WO2023234675A1 - 모노아민 산화효소 b에 대한 안티센스 올리고머 및 이의 용도 - Google Patents
모노아민 산화효소 b에 대한 안티센스 올리고머 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 모노아민 산화효소 B에 대한 안티센스 올리고머 및 이의 용도에 관한 것으로, 모노아민 산화효소 B를 코딩하는 유전자 구체적으로 mRNA 또는 단백질 양을 조절하는 안티센스 올리고머 및 이의 간질환, 비만 또는 신경질환의 예방, 경감 또는 치료 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 모노아민 산화효소 B에 대한 안티센스 올리고머 및 이의 용도에 관한 것으로, 모노아민 산화효소 B를 코딩하는 유전자 구체적으로 mRNA 또는 단백질 양을 조절하는 안티센스 올리고머 및 이의 간질환, 비만 또는 신경질환의 예방, 경감 또는 치료 용도에 관한 것이다.
MAO((Monoamine oxidase)는 특히 간과 뇌의 미토콘드리아 외막에 위치하며, 도파민과 같은 모노아민 신경전달물질의 산화적 탈아미노화 반응을 촉진하는 것으로 알려져 있다. MAO에 의해 촉진되는 반응을 통해 산화적 스트레스와 신경세포사멸을 유발하는 과산화수소 (H2O2)를 생산하는 것으로 알려져 있다.
MAO에 MAO-A와 MAO-B가 존재하고, MAO-B는 세로토닌을 방출하는 뉴런과 성상 세포에 풍부하고, 셀레길린 (selegiline)과 라사갈린 (rasagiline)과 같은 강력한 저해제에 의해 선택적으로 저해되는 것으로 알려져 있다.
특히, 사람의 뇌에서 모노아민 옥시데이즈 B (Monoamine oxidase B, MAO-B)의 발현 수준이 나이와 함께 증가되며, 신경질환에서 활성이 증가되는 것으로 알려져 있다 (Park et al., Sci Adv. 2019 Mar 20;5(3):eaav0316).
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 모노아민 산화효소 B에 대한 안티센스 올리고머를 확인하고, 안티센스 올리고머가 모노아민 산화효소 B를 코딩하는 mRNA의 발현을 조절함으로써, 신경질환의 예방, 경감 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 모노아민 산화효소 B를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 안티센스 올리고머를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 안티센스 올리고머를 포함하는 간질환 또는 신경질환의 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 안티센스 올리고머를 투여하는 간질환 또는 신경질환의 예방, 경감 또는 치료방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 안티센스 올리고머를 포함하는 간질환 또는 신경질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물 제조 용도를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뉴클레이염기 MAOB 전체 프리-mRNA 서열 (MAOB whole pre-mRNA sequence)의 핵산서열 중 적어도 8개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 2, 3, 9으로 구성된 군에서 선택되는 하나의 서열 중 적어도 8개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 9의 서열 중 적어도 8개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 22, 23, 29로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 올리고머를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 29의 서열을 포함하는 올리고머를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음의 서열과 화학구조를 가지는 올리고머를 제공한다:
T*GAAC*6*6*5*5*5*7*7*6*5*6*ACGA*G;
G*ATCA*6*5*7*7*6*6*8*6*8*6*CAGC*T; 및
C*ACTA*5*8*6*5*6*5*8*5*8*8*TAGC*C,
여기서, PS, phosphorothioate; 2’MOE, 2’-O-methoxyethyl. A=2'MOE-A, C=2'MOE-5'-methyl-C, G=2'MOE-G, T=2'MOE-T, 5=DNA-A, 6=DNA-5'-methyl-C, 7=DNA-G, 8=DNA-T, *=PS를 의미함.
본 발명은 또한, 올리고머 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 올리고머 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 간질환 또는 신경질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 올리고머 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 간질환 또는 신경질환의 예방, 경감 또는 치료방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 올리고머 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 포함하는 간질환 또는 신경질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물 제조 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명은 또한, 올리고머 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 지방간의 예방, 경감 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 올리고머 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 지방간의 예방, 경감 또는 치료방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 올리고머 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 포함하는 지방간의 예방, 경감 또는 치료용 조성물 제조 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명은 또한, 올리고머 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 비만의 예방, 경감 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 올리고머 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 비만의 예방, 경감 또는 치료방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 올리고머 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 포함하는 비만의 예방, 경감 또는 치료용 조성물 제조 용도를 제공하는 데 있다.
도 1a 및 도 1b는 Huh7 세포주에서 KD 테스트를 통해 MAOB mRNA 발현양 억제 가능성 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Huh7 세포주에서 KD 테스트를 통해 A34, A35, A41 후보군에서 MAOB 발현양 억제를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 MAOB ASO 주입시 생존율 측정을 통한 안전성 확인 시험 및 발현양 억제 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 A41을 주입한 그룹의 대뇌, 시상, 소뇌에서 MAOB mRNA 발현이 억제되는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 성체 중 MAOB ASO 주입시 생존율 측정을 통한 안전성 확인 시험 및 발현양 억제 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 알츠하이머모델에서 MAOB ASO 주입을 통한 기억력 회복 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 알츠하이머모델에서 MAOB ASO 주입을 통한 토닉 GABA (tonic GABA) 양 측정 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 기존 동일 알츠하이머 동물모델에서 측정된 tonic GABA 양에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 지방간 및 비만 동물모델에서 MAOB ASO 주입을 통한 체중감소 효과를 특정한 실험결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 기존 동일 지방간 및 비만 동물모델의 간에서 조직학적으로 관찰된 중성지방의 변화에 대한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 안티센스 올리고머 (올리고뉴클레오타이드)는 모노아민 산화효소 B를 코딩하는 유전자, 구체적으로 mRNA의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고머(올리고뉴클레오타이드)는 모노아민 산화효소 B를 코딩하는 mRNA와 상보적인 서열을 포함한다.
