藻土等による成分吸着、種々の分離モード(イオン交換、親水性吸着、疎水性吸着、サイズ排除、配位子交換、アフィニティー等)を有するクロマトグラフィーを用いた分画、濾紙やメンブランフィルター、限外濾過膜等を用いた濾過、加圧又は減圧、加温又は冷却、乾燥、pH調整、脱臭、脱色、長時間の静置保管等であり、これらを任意に選択し、組合わせた処理を行うことも可能である。
(スイカズラ)
 スイカズラ(吸蔓)は、スイカズラ科(Caprifoliaceae)のスイカズラ(Lonicera japonica)、である。スイスガラの生薬名は、葉をニンドウ(忍冬),花をキンギンカ(金銀花)ともいう。スイスガラの生薬は、民間薬として利尿や解熱、また煎液をうがい液として利用されている。
 本発明で用いる「スイカズラの抽出物」を製造する際には、材料として、例えば、スイカズラの葉、スイカズラの花(例えば、頭花、花穂及び/又は帯花枝葉、を含む)を用いる。スイカズラの抽出物は、例えば、以下が挙げられる。
・ファルコレックススイカズラFB:スイカズラの花の抽出物、1,3-ブチレングリコール溶液を溶媒として抽出物を作製、一丸ファルコス株式会社。
・ファルコレックススイカズラFE:スイカズラの花の抽出物、エタノール溶液を溶媒として抽出物を作製、一丸ファルコス株式会社。
・ファルコレックススイカズラSB:スイカズラの葉の抽出物、1,3-ブチレングリコール溶液を溶媒として抽出物を作製、一丸ファルコス株式会社。
(経口組成物の形態)
 本発明による経口組成物は、例えば、飲料、食品、医薬品、医薬部外品が挙げられる。
(皮膚外用剤の形態)
 本発明による皮膚外用剤は、アンプル、カプセル、粉末、顆粒、液体、ゲル、気泡、エマルジョン、シート、ミスト、スプレー剤等利用上の適当な形態の1)医薬品類、2)医薬部外品類、3)局所用又は全身用の皮膚外用剤類(例えば、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料、固形石鹸、液体ソープ、ハンドウォッシュ等の洗顔料や皮膚洗浄料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、除毛剤、脱毛剤、髭剃り処理料、アフターシェーブローション、プレショーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧料、香水類、美爪剤、美爪エナメル、美爪エナメル除去剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤等)、4)頭皮・頭髪に適用する薬用又は/及び化粧用の製剤類(例えば、シャンプー剤、リンス剤、ヘアートリートメント剤、プレヘアートリートメント剤、パーマネント液、染毛料、整髪料、ヘアートニック剤、育毛・養毛料、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、エアゾール剤等)、5)浴湯に投じて使用する浴用剤、6)その他、腋臭防止剤や消臭剤、制汗剤、衛生用品、衛生綿類、ウエットティシュ等が挙げられる。
(皮膚外用剤の構成成分)
 また、このような剤には、必要に応じて、本発明の効果を損ねない範囲で以下に例示する成分や添加剤を任意に選択・併用して製造することができる。
(1)各種油脂類
 アボカド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物(硬化油等)等。
(2)ロウ類
 ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等。
(3)鉱物油
 流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等。
(4)脂肪酸類
 ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、12-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の天然脂肪酸、イソノナン酸、カプロン酸、2-エチルブタン酸、イソペンタン酸、2-メチルペンタン酸、2-エチルヘキサン酸、イソペンタン酸等の合成脂肪酸。
(5)アルコール類
 エタノール、イソプロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール等の天然アルコール、2-ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール等の合成アルコール。
(6)多価アルコール類
 酸化エチレン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、酸化プロピレン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、ガラクチトール、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール、マルチトール等。
(7)エステル類
 ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコール等。
(8)金属セッケン類
 ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛、ミリスチン酸マグネシウム、ラウリン酸亜鉛、ウンデシレン酸亜鉛等。
(9)ガム質、糖類又は水溶性高分子化合物
 アラビアゴム、ベンゾインゴム、ダンマルゴム、グアヤク脂、アイルランド苔、カラヤゴム、トラガントゴム、キャロブゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン(C~C)オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル(C~C)キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等。
(10)界面活性剤
 アニオン界面活性剤(アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩)、カチオン界面活性剤(アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩)、両性界面活性剤:カルボン酸型両性界面活性剤(アミノ型、ベタイン型)、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、非イオン界面活性剤(エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤)、その他の界面活性剤(天然界面活性剤、タンパク質加水分解物の誘導体、高分子界面活性剤、チタン・ケイ素を含む界面活性剤、フッ化炭素系界面活性剤)等。
(11)各種ビタミン類
