WO2021177430A1

WO2021177430A1 - 育毛促進用及び／又は白髪改善用組成物

Info

Publication number: WO2021177430A1
Application number: PCT/JP2021/008587
Authority: WO
Inventors: 雅和橋本; 小島　弘之; 有香河合; 雅義大山
Original assignee: 一丸ファルコス株式会社
Priority date: 2020-03-05
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2021-09-10

Abstract

【課題】Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１産生促進作用を有する化合物を見出し、当該化合物を用いて育毛促進及び／又は白髪改善用組成物を提供する。【解決手段】下記式（Ｉ）：　で表される化合物又はその塩を有効成分として含む、育毛促進用組成物又は白髪改善剤。

Description

育毛促進用及び／又は白髪改善用組成物

クロスリファレンス

　本出願は、日本国において、２０２０年３月５日に出願された特願２０２０－０３７７１８号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。また、本願において引用した全ての特許、特許出願及び文献に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。

　本発明は、育毛促進用及び／又は白髪改善用組成物に関し、例えば、２－Ｏ－フェルロイル－Ｌ－リンゴ酸を含む育毛促進用及び／又は白髪改善用組成物に関する。

　髪の毛を生み出す器官である毛包は、胎児期に形成され、周期的なヘアサイクルにより、毛包器官の再生を繰り返している。毛包形成のメカニズムは以下のように考えられている。最初に、毛乳頭細胞からの発毛シグナルにより分裂を開始した外毛根鞘細胞が真皮深層に向かいながら、毛乳頭細胞の直上に毛母領域を形成する。毛母領域を構成する細胞が毛母細胞と呼ばれているが、さらに増殖分化して毛幹と内毛根鞘細胞を形成する。外毛根鞘細胞のバルジ領域と二次毛芽となる部分には、幹細胞マーカーとされているＬＧＲ５（Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ５）を発現する細胞が存在する。ＬＧＲ５陽性細胞はＷｎｔシグナルに依存して増殖し、毛包の恒常性維持に寄与している毛包増殖細胞とされている。成長期への導入と維持の調整に深く関与するＬＧＲ５は長らくオーファン受容体とされてきたが、近年、分泌タンパク質Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ（ＲＳＰＯ：本明細書および図面では、ＲＳＰＯとも表記する）をリガンドとすることが報告された（非特許文献１～４）。

　Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎは、Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎシグナル伝達経路の強力な増強物質として単離された４つの分泌タンパク質（ＲＳＰＯ１－４）のファミリーである。これらのタンパク質は、４０～６０％の配列同一性を有し、トロンボスポンジン様ドメイン及びフーリン様ドメインを持った類似構造を有する。アブラナ科に属する植物であるＮａｓｔｕｒｔｉｕｍ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ（オランダガラシ、和蘭芥子）の抽出物が、このＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ１の産生を促進することが報告されている（特許文献１）。Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１は、毛乳頭細胞で産生し、毛包形成の休止期末期から成長期にかけて増加し、毛包幹細胞を活性化することから、これを用いた育毛などを促進する組成物が提案されている。しかしながら、オランダガラシ抽出物に含まれる育毛等促進に関わる有効成分は、未だ明らかではない。

Ｃａｒｍｏｎ　ＫＳ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２０１１　Ｊｕｌ　１２；１０８（２８）：１１４５２－７．ｄｅ　Ｌａｕ　Ｗ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１　Ｊｕｌ　　４；４７６（７３６０）：２９３－７．Ｇｌｉｎｋａ　Ａ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｒｅｐ．２０１１　Ｓｅｐ　３０；１２（１０）：１０５５－６１．Ｙｏｏｎ　ＪＫ，Ｌｅｅ　ＪＳ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌ．２０１２　Ｆｅｂ；２４（２）：３６９－７７．

特開２０１９－１９４１７６号公報

　本発明は、オランダガラシなどに含まれる、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１産生促進作用を有する化合物を見出し、当該化合物を用いて育毛促進用及び／又は白髪改善用組成物を提供することなどを目的とする。

　本発明は上記課題を解決するためになされたものであって、オランダガラシ抽出物から、カラムクロマトグラフィー等を用いて分画、精製した特定の化合物が、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１産生促進作用、並びにヒトでの育毛及び／又は抗白髪作用を有することなどを見出すことによって完成した。

　すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。
（１）下記式（Ｉ）：

で表される化合物又はその塩を有効成分として含む、育毛促進用組成物。
（２）上記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を有効成分として含む、白髪改善用組成物。
（３）上記式（Ｉ）で表される化合物が、２－Ｏ－フェルロイル－Ｌ－リンゴ酸である（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）上記（１）又は（２）のいずれか一項に記載の組成物を含有する皮膚外用剤。
（５）上記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を有効成分として含む組成物を用いて、毛乳頭細胞におけるＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ１の産生を促進することを含む、育毛促進及び／又は白髪改善のための美容方法。

　本発明の組成物は、例えば、ヒトでの育毛促進及び／又は白髪改善のために用いることができる。

図１は、オランダガラシ抽出物からの有効成分の精製方法を示すフロー図である。図２は、オランダガラシ抽出物を粗分画して得たＦｒ．０１のＨＰＬＣによる分析結果である。図３は、オランダガラシ抽出物を精製して得たＦｒ．２１のＨＰＬＣによる分析結果である。図４は、オランダガラシ抽出物の各精製画分を培地中に添加して、ヒト乳頭細胞を培養したときのＲＳＰＯ１産生量を測定した結果である。図５は、有効成分を含有するローションをヒト被験者に適用したときの白髪改善等確認試験の結果を示すマイクロスコープ画像である。図６は、ヒト表皮角化細胞を用いて、ＲＳＰＯ１の作用機序の解析を行った結果である。

（定義）
　本明細書において、「育毛」とは、「現在ある髪の毛を健康に保ち、抜け毛を防ぎ、強い髪にする」ことである（日本毛髪業協会による育毛の定義）。本発明における育毛作用も基本的にはこのような作用を指し、より具体的には、例えば毛髪の太さ、色艶や光沢の改善、特に白髪の改善を含む。その作用が顕著な場合の例として、頭皮のすでに脱毛している部分に頭髪が再び見られるようになる（いわゆる発毛）ことなどを含めた、広義の作用をいう。

　毛髪や皮膚の色を決定するメラニン色素は、メラノサイト（メラニン合成細胞）内のメラノソームでチロシンから生合成される。白髪は、老化やストレス等により、メラノサイトやメラノソームの減少、またはこれら細胞や器官の異常によるチロシナーゼの量や活性の低下、メラノソームの輸送阻害等が関与すると考えられている。日本人の場合、黒色又は茶褐色などの髪が一般に好まれるが、加齢の結果として白髪が多く現れる。これは、毛根部などに存在するメラノサイトの数や活性の低下によりメラニンが著しく減少することによるもので、美容的および心理的にも敬遠される傾向にある。

　したがって、本明細書において、「白髪改善」とは、メラノサイト等のメラニン産生細胞に作用して毛髪色素の生成を促すことをいう。具体的には、例えば、黒髪、栗毛、金髪、赤毛等の状態の毛髪やその頭皮部に予防的に適用して、その適用を受けた毛髪が白髪やより退色した状態になるのを防ぐこと等を意味し、改善とは、例えば、白髪や退色した状態となった毛髪やその頭皮部に適用して、もとの黒髪、栗毛、金髪、赤毛等の状態にしたり、より有色に着色した状態にしたりすること等を意味している。

（有効成分）
　本実施形態の育毛促進及び／又は白髪改善用組成物は、下記式（Ｉ）：

で表される化合物若しくはその異性体またはそれらの塩を有効成分として含有する。上記式（Ｉ）で表される化合物は、２位に不斉炭素原子を含み、かつ７’位と８’位の炭素原子間の二重結合はトランス型（Ｚ）の立体配座を有する。したがって、有効成分としては、これらの位置に関する光学異性体、ラセミ体及び／又は幾何異性体を含む。本発明者らはオランダガラシのエタノール抽出液からＨＰＬＣにより精製して得られた式（Ｉ）で表される化合物である２－Ｏ－フェルロイル－Ｌ－リンゴ酸が、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１産生を促進し、並びにヒトでの育毛促進及び／又は白髪改善のための主な有効成分であることを見出した。したがって、本発明の有効成分は、オランダカラシなどの薬用植物から有機溶媒抽出およびカラムクロマトグラフィー精製により製造することができる。あるいは、公知の方法を用いた化学合成法により製造してもよい。例えば、市販されている出発原料であるＬ－リンゴ酸とフェルラ酸とを、カルボジイミドを縮合剤として用いるシュテークリヒエステル化（Ｓｔｅｇｌｉｃｈ　ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）反応により合成することもできる（Ｆｌｏｒｅｎｔ　Ａｌｌａｉｓ，　Ｓｏｐｈｉｅ　Ｍａｒｔｉｎｅｔ，　ａｎｄ　Ｐａｕｌ－Ｈｅｎｒｉ　Ｄｕｃｒｏｔ，　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　２００９（２１）：３５７１－３５７８）。