"안티센스 활성"은 그의 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물의 혼성화에 기여하는 임의의 검출가능한 또는 측정가능한 활성을 의미한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 활성은 표적 핵산 또는 이러한 표적 핵산에 의해 암호화된 단백질의 양 또는 발현에 있어서의 감소이다. 본 발명에 따른 안티센스 활성은 모노아민 산화효소 B를 코딩하는 표적 핵산에 작용하여, 암호화된 모노아민 산화효소 B 단백질의 양 또는 발현을 감소시킨다.
"표적화", "표적하는" 또는 "표적된"은 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하여 바람직한 효과를 유도하는 것을 의미한다.
"표적 핵산", "표적 RNA" 및 "표적 RNA 전사체"는 모두 안티센스 올리고머에 의해 표적될 수 있는 핵산을 의미한다.
본 발명은 수소 결합을 통해 표적 핵산에 대한 혼성화를 수행할 수 있는 올리고머를 포함한다.
“억제”는 안티센스 올리고머 부재 시에 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준과 비교하여 표적 핵산에 상보적인 안티센스 화합물의 존재 시에 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준의 감소를 의미한다.
"안티센스 올리고머"는 표적 핵산의 대응하는 부위 또는 분절에 혼성화를 가능케 하는 뉴클레이염기 서열을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 MAOB whole pre-mRNA sequence의 핵산서열 중 적어도 8개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머에 관한 것이다.
상기 서열은 chrX:43,766,610-43,882,450 (hg38, (-) strand, 길이 115,841 bp)로, 서열번호 41의 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 올리고머는 다음의 핵산 서열 중 적어도 8개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하다.
본 발명에 따른 올리고머는 상기 핵산 서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개 또는 적어도 18개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하다.
혼성화에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 혼성화 되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 혼성화 되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 혼성화 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.
매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(혼성화 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 혼성화 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 혼성화에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.
상기 혼성화를 이루는 염기쌍 중에 최소한 하나가 유동 염기쌍 (wobble pair) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 포함할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 내지 20으로 구성된 군에서 선택되는 하나의 서열 중 적어도 8개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머를 포함한다.
하나의 실시예에서, 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고머로, 서열번호 1 내지 20로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 적어도 8개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머를 포함한다. 서열번호 1 내지 20로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개 또는 적어도 18개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머를 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고머일 수 있으며, 서열번호 1 내지 20으로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개 또는 적어도 18개 의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머를 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고머일 수 있으며, 서열번호 1 내지 20으로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개 또는 적어도 18개 의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머를 포함할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 1 내지 20으로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 18개 이상, 19개 이상, 20개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 2, 3, 또는 9으로 구성된 군에서 선택되는 하나의 서열 중 적어도 8개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머에 관한 것이다.
서열번호 2, 3, 9으로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개 또는 적어도 18개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머를 포함할 수 있다.
상기 혼성화를 이루는 염기쌍 중에 최소한 하나가 유동 염기쌍 (wobble pair) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 9의 서열 중 적어도 8개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머다.
서열번호 9의 서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개 또는 적어도 18개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 10 내지 50 nt의 길이를 갖는 올리고머를 포함할 수 있다.
상기 혼성화를 이루는 염기쌍 중에 최소한 하나가 유동 염기쌍 (wobble pair) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 포함할 수 있다.
"연속된 뉴클레이염기"는 서로에 바로 인접한 뉴클레이염기를 의미한다. "뉴클레오시드간 연결"은 뉴클레오시드들 사이의 화학적 결합을 지칭한다. "연결된 뉴클레오시드"는 함께 결합된 인접한 뉴클레오시드를 의미한다.
"핵산"은 단량체 뉴클레오티드로 이루어진 분자를 지칭한다. 핵산에는 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 단일-가닥 핵산, 이중-가닥 핵산, 소분자 간섭 리보핵산 (siRNA), 및 마이크로RNAs (miRNA)가 포함된다. 핵산은 또한 단일 분자 내에 이들 요소들의 조합을 포함할 수 있다.
"뉴클레이염기"는 다른 핵산의 염기와 짝짓기를 할 수 있는 헤테로사이클릭 모이어티를 의미한다.
"뉴클레이염기 서열"은 임의의 당, 연결, 또는 뉴클레이염기 변형과 무관한 연속된 뉴클레이염기의 순서를 의미한다.
"뉴클레오시드"는 당에 연결된 뉴클레이염기를 의미한다.
"뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유적으로 연결된 인산기를 갖는 뉴클레오시드를 의미한다.
“올리고머”는 핵산 분자의 영역에 혼성화할 수 있는 연결된 단량체 소단위의 중합체를 의미한다.
"올리고뉴클레오티드"는 각각이, 서로 독립적으로, 변형되거나 비변형될 수 있는, 연결된 뉴클레오시드의 중합체를 의미한다.
