WO2023234583A1 - 1개 이상의 유효성분을 포함하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

1개 이상의 유효성분을 포함하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2023234583A1
WO2023234583A1 PCT/KR2023/006375 KR2023006375W WO2023234583A1 WO 2023234583 A1 WO2023234583 A1 WO 2023234583A1 KR 2023006375 W KR2023006375 W KR 2023006375W WO 2023234583 A1 WO2023234583 A1 WO 2023234583A1
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elemene
fibrosis
renal fibrosis
guggulsterone
preventing
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PCT/KR2023/006375
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박정선
쑨왠지안
김창성
배은희
마성권
김수완
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전남대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating renal fibrosis. More specifically, it was confirmed that ⁇ -elemene and Z-guggulsterone each or cooperatively inhibit renal fibrosis in renal tubules and renal interstitium fibroblasts. and pharmaceutical compositions and health functional foods for preventing, improving or treating renal fibrosis containing one or more active ingredients developed by utilizing these new uses.
  • Chronic kidney disease is one of the most rapidly progressing causes of death worldwide and causes end-stage renal disease (ESRD) due to progressive loss of kidney function.
  • ESRD end-stage renal disease
  • the pathogenesis of renal fibrosis that causes this is characterized by glomerular sclerosis, tubular interstitial and vascular fibrosis, and scar formation.
  • well-known causes of chronic kidney disease and fibrosis include diabetes, hypertension, systemic diseases such as lupus, various glomerular nephritis, stones, and polycystic nephropathy.
  • Cell damage caused by infiltration of inflammatory cells in the acute or chronic process is an important factor.
  • ECM extracellular matrix
  • the Smad family that plays an important role in renal fibrosis is Smad3, which plays a key role in myofibroblast activation, ECM synthesis, stimulation of Integrin expression, and protease and antiprotease secretion that increases fibrosis in signal transmission.
  • TGF ⁇ When stimulated by Smad3, it is phosphorylated, moves into the nucleus, and attaches to transcription factors of proteins that increase fibrosis, such as Collagen I, CTGF, and ⁇ -SMA, and plays a role in regulating transcription.
  • STAT3 is involved in another mechanism that increases fibrosis. When stimulated by TGF ⁇ , JAK2 is phosphorylated and STAT3 is phosphorylated, and the phosphorylated STAT3 forms a dimer. Moves into the nucleus and causes cell inflammation, cell growth, proliferation and differentiation It acts as a polymorphic transcription factor involved in a variety of physiological and pathophysiological processes, including.
  • kidney disease Although there are many causes of acute and chronic kidney disease that progresses to fibrosis, a new treatment related to kidney disease is utilized by utilizing the mechanism of inhibiting renal fibrosis by reducing phosphorylation of STAT3 and Smad3 by engaging in the phosphorylation mechanism of STAT3 and Smad3 described above. If developed, it could be useful for patients with kidney disease.
  • the present inventors identified an active ingredient that can prevent or treat renal fibrosis by participating in the phosphorylation mechanism of STAT3 and Smad3, and completed the present invention. .
  • the purpose of the present invention is to use a completely new use of ⁇ -elemene and Z-guggulsterone, which are known to have mainly anti-inflammatory effects, that is, the compounds can work individually or in cooperation with each other to promote MyD88/STAT3/Smad3 signaling in renal tubules and interstitial fibroblasts.
  • Kidney containing one or more active ingredients that can prevent, improve, or treat renal fibrosis that acts on this mechanism by confirming that it acts on the mechanism of reducing renal fibrosis by inhibiting delivery, and utilizing new uses of these substances.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing, improving or treating renal fibrosis that can be usefully used to suppress the progression of kidney disease caused by kidney damage by effectively inhibiting kidney cell fibrosis caused by acute or chronic kidney disease at a relatively early stage; and It provides health functional foods.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating renal fibrosis containing ⁇ -elemene or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating renal fibrosis containing Z-guggulsterone or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention relates to ⁇ -elemene or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and Z-guggulsterone or a pharmaceutically acceptable salt thereof as active ingredients. It provides a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating renal fibrosis.
  • the ⁇ -elemene and the Z-guggulsterone are included in a weight ratio of 2:1 to 1:1.
  • the active ingredient inhibits MyD88 and thereby reduces phosphorylation of STAT3 and Smad3, thus inhibiting renal fibrosis.
  • the present invention provides a method of treating renal fibrosis comprising administering any of the above-described pharmaceutical compositions to mammals other than humans.
  • the present invention provides a health functional food for preventing and improving renal fibrosis containing ⁇ -elemene or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food for preventing and improving renal fibrosis containing Z-guggulsterone or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention relates to ⁇ -elemene or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and Z-guggulsterone or a pharmaceutically acceptable salt thereof as active ingredients. It provides a health functional food for preventing and improving renal fibrosis.
  • the ⁇ -elemene and the Z-guggulsterone are included in a weight ratio of 1:1 to 2:1.
  • it has the form of any one of powders, granules, tablets, capsules and beverages.
  • ⁇ -elemene and Z-guggulsterone which are known to have mainly anti-inflammatory effects, that is, the compounds individually or in cooperation with each other promote MyD88/STAT3/Smad3 signaling in renal tubules and interstitial fibroblasts.