　本実施形態の有効成分をオランダガラシから抽出する場合、抽出原料として使用し得る部位としては、例えば、葉、茎、花、根、地上部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは葉及び地上部である。抽出方法としては、水または有機溶媒（エタノール溶液など）にて抽出することができ、好ましくは、５０％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いる。本実施形態においては、オランダガラシの全草を用いたエタノール抽出物を用いることが好ましい。

　なお、本発明の有効成分は、遊離体のままでもよいが、カルボキシル基又はヒドロキシ基が適度な酸性を有する場合は塩の形態であってもよい。カルボキシル基又はヒドロキシ基の塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩類；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩類；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩；Ｎ，Ｎ－ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩；ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩；アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸塩；テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アンモニウム塩等が挙げられる。また、本発明の化合物（１）の遊離体又はカルボキシル基又はヒドロキシ基の塩は、水和物として存在することもある。

　また、本発明の有効成分である式（Ｉ）で表される化合物は、分子内に不斉炭素を一つ有するが、いずれかの光学異性体であってもよいし、ラセミ体であってもよい。

（育毛促進用及び／又は白髪改善用組成物に含まれる上記式（Ｉ）で表される化合物の含有量）
　本実施形態の組成物における、上記式（Ｉ）で表される化合物の含有量は、特に限定されるものではない。例えば、上記式（Ｉ）で表される化合物の含有量は、本発明の組成物の全重量に対して、好ましくは１×１０^－５質量％以上、より好ましくは５×１０^－５質量％以上であり、さらに好ましくは１×１０^－４質量％以上である。また、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．５質量％以下、さらに好ましくは０．１質量％以下である。組成物の形態は、液体だけでなく、例えば固形物等も挙げられる。

（皮膚外用剤に含まれる上記式（Ｉ）で表される化合物の含有量）
　当該組成物が含有される本実施形態の皮膚外用剤における、上記式（Ｉ）で表される化合物の含有量は、その投与形態および投与方法等を考慮し、育毛促進及び／又は白髪改善効果が得られるような量であればよく、特に限定されるものではない。例えば、上記式（Ｉ）で表される化合物の含有量は、当該皮膚外用剤の全重量に対して、好ましくは２．０×１０^－７質量％以上、より好ましくは１．０×１０^－７質量％以上であり、さらに好ましくは２．０×１０^－６質量％以上である。また、好ましくは２．０×１０^－２質量％以下、より好ましくは１．０×１０^－２質量％以下、さらに好ましくは２．０×１０^－３質量％以下である。

（皮膚外用剤の形態）
　本発明による皮膚外用剤は、アンプル、カプセル、粉末、顆粒、液体、ゲル、気泡、エマルジョン、シート、ミスト、スプレー剤等利用上の適当な形態の１）医薬品類、２）医薬部外品類、３）局所用又は全身用の皮膚外用剤類（例えば、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料、固形石鹸、液体ソープ、ハンドウォッシュ等の洗顔料や皮膚洗浄料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、除毛剤、脱毛剤、髭剃り処理料、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧料、香水類、美爪剤、美爪エナメル、美爪エナメル除去剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤等）、４）頭皮・頭髪に適用する薬用又は／及び化粧用の製剤類（例えば、シャンプー剤、リンス剤、ヘアートリートメント剤、プレヘアートリートメント剤、パーマネント液、染毛料、整髪料、ヘアートニック剤、育毛・養毛料、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、エアゾール剤等）、５）浴湯に投じて使用する浴用剤、６）その他、腋臭防止剤や消臭剤、制汗剤、衛生用品、衛生綿類、ウエットティシュ等が挙げられる。