"단일-가닥 올리고뉴클레오티드"는 상보적 가닥에 혼성화되지 않는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
상기 혼성화를 이루는 염기쌍 중에 최소한 하나가 유동 염기쌍 (wobble pair) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 예를 들어, 서열번호 21 내지 40로 구성된 군에서 선택되는 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 21 내지 40로 구성된 군에서 선택되는 서열과 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상동성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 예를 들어, 서열번호 22, 23 및 29로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 22, 23 및 29로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열과 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상동성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 서열번호 22, 23 및 29로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 하나의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 예를 들어, 서열번호 29의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 29의 서열과 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상동성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 예를 들어, 서열번호 29의 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "상동성"은 폴리뉴클레오티드 모이티 사이의 동일성 퍼센트를 의미한다. "동일성"은 비교창(comparison window)을 통해 폴리뉴클레오티드 서열에 기반하여 서열이 기능적 또는 구조적으로 동일한 정도를 의미한다. 서열 상동성은 표준 소프트웨어를 사용, 예를 들면 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993)에 기초하여 개발된 BLASTN 이나 BLASTX라 불리는 프로그램에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 20개의 연결된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 서열번호 22, 23 및 29로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
TGAACCCAAAGGCACACGAG (서열번호 22);
GATCACAGGCCTCTCCAGCT (서열번호 23); 및
CACTAATCACATATTTAGCC (서열번호 29).
특히, 본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 서열번호 29의 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 상보적인 서열은 모노아민 산화효소 B를 코딩하는 mRNA에 대하여 발현을 억제할 수 있을 정도에 대응하는 일부 염기 결손 및 불완전한 상보성도 포괄하는 의미이다.
"뉴클레오시드"는 당에 연결된 뉴클레이염기를 의미하고, "뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유적으로 연결된 인산기를 갖는 뉴클레오시드를 의미한다. 뉴클레이염기"는 다른 핵산의 염기와 짝짓기를 할 수 있는 헤테로사이클릭 모이어티를 의미한다.
"올리고머"는 적어도 핵산 분자의 영역에 혼성화할 수 있는 연결된 단량체 소단위의 중합체를 의미한다.
상기 뉴클레오시드는 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 뉴클레오시드간 연결이 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하거나, 변형된 당을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 연결일 수 있다.
본 발명에 따른 뉴클레오시드간 연결은 sooosssssssssssooos의 연결일 수 있다. s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, o는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결일 수 있다.
상기 뉴클레오시드가 다음의 변형된 당을 포함할 수 있다:
당 구조의 2' 탄소 위치에서 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5’메틸, 2'-O-아미노에틸, 5’-메틸, 2’-O-프로필(propyl), 2’-메틸티오에틸 (methylthioethyl), 또는 2’-플로로 (2’-Fluoro)로 치환의 변형.
상기 뉴클레오시드는 예를 들어, 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 연결; 및 당 구조의 2' 탄소 위치에서 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5’메틸, 2'-O-아미노에틸, 5’-메틸, 2’-O-프로필(propyl), 2’-메틸티오에틸 (methylthioethyl), 또는 2’-플로로 (2’-Fluoro)로 치환의 변형을 포함할 수 있다.
상기 뉴클레오시드는 예를 들어, 다음으로 구성된 군에서 선택된 변형을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 변형은 당 모이어티의 변형 예를 들어, 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 변형 구체적으로, 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5’메틸, 2'-O-아미노에틸, 5’-메틸, 2’-O-프로필(propyl), 2’-메틸티오에틸 (methylthioethyl), 또는 2’-플로로 (2’-Fluoro)로 변형; 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형; PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; 및 인산기(phosphate group) 포함할 수 있다.
"2'-O-메톡시에틸" (또한, 2'-MOE 및 2'-O(CH2)2-OCH3)은 퓨로실 고리의 2' 위치에서의 O-메톡시-에틸 변형을 의미한다.
"2'-O-메톡시에틸 뉴클레오티드"는 2'-O-메톡시에틸 변형된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드를 의미한다.
"변형된 당"은 천연 당으로부터의 치환 또는 변화를 지칭한다.
"5-메틸시토신"은 5' 위치에 부착된 메틸기로 변형된 시토신을 의미한다. 5-메틸시토신은 변형된 뉴클레이염기다.
"변형된 뉴클레오시드간 연결"은 자연 발생적인 뉴클레오시드간 결합으로부터의 치환 또는 임의의 변화를 의미한다.
"변형된 뉴클레이염기"는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 또는 우라실이 아닌 임의의 뉴클레이염기를 의미한다. "변형된 뉴클레이염기"는 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G)과, 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)을 의미한다.
"변형된 뉴클레오티드"는, 독립적으로, 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오시드간 연결, 또는 변형된 뉴클레이염기를 갖는 뉴클레오티드를 의미한다. "변형된 뉴클레오시드"는, 독립적으로, 변형된 당 모이어티 또는 변형된 뉴클레이염기를 갖는 뉴클레오시드를 의미한다.
"변형된 올리고뉴클레오티드"는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고머를 의미한다.
본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 3가 GalNAc(N-아세틸갈락토스아민) 또는 5가 GalNAc(N-아세틸갈락토스아민)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5’메틸, 5’-메틸 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합으로의 변형을 포함할 수 있다.
다른 관점에서, 서열번호 2, 3 및 9로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 적어도 8개의 연속된 뉴클레이염기를 포함하는, 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고머에 관한 것이다.