  • the present invention can be effectively used to suppress the progression of chronic kidney disease caused by kidney damage by effectively suppressing renal cell fibrosis caused by acute and chronic kidney disease at a relatively early stage.
  • the present invention proposes a therapeutic action point that effectively inhibits the progression of cellular fibrosis in the mechanism of progression of renal tubular cells to cellular fibrosis, which is the most difficult problem to solve in kidney disease, and kidney function that appears as a side effect due to the administration of various drugs. It can be usefully used as a pharmaceutical composition and functional food material to help improve and treat the decline of.
  • Figures 1A to 1C show the degree of kidney cell support effect and renal fibrosis inhibition obtained by injecting ⁇ -elemene in the mouse UUO model using hematoxylin and eosin (H&E), Periodic acid-Schiff (PAS), and Masson's tri. chrome (MT) This shows the results confirmed by kidney cell tissue staining.
  • H&E hematoxylin and eosin
  • PAS Periodic acid-Schiff
  • MT Masson's tri. chrome
  • Figures 2a to 2h show the decrease in cell tissue staining expression and the accumulation of collagen I/collagen III in the ⁇ -elemene of ⁇ -SMA, which increases renal cell fibrosis obtained by injecting ⁇ -elemene in the mouse UUO model. What is reduced by This shows the results confirmed through Sirius red staining.
  • Figures 3a to 3e show the results of confirming the concentration-dependent decrease in cytotoxicity and fibrosis markers by treating ⁇ -elemene at different concentrations in renal fibroblasts (NRK49F cells) by comparing cell survival analysis and protein expression changes.
  • Figures 4a to 4f show the results of confirming by protein expression whether MyD88, P-JAK2, P-STAT3, and P-Smad3, signaling transducers related to kidney fibrosis, are reduced by ⁇ -elemene in the mouse UUO model.
  • Figures 5a to 5e show the results of confirming by protein expression whether MyD88, P-JAK2, P-STAT3, and P-Smad3, signal transducers related to renal fibrosis, are reduced by ⁇ -elemene in renal fibroblasts (NRK49F cells). will be.
  • Figures 6a to 6g show that P-STAT3 and P-Smad3, which were increased by TGF ⁇ treatment in renal fibroblasts (NRK49F cells), were decreased by NSC, an inhibitor of STAT3, and SIS3, an inhibitor of Smad3. After confirmation, apply NSC and SIS3 inhibitor. This shows the results confirming that the expression of fibrosis marker proteins is reduced by suppressing the cell signaling of P-STAT3 and P-Smad3.
  • Figures 7a to 7d show the reduction in expression of P-STAT3 and P-Smad3 and inhibition of MyD88 protein in renal fibroblasts (NRK49F cells) through TGF ⁇ treatment and transfection of MyD88 siRNA cells. It shows the results confirmed by manifestation.
  • Figures 8a and 8b show a decrease in the expression of renal fibrosis markers ⁇ -SMA, vimentin, and CTGF in renal tubules (HK-2 cells), and a decrease in the expression of fibrosis-related signal transducers MyD88, P-STAT3, and P-Smad3 in response to Z-gugglesterone. This shows the results of confirming whether protein expression is reduced by protein expression.
  • Figures 9a and 9b show the results of confirming the expression of fibrosis protein markers in renal tubules (HK-2 cells) and renal fibroblasts (NRK49F cells) by combination treatment of ⁇ -elemene and Z-gugglesterone. It shows.
  • Figures 10a and 10b show the results of confirming the expression of fibrosis protein markers in renal tubules (HK-2 cells) and renal fibroblasts (NRK49F cells) by combination treatment of ⁇ -elemene and Z-gugglesterone. It shows.
  • Figures 11a and 11b show the molecular structures of ⁇ -elemene and Z-gugglesterone.
  • Figures 12a and 12b show that ⁇ -elemene treatment in mouse UUO model and kidney fibroblasts (NRK49F cells) suppresses MyD88, which leads to kidney fibrosis mechanism and exists in its subgroup. It reduces phosphorylation of STAT3 and Smad3, ultimately leading to kidney fibrosis. and suppresses MyD88 in renal tubules (HK-2 cells) by treatment with Z-gugglesterone and phosphorylation of STAT3 and Smad3 that exist in that subgroup.
  • This is a schematic diagram showing that it ultimately reduces kidney fibrosis.
  • first, second, etc. may be used to describe various components, but the components are not limited by the terms. The above terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another. For example, a first component may be referred to as a second component, and similarly, the second component may also be referred to as a first component without departing from the scope of the present invention.
  • temporal relationship for example, if a temporal relationship is described as ‘ ⁇ after’, ‘after ⁇ ’, ‘ ⁇ next’, ‘before’, etc., ‘immediately’ or ‘directly’ This also includes non-consecutive cases unless used.
  • the technical feature of the present invention focuses on a completely new use of ⁇ -elemene and Z-guggulsterone, which are known to have mainly anti-inflammatory effects.
  • ⁇ -elemene and Z-guggulsterone can be used alone or in renal tubules and renal fibroblasts.
  • cellular fibrosis is suppressed, that is, these compounds suppress renal fibrosis by suppressing Myeloid differentiation primary response 88 (Myd88), which leads to the mechanism of renal fibrosis, thereby reducing the phosphorylation of STAT3 and Smad3 that exist in the subgroup.