 ビタミンA群:レチノール、レチナール(ビタミンA1)、デヒドロレチナール(ビタミンA2)、カロチン、リコピン(プロビタミンA)、ビタミンB群:チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩(ビタミンB1)、リボフラビン(ビタミンB2)、ピリドキシン(ビタミンB6)、シアノコバラミン(ビタミンB12)、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンC群:ビタミンC酸又はその誘導体、ビタミンD群:エルゴカルシフェロール(ビタミンD2)、コレカルシフェロール(ビタミンD3)、ジヒドロタキステロール、ビタミンE群:ビタミンE又はその誘導体、ユビキノン類、ビタミンK群:フィトナジオン(ビタミンK1)、メナキノン(ビタミンK2)、メナジオン(ビタミンK3)、メナジオール(ビタミンK4)、その他、必須脂肪酸(ビタミンF)、カルニチン、フェルラ酸、γ-オリザノール、オロット酸、ビタミンP類(ルチン、エリオシトリン、ヘスペリジン)、ビタミンU等。
(12)各種アミノ酸類
 バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等。
(13)添加物
 添加しようとする製品種別、形態に応じて常法的に行われる加工(例えば、粉砕、製粉、洗浄、加水分解、醗酵、精製、圧搾、抽出、分画、ろ過、乾燥、粉末化、造粒、溶解、滅菌、pH調整、脱臭、脱色等を任意に選択、組み合わせた処理)を行い、各種の素材から任意に選択して供すれば良い。
 尚、抽出に用いる溶媒については、供する製品の使用目的、種類、或いは後に行う加工処理等を考慮した上で選択すれば良いが、通常では、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコール或いは含水低級アルコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール或いは含水多価アルコール、アセトン、酢酸エチル等の各種有機溶媒の中から選ばれる1種若しくは2種以上の混液を用いるのが望ましい。但し、用途により有機溶媒の含有が好ましくない場合においては、水のみを使用したり、若しくは抽出後に除去しやすいエタノールを採用し、単独又は水との任意の混液で用いたりすれば良く、又、搾取抽出したものでも良い。
 尚、植物又は動物系原料由来の添加物を、全身用又は局所用の外用剤、化粧品類に供する場合、皮膚や頭髪の保護をはじめ、保湿、感触・風合いの改善、柔軟性の付与、刺激の緩和、芳香によるストレスの緩和、細胞賦活(細胞老化防止)、炎症の抑制、肌質・髪質の改善、肌荒れ防止及びその改善、発毛、育毛、脱毛防止、光沢の付与、清浄効果、疲労の緩和、血流促進、温浴効果等の美容的効果のほか、香付け、消臭、増粘、防腐、緩衝等の効果も期待できる。
 さらにこの他にも、これまでに知られている各原料素材の様々な美容的、薬剤的効果を期待し、これらを組み合わせることによって、本発明の目的とする効果の増進を図り、多機能的な効果を期待した製品とすることも可能である。なお、以下の実施例において、有効成分等の添加量を示すパーセンテージは、特に異なる記載がない限り重量%を意味する。
 以下、本発明の実施例について、説明する。以下、実施例で挙げる実験で用いた実験材料は次の通りである。
・正常ヒト成人皮膚線維芽細胞:KF-4109(クラボウ)、ヒトの年齢で40歳以上の細胞、以下「AD細胞」と記載する。
・正常ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞:KF-4009(クラボウ)、以下「NB細胞」と記載する。
・カワラヨモギの花の抽出物:ファルコレックスカワラヨモギB(一丸ファルコス)
[試験1]皮膚線維芽細胞を用いたヒアルロン酸の構造の維持の確認(RT-PCR)
 RT-PCR法を用いて、当該確認を行った。
(試験方法の概要)
1.試験で用いる細胞の準備
 NB細胞を準備した。前培養は5%FBSを含むDMEMを使用し、本実験では0.25%FBSを含むDMEMを使用した。5%CO、37℃の条件で培養した。
2.ヒアルロン酸(HA)の準備
 以下のHAを準備した。
・H2:分子量が1200kDa~1600kDaのHA
・M2:分子量が600kDa~1120kDaのHA
・S2:分子量が40kDa~80kDaのHA
・U2:分子量が5kDa~10kDaのHA
3.実験群の設定
 6×10個のNB細胞を6well plateに播種し75%コンフルエント状態になるまで培養した。その後、0.25%FBSを含むDMEMに置換し、24時間培養した後、新たな0.25%FBSを含むDMEMに置換した。
 当該置換後のNB細胞に対し、上述のHAを最終濃度10μg/mLとなるように添加し、以下の群を作製した。
(実験群)
・コントロール群:HAを添加しなかった群
・H2添加群:H2を添加した群
・M2添加群:M2を添加した群
・S2添加群:S2を添加した群
・U2添加群:U2を添加した群
 当該群を作製後、さらにCOインキュベーターにて37℃で1~2時間培養した。この1~2時間の培養後、細胞を炎症状態とするために、上述の群(コントロール群も含める)に対して、TNF-αを最終濃度1ng/mLとなるように添加した。当該添加後、COインキュベーターにて37℃で6時間培養した。
4.mRNAの定量
 当該6時間の培養後の細胞より、mRNAを精製した。mRNAの精製にはQIAGEN社より販売されているQIAshreder及びRNeasy Mini Kitを用いた。
 精製したmRNAを鋳型として、TaKaRaより販売されているPrimeScript RT master Mixを用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。以下の表1に示した、それぞれの標的因子に対応するプライマー対を用いて、RT-PCRを行い、相対定量にて発現量変化を解析した。RT-PCRにはTaKaRaより販売されているTB Green Premix Ex Taqを用いた。また、相対量変化解析のリファレンスにはRPS18(ribosomal protein S18)の増幅結果を用いた。
 なお、表1中の「MMP」は、マトリックスメタロプロテアーゼである。
(試験結果:mRNAの定量の結果)
 以下結果を表2に示す。結果は、コントロール群の値(当該相対定量にて発現量変化)を1とした場合の値で示す。これらの値は、小数点第2位を四捨五入した値である。
 **印は、Dunnett検定において、コントロール群の値との比較による有意差(p<0.01)、を示す。
 ***印は、Dunnett検定において、コントロール群の値との比較による有意差(p<0.001)、を示す。
 当該試験結果より、S2添加群及びU2添加群の値とH2添加群及びM2添加群の値とを比較することなどから、以下が示された。