하나의 실시예에서, 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고머로, 서열번호 2, 3 및 9로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 적어도 8개의 연속된 뉴클레이염기를 포함한다. 서열번호 2, 3 및 9로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개 또는 적어도 15개의 연속된 뉴클레이염기를 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고머일 수 있으며, 서열번호 2, 3 및 9로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개 또는 적어도 15개의 연속된 뉴클레이염기를 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고머일 수 있으며, 서열번호 2, 3 및 9로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개 또는 적어도 15개의 연속된 뉴클레이염기를 포함할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 2, 3 및 9로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 18개 이상, 19개 이상, 20개의 연속된 뉴클레이염기를 포함할 수 있다.
다른 관점에서, 서열번호 9의 서열 중 적어도 8개의 연속된 뉴클레이염기를 포함하는, 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고머에 관한 것이다.
하나의 실시예에서, 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고머로, 서열번호 9의 서열 중 적어도 8개의 연속된 뉴클레이염기를 포함한다. 서열번호 2, 3 및 9로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개 또는 적어도 15개의 연속된 뉴클레이염기를 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고머일 수 있으며, 서열번호 9의 서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개 또는 적어도 15개의 연속된 뉴클레이염기를 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고머일 수 있으며, 서열번호 9의 서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개 또는 적어도 15개의 연속된 뉴클레이염기를 포함할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 9의 서열 중 18개 이상, 19개 이상, 20개의 연속된 뉴클레이염기를 포함할 수 있다.
본 발명은 서열번호 2, 3 및 9로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 모노아민 산화효소 B를 코딩하는 유전자를 타겟하는 안티센스 올리고머에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 서열번호 9의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 올리고머가 13 내지 35 nt의 길이를 갖거나, 16 내지 25 nt의 길이를 가질 수 있다. 상기 올리고머는 16nt, 17nt, 18nt, 19nt, 20nt, 21nt, 22nt, 23nt, 24nt 또는 25nt일 수 있다.
상기 서열번호 2, 3 및 9로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 뉴클레오시드 각각은 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 뉴클레오시드간 연결이 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하거나, 변형된 당을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 연결일 수 있다. 상기 변형된 뉴클레오시드간 연결 중 최소 하나가 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 연결일 수 있다.
본 발명에 따른 뉴클레오시드간 연결은 sooosssssssssssooos의 연결일 수 있다. s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, o는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결일 수 있다.
상기 올리고머의 적어도 하나의 뉴클레오시드가 DNA나 RNA와 다른 변형된 당을 포함할 수 있다. 상기 뉴클레오시드가 다음의 변형된 당을 포함할 수 있다:
당 구조의 2' 탄소 위치에서 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5’메틸, 2'-O-아미노에틸, 5’-메틸, 2’-O-프로필(propyl), 2’-메틸티오에틸 (methylthioethyl), 또는 2’-플로로 (2’-Fluoro)로 치환의 변형.
상기 뉴클레오시드는 예를 들어, 다음으로 구성된 군에서 선택된 변형을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 변형은 당 모이어티의 변형 예를 들어, 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 변형 구체적으로, 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5’메틸, 2'-O-아미노에틸, 5’-메틸, 2’-O-프로필(propyl), 2’-메틸티오에틸 (methylthioethyl), 또는 2’-플로로 (2’-Fluoro)로 변형; 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형; PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; 및 인산기(phosphate group) 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5’메틸, 5’-메틸 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합으로의 변형을 포함할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이의 적어도 하나의 뉴클레오시드가 2'-O-메톡시에틸 (2'MOE)을 가질 수 있다.
상기 서열번호 9의 서열 중 뉴클레오시드 각각은 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 뉴클레오시드간 연결이 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하거나, 변형된 당을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 연결일 수 있다.
본 발명에 따른 뉴클레오시드간 연결은 sooosssssssssssooos의 연결일 수 있다. s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, o는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결일 수 있다.
상기 뉴클레오시드가 다음의 변형된 당을 포함할 수 있다:
당 구조의 2' 탄소 위치에서 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5’메틸, 2'-O-아미노에틸, 5’-메틸, 2’-O-프로필(propyl), 2’-메틸티오에틸 (methylthioethyl), 또는 2’-플로로 (2’-Fluoro)로 치환의 변형.
상기 뉴클레오시드는 예를 들어, 다음으로 구성된 군에서 선택된 변형을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 변형은 당 모이어티의 변형 예를 들어, 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 변형 구체적으로, 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5’메틸, 2'-O-아미노에틸, 5’-메틸, 2’-O-프로필(propyl), 2’-메틸티오에틸 (methylthioethyl), 또는 2’-플로로 (2’-Fluoro)로 변형; 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형; PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; 및 인산기(phosphate group) 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 올리고머는 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5’메틸, 5’-메틸 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합으로의 변형을 포함할 수 있다.
상기 올리고머의 적어도 하나의 뉴클레오시드가 당 부분에 추가적인 고리가 형성된 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다.
상기 올리고머의 적어도 하나의 뉴클레오시드의 변형된 당이 바이사이클릭 (cEt) 또는 LNA (locked nucleic acid)일 수 있다.
"바이사이클릭 당"은 2개의 비-동일탄소상 고리 원자의 연결에 의해 변형된 퓨로실 고리를 의미한다. 바이사이클릭 당은 변형된 당이다.
바이사이클릭 당은 4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함한다. 하나의 실시예에서, 적어도 하나의 변형된 당은 2'-O-메톡시에틸을 포함한다.