  • Myd88 Myeloid differentiation primary response 88
  • the aim is to confirm the mechanism of action and, taking this into consideration, to provide pharmaceutical compositions and health functional foods that can prevent, improve or treat renal fibrosis using the above compounds alone or in combination.
  • Myd88 acts as an important target to suppress fibrosis by suppressing inflammation in renal tubules and interstitial fibroblasts, so inhibiting Myd88 increases the expression of Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF- ⁇ B). , and the phosphorylation of Smad2/3 and the nuclear protein expression of Smad4 are reduced, thereby suppressing cellular fibrosis. This is because ⁇ -elemene and Z-gugglesterone have been confirmed to be substances that inhibit Myd88.
  • NF- ⁇ B Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
  • the present invention presents MyD88, SMAD3, and STAT3 axis as one of the renal fibrosis inhibition mechanisms through which ⁇ -elemene and Z-guggulsterone act, and by elucidating their inhibitory mechanisms for fibrosis, the inhibition of ⁇ -elemene and Z-guggulsterone Since the point of action of the therapeutic agent for single and combined therapy has been established, the pharmaceutical composition of the present invention can be used to prevent or treat the development of renal fibrosis by administering it to an individual who is likely to develop or has developed renal fibrosis.
  • renal fibrosis is a condition in which kidney tissue becomes fibrosed and loses kidney function as a result of various causes such as excessive inflammatory response occurring in kidney tissue, oxidative stress, and fibrosis of epithelial cells. means.
  • the first aspect of the pharmaceutical composition for preventing, improving or treating renal fibrosis of the present invention contains ⁇ -elemene or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the second aspect includes Z-guggulsterone or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the third aspect includes ⁇ -elemene or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient; and Z-guggulsterone or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the combination therapy combining ⁇ -elemene and Z-guggulsterone causes cell fibrosis due to TGF ⁇ even when used at a concentration of 50% or less than that used when ⁇ -elemene or Z-guggulsterone is included alone.
  • the synergistic effect of the two ingredients can be confirmed because the reduction of the proteins ⁇ -SMA and Fibronectin is superior compared to when ⁇ -elemene or Z-guggulsterone is used alone at high concentration.
  • ⁇ -elemene and Z-guggulsterone can be mixed and used in a weight ratio of 1:1 to 2:1, and the mixing ratio is determined through experiment.
  • ⁇ -elemene is the root and stem extract of Curcuma longa and belongs to the elemene family, a group of natural compounds found in various plants. These elemenes include ⁇ -, ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -elemenes and form structural isomers of each other.
  • a class of terpenes consisting of unsaturated hydrocarbon compounds composed of three isoprene units and classified as sesquiterpenes with the molecular formula C 15 H 24 and the structural formula shown in Figure 11a.
  • ⁇ -elemene is responsible for the flower scent of some plants and is also used as a pheromone for some insects.
  • Z-GUGULSTERONE is a Guggul tree synthetic steroid, also known as a myrrrgic called the indian bdellium-tree-tree-tree, gugal, guggul, gugul, or mukul myrrh tree.
  • Various cancer and organizations and It has an anti-inflammatory effect in cells and is related to the inhibition of various signaling activities such as MAPK, AKT, and NF- ⁇ B.
  • Guggulsterone shows the ability to lower LDL cholesterol and triglyceride levels and is a selective antagonist of FXR (farnesoid X receptor).
  • Z-guggulsterone also has an unknown role in renal function following renal fibrosis. However, through the present invention, as shown in Figures 12a and 12b, it was found that Z-guggulsteron alone or in cooperation with ⁇ -elemene can improve renal fibrosis by suppressing MyD88 and reducing phosphorylation of STAT3 and Smad3. will be.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally and used to prevent, improve, or treat renal fibrosis in mammals, including humans.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain ⁇ -elemene or a pharmaceutically acceptable salt thereof and/or Z-guggulsterone or a pharmaceutically acceptable salt thereof as active ingredients, depending on the formulation, method of use and purpose of use. It may further include a pharmacologically acceptable carrier or excipient. When provided as a mixture, the active ingredient may be included in the pharmaceutical composition in an amount of 0.0001 to 50% by weight.
  • the pharmaceutical composition of the present invention containing a pharmaceutically acceptable carrier can be used in tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, oral solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, and freeze-dried. It is any one dosage form selected from the group consisting of preparations and suppositories and may be in various oral or parenteral dosage forms. When formulated, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants. Solid preparations for oral administration include tablets, powders, granules, capsules, etc.
  • solid preparations include one or more compounds and at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose, or lactose ( It is prepared by mixing lactose, gelatin, etc.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, or lactose
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • simple diluents such as water and liquid paraffin, they contain various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives. You can.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • injectable esters such as ethyl oleate.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao, laurel, glycerogelatin, etc. can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally in a pharmaceutically effective amount.
  • parenterally When administered parenterally, it can be applied topically to the skin, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, etc. It can be administered.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be administered.
  • “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is It can be determined based on factors including type and severity, age, gender, activity of the substance, sensitivity to the substance, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, substances used simultaneously, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be administered single or multiple times. It is important to consider all of the above factors and administer the amount that will achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects.