・ヒアルロン酸の構造を維持することは、分子量の下限が好ましくは600kDa、分子量の上限が好ましくは2000kDa、であること。
[試験2]NB細胞を用いてヒスタミンの誘導によるHYBIDの発現の確認(RT-PCR)
 RT-PCR法を用いて、当該確認を行った。
(試験方法の概要)
1.試験で用いる細胞の準備
 NB細胞を準備した。前培養は5%FBSを含むDMEMを使用し、本実験では0.25%FBSを含むDMEMを使用した。5%CO、37℃の条件で培養した。
 6×10個のNB細胞を6well plateに播種し75%コンフルエント状態になるまで培養した。その後、0.25%FBSを含むDMEMに置換し、24時間培養した後、新たな0.25%FBSを含むDMEMに置換した。
2.実験群の設定
 当該置換後のNB細胞に対し、ヒスタミン(ヒアルロン酸分解活性を亢進する物質、非特許文献2)を用いて、以下の群を作製した。
(実験群)
・未添加群:ヒスタミンを添加しなかった群
・0.1添加群:ヒスタミンを最終濃度0.1μM添加した群
・1.0添加群:ヒスタミンを最終濃度1.0μM添加した群
・10添加群:ヒスタミンを最終濃度10μM添加した群
3.RT-PCR
 当該群を作製後、さらにCOインキュベーターにて37℃で24時間培養した。当該24時間の培養後の細胞より、mRNAを精製した。mRNAの精製にはQIAGEN社より販売されているQIAshreder及びRNeasy Mini Kitを用いた。
 精製したmRNAを鋳型として、TaKaRaより販売されているPrimeScript RT master Mixを用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。以下の表3に示した、それぞれの標的因子に対応するプライマー対を用いて、RT-PCRを行い、相対定量にて発現量変化を解析した。RT-PCRにはTaKaRaより販売されているTB Green Premix Ex Taqを用いた。また、相対量変化解析のリファレンスにはRPS18(ribosomal protein S18)の増幅結果を用いた。
(試験結果:RT-PCRの結果)
 以下結果を表4に示す。結果は、未添加群の値(当該相対定量にて発現量変化)を1とした場合の値で示す。これらの値は、小数点第3位を四捨五入した値である。
 **印は、Dunnett検定において、未添加群の値との比較による有意差(p<0.01)、を示す。
 ***印は、Dunnett検定において、未添加群の値との比較による有意差(p<0.001)、を示す。
 当該試験結果より、NB細胞において、ヒスタミン(ヒアルロン酸分解活性を亢進する物質)の添加により、HYBIDの発現が亢進することを確認した。
[試験3]NB細胞を用いてヒスタミンの誘導によるHYBIDの発現の確認(RT-PCR)
 RT-PCR法を用いて、当該確認を行った。試験2と異なり、この試験3では、カワラヨモギの花の抽出物の添加により、HYBIDの発現が抑制されるかどうかを確認した。
(試験方法の概要)
1.試験で用いる細胞の準備
 NB細胞を準備した。前培養は5%FBSを含むDMEMを使用し、本実験では0.25%FBSを含むDMEMを使用した。5%CO、37℃の条件で培養した。
2.実験群の設定
 6×10個のNB細胞を6well plateに播種し75%コンフルエント状態になるまで培養した。その後、0.25%FBSを含むDMEMに置換し、24時間培養した後、新たな0.25%FBSを含むDMEMに置換した。
 当該置換後のNB細胞に対し、カワラヨモギの花の抽出物を用いて、以下の群を作製した。
(実験群)
・未添加群:当該抽出物及び以下挙げるヒスタミンを添加しなかった群
・コントロール群:当該抽出物を添加しなかったが、以下挙げるヒスタミンを添加した群
・0.125添加群:当該抽出物を最終濃度0.125%添加し、更に以下挙げるヒスタミンを添加した群
・0.25添加群:当該抽出物を最終濃度0.25%添加し、更に以下挙げるヒスタミンを添加した群
・0.5添加群:当該抽出物を最終濃度0.5%添加し、更に以下挙げるヒスタミンを添加した群
・1.0添加群:当該抽出物を最終濃度1.0%添加し、更に以下挙げるヒスタミンを添加した群
 当該群を作製後、さらにCOインキュベーターにて37℃で3時間培養した。この3時間の培養後、細胞を炎症状態とするために、上述の群(未添加群を除く)に対して、ヒスタミンを最終濃度10μMとなるように添加した。当該添加後、COインキュベーターにて37℃で24時間培養した。なお、ヒスタミンの添加は、上述の試験2に記載のように、HYBIDの発現を亢進させるために行った。
3.mRNAの定量
 当該24時間の培養後の細胞より、mRNAを精製した。mRNAの精製にはQIAGEN社より販売されているQIAshreder及びRNeasy Mini Kitを用いた。
 精製したmRNAを鋳型として、TaKaRaより販売されているPrimeScript RT master Mixを用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。以下の表5に示した、それぞれの標的因子に対応するプライマー対を用いて、RT-PCRを行い、相対定量にて発現量変化を解析した。RT-PCRにはTaKaRaより販売されているTB Green Premix Ex Taqを用いた。また、相対量変化解析のリファレンスにはRPS18(ribosomal protein S18)の増幅結果を用いた。
(試験結果:mRNAの定量の結果)
 以下結果を表6に示す。結果は、未添加群の値(当該相対定量にて発現量変化)を1とした場合の値で示す。これらの値は、小数点第3位を四捨五入した値である。
 *印は、Dunnett検定において、コントロール群の値との比較による有意差(p<0.05)、を示す。
 **印は、Dunnett検定において、コントロール群の値との比較による有意差(p<0.01)、を示す。
 ***印は、Dunnett検定において、コントロール群の値との比較による有意差(p<0.001)、を示す。
 当該試験結果より、炎症状態のNB細胞において、カワラヨモギの花の抽出物の添加により、HYBIDの発現を抑制することを確認した。
[試験4]NB細胞及びAD細胞におけるmiR-600の発現の違いの確認
 RT-PCR法を用いて、当該確認を行った。この試験4では、カワラヨモギの花の抽出物の添加により、miR-600の発現が亢進されるかどうかを確認した。マイクロRNA(miRNA)は、タンパク質を作りださない短鎖(20~25塩基)のRNA(ノンコーディングRNA)である。マイクロRNAは、自身と同じ配列をもつ遺伝子のメッセンジャーRNA(mRNA)に結合し、そのmRNAを分解したりタンパク質への翻訳を阻害したりすることでその遺伝子の発現を抑制する。マイクロRNAの1つであるmiR-600は、HYBIDのinhibitor(非特許文献3)である。