상기 올리고머가 a. 8-12개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 이루어진 갭 분절;
3-7개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5'날개 분절;
3-7개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3'날개 분절을 포함하고,
b. 갭 분절이 5'날개 분절과 3'날개 분절 사이에 위치하고
c. 각 날개 분절의 각 뉴클레오시드가 변형된 당을 포함하는 것인 올리고머일 수 있다.
상기 올리고머가 20개 길이이고 10개의 연결된 데옥시 뉴클레오시드로 이루어진 갭 분절;
5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5'날개 분절;
5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3'날개 분절을 포함하고
갭 분절이 5'날개 분절과 3'날개 분절 사이에 위치하고,
각 날개 분절의 각 뉴클레오시드가 2'-O-메톡시에틸당(2'-MOE ribose)을 포함하는 올리고머일 수 있다.
상기 뉴클레오시드간 연결은 sooosssssssssssooos의 연결인 안티센스 올리고머: s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, o는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결일 수 있다.
상기 올리고머가 18개 길이이고:
8개의 연결된 데옥시 뉴클레오시드로 이루어진 갭 분절
5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5'날개 분절
5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3'날개 분절을 포함하고
갭 분절이 5'날개 분절과 3'날개 분절 사이에 위치하고
각 날개 분절의 각 뉴클레오시드가 2'-O-메톡시에틸당(2'-MOE ribose)을 포함하는 올리고머일 수 있다.
상기 올리고머가 20개 길이이고:
8개의 연결된 데옥시 뉴클레오시드로 이루어진 갭 분절
6개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5'날개 분절
6개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3'날개 분절을 포함하고
갭 분절이 5'날개 분절과 3'날개 분절 사이에 위치하고
각 날개 분절의 각 뉴클레오시드가 2'-O-메톡시에틸당(2'-MOE ribose)을 포함하는 올리고머일 수 있다.
"갭머"는 RNase H 절단을 지지하는 복수 개의 뉴클레오시드를 갖는 내부 영역이 하나 이상의 뉴클레오시드를 갖는 외부 영역들 사이에 위치하고, 내부 영역을 포함하는 상기 뉴클레오시드가 외부 영역들을 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드와 화학적으로 구분되는, 키메릭 안티센스 화합물을 의미한다. 내부 영역은 "갭 분절"로 언급될 수 있고, 외부 영역은 "날개 분절"로 언급될 수 있다.
"갭-확장된"은 1 내지 6개의 뉴클레오시드를 갖는 5' 및 3' 날개 분절 사이 및 그에 바로 인접하여 위치하는 12개 이상의 연속된 2'-데옥시리보뉴클레오시드의 갭 분절을 갖는 키메릭 안티센스 화합물을 의미한다.
하나의 실시예에서, 적어도 하나의 뉴클레오시드가 변형된 뉴클레이염기를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레이염기가 5-메틸시토신 (5mC)일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 다음으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 올리고머를 포함하는 신경질환의 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 안티센스 올리고머를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경질환의 예방, 경감 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 안티센스 올리고머를 포함하는 신경질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물 제조 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 올리고머는 MAO-B 저해제일 수 있다. 본 발명에 따른 올리고머를 MAOB mRNA 또는 단백질 양을 감소시키기 위해 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 MAOB mRNA 또는 단백질 양을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 이를 통해, 산소 라디칼 형성을 감소시키고 뇌 안에 유용한 모노아민의 양을 증가시킬 수 있다. 또한, 알츠하이머병을 비롯한 뇌 질환 및 뇌 손상에서 MAO-B는 반응성 성상교세포 내에서 푸트레신 대사 과정을 촉진하여 과량의 GABA가 생산되도록 한다. 따라서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고머 MAO-B 저해제는 성상교세포에 의한 GABA 생성 억제제로 작용하여 신경 신호 전달과 뇌 기능을 회복시킬 수 있다. 상기 신경질환은 예를 들어, 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 헌팅턴병 (Huntington's disease; HD), 루게릭 병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 또는 진행성 핵상마비(progressivesupranuclear palsy; PSP)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 올리고머는 간질환의 예방, 경감 또는 치료에 사용될 수 있다. 상기 간질환은 구체적으로 지방간일 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 올리고머를 포함하는 간질환의 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 안티센스 올리고머를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간질환의 예방, 경감 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 안티센스 올리고머를 포함하는 간질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물 제조 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 올리고머를 포함하는 비만의 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 안티센스 올리고머를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만의 예방, 경감 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 안티센스 올리고머를 포함하는 비만의 예방, 경감 또는 치료용 조성물 제조 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 '치료'는 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
본 발명은 올리고머 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다.
임의의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 그와 같은 에스테르의 염, 또는 인간을 포함하는 동물에게 투여시, (직접적으로 또는 간접적으로) 생물학적 활성 대사물또는 이의 잔류물을 제공할 수 있는 임의의 다른 올리고머를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 안티센스 올리고머의 약제학적으로 허용가능한 염, 전구약물, 그와 같은 전구약물의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 다른 생물동등체에 관한 것이다. 적당한 약제학적으로 허용가능한 염은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 나트륨 및 칼륨 염.
상기 조성물과 제2제제를 병용-투여할 수 있다. "병용-투여"에서 제2제제를 포함하는 경우, 단일 약학적 조성물일 수 있고, 별개의 약학적 조성물일 수 있다. 제2제제는 조성물과 같거나 다른 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 병용-투여는 동시 또는 연속 투여를 포함한다.