（皮膚外用剤の構成成分）
　また、このような剤には、必要に応じて、本発明の効果を損ねない範囲で以下に例示する成分や添加剤を任意に選択・併用して製造することができ、これらの処方系中への配合量は、特に規定するものではないが、通常、０．０００１～５０％程度が好ましいと考えられる。

（１）各種油脂類
　アボカド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）等。

（２）ロウ類
　ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等。

（３）鉱物油
　流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等。

（４）脂肪酸類
　ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、１２－ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の天然脂肪酸、イソノナン酸、カプロン酸、２－エチルブタン酸、イソペンタン酸、２－メチルペンタン酸、２－エチルヘキサン酸、イソペンタン酸等の合成脂肪酸。

（５）アルコール類
　エタノール、イソプロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール等の天然アルコール、２－ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、２－オクチルドデカノール等の合成アルコール。

（６）多価アルコール類
　酸化エチレン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、酸化プロピレン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、ガラクチトール、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール、マルチトール等。

（７）エステル類
　ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコール等。

（８）金属セッケン類
　ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛、ミリスチン酸マグネシウム、ラウリン酸亜鉛、ウンデシレン酸亜鉛等。

（９）ガム質、糖類又は水溶性高分子化合物
　アラビアゴム、ベンゾインゴム、ダンマルゴム、グアヤク脂、アイルランド苔、カラヤゴム、トラガントゴム、キャロブゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン（Ｃ２～Ｃ４）オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル（Ｃ２～Ｃ４）キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等。

（１０）界面活性剤
　アニオン界面活性剤（アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩）、カチオン界面活性剤（アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩）、両性界面活性剤：カルボン酸型両性界面活性剤（アミノ型、ベタイン型）、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、非イオン界面活性剤（エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤）、その他の界面活性剤（天然界面活性剤、タンパク質加水分解物の誘導体、高分子界面活性剤、チタン・ケイ素を含む界面活性剤、フッ化炭素系界面活性剤）等。

（１１）各種ビタミン類
　ビタミンＡ群：レチノール、レチナール（ビタミンＡ１）、デヒドロレチナール（ビタミンＡ２）、カロチン、リコピン（プロビタミンＡ）、ビタミンＢ群：チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ群：ビタミンＣ酸又はその誘導体、ビタミンＤ群：エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、ジヒドロタキステロール、ビタミンＥ群：ビタミンＥ又はその誘導体、ユビキノン類、ビタミンＫ群：フィトナジオン（ビタミンＫ１）、メナキノン（ビタミンＫ２）、メナジオン（ビタミンＫ３）、メナジオール（ビタミンＫ４）、その他、必須脂肪酸（ビタミンＦ）、カルニチン、フェルラ酸、γ－オリザノール、オロット酸、ビタミンＰ類（ルチン、エリオシトリン、ヘスペリジン）、ビタミンＵ等。

（１２）各種アミノ酸類
　バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等。

（１３）植物又は動物系原料由来の種々の添加物
　これらは、添加しようとする製品種別、形態に応じて常法的に行われる加工（例えば、粉砕、製粉、洗浄、加水分解、醗酵、精製、圧搾、抽出、分画、ろ過、乾燥、粉末化、造粒、溶解、滅菌、ｐＨ調整、脱臭、脱色等を任意に選択、組み合わせた処理）を行い、各種の素材から任意に選択して供すれば良い。

（作用効果）
　本実施形態の組成物は、毛乳頭細胞におけるＲＳＰＯ１の産生を促進することで、毛の成長を促すとともに白髪改善作用も有すると考えられる。毛包形成に関わるＲＳＰＯ類は毛乳頭細胞で産生しており、特にＲＳＰＯ１は休止期末期から成長期にかけて著しく増加し、毛包幹細胞を活性化する。すなわち、毛乳頭細胞の活性化並びに毛乳頭細胞からのＲＳＰＯ１の産生促進及び／又は低下抑制は、バルジおよび外毛根鞘細胞に存在するＬＧＲ５陽性細胞増殖にとって望ましいことであり、発毛、成長期成熟化に関与すると考えられる。また、Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎシグナル伝達経路の阻害分子としてＤｉｃｋｋｏｐｆ１（ＤＫＫ１）が知られており、Ｗｎｔの共受容体ＬＲＰ６とＤＫＫ１受容体Ｋｒｅｍｅｎとの複合体を形成することでＷｎｔシグナルは抑制される。（Ｂｉｎｎｅｒｔｓ　ＭＥ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．　２００７　Ｓｅｐ；１１；１０４（３７）：１４７００－５）。ＤＫＫ１は、Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路を阻害する因子として、成長期毛包を退行期に移行させるファクターの一つとして考えられており、男性型脱毛に関わる因子でもある（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２０１２），Ｖｏｌｕｍｅ　１３２，１５５４－１５６０）。