  • the dosage of the pharmaceutical composition for preventing, improving or treating renal fibrosis of the present invention is determined by those skilled in the art, taking into account the purpose of use, the degree of addiction of the disease, the patient's age, weight, gender, antecedent history, or the type of substance used as an active ingredient. can decide.
  • the composition of the present invention comprising ⁇ -elemene or a pharmaceutically acceptable salt thereof and/or Z-guggulsterone or a pharmaceutically acceptable salt thereof as active ingredients is administered in an amount of about 0.1 ng to about 100 mg per adult. /kg, especially 1 ng to about 40 mg/kg.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered at about 0.0001 to 100 mg/kg, particularly 0.001 to 60 mg/kg, and more specifically 0.01 to 40 mg/kg per adult.
  • the frequency of administration is not particularly limited, but may be administered once a day, or the dose may be divided and administered several times.
  • the health functional food for preventing and improving renal fibrosis of the present invention contains ⁇ -elemene or a pharmaceutically acceptable salt thereof and/or Z-guggulsterone or a pharmaceutically acceptable salt thereof contained in the above-mentioned pharmaceutical composition. By including it as an active ingredient, it can be used for the purpose of preventing and improving the symptoms of renal fibrosis.
  • 'health functional food refers to a natural product or processed product containing one or more nutrients, and preferably, the function of the food is modified for a specific purpose by using physical, biochemical, biotechnological methods, etc. It refers to food that has been designed and processed to fully express the body control functions related to biological defense rhythm regulation, disease prevention and recovery, etc., which the food group or food composition has added value to act on and express in the living body.
  • Health functional foods may include food auxiliary additives that are foodologically acceptable, and may further include appropriate carriers, excipients, and diluents commonly used in the production of health functional foods.
  • Health functional foods of the present invention include, for example, various foods, beverages, gum, tea, vitamin complexes, etc. Additionally, special nutritional foods (e.g., milk formula, infant and toddler food, etc.), health supplements, confectionery (e.g., snacks), dairy products (e.g., fermented milk, cheese, etc.), other processed foods, beverages (e.g., fruits, vegetables, etc.) Beverages, soy milk, fermented beverages, etc.), etc., but are not limited thereto.
  • special nutritional foods e.g., milk formula, infant and toddler food, etc.
  • health supplements e.g., snacks
  • dairy products e.g., fermented milk, cheese, etc.
  • other processed foods e.g., fruits, vegetables, etc.
  • Beverages, soy milk, fermented beverages, etc. Beverages, soy milk, fermented beverages, etc.
  • the above-described foods, beverages, or food additives can be manufactured by conventional manufacturing methods.
  • the health functional food of the present invention contains various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic and natural flavors, colorants and thickening agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its It may contain salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, water, carbonating agents used in carbonated drinks, etc. These ingredients can be used independently or in combination.
  • the health functional food of the present invention has various formulations, and in particular, it may have any one of powder, granule, tablet, capsule, and beverage formulations.
  • the health functional food of the present invention when implemented as a beverage, other than containing ⁇ -elemene or a pharmaceutically acceptable salt thereof and/or Z-guggulsterone or a pharmaceutically acceptable salt thereof as essential ingredients.
  • the ingredients may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients.
  • natural carbohydrates include monosaccharides, such as glucose, fructose, etc., disaccharides, such as maltose, sucrose, etc., and polysaccharides, such as common sugars such as dextrin, cyclodextrin, etc., and xylitol, Sugar alcohols such as sorbitol and erythritol.
  • natural flavoring agents thaumatin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the content of the active ingredients ⁇ -elemene or a pharmaceutically acceptable salt thereof and/or Z-guggulsterone or a pharmaceutically acceptable salt thereof depends on the purpose of use ( (for prevention or improvement) may be appropriately determined.
  • the method for treating renal fibrosis of the present invention can treat renal fibrosis by including the step of orally or parenterally administering the above-described pharmaceutical composition to treat renal fibrosis in mammals other than humans.
  • renal fibrosis is effectively suppressed, it is useful in suppressing the progression of chronic kidney disease caused by kidney damage, so it may have the effect of treating chronic kidney disease.
  • composition 1 with a ⁇ -elemene concentration of 20 ⁇ M was prepared by dissolving ⁇ -elemene in ethanol (99.9% purity).
  • composition 2 with a g-guggulsteronee concentration of 10 ⁇ M was prepared by dissolving g-guggulsteronee in ethanol (purity 99.9%).
  • composition 3 with respective concentrations of 5 ⁇ M and 2.5 ⁇ M was prepared by dissolving ⁇ -elemene and g-guggulsteronee in ethanol (purity 99.9%).
  • composition 4 with respective concentrations of 10 ⁇ M and 5 ⁇ M was prepared by dissolving ⁇ -elemene and g-guggulsteronee in ethanol (99.9% purity).
  • the mouse was an 8-week-old male C57BL/6J mouse weighing between 20 and 25 g.
  • unilateral ureteral obstruction UUO
  • the animals were divided into 4 groups with 6 animals per group, control group, ⁇ -elemene, UUO, UUO+ ⁇ -elemene, and anesthesia was performed using ketamine. proceeded.
  • mice were sacrificed on the 7th day after IP injection at 40 mg/kg/day for 6 days, 24 hours after creating the UUO model, and the left kidney was prepared for protein expression analysis and immunofluorescence analysis.