본 발명에 따른 조성물을 MAOB mRNA 또는 단백질 양을 감소시키기 위해 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 MAOB mRNA 또는 단백질 양을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
상기 동물은 인간, 원숭이 등의 영장류 개， 돼지， 소， 양， 염소, 마우스，래트일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 동물은 예를 들어 인간일 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명의 약학 조성물은 CNS (central nervous system)에 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 수막공간내 주사 (intrathecal injection)에 의해 투여될 수 있다.
경우에 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 혈관 주사(intravenous injection) 또는 피하 주사 (subcutaneous injection)에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
"용량"은 단일 투여에서, 또는 명시된 기간 동안에 제공된 약제학적 제제의 명시된 양을 의미한다. 용량은 하나, 둘 또는 그 이상의 볼러스 (boluses), 정제, 또는 주사제로 투여될 수 있다. 예를 들어, 피하 투여를 원하는 특정 구현예에서, 원하는 용량은 단일 주사에 의해서 쉽게 수용되지 않는 용적을 필요로 하며, 두 개 또는 그 이상의 주사제를 사용하여 원하는 용량을 달성할 수 있다. 약제는 장시간에 걸쳐 또는 연속적으로 주입에 의해 투여된다. 용량은 시간, 일, 주, 또는 개월 당 약제학적 제제의 양으로 언급될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. MaoB knockdown ASO screening
Huh7 세포주에서 MAOB mRNA 발현양 억제 가능성을 확인고자 시험하였다. a33-a52의 후보군 200nM의 ASO를 48시간 형질전환하였다. 도 1a 및 도 1b에 따르면, a33-a52의 후보군 중 A34, A35, A41 후보에서 두드러진 MAOB 발현양 억제를 보여주었다 (Error bar : 95% confidence interval).
실시예 2. MaoB knockdown lead ASO test
Huh7 세포주에서 KD 테스트를 수행했다. 200nM 각 ASO를 48시간 동안 형질감염하였다. a33-a52 후보군의 스크리닝으로 도출한 A34, A35, A41 후보군에서 Huh7에서 반복 실험한 결과, 도 2에서와 같이 반복적이고 효과적인 MAOB 발현양 억제를 보여주었다.
실시예 3. MaoB ASO KD test
3-1. p1 마우스에서 MaoB ASO KD test
25ug의 PBS, 대조 ASO(a114) 및 MAOB를 타겟하는 ASO (a41)를 생후 1일째 C57BL/J에 뇌실내 주사(ICV 주사, 피부 표면으로부터 복측 2.0mm)하였다. ICV 주사에 33G 주사 바늘을 사용하였다. ICV 주사 8일 후 모든 뇌를 대뇌, 시상, 소뇌로 해부하였다. ASO를 주사한 마우스로부터 mRNA 분리 및 정제를 위해 Rneasy mini prep kit (Qiagen)를 사용하였다. cDNA 합성에는 SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen™)을 사용하였다. qRT-PCR은 PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix(AppliedBiosystems™), 500nM 프라이머, ASO를 주입한 뇌에서의 10ng cDNA를 사용하였다. 다음 프라이머 서열을 qRT-PCR에 사용하였다. mMAOB forward: 5-'AGTTGAGCGGCTGATACACT-3', reverse: 5'-TGGCCCATCTCATCCATTGT-3'; GAPDH forward: 5'-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3', reverse: 5'-TCCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT-3'. 상대 mRNA 발현 수준은 비교 Ct 방법을 사용하여 계산되었고 GAPDHmRNA 수준으로 정규화되었다.
도 3a에 따르면, MAOB ASO 주입시 생존율 측정을 통한 안전성 확인 시험 및 발현양 억제 확인 시험 (생후 1일) 결과, A34, A35, A41 후보군 ASO 를 생후1일 C57BL/6j 동물에 주입하여 생존능력에 문제가 있는지 확인하는 실험을 하여 A41 후보가 생존에 문제가 없음을 확인하였다.
도 3b에 따르면, A34, A35, A41 후보군 ASO를 생후 1일 C57BL/6j 동물에 주입하여 MAOB mRNA 발현양을 측정한 결과, A41을 주입한 그룹의 대뇌, 시상, 소뇌에서 MAOB mRNA 발현이 억제되는 것을 확인하였다.
3-2. APP/PS1 마우스에서 MaoB ASO KD test
500ug의 대조군 ASO(a114) 및 ASO를 표적으로 하는 MAOB(a41)을 성체 C57BL/6J 마우스(독성 및 녹다운 효율 시험) 및 APP/PS1 마우스에 뇌실내 주사하였다. 마우스를 기화된 이소플루란으로 마취하고 정위 고정 프레임(Kopf)에 넣었다. 두피를 절개하고 뇌실의 두개골에 구멍을 뚫었다 (전방 / 후방 + 0.3mm, 브레그마에서 내부 / 외부-0.8mm, 뇌 표면에서 등 / 복부, -2.5mm). ASO(100 ug/uL 농도)를 유리 바늘에 로딩하고 주사기 펌프(KD Scientific)를 사용하여 1 μl/분의 속도로 5분(총 5 μl) 뇌실에 주입하였다. 녹다운 효율과 독성 시험에 성인 C57BL/6J 마우스를 사용하였다. 시상, 대뇌, 소뇌 주사 2주 후 뇌를 해부하였다. Rneasy miniporep kil(Qiagen)을 사용하여 RNA를 분리하였다. cDNA는 oligodT 프라이머와 SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen) 키트를 사용하여 mRNA로부터 합성되었다. 유전자 발현 수준은 PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)를 사용하여 10ng cDNA의 qRT-PCR에 의해 측정되었다. APP/PS1 마우스는 주사 후 2주 이상, 행동 시험 및 전기 생리학에 사용되었다.