(試験方法の概要)
1.試験で用いる細胞の準備
 6×10個のNB細胞及びAD細胞を6well plateに播種し75%コンフルエント状態になるまで培養した。その後、0.25%FBSを含むDMEMに置換し、24時間培養した後、新たな0.25%FBSを含むDMEMに置換した。
2.実験群の設定
 当該置換後のNB細胞及びAD細胞に対し、カワラヨモギの花の抽出物を用いて、以下の群を作製した。
(実験群)
・NB細胞未添加群:NB細胞において、当該抽出物を添加しなかった群
・AD細胞未添加群:NB細胞において、当該抽出物を添加しなかった群
・NB細胞1.0添加群:NB細胞において、当該抽出物を最終濃度1.0%添加した群
・AD細胞1.0添加群:NB細胞において、当該抽出物を最終濃度1.0%添加した群
3.miRNAの定量
 当該群を作製後、さらにCOインキュベーターにて37℃で6時間培養した。この6時間培養後、miRNeasy Tissue/Cells Advanced Mini Kit(Qiagen、Cat.No./ ID: 217684)を用い、totalRNAの精製抽出を行った。その後、リアルタイムPCRを用いたmiRNA(miR-600)の発現量の確認を行った。
 miRNAの発現量を測定するために、Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit (Clontech Laboratories(タカラバイオ)、638313、タカラバイオコード:Z8313N)を用いて、当該total RNAから相補的DNA(cDNA)を合成した。その後、Mir-XTM miRNA qRT-PCR SYBR Kit(Clontech) 、表7に記載のプライマー及びThermal Cycler Dice Real Time System TP800(Clontech Laboratories(タカラバイオ))を使用して、RT-PCRを行った。Delta-delta-CT法により、異なる実験群間のmiRNA発現の違いを比較した。
 なお、当該RT-PCRの温度サイクリング条件(thermal cycling conditions)は以下の通りである。
・ステップ1:95℃で30秒、95℃で5秒、60℃で30秒の2段階PCRを40サイクル行った。
・ステップ2:ステップ1の後、95℃で15秒、60℃で30秒、95℃で15秒のdissociation stepsを1サイクル行った。
(試験結果:miRNAの定量の結果)
 以下結果を表8に示す。結果は、NB細胞未添加群(当該相対定量にて発現量変化)を1とした場合の値で示す。これらの値は、小数点第3位を四捨五入した値である。
 *印は、Student’s t-testにおいて、NB細胞未添加群の値との比較による有意差(p<0.05)、を示す。
 †印は、Student’s t-testにおいて、AD細胞未添加群の値との比較による有意差(p<0.05)、を示す。
 当該試験結果より、以下を確認した。
・未添加群において、NB細胞に比べ、AD細胞において、miR-600の発現が減少したこと。
・AD細胞及びNB細胞において、共に、カワラヨモギの花の抽出物の添加により、miR-600の発現が亢進したこと。
[実施例1]ローションの作製
 下記モニター試験で用いるローションを次のように作製した。表9に記載のように、カワラヨモギの花の抽出物を1%含有したローション(表9ローション)を作製した。表10に記載のように、プラセボローション(当該出物を含有しないローション)を作製した。
(実験5-1:ヒトでの皮膚モニター試験、皮膚外用剤)
 正常なヒト被験者(平均年齢43.6歳の男女13名)の顔の所定部位に、表9記載のローションと、表10記載のプラセボローションとを塗布することにより、2022年1月31日から2022年3月4日の間に試験を行った。表9で示す組成のローションを被験者の顔の半分の所定部位に所定間隔にて塗布し、表10に示すローションを被験者の顔のもう一方の半分の所定部位に所定間隔にて塗布した。この所定間隔は、1日2回ずつ(朝晩)4週間である。所定部位は、「顔全体」である。
 図1に記載のように皮膚のたるみを測定した。被験者の頬に、中心にドーナツ状に穴の開いた粘着テープ(DermaLabTMCombo(COTEX TECHNOLOGY)ELASTICITYプローブ用粘着テープ)の下側にホッチキス針(No.11-1M(マックス株式会社))を引掛けた。図1に示すように、粘着テープの貼付位置を、顔面の鼻下から横に引いたラインと目尻から縦に引いたラインの交点と粘着テープのドーナツ円の内側の下部が重なる交点とした。
 図1記載の分銅は、おもり(5g~20g)である。当該おもりをこの実験5-1で用いた。この実験5-1では、分銅とクリップを紐で固定し、クリップ側をホッチキスの針に引掛けた。なお、この実験5―1では、事前に各被験者に対しおもりを付加し、重力によって頬が1-2mm移動する重さの重りを用いた。
 おもり負荷前と負荷後の顔面の様子をVISIATM Evolution(Canfield Scientific)を用いて左右の顔写真撮影を撮影した。それぞれ試験前と4週間後に撮影を行った。写真加工ソフト(Photoshop)にておもり負荷前と負荷後の撮影した画像を重ね合わせ、画像解析ソフト(Digital Microscope VHX-5000(株式会社キーエンス))にて試験前と4週間後の重り負荷時の粘着テープの移動距離と粘着テープの長さを計測した。実際のおもり負荷時の移動距離は、粘着テープの長さから推定換算値を算出し、比較を行った。当該比較した結果(測定した結果)を表11に示す。表11では、0週の値を1.00として示した。
 表11の*印は、Wilcoxon Rank-Sum Testにおいて、0週の値(表9ローション塗布群)との比較による有意差(p<0.05)、を示す。4週において、表10ローション(プラセボローション)塗布と比べ、表9ローション塗布により、たるみの抑制を確認した。
 なお、4週において、表9ローション塗布群と表10ローション塗布群の値(当該長さ)の比較も行った。この比較の結果は表12に示す。表12の*印は、Wilcoxon Rank-Sum Testにおいて、表10ローション塗布群の値(100.00、とする)との比較による有意差(p<0.05)、を示す。この比較の結果(表12)からも、表10ローション(プラセボローション)塗布と比べ、表9ローション塗布により、たるみの抑制がおきていることを示す。
(実験5-2:ヒトでの皮膚モニター試験その2、皮膚外用剤)