  • FIG. 1a is a tissue staining photograph
  • Figures 2A to 2H histopathological damage and renal fibrosis protein expression caused by ⁇ -elemene treatment were observed as follows, and the results are shown in Figures 2A to 2H.
  • Figure 2a shows interstitial fibrosis in kidney tissue evaluated by immunohistochemistry of ⁇ -SMA and Sirius red staining
  • Figures 2b and 2c show the results of quantifying the observed cell damage.
  • Figure 2d shows the results of confirming the expression of ⁇ -SMA, vimentin, CTGF, and fibronectin by Western blot after protein extraction.
  • Figures 2e to 2h show the results of quantifying the amount of protein observed.
  • Figure 3a shows NRK49F cells treated with ⁇ -elemene for 24 hours.
  • toxicity was observed starting from 40 ⁇ M ⁇ -elemene treatment.
  • Figure 3b shows the results of confirming protein expression of ⁇ -SMA, CTGF, and Vimentin in NRK49F cells stimulated with TGF- ⁇ by Western blot as follows.
  • the concentration of ⁇ -elemene in kidney fibroblasts was found to reduce fibrosis without being cytotoxic, and ⁇ -SMA, vimentin was found at 20 ⁇ M without cytotoxicity. ,Same as CTGF A decrease in fibrosis-related markers was observed. From these results, the concentration of ⁇ -elemene, which has no cytotoxicity and reduces fibrosis markers, was determined to be 5-20 ⁇ M.
  • Figure 4a shows the results of Western blot confirmation of protein expression of P-JAK2, P-STAT3, P-Smad3, and MyD88 in the UUO mouse kidney model
  • FIG. 5A shows the increase in TGF- ⁇ by ⁇ -elemene treatment in NRK49F cells. This is the result of observing through Western blot that the protein expression of P-JAK2, P-STAT3, P-Smad3, and MyD88 is decreased, and Figures 5b to 5e quantify the observed amount of protein.
  • cells treated with Control and ⁇ -elemene showed no change in signaling expression of MyD88, P-JAK2, P-STAT3, and P-Smad3, and were treated with 10 ng/ml of TGF ⁇ .
  • the phosphorylation of signaling proteins related to fibrosis is greatly increased, and in cells treated with ⁇ -elemene and cells treated with TGF ⁇ after pretreatment with ⁇ -elemene, MyD88, P-JAK2, P-STAT3, P-S mad3 is well reduced I was able to confirm that it worked.
  • Figures 6a to 6g The effect of suppressing fibrosis signaling for NSCs and SIS3 inhibitors on fibrosis stimulated with TGF- ⁇ in NRK49F cells was observed, and the results are shown in Figures 6a to 6g.
  • Figure 6a shows NSCs and NSCs by Western blotting in NRK49F cells.
  • the results confirmed that SIS3 inhibitor treatment reduced protein expression of P-STAT3 and P-Smad3 stimulated with TGF- ⁇ , and Figures 6b to 6c show the results of quantifying the amount of protein observed.
  • Figure 6d shows the results confirming by Western blotting in NRK49F cells that NSC and SIS3 inhibitor treatment reduce the protein expression of ⁇ -SMA, Vimentin, and CTGF stimulated with TGF- ⁇ .
  • Figures 6e to 6g show the results of quantifying the observed amount of protein.
  • Figures 7a to 7d show the results of quantifying the amount of protein observed.
  • the decrease in expression of P-STAT3 and P-Smad3 through MyD88 siRNA means that MyD88 exists on top of STAT3 and Smad3, and that STAT3 and Smad3 are regulated by increased and decreased expression of MyD88. I was able to confirm that it was controlled.
  • Figure 8a shows Z-guggulsterone in HK-2 cells.
  • Western blotting confirmed that the protein expression of ⁇ -SMA, Vimentin, and CTGF, which was increased by TGF- ⁇ , was decreased by treatment, and the amount of observed protein was quantified, and
  • Figure 8b shows the decrease in protein expression of ⁇ -SMA, Vimentin, and CTGF in HK-2 cells treated with Z-guggulsterone.
  • Figure 9a shows the treatment of ⁇ -elemene (20 ⁇ M) and Z-guggulsterone (10 ⁇ M) alone and the treatment of ⁇ -elemene (5 and 10 ⁇ M) and Z-guggulsterone (2.5 and 5 ⁇ M) in HK-2 cells.
  • Composite This is the result of Western blotting confirming that the protein expression of ⁇ -SMA, Vimentin, and CTGF, which was increased by TGF- ⁇ , was decreased by treatment, and quantifying the observed protein amount.
  • Figure 9b shows treatment of ⁇ -elemene (20 ⁇ M) and Z-guggulsterone (10 ⁇ M) alone and treatment of ⁇ -elemene (5 and 10 ⁇ M) and Z-guggulsterone (2.5 and 5 ⁇ M) in NRK49F cells.
  • complex processing This is the result of confirming the decrease in protein expression of ⁇ -SMA, Vimentin, and CTGF, which was increased by TGF- ⁇ , by Western blotting and quantifying the amount of protein observed.
  • fibrosis markers were confirmed in kidney fibroblasts (NRK49F cells) and kidney tubule cells (HK-2 cells).
  • ⁇ -SMA, vimentin, and CTGF proteins were increased by TGF ⁇ .