성체 중 MAOB ASO 주입시 생존율 측정을 통한 안전성 확인 실험 및 발현양 억제 확인 시험 결과를 도 4a에 나타내었다. A41 후보군 ASO 를 12개월 C57BL/6j 동물에 주입하여 MAOB mRNA 발현양을 측정한 결과, 대뇌, 시상, 소뇌에서 MAOB mRNA 발현이 억제되는 것을 확인하였다.
수동적 회피 시험 전에, 마우스는 실험자의 손으로 7일 동안 매일 취급되었다. 수동적 회피 테스트에서는 정전류 충격 발생기(Scitech)가 장착된 2 구획 셔틀 챔버(명암)에 마우스를 배치했다. 취득일에는, 마우스를 라이트 챔버의 코너에 60초간 넣어(습관화), 2개의 챔버 사이의 셔터를 열었다. 마우스가 셔터를 통과할 때, 셔터는 즉시 닫히고 혐오 감전(0.5 mA, 2초)이 그리드 플로어에 전달되었다. 감전 후 마우스를 케이지로 되돌아 가도록 하고, 홀딩 테스트는 획득 테스트 24시간 후에 수행되었다. 유지 시험을 위해, 마우스를 라이트 챔버의 모서리에 놓고 1분 후에 셔터를 열었다. 어두운 챔버로의 침입 대기 시간은 최대 540초까지 자동으로 기록되었다.
알츠하이머모델에서 MAOB ASO 주입을 통한 기억력 회복 실험 결과를 도 4b에 나타내었다. 알츠하이머 동물모델 APP/PS1에 MAOB ASO A41을 주입한 결과, 감소된 기억력이 정상 그룹과 유사한 정도로 기억력이 회복되는 것을 확인하였다.
3-3. APP/PS1 마우스에서 MaoB ASO KD test (tonic GABA recording)
APP/PS1 트랜스제닉 마우스 및 약 13 내지 16개월의 WT 동복제로부터 뇌 슬라이스를 제조하였다. 마우스를 이소플루란으로 깊게 마취시켰다. 마취 후 뇌를 두개골로부터 신속하게 절제하고 93 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM 포도당, 5 mM을 포함하는 빙냉 NMDG 기반 절단 용액에 침전시켰다. 아스코르브산나트륨, 2 mM 티오우레아, 3 mM 피루브산나트륨, 10 mM MgSO4, 0.5 mM CaCl2 (300-310 mOsm, 10N HCl로 pH 조정).
절삭액은 95% O2 및 5% CO2로 가스 처리되었다. 해마 슬라이스는 300um 두께의 관상 해마 절편에서 마이크로톰 (DSK, Linearslicer 7N)을 진동시킴으로써 얻어졌으며 세포 외 인공 뇌척수액을 포함하는 수중 챔버에서 실온으로 유지되었다.
액체 (aCSF) 용액 (126 mM NaCl, 24 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 2.5 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 및 10 mM D-(+)-글루코스 (pH 7.4)). aCSF 용액을 95% O2 및 5% CO2로 가스 처리하였다. 슬라이스를 기록하기 전에 적어도 1시간 동안 aCSF에서 실온에서 인큐베이션하였다. 전체 세포 패치 클램프 기록은 DG에 있는 과립 세포 세포체로부터 생성되었다. 유지 전위는 -70mV였다. 피펫의 저항은 보통 5-7 메가옴이며 내부 용액(135 mM CsCl, 4 mM NaCl, 0.5 mM CaCl2, 10 mM Hepes, 5 mM EGTA, 2 mM Mg-아데노신 삼인산, 0.5 mM Na2-구아노신 삼인산, 및 10 mM QX-314, CsOH (278-285 mOsm) 7.2로 조정). 강직성 전류를 측정하기 전에 기준선 전류를 d-AP5(50 uM) 및 6-시아노-7-니트로퀴녹살린-2,3-디온(CNQX, 20 uM)에서 안정시켰다. 강장성 GABA 전류의 진폭은 Clampfit 프로그램을 사용하여 비크린 (100 mM) 투여 후 기준선 이동에 의해 측정되었다. 토닉 전류는 기준선에서 비크린 처리 전류까지 측정되었다.
알츠하이머모델에서 MAOB ASO 주입을 통한 토닉 GABA (tonic GABA) 양 측정 실험 결과를 도 5a에 나타내었다. 알츠하이머 동물모델 APP/PS1에 MAOB ASO A41을 주입한 결과, 약 3.2 pA 수준의 tonic GABA가 측정되었다. 이는 도 5b에 나타낸 기존 동일 알츠하이머 동물모델에서 측정된 tonic GABA의 양과 비교하여 상대적으로 낮은 양이다.