 正常なヒト被験者(平均年齢43.6歳の男女13名)の顔の所定部位に、表9記載のローションと、表10記載のプラセボローションとを塗布することにより、2022年1月31日から2022年3月4日の間に試験を行った。表9で示す組成のローションを被験者の顔の半分の所定部位に所定間隔にて塗布し、表10に示すローションを被験者の顔のもう一方の半分の所定部位に所定間隔にて塗布した。この所定間隔は、1日2回ずつ(朝晩)4週間である。所定部位は、「顔全体」である。
 そして、これらのローションの塗布前の0週目と、ローションを塗布してから4週間目に、測定(まぶたのシワの有無)を行った。まぶたは、上眼瞼、目尻を含む。まぶたのシワの有無の測定を、ANTERA 3D(登録商標、ガデリウス・メディカル株式会社)を用いて行った。
 この実験6の測定は、各塗布群の0週の被験者の測定結果の平均値を「100.00」として、各塗布群の4週の被験者の測定結果を相対値として算出して行った。より詳細に述べると、全ての測定において、0週の値(100.00)は、1人につき1部位で3回測定し、3回測定した平均値を算出し、この算出した平均値を13名分集めて集計した平均値を100とした。4週の測定結果と12週の測定結果は、0週の値と比べての変化率を算出した値である。
 表13でまぶたのシワの有無の測定の結果を示す。表13では、当該4週の測定結果を示す。表13の*印は、Wilcoxon Rank-Sum Testにおいて、表10ローション塗布群の値(100.00、とする)との比較による有意差(p<0.05)、を示す。表13で示すシワの測定では、シワの大きさ(全体の大きさ)及び深度を測定した。表13で示すように、表10で示す組成のローションの塗布と比べ、表9で示す組成のローションの塗布により、シワの大きさが小さくなり、深度も浅くなった。
(実験5-3:ヒトでの皮膚モニター試験その3、皮膚外用剤)
 正常なヒト被験者(平均年齢43.6歳の男女13名)の顔の所定部位に、表9記載のローションと、表10記載のプラセボローションとを塗布することにより、2022年1月31日から2022年3月4日の間に試験を行った。表9で示す組成のローションを被験者の顔の半分の所定部位に所定間隔にて塗布し、表10に示すローションを被験者の顔のもう一方の半分の所定部位に所定間隔にて塗布した。この所定間隔は、1日2回ずつ(朝晩)4週間である。所定部位は、「顔全体」である。
 そして、これらのローションの塗布前の0週目と、ローションを塗布してから4週間目に、測定(皮膚の水分分布の測定)を行った。当該測定を、Corneometer(CM825、C+K社)を用いて行った。以下当該13名の平均値(当該水分分布の測定の平均値)を記載する。
 表9ローション塗布群及び表10ローション塗布群の0日(当該塗布前)の値を100とした場合、当該4週間後において、表9ローション塗布群は107.73(所定の皮膚水分量を保ちやすいこと)であったが、表10ローション塗布群は98.98であった。
[試験6]NB細胞を用いてヒスタミンの誘導によるHYBIDの発現の確認(RT-PCR)
 RT-PCR法を用いて、当該確認を行った。試験2と異なり、この試験6では、カワラヨモギの花の抽出物又はスイカズラの抽出物の添加により、HYBIDの発現が抑制されるかどうかを確認した。なお、この試験6で用いた抽出物は以下である。
・ファルコレックススイカズラFB:スイカズラの花の抽出物、一丸ファルコス株式会社
・ファルコレックスカワラヨモギB:カワラヨモギの花の抽出物、一丸ファルコス株式会社
(試験方法の概要)
1.試験で用いる細胞の準備
 NB細胞を準備した。前培養は5%FBSを含むDMEMを使用し、本実験では0.25%FBSを含むDMEMを使用した。5%CO、37℃の条件で培養した。
2.実験群の設定
 6×10個のNB細胞を6well plateに播種し75%コンフルエント状態になるまで培養した。その後、0.25%FBSを含むDMEMに置換し、24時間培養した後、新たな0.25%FBSを含むDMEMに置換した。
 当該置換後のNB細胞に対し、カワラヨモギの花の抽出物を用いて、以下の群を作製した。
(実験群)
・未添加群:当該抽出物及び以下挙げるヒスタミンを添加しなかった群。
・コントロール群:当該抽出物を添加しなかったが、以下挙げるヒスタミンを添加した群。
・0.125スイカズラFB添加群:ファルコレックススイカズラFBを最終濃度0.125%添加し、更に以下挙げるヒスタミンを添加した群。
・0.25スイカズラFB添加群:ファルコレックススイカズラFBを最終濃度0.25%添加した群。
・0.5スイカズラFB添加群:ファルコレックススイカズラFBを最終濃度0.5%添加し、更に以下挙げるヒスタミンを添加した群。
・1.0スイカズラFB添加群:ファルコレックススイカズラFBを最終濃度1.0%添加し、更に以下挙げるヒスタミンを添加した群。
・0.125カワラヨモギB添加群:ファルコレックスカワラヨモギBを最終濃度0.125%添加し、更に以下挙げるヒスタミンを添加した群。
・0.25カワラヨモギB添加群:ファルコレックスカワラヨモギBを最終濃度0.25%添加し、更に以下挙げるヒスタミンを添加した群。
・0.5カワラヨモギB添加群:ファルコレックスカワラヨモギBを最終濃度0.5%添加し、更に以下挙げるヒスタミンを添加した群。
・1.0カワラヨモギB添加群:ファルコレックスカワラヨモギBを最終濃度1.0%添加し、更に以下挙げるヒスタミンを添加した群。
 当該群を作製後、さらにCOインキュベーターにて37℃で3時間培養した。この3時間の培養後、細胞を炎症状態とするために、上述の群(未添加群を除く)に対して、ヒスタミンを最終濃度10μMとなるように添加した。当該添加後、COインキュベーターにて37℃で24時間培養した。なお、ヒスタミンの添加は、上述の試験2に記載のように、HYBIDの発現を亢進させるために行った。
3.mRNAの定量
 当該24時間の培養後の細胞より、mRNAを精製した。mRNAの精製にはQIAGEN社より販売されているQIAshreder及びRNeasy Mini Kitを用いた。
 精製したmRNAを鋳型として、TaKaRaより販売されているPrimeScript RT master Mixを用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。以下の表14に示した、それぞれの標的因子に対応するプライマー対を用いて、RT-PCRを行い、相対定量にて発現量変化を解析した。RT-PCRにはTaKaRaより販売されているTB Green Premix Ex Taqを用いた。また、相対量変化解析のリファレンスにはRPS18(ribosomal protein S18)の増幅結果を用いた。
(試験結果:mRNAの定量の結果)
 以下結果を表15に示す。結果は、未添加群の値(当該相対定量にて発現量変化)を1とした場合の値で示す。
 *印は、Dunnett検定において、未添加群の値との比較による有意差(p<0.05)、を示す。