　本発明者らは、ヒト表皮角化細胞の生存割合を確認することにより、Ｗｎｔ－３ａとＲＳＰＯ１とＤＫＫ１との相互作用が細胞増殖に影響を与えることを確認した。後述する参考例１の結果によれば、ＲＳＰＯ１がＤＫＫ１に拮抗してＷｎｔ活性を維持することが示され、ＲＳＰＯ１がＤＫＫ１を無効化することによって、メラノサイトの増殖及びメラニン形成に係る因子の産生を促進すると考えられる。

［美容方法］
　本発明の美容方法は、下記式（Ｉ）：

で表される化合物又はその塩を有効成分として含む組成物を用いて、毛乳頭細胞におけるＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ１の産生を促進することを特徴とする。前述のとおり、本発明者らは、上記式（Ｉ）で表される化合物に、育毛促進及び／又は白髪改善作用を見出した。そして、この知見から本発明者らは、育毛促進及び／又は白髪改善のための美容方法として、上記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を用いて毛乳頭細胞におけるＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ１の産生を促進することに至り、本発明を完成させた。また、本発明において、美容方法とは、単に個人的に行われる方法のみならず、美容に関わる商品の提供の際に、顧客にあわせた化粧料の処方として提供され、医師以外の化粧料販売員やエステティシャンにより提供されるものを含む。また、美容に関わる商品の説明書（添付文書等）等においてその商品の使用方法として提供されるものも含む。

　本発明の美容方法において、上記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、上記に説明したものを用いることができる。また、上記化合物又はその塩を含有する剤および組成物も、本発明の美容方法における抽出物として好適に使用できる。このような組成物は、例えば、被験者の所望の部位の皮膚に適用することによって使用することができる。皮膚への適用は、例えば１日１回または複数回行ってよい。

　次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、本発明の有効成分等の含有量を示す数値の単位％は、質量％を意味する。

［実施例１］オランダガラシ抽出物の調製
　オランダガラシ（Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）の葉及び茎の乾燥粉砕物２００ｇに、５０％エタノール１０００ｍＬを加え、室温で時々攪拌しながら７日間抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、残渣を除いて、粗抽出物とした。この粗抽出物に含まれる固形分は、０．４６％である。

［実施例２］オランダガラシ抽出物の精製
　実施例１で調製したオランダガラシの粗抽出物から図１に示した手順にて精製を行った。オランダガラシの粗抽出物を、最初にダイヤイオンＨＰ２０（三菱ケミカル株式会社製）を充填したカラムで粗分画した。カラム吸着物を、２０％エタノール水溶液で溶出した画分（Ｆｒ．０１）を分取し、この画分をＳｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８カートリッジ（日本ウォーターズ社製）に吸着させ、２０％エタノール水溶液で溶出される画分（Ｆｒ．１４）を分取した。分取した画分のエタノールを濃縮した後にブタノールを添加して抽出し、得られたブタノール層を濃縮後、再び２０％エタノールで溶解し、以下の液体クロマトグラフィーＬＣ１及びＬＣ２を連続的に行って、化合物を分取した。

　上述した液体クロマトグラフィーＬＣ１及びＬＣ２の条件は、以下のとおりである。
ＬＣ１：
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２９０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＩＩ　ＬＣ　システム
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ　ＲＰ－１８　ＧＰ（２０ｍｍ×２５０ｍｍ）
溶出液：ＭｅＯＨ：０．１％ギ酸＝３５：６５
流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ
温度：室温
検出器：３３０ｎｍ

ＬＣ２：
装置：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＬＣ－１０Ａ　シリーズ
カラム：Ｕｎｉｓｏｎ　ＵＫ－Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
溶出液：ＭｅＯＨ：０．１％ギ酸＝３１：６９
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度：室温
検出器：３３０ｎｍ