  • Appearance ⁇ When comparing the single and combined treatment of -elemene and Z-guggulsterone, it was confirmed that protein expression decreased more in the combined treatment with reduced concentration than in the single treatment.
  • the expression of ⁇ -SMA, vimentin, and CTGF increased significantly by TGF ⁇ treatment in both cells, while the concentration of ⁇ -elemene and Z-gugglesterone combined treatment increased to 1/4 and 1. In the group reduced to /2 This is because it was confirmed that protein expression was significantly reduced at low concentrations compared to the group treated with ⁇ -elemene and Z-gugglesterone alone.
  • FIG. 10A is a sole treatment of ⁇ -elemene (20 ⁇ M) and z-Gugulsterone (10 ⁇ M) in HK-2 cells and a complex treatment of ⁇ -elemene (5 and 10 ⁇ M) It was confirmed by Western blotting that the protein expression of MyD88, P-STAT3, and P-Smad3, which was increased by TGF- ⁇ , was decreased, and the results of quantifying the amount of protein observed were shown.
  • Figure 10b shows the results of quantifying the amount of protein observed in NRK49F cells.
  • TGF- ⁇ by single treatment of elemene (20 ⁇ M) and Z-guggulsterone (10 ⁇ M) and combined treatment of ⁇ -elemene (5 and 10 ⁇ M) and Z-guggulsterone (2.5 and 5 ⁇ M).
  • Increased MyD88 the decrease in protein expression of P-STAT3 and P-Smad3 was confirmed by Western blotting, and the amount of protein observed was quantified.
  • ⁇ -elemene treatment inhibits MyD88, which leads to the kidney fibrosis mechanism, and reduces the phosphorylation of STAT3 and Smad3, which exist in its subgroups, ultimately leading to kidney failure.
  • Z-gugglesterone By suppressing MyD88 in the renal tubules (HK-2 cells) and reducing the phosphorylation of STAT3 and Smad3 existing in the subgroup, it ultimately reduces renal fibrosis. It is shown that ⁇ -elemene and Z-guggulsterone induce fibrosis in kidney fibroblasts. By controlling the transmission of related signals, fibrosis markers are reduced, and MyD88 acts as an important first target in this mechanism, indicating that the point of action for the treatment of renal cell fibrosis inhibition has been systematically revealed.

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Abstract

본 발명은 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 β-elemene과　Z-guggulsterone이 각각 또는 서로 협력하여 신장　세뇨관과　신장간질　섬유아세포에서 신장섬유화를 억제하는 것을 확인하고 이들의 신규 용도를 활용하여 개발된 1개 이상의 유효성분을 포함하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

1개 이상의 유효성분을 포함하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 β-elemene과　Z-guggulsterone이 각각 또는 서로 협력하여 신장　세뇨관과　신장간질　섬유아세포에서 신장섬유화를 억제하는 것을 확인하고 이들의 신규 용도를 활용하여 개발된 1개 이상의 유효성분을 포함하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
만성　신장 질환（CKD)은 전　세계적으로　가장　빠르게　진행하는　사망　원인　중　하나이며，　신장　기능의　점진적　손실에　의해　말기　신장　질환（ESRD)을　유발한다．　이러한　원인을　일으키는　신장　섬유화증　발병기전은　사구체　경화증，　세뇨관　간질　및　혈관의　섬유화증，　흉터　형성 등을　특징으로　한다．　또한　만성　신장　질환　섬유화증을　일으키는　원인으로　잘　알려진　것은　　당뇨병, 고혈압, 루푸스와 같은 전신　질환, 각종 사구체 신장염, 결석, 다낭신증 급성 또는 만성　과정에서 염증세포의 침윤에　의한 세포손상 등이 중요한 요인이다.
신장　섬유화증이　말기　신장질환으로　진행될　때　섬유아세포의　활성　 및　근섬유아세포의　증식으로　인하여　신세뇨관　간질에　다량의　세포외　기질（ECM)이　축적되고　ECM 분해　및　가교와 관련된　단백질들의　감소가　나타나며　유해　자극에　대한　반응을　나타낸다． 그　결과 Fibronectin（유착당단백질）， α－SMAα－평활근액틴），Vimentin, CTGF（결합조직성장인자）등의　발현이　높게　나타난다．　
신장　섬유화증에서 중요한 역할을 하는 Smad family 신호　전달에서 섬유화를　증가시키는　근섬유아세포 활성, ECM 합성, Integrin (인티그린) 발현 자극, 프로테아제　및 항프로테아제 분비에 핵심적인 역할을 하는　Smad family는　Smad3이다．TGFβ에　의해　자극되면　Smad3가　인산화　되면서　핵안으로　이동하고　Collagen I, CTGF, α－SMA과　같은　섬유화를　증가　시키는　단백질들의　전사인자에　붙어　전사를　조절하는　역할을　한다．　또한，　섬유화를　증가시키는　다른　기전으로는　STAT3가 관여하는데　이　또한　TGFβ에　의해　자극되면　JAK2가　인산화　되면서　STAT3를　인산화　시키고　인산화　된　STAT3는　dimer를　형성하여　핵　안으로　이동되고　세포 염증, 세포 성장, 증식 및 분화를 포함한 다양한 생리학적 및 병태생리학적 과정에 관여하는 다형성 전사 인자로　작용한다．
이와 같이, 섬유화로 진행되는 급성, 만성 신장질환의 유발원인이 매우 다양하지만, 상술된 STAT3 및 Smad3의 인산화 기전에 관여하여 인산화를 감소시키면 신장 섬유화가 억제되는 기전을 활용하여 신장질환과 관련된 새로운 치료제가 개발되면 신장질환 환자에게 유용할 수 있다.