 ***印は、Dunnett検定において、未添加群の値との比較による有意差(p<0.001)、を示す。
 当該試験結果より、炎症状態のNB細胞において、スイカズラFBの添加でもカワラヨモギBの添加により、HYBIDの発現を抑制することを確認した。
[試験7]NB細胞を用いてIL-1βの誘導によるHYBIDの発現の確認(RT-PCR)
 RT-PCR法を用いて、当該確認を行った。試験2と異なり、この試験7では、カワラヨモギの花の抽出物又はスイカズラの抽出物の添加により、HYBIDの発現が抑制されるかどうかを確認した。なお、この試験7で用いた抽出物は以下です。
・ファルコレックススイカズラFB:スイカズラの花の抽出物、一丸ファルコス株式会社
・ファルコレックススイカズラSB:スイカズラの葉の抽出物、一丸ファルコス株式会社
・ファルコレックスカワラヨモギB:カワラヨモギの花の抽出物、一丸ファルコス株式会社
(試験方法の概要)
1.試験で用いる細胞の準備
 NB細胞を準備した。前培養は5%FBSを含むDMEMを使用し、本実験では0.25%FBSを含むDMEMを使用した。5%CO、37℃の条件で培養した。
2.実験群の設定
 6×10個のNB細胞を6well plateに播種し75%コンフルエント状態になるまで培養した。その後、0.25%FBSを含むDMEMに置換し、24時間培養した後、新たな0.25%FBSを含むDMEMに置換した。
 当該置換後のNB細胞に対し、カワラヨモギの花の抽出物を用いて、以下の群を作製した。
(実験群)
・未添加群:当該抽出物及び以下挙げるIL-1βを添加しなかった群
・コントロール群:当該抽出物を添加しなかったが、以下挙げるIL-1βを添加しなかった群。
・1.0スイカズラFB添加群:ファルコレックススイカズラFBを最終濃度1.0%添加し、以下挙げるIL-1βを添加しなかった群。
・1.0スイカズラSB添加群:ファルコレックススイカズラSBを最終濃度1.0%添加し、以下挙げるIL-1βを添加しなかった群。
・1.0カワラヨモギB添加群:ファルコレックスカワラヨモギBを最終濃度1.0%添加し、以下挙げるIL-1βを添加しなかった群。
 当該群を作製後、さらにCOインキュベーターにて37℃で3時間培養した。この3時間の培養後、細胞を炎症状態とするために、上述の群(未添加群を除く)に対して、IL-1βを最終濃度50ng/mLとなるように添加した。当該添加後、COインキュベーターにて37℃で24時間培養した。なお、ヒスタミンの添加は、上述の試験2に記載のように、HYBIDの発現を亢進させるために行った。
3.mRNAの定量
 当該24時間の培養後の細胞より、mRNAを精製した。mRNAの精製にはQIAGEN社より販売されているQIAshreder及びRNeasy Mini Kitを用いた。
 精製したmRNAを鋳型として、TaKaRaより販売されているPrimeScript RT master Mixを用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。以下の表16に示した、それぞれの標的因子に対応するプライマー対を用いて、RT-PCRを行い、相対定量にて発現量変化を解析した。RT-PCRにはTaKaRaより販売されているTB Green Premix Ex Taqを用いた。また、相対量変化解析のリファレンスにはRPS18(ribosomal protein S18)の増幅結果を用いた。
(試験結果:mRNAの定量の結果)
 以下結果を表17に示す。結果は、未添加群の値(当該相対定量にて発現量変化)を1とした場合の値で示す。
 **印は、Dunnett検定において、未添加群の値との比較による有意差(p<0.01)、を示す。
 ***印は、Dunnett検定において、未添加群の値との比較による有意差(p<0.001)、を示す。
 当該試験結果より、炎症状態のNB細胞において、スイカズラFBの添加でも、スイカズラSBの添加でも、カワラヨモギBの添加により、HYBIDの発現を抑制することを確認した。
[試験8]含有するHAのサイズ違いによる効果の違いの確認
 コラーゲンゲルを用いて、HAのサイズの違いにより、水溶性ゲルの構造の維持の違いの有無を確認した。
(試験方法の概要)
1.試験で用いるゲルの準備
 コラーゲンゲル培養キット(Collagen Gel Culturing Kit、新田ゼラチン、638-00781)を用いて、当該638-00781の手順書に沿ってゲルを作製した。なお、コラーゲンゲルを用いた実験は、例えば非特許文献4に記載されている。
2.ヒアルロン酸(HA)の準備
 以下のHAを準備した。
・H2:分子量が1200kDa~1600kDaのHA
・U2:分子量が5kDa~10kDaのHA
3.実験群の設定
 当該ゲルに、上述のHAを最終濃度50μg/mLとなるように添加し、以下の群を作製した。
(実験群)
・H2添加群:H2を添加した群
・U2添加群:U2を添加した群
 当該実験群を作製後、37℃で30分静置した。当該静置後、実験群(ゲル)の状態を目視で確認して、ゲルの高さを測定した。
 図2に当該実験群(ゲル)の状態を示した。ゲルの高さを測定したところ、H2添加群の値を100とすると、U2添加群は90であった。よって、U2添加群は、H2添加群と比べ、図2の矢印の程度、ゲルが小さくなった。当該ゲルが小さくなったことは、U2添加群がH2添加群と比べ水分子を保持する能力が小さくなり水溶性ゲルの構造を維持できないことである。よって、この試験8では、当該構造の維持のために、HAの分子量が重要な要件であることが示唆された。
[試験9]NB細胞を用いて、カワラヨモギの花の抽出物の添加によるHYBIDの発現の確認(RT-PCR)
 RT-PCR法を用いて、当該確認を行った。
(試験方法の概要)
1.試験で用いる細胞の準備
 NB細胞を準備した。前培養は10%FBSを含むDMEMを使用し、本実験では0.25%FBSを含むDMEMを使用した。5%CO、37℃の条件で培養した。
 6×10個のNB細胞を6well plateに播種し75%コンフルエント状態になるまで培養した。その後、0.25%FBSを含むDMEMに置換し、24時間培養した後、新たな0.25%FBSを含むDMEMに置換した。
2.実験群の設定
 当該置換後のNB細胞に対し、カワラヨモギの花の抽出物を用いて、以下の群を作製した。
(実験群)
・未添加群:当該抽出物を添加しなかった群
・1.0添加群:カワラヨモギの花の抽出物を最終濃度1.0μM添加した群
3.RT-PCR
 当該群を作製後、さらにCOインキュベーターにて37℃で3時間培養した。当該3時間の培養後、新たな0.25%FBSを含むDMEMに置換した。当該置換後の培地にて、CO2インキュベーターにて37℃で24時間培養した。この24時間培養後の細胞より、mRNAを精製した。mRNAの精製にはQIAGEN社より販売されているQIAshreder及びRNeasy Mini Kitを用いた。