　オランダガラシ抽出物から精製したＦｒ．０１及びＦｒ．２１を、上記ＬＣ２で分析した結果をそれぞれ図２及び図３に示す。図２及び図３に示すように、有効成分の化合物は保持時間が約２２．１分の位置に溶出された。その含有量は、フェルラ酸（１９４．１８ｇ／ｍｏｌ）を標準物質として上記ＨＰＬＣで検出されるピーク面積から算出した。フェルラ酸換算とした理由は、当該化合物はフェルラ酸の部分構造を有すること、及びフェルラ酸の吸収スペクトルと当該化合物のＵＶ可視吸収スペクトルが極めて類似（λｍａｘは３２５－３３０ｎｍ）していることに基づく。オランダガラシの５０％エタノール粗抽出物からの当該化合物の収率は、約８０％程度であった。

［実施例３］有効成分の構造決定
　実施例２で得られたＦｒ．２１に含まれる単一成分（化合物２１）をＮＭＲで分析した結果、化合物２１は、２－Ｏ－フェルロイル－Ｌ－リンゴ酸（式（Ｉ）で表される化合物）であることが分かった。核磁気共鳴装置ＪＥＯＬ（日本電子株式会社）ＪＮＭ－ＥＣＡ５００で測定した化合物２１のＮＭＲ測定データは以下のとおりである。

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ），δ：７．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，７’－Ｈ），７．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，２’－Ｈ），７．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．９Ｈｚ，６’－Ｈ），６．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，５’－Ｈ），６．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，８’－Ｈ），５．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２，３．２Ｈｚ，２－Ｈ），３．８９（３Ｈ，ｓ，Ｊ＝Ｈｚ，３’－ＯＣＨ_３），２．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．５，３．２Ｈｚ，３－Ｈａ），２．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．５，９．２Ｈｚ，３－Ｈｂ）．

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ），δ：１６８．２（Ｃ－９’），１５０．７（Ｃ－４’），１４９．４（Ｃ－３’），１４７．５（Ｃ－７’），１２７．７（Ｃ－１’），１２４．３（Ｃ－６’），１１６．４（Ｃ－５’），１１４．９（Ｃ－８’），１１１．６（Ｃ－２’），５６．４（３’－ＯＣＨ_３），３７．５（Ｃ－３）．

［試験例１］ＲＳＰＯ１産生促進作用の評価
　継代５（Ｐ５、５回継代したこと）のヒト毛乳頭細胞（Ｄｅｒｍａｌ　ｐａｐｉｌｌａ　ｃｅｌｌ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ製）を、５，０００個／ウェルの密度で、プラスチック製の９６ウェルプレート上に播種した。翌日、実施例２で分画した各サンプル（Ｆｒ．０１及びＦｒ．１１～Ｆｒ．１４）を、培地中の最終濃度が０．２５％になるように、１％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地へ添加した。ネガティブコントロールとして、エタノールを培地中の最終濃度が０．１２５％になるように添加した。これらの毛乳頭細胞を２日間培養し、培養上清をＥＬＩＳＡアッセイサンプルとして採取した。

　上記乳頭細胞培養上清中のＲＳＰＯ１含有量は、ヒトＲＳＰＯ１／ＲＳＰＯ　ＥＬＩＳＡキット（ＬＳｂｉｏ製）を使用して、毛乳頭細胞から分泌されたＲＳＰＯ１の量を定量した。ＲＳＰＯ１の産生量は生存細胞数で補正した値を用いた。生存細胞数は、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８、Ｄｏｊｉｎｄｏ製）を用いて行った。

　その結果を図４に示す。図４に示した通り、Ｆｒ．１４に回収された単一ピークの化合物２１が、Ｆｒ．０１と同程度のＲＳＰＯ１産生促進作用を示し、ＲＳＰＯ１産生促進剤の有効成分であることが確認できた。

［試験例２］白髪改善等確認試験
　化合物２１（２－Ｏ－フェルロイル－Ｌ－リンゴ酸）を、フェルラ酸換算にて８９．４ｐｐｂ（８．９４×１０^－６質量％）含有する１５％エタノール水溶液を調製した。これを５１歳の男性被験者に、アトマイザー容器を用いて朝晩の１日２回で１０プッシュ（０．１２ｇ×１０＝１．２ｇ）／回、６か月間毎日、頭皮用ローションとして使用してもらい、以下のプロトコルに従って、白髪改善等確認試験を行った。