본 발명자들은 신장의 섬유화를 예방 또는 치료할 수 있는 제제를 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, STAT3 및 Smad3의 인산화 기전에 관여하여 신장섬유화증을 예방 또는 치료할 수 있는 유효성분을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 지금까지 주로 항염증작용을 갖는 것으로 알려진 β-elemene과　Z-guggulsterone의 전혀 새로운 용도 즉 상기 화합물들이 각각 또는 서로 협력하여 신장세뇨관 및 간질 섬유아세포에서 MyD88／STAT3/Smad3 신호전달을　억제하여 신장섬유화를 감소시키는 기전에 작용하는 것을 확인하고, 이들 물질의 새로운 용도를 활용하여 상기 기전에 작용하는 신장섬유화증을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 1개 이상의 유효성분을 포함하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 급성 또는 만성신질환으로 인한 신장 세포 섬유화를 비교적 초기에 효과적으로 억제하여 신장손상에 의한 신장질환의 진행을 억제하는 데 유용하게 사용될 수 있는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 건강기능성식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 및 Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염;을 유효성분으로 포함하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 β-elemene 과 상기 Z-guggulsterone은 ２：１　내지　１：１의　중량비로 포함된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 유효성분은 MyD88을　억제함으로써 STAT3 및 Smad3의　인산화를 감소시켜 신장섬유화를 억제한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 약학조성물을 인간을 제외한 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 신장섬유화증 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 신장섬유화증 예방 및 개선용 건강기능성식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 신장섬유화증 예방 및 개선용 건강기능성식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 및 Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염;을 유효성분으로 포함하는 신장섬유화증 예방 및 개선용 건강기능성식품을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 β-elemene 과 상기 Z-guggulsterone은 １：１　내지　２：１의 중량비로 포함된다.
바람직한 실시예에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 및 음료 중 어느 하나의 제형을 갖는다.
상술된 본 발명에 의하면 지금까지 주로 항염증작용을 갖는 것으로 알려진 β-elemene과　Z-guggulsterone의 전혀 새로운 용도 즉 상기 화합물들이 각각 또는 서로 협력하여 신장세뇨관 및 간질 섬유아세포에서 MyD88／STAT3/Smad3 신호전달을　억제하여 신장섬유화를 감소시키는 기전에 작용하는 것을 확인하고, 이들 물질의 새로운 용도를 활용하여 신장섬유화증을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명은 급,만성신질환으로 인한 신장 세포 섬유화를 비교적 초기에 효과적으로 억제하여 신장 손상에 의한 만성신장질환의 진행을 억제하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 신장의 신세뇨관 세포에서 신장질환의 가장 해결하기 어려운 문제인 세포 섬유화로의 진행 기전에 있어서 세포 섬유화 진행을 효과적으로 억제하는 치료 작용점을 제시한 것으로서 다양한 약제 투여에 의한 부작용으로 나타나는 신장 기능의 저하를 개선 및 치료하는데 도움이 되는 약학조성물 및 기능성 식품소재로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 이러한 기술적 효과들은 이상에서 언급한 범위만으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 실시를 위한 구체적 내용의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 효과 역시 당연히 포함된다.
도 1a 내지 도 1c는 마우스　UUO　모델에서 β－elemene을　주사하여 얻는　신장　세포　보효　효과　 및　신섬유화　억제에　대한 정도를 hematoxylin and eosin (H&E)，　Periodic acid-Schiff (PAS)，　Masson's trichrome (MT)의 신장　세포　조직염색법으로　확인한 결과를 도시한 것이다.
도 2a 내지 도 2h는 마우스　UUO　모델에서 β－elemene을　주사하여 얻는　신장　세포　섬유화를　증가시키는　α－SMA의　세포　조직　염색 발현의　감소와　collagen I/collagen III의　축척이　β－elemene에　의해　감소되는　것을　Sirius red 염색을　통하여 확인한 결과를 도시한 것이다.
도 3a 내지 도 3e는 신장 섬유아세포（NRK49F　세포）에서　β－elemene을　농도별로　처리함으로써　세포독성　및　섬유화　마커들의　농도　의존적　감소를 세포　생존분석법과　단백질의 발현　변화를 비교하여 확인한 결과를 도시한 것이다.
도 4a 내지 도 4f는 마우스　UUO　모델에서　신장　섬유화와　관련된 신호전달인　MyD88, P-JAK2, P-STAT3, P-Smad3이 β－elemene에　의하여　감소되는지　단백질　발현으로　확인한 결과를 도시한 것이다.　
도 ５a 내지 도 5e는 신장 섬유아세포（NRK49F 세포）에서　신장　섬유화와　관련된 신호전달인　MyD88, P-JAK2, P-STAT3, P-Smad3이 β－elemene에　의하여　감소되는지　단백질　발현으로　확인한 결과를 도시한 것이다.　