 精製したmRNAを鋳型として、TaKaRaより販売されているPrimeScript RT master Mixを用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。以下の表18に示した、それぞれの標的因子に対応するプライマー対を用いて、RT-PCRを行い、相対定量にて発現量変化を解析した。RT-PCRにはTaKaRaより販売されているTB Green Premix Ex Taqを用いた。また、相対量変化解析のリファレンスにはRPS18(ribosomal protein S18)の増幅結果を用いた。
(試験結果:RT-PCRの結果)
 以下結果を表19に示す。結果は、未添加群の値(当該相対定量にて発現量変化)を1(1.00)とした場合の値で示す。これらの値は、小数点第3位を四捨五入した値である。
 ***印は、Studentのt検定において、未添加群の値との比較による有意差(p<0.001)、を示す。
 当該試験結果より、NB細胞において、カワラヨモギの花の抽出物の添加により、HYBIDの発現を抑制することを確認した。
[試験10]AD細胞及びNB細胞を用いて、カワラヨモギの花の抽出物の添加によるHYBIDの発現の確認(RT-PCR)
 RT-PCR法を用いて、当該確認を行った。
(試験方法の概要)
1.試験で用いる細胞の準備
 AD細胞及びNB細胞を準備した。前培養は10%FBSを含むDMEMを使用し、本実験では0.25%FBSを含むDMEMを使用した。5%CO、37℃の条件で培養した。
 6×10個のAD細胞又は6×10個のNB細胞を6well plateに播種し75%コンフルエント状態になるまで培養した。その後、0.25%FBSを含むDMEMに置換し、24時間培養した後、新たな0.25%FBSを含むDMEMに置換した。
2.実験群の設定
 当該置換後のAD細胞又はNB細胞に対し、カワラヨモギの花の抽出物を用いて、以下の群を作製した。
(実験群)
・NB未添加群:NB細胞を用いて当該抽出物を添加しなかった群
・AD未添加群:AD細胞を用いて当該抽出物を添加しなかった群
・AD1.0添加群:AD細胞を用いてカワラヨモギの花の抽出物を最終濃度1.0μM添加した群
3.RT-PCR
 当該群を作製後、さらにCOインキュベーターにて37℃で3時間培養した。当該3時間の培養後、新たな0.25%FBSを含むDMEMに置換した。当該置換後の培地にて、CO2インキュベーターにて37℃で24時間培養した。この24時間培養後の細胞より、mRNAを精製した。mRNAの精製にはQIAGEN社より販売されているQIAshreder及びRNeasy Mini Kitを用いた。
 精製したmRNAを鋳型として、TaKaRaより販売されているPrimeScript RT master Mixを用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。以下の表20に示した、それぞれの標的因子に対応するプライマー対を用いて、RT-PCRを行い、相対定量にて発現量変化を解析した。RT-PCRにはTaKaRaより販売されているTB Green Premix Ex Taqを用いた。また、相対量変化解析のリファレンスにはRPS18(ribosomal protein S18)の増幅結果を用いた。
(試験結果:RT-PCRの結果)
 以下結果を表21に示す。結果は、NB未添加群の値(当該相対定量にて発現量変化)を1とした場合の値で示す。これらの値は、小数点第2位を四捨五入した値である。
 ***印は、Dunnett検定において、AD未添加群の値との比較による有意差(p<0.001)、を示す。
 当該試験結果より、AD細胞において、カワラヨモギの花の抽出物の添加によりHYBIDの発現を抑制すること(NB細胞程度のHYBIDの発現となったこと)、を確認した。
[試験11]NB細胞を用いてのHAの分布の確認
 当該確認を行った。ヒスタミンを添加してHYBIDが亢進されやすい条件でのNB細胞において、カワラヨモギの花の抽出物の添加により、当該細胞におけるHAの分布(当該細胞においてどの大きさのHAが存在するか)を確認した。
(試験方法の概要)
1.試験で用いる細胞の準備
 NB細胞を準備した。前培養は10%FBSを含むDMEMを使用し、本実験では0.25%FBSを含むDMEMを使用した。5%CO、37℃の条件で培養した。
2.実験群の設定
 6×10個のNB細胞を6well plateに播種し75%コンフルエント状態になるまで培養した。その後、0.25%FBSを含むDMEMに置換し、24時間培養した後、新たな0.25%FBSを含むDMEMに置換した。
 当該置換後のNB細胞に対し、カワラヨモギの花の抽出物を用いて、以下の群を作製した。
(実験群)
・未添加群:当該抽出物及び以下挙げるヒスタミンを添加しなかった群
・コントロール群:当該抽出物を添加しなかったが、ヒスタミンを添加した群
・0.5添加群:当該抽出物を最終濃度0.5%添加し、更にヒスタミンを添加した群
・1.0添加群:当該抽出物を最終濃度1.0%添加し、更にヒスタミンを添加した群
 当該群を作製後、さらにCOインキュベーターにて37℃で3時間培養した。この3時間の培養後、細胞を炎症状態とするために、上述の群(未添加群を除く)に対して、ヒスタミンを最終濃度10μMとなるように添加した。当該添加後、COインキュベーターにて37℃で2時間培養した。なお、ヒスタミンの添加は、上述の試験6に記載のように、HYBIDの発現を亢進させるために行った。
3.HAの添加
 培地を交換せずに当該2時間の培養後の細胞に対して、フルオレセインアミン標識ヒアルロン酸ナトリウム(H2、平均分子量120万~160万、FAHA-H2、岩井化学薬品株式会社)を添加した。添加後、COインキュベーターにて37℃で48時間培養した。当該48時間の培養後、培養液を回収した。なお、当該FAHAを用いている実験例は、例えば、非特許文献5(Figure4)、非特許文献6(Figure1、Supplemental Figure1)に記載されている。
4.HPLCを用いてのHAの分布
 当該培養液を用いて当該分布の確認を行った。HPLCの条件は以下である。当該確認した結果を図3に示す。
(HPLCの条件)
装置:SHIMADZU LC-20A Prominence
カラム:TSKgel G5000PWXL(Tosoh Corporation)
溶離液:0.2mol/L NaCl
流速:0.5mL/min
検出器波長:励起波長 490nm 蛍光波長 525nm
 図3に示す各群のピークトップの蛍光強度を以下表22に示す。表22において、未添加群の値(強度)を100として示し、他の群の値は小数点第4位を四捨五入して示す。ヒスタミンを添加した群(コントロール群、0.5添加群、1.0添加群)では、未添加群に比べ、ピークトップが低かった。当該低かったことは、ヒスタミンによりHYBIDが亢進された状態で、HYBIDにより、一定数のヒアルロン酸が断片に分解されたことが示唆される。