3-4. 고지방식이 (High fat diet) 마우스에서 MaoB ASO KD test (체중 변화 측정)
고지방식이 쥐 모델에서 수행된 모든 실험은 미국의 Jackson Laboratory (stock number 000664)에서 유래한 C57BL/6J 배경의 쥐를 사용했다. 6주령의 수컷 C57BL/6J 쥐 (DBL, 충북, 대한민국)는 6∼23주 동안 고지방식이 (60% kcal 지방, D12492, Research Diets Inc.) 또는 일반 사료 (Teklad, 2018S, Envigo)를 섭취하였다. 대조군으로 PBS와 3.5 mg/kg의 ASO(a143)를 사용하고, MAOB를 표적으로 하는 ASO (a41과 GalNAc 접합된 a41)를 사용하였다. 고지방식이 마우스를 기화된 이소플루란으로 마취하고 목덜미를 잡아서 ASO(3.5 mg/kg 농도)를 로딩한 주사기를 사용, 피하로 200ul 주입하였다. 총 5주간의 관찰기간 중 0주차와 2주차에 2번 주사하였고, 체중은 0주차부터 5주차까지 주 1회 측정하였다.
지방간 및 비만모델에서 MAOB ASO 주입을 통한 체중 감소 효과 실험결과를 도 6a에 나타내었다. 지방간 및 비만 동물모델 고지방식이 쥐에서 MAOB를 타겟하는 ASO 를 주입한 결과, 대조군에서 비해 유의미하게 체중이 감소됨을 확인하였다.
3-5. High fat diet (HFD) 마우스에서 MaoB ASO KD test (지방간 표현형)
3-4에 사용된 쥐들은 5주차에 이소플루란으로 깊게 마취시킨 후 즉시 장기들을 분리했다. 간 조직은 4% PFA로 고정되었으며, 하룻밤 동안 고정되었고 추가적인 과정이 진행되었다. lipid droplet의 조직학적 변화는 hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 통해 확인되었다. 대조 염색으로는 모든 슬라이드에 Mayer’s hematoxylin이 사용되었다.
고지방식이 쥐의 간에서 중성지방 (Triglyceride)의 유의한 증가가 관찰되며, 이는 지방간의 형질과 유사한 형질이다. 고지방식이 쥐에서 MAOB ASO 주입을 통한 지방간 회복 효과 실험결과를 도 6b에 나타내었다. 고지방식이 쥐에서 MAOB를 타겟하는 ASO 를 주입한 결과, 대조군에서 비해 유의미하게 중성지방이 감소됨을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 모노아민 산화효소 B를 코딩하는 mRNA 또는 단백질 양을 감소시킴으로써, 신경질환 또는 간질환의 예방, 경감 또는 치료에 유효하게 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (16)
- 서열번호 41번로 기재된 MAOB 전체 프리-mRNA 서열 (MAOB whole pre-mRNA sequence)의 핵산서열 중 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 왓슨-크릭 염기쌍 (Watson-Crick pairing) A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍 (wobble pairing) G:U, I:A, I:C, 또는 I:U를 통한 혼성화를 통해서 MAOB 유전자 발현을 억제하는 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고머가 서열번호 1 내지 20으로 구성된 군에서 선택되는 하나의 서열 중 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 왓슨-크릭 염기쌍 (Watson-Crick pairing) A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍 (wobble pairing) G:U, I:A, I:C, 또는 I:U를 통한 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고머가 서열번호 2, 3, 9로 구성된 군에서 선택되는 하나의 서열 중 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 왓슨-크릭 염기쌍 (Watson-Crick pairing) A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍 (wobble pairing) G:U, I:A, I:C, 또는 I:U를 통한 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고머가 서열번호 9의 서열 중 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 왓슨-크릭 염기쌍 (Watson-Crick pairing) A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍 (wobble pairing) G:U, I:A, I:C, 또는 I:U를 통한 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고머가 다음의 서열과 화학구조를 가지는 올리고머:T*GAAC*6*6*5*5*5*7*7*6*5*6*ACGA*G;G*ATCA*6*5*7*7*6*6*8*6*8*6*CAGC*T; 또는C*ACTA*5*8*6*5*6*5*8*5*8*8*TAGC*C,여기서, PS, phosphorothioate; 2’MOE, 2’-O-methoxyethyl. A=2'MOE-A, C=2'MOE-5'-methyl-C, G=2'MOE-G, T=2'MOE-T, 5=DNA-A, 6=DNA-5'-methyl-C, 7=DNA-G, 8=DNA-T, *=PS를 의미함.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고머가 다음의 서열과 화학구조를 가지는 올리고머:C*ACTA*5*8*6*5*6*5*8*5*8*8*TAGC*C,여기서, PS, phosphorothioate; 2’MOE, 2’-O-methoxyethyl. A=2'MOE-A, C=2'MOE-5'-methyl-C, G=2'MOE-G, T=2'MOE-T, 5=DNA-A, 6=DNA-5'-methyl-C, 7=DNA-G, 8=DNA-T, *=PS를 의미함.
- 제6항에 있어서, GalNAc (N-아세틸갈락토스아민)을 포함하는 올리고머.
- 제7항에 있어서, 3가 GalNAc (N-아세틸갈락토스아민)이 올리고머의 5’ 또는 3’ terminal phosphate에 연결된 올리고머.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 올리고머 화합물의 염 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
- 제9항에 있어서, 염이 나트륨 염 또는 칼륨 염인 조성물.
- 제9항에 있어서, 신경질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 신경질환은 알츠하이머병인 조성물.
- 제9항에 있어서, 간질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 간질환은 지방간인 조성물.
- 제9항에 있어서, 대사질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 대사질환은 비만인 조성물.
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| US20070004683A1 (en) * | 2005-07-01 | 2007-01-04 | Jenrin Discovery | Mao-b inhibitors useful for treating obesity |
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