　このローションを使用する２日前に、頭部の一か所を剃毛した。剃毛から２日目（試験開始０か月）に剃毛部位をマイクロスコープで撮影することにより評価した。試験開始１か月後に、同じ部分を剃毛し、剃毛から２日目に同様の評価を行った。これを試験開始から６か月間繰り返した。評価方法としては、マイクロスコープで撮影した画像をＴｒｉｃｈｏＳｃａｎ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｇ社製）に取り込んで、毛髪の本数及び密度等を解析した。

　その解析した結果として、頭皮のマイクロスコープ画像を図５にて、頭部の１平方センチメートルあたりの髪の毛の太さ、本数、成長速度（０か月と６か月の比較）の平均値を以下の表１にて示す。

　表１では、化合物２１（式（Ｉ）で表される化合物）が含有されたローションを使用することにより、髪の毛の太さ、本数を増加させると共に髪の毛の成長が促進された結果を示す。この結果から、化合物２１（式（Ｉ）で表される化合物）が育毛促進作用を有すると考えられる。

　図５では、化合物２１（式（Ｉ）で表される化合物）が含有されたローションを使用することにより髪の毛が黒くなった実験結果を示す。この結果から、化合物２１（式（Ｉ）で表される化合物）が白髪改善作用を有すると考えられる。

［参考例１］ＲＳＰＯ１の作用機序の解析
　ＲＳＰＯ１の作用機序を解析するために、ヒト表皮角化細胞を用いて、Ｗｎｔ－３ａとＲＳＰＯ１とＤＫＫ１との相互作用が細胞増殖に影響を与えることを確認した。継代４（Ｐ４）のヒト表皮角化細胞（クラボウ社製）を、５，０００個／ウェルの密度で、プラスチック製の９６ウェルプレート上に播種した。翌日、培地を交換し、３日目に、Ｗｎｔ－３ａ（Ｒ＆Ｄ　　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）と共に、ＤＫＫ１（Ｒ＆Ｄ　　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）又はＤＫＫ１とＲＳＰＯ１（Ｒ＆Ｄ　　ｓｙｓｔｅｍｓ社製））の両方を添加し、３７℃で４８時間培養し、６日目に、細胞増殖アッセイキットＣＣＫ－８により、ヒト表皮角化細胞の細胞数を測定した。

　その結果を図６に示す。図６の縦軸は、Ｗｎｔ－３ａのみを２００ｎｇ／ｍＬ添加したときの細胞生存割合を１としたときに、Ｗｎｔ－３ａとＤＫＫ１又はＷｎｔ－３ａとＤＫＫ１とＲＳＰＯ１とを添加したときの細胞生存割合を示す。横軸に示した数値単位は、各添加物の量（ｎｇ／ｍＬ）である。

　Ｗｎｔ－３ａのみ添加群の細胞生存割合を１としたとき、Ｗｎｔ－３ａとＤＫＫ１の両方を添加した群の細胞数平均値は０．８３、Ｗｎｔ－３ａとＤＫＫ１とＲＳＰＯ１とを添加した群の細胞数平均値は１．０５であった。
　これらの結果より、ＤＫＫ１により、細胞増殖（Ｗｎｔ活性）が抑制されるが、ＲＳＰＯ１を添加すると、ＤＫＫ１に拮抗してＷｎｔ活性を維持する（補助する）ことが示唆され、ＲＳＰＯ１がＤＫＫ１を無効化する作用があることが示唆された。　

Claims

　下記式（Ｉ）：

で表される化合物又はその塩を有効成分として含む、育毛促進用組成物。
　下記式（Ｉ）：

で表される化合物又はその塩を有効成分として含む、白髪改善用組成物。
　前記式（Ｉ）で表される化合物が、２－Ｏ－フェルロイル－Ｌ－リンゴ酸である請求項１又は２に記載の組成物。
　請求項１～３いずれか一項に記載の組成物を含有する皮膚外用剤。
　下記式（Ｉ）：

で表される化合物又はその塩を有効成分として含む組成物を用いて、毛乳頭細胞におけるＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ１の発現を促進することを含む、育毛促進及び／又は白髪改善のための美容方法。