 ヒスタミンを添加した群において、カワラヨモギの花の抽出物を添加した群(0.5群、1.0群)では、コントロール群と比べ、当該ピークトップが高かった。よって、カワラヨモギの花の抽出物の添加により、HYBIDの作用が抑制され、ヒアルロン酸の当該分解が抑制されたことが示唆される。
 以上、本発明の実施の形態(実施例も含め)について、図面を参照して説明してきたが、本発明の具体的構成は、これに限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、設計変更等があっても、本発明に含まれるものである。
 本発明は、例えば、ヒトなどの皮膚などにおけるヒアルロン酸の構造を維持するための組成物(化粧品等)、及び/又はこれらに配合する素材(剤)などに利用される。

Claims (2)

  1.  ヒアルロン酸の構造を維持するための剤であって、
    カワラヨモギの花の抽出物を含有し、
    当該ヒアルロン酸は分子量が600から2000kDaである、当該剤。
  2.  当該ヒアルロン酸は分子量が1200から1600kDaである、請求項1に記載の剤。

     
PCT/JP2023/022912 2022-06-22 2023-06-21 ヒアルロン酸の構造を維持するための剤 WO2023249046A1 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022-099992 2022-06-22
JP2022099992 2022-06-22
JP2023020008 2023-02-13
JP2023-020008 2023-02-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023249046A1 true WO2023249046A1 (ja) 2023-12-28

Family

ID=89379944

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/022912 WO2023249046A1 (ja) 2022-06-22 2023-06-21 ヒアルロン酸の構造を維持するための剤

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023249046A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013237658A (ja) * 2012-05-17 2013-11-28 Ominedo Yakuhin Kogyo Kk アディポネクチン産生促進用組成物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013237658A (ja) * 2012-05-17 2013-11-28 Ominedo Yakuhin Kogyo Kk アディポネクチン産生促進用組成物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GNPD MINTEL; 15 February 2012 (2012-02-15), BENEFIT, UK: "Moisture Prep Toning Lotion", XP093120914, Database accession no. 1737710 *
DATABASE GNPD MINTEL; 25 April 2022 (2022-04-25), 93120911: "Morning Matrix Performance Day Cream", XP093120911, Database accession no. 9556996 *
DATABASE GNPD MINTEL; ALBION, JAPAN: "White Surge Solution W", XP093120915, Database accession no. 9506670 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4425163B2 (ja) 抗老化化粧料
JP6389308B1 (ja) 皮膚外用剤
JP2023091082A (ja) アンチポリューション剤及び皮膚外用組成物
JP2006265120A (ja) コラーゲン合成促進剤
WO2023249046A1 (ja) ヒアルロン酸の構造を維持するための剤
JP2019194176A (ja) R−spondin1の産生促進剤
JP7450903B2 (ja) 前駆脂肪細胞の増殖及び分化促進剤
JP2016509040A (ja) ケウインの化粧料使用
JP5462491B2 (ja) プロアントシアニジン三量体
WO2024048489A1 (ja) レチノール様作用の誘導に用いるための剤およびその用途
JP7144878B1 (ja) エラスチン産生促進のための剤
JP7451005B1 (ja) ヘレナリン誘導体を含有する前駆脂肪細胞の増殖及び/又は分化促進剤
JP2024035284A (ja) ヒアルロン酸産生促進剤
JP2003128573A (ja) ヒアルロン酸産生促進剤、及びこれを含有して成る皮膚外用剤
WO2024100919A1 (ja) スフィンゴイド塩基を含む掻痒抑制に用いるための剤およびその用途
EP1009378A1 (fr) Utilisations d'extraits de la plante rhoeo discolor dans le domaine de la cosmetique et de la pharmacie, notamment de la dermatologie
CN115209867B (zh) 毛发生长促进用和/或白发改善用组合物
JP2021134215A (ja) プロテアソーム活性化剤
JP7485336B2 (ja) MSX-2 mRNA発現促進剤、まつ毛の育毛剤、及びまつ毛の育毛用外用剤組成物
WO2021177430A1 (ja) 育毛促進用及び/又は白髪改善用組成物
JP6920787B2 (ja) 皮脂分泌促進剤及びその利用
JP6732495B2 (ja) 皮脂分泌抑制用組成物
JP2018070524A (ja) 表皮細胞賦活剤
JP2024075916A (ja) 皮膚の糖化を抑制するための剤
JP2020138932A (ja) Abca12遺伝子発現促進剤

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23827229

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1