도 6a 내지 도 6g는 신장 섬유아세포（NRK49F　세포）에서　TGFβ　처리에　의해　증가된　P-STAT3, P-Smad3이　 STAT3의　억제제인　NSC와　Smad3　억제제인SIS3에　의해　감소되는　것을　확인　후　NSC과　SIS3　억제제를　통해　P-STAT3, P-Smad3의　세포　신호전달을　억제　시킴으로써　섬유화　마커　단백질들의　발현이　감소하는　것을　확인한 결과를 도시한 것이다．
도 ７a 내지 도 7d는 신장 섬유아세포（NRK49F　세포）에서　TGFβ　처리와　MyD88　siRNA의　형질　감염　세포를　통해　P-STAT3, P-Smad3의　발현　감소와　MyD88의　억제를　단백질　발현으로　확인한 결과를 도시한 것이다.　
도 ８a 및 도 8b는 신장 세뇨관（HK-2세포）에서　신장 섬유화 마커인　α-SMA, vimentin，CTGF의　발현　감소와　섬유화와　관련된 신호전달인　MyD88, P-STAT3, P-Smad3이 Z-gugglesterone에　의하여　감소되는지　단백질　발현으로　확인한 결과를 도시한 것이다.　
도 ９a 및 도 9b는 신장 세뇨관（HK-2　세포） 및　신장 섬유아세포（NRK49F　세포）에서　β－elemene과　Z-gugglesterone의　combination　처리에　의한　섬유화　단백질　마커들의　발현을　확인한 결과를 도시한 것이다．　
도 10a 및 도 10b는 신장 세뇨관（HK-2　세포） 및　신장 섬유아세포（NRK49F　세포）에서　β－elemene과　Z-gugglesterone의　combination　처리에　의한　섬유화　단백질　마커들의　발현을　확인한 결과를 도시한 것이다．　
도 11a 및 도 11b는 β－elemene과　Z-gugglesterone의　분자구조식을　나타낸 것이다．
도 12a 및 도 12b는 각각 마우스　UUO　모델　 및　신장 섬유아세포（NRK49F　세포）에서 β－elemene 처리는　신장　섬유화　기전으로　이어지는　MyD88을　억제　시키고　그　하위　그룹에　존재하는　STAT3와 Smad3의　인산화를　감소　시키므로　결국　신장　섬유화를　감소시킨다는　것과　Z-gugglesterone의　처리에　의해　　신장 세뇨관　（HK-2　세포）에서　MyD88을　억제　시키고　그　하위　그룹에　존재하는　STAT3와 Smad3의　인산화를　감소　시키므로　결국　신장　섬유화를　감소시킨다는　것을　보여주는 모식도이다.
본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 발명의 설명에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다.
구성 요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다. 특히, 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등이 사용되는 경우 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되는 것으로 해석될 수 있다.
시간 관계에 대한 설명일 경우, 예를 들어, '~후에', '~에 이어서', '~다음에', '~전에' 등으로 시간적 선후관계가 설명되는 경우, '바로' 또는 '직접'이 사용되지 않는 이상 연속적이지 않은 경우도 포함한다.
이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명의 기술적 특징은 지금까지 주로 항염증작용을 갖는 것으로 알려진 β-elemene과　Z-guggulsterone의 전혀 새로운 용도에 초점이 있는데, 신장 세뇨관 및　신장 섬유아세포에 β－elemene과　Z-gugglesterone이　단독으로 또는 배합되어 처리되면 세포섬유화가 억제되는 것, 즉 이들 화합물이 신장 섬유화　기전으로　이어지는 Myeloid differentiation primary response 88 (Myd88)을　억제시킴으로써 그　하위　그룹에　존재하는　STAT3와 Smad3의　인산화를　감소시켜 신장섬유화를 억제시키는 기전에 작용하는 것을 확인하고, 이에 착안하여 상기 화합물들을 단독 또는 병행으로 사용하는 신장섬유화증을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 약학조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것에 있다.
즉, Myd88은 신장세뇨관 및 간질 섬유아세포에서 염증을　억제하여 섬유화를 억제하기 위한 중요한 타겟으로 작용하므로, Myd88을 억제하면 Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells(NF-κB)의　발현을 감소시키며, Smad2/3의　인산화 및　Smad4의　핵단백질 발현이 감소되어 세포섬유화가 억제되는데, β－elemene과　Z-gugglesterone이 Myd88의 억제에 작용하는 물질임이 확인되었기 때문이다.
그 결과, 본 발명은 β-elemene과　Z-guggulsterone이 작용하는 신장　섬유화　억제 기전중의 하나로 MyD88，SMAD3, STAT3 axis을 제시하고 이들의 섬유화에 대한 억제 기전을 밝힘으로써 β-elemene과　Z-guggulsterone의　단독 및 병행 요법에 대한 치료제의 작용점을 확립하였으므로, 본 발명의 약학조성물은 신장섬유화증이 발생할 가능성이 있거나 또는 발생된 개체에게 투여함으로써 신장섬유화증의 발병을 예방 또는 치료하는데 활용될 수 있다.
여기서, 신장섬유화증(Renal fibrosis)이란, 신장조직에서 발생되는 과다한 염증반응, 산화적 스트레스, 상피세포의 섬유세포화와 같은 다양한 원인들의 결과로서 신장조직이 섬유화되어 신장의 기능을 상실하게 되는 증상을 의미한다.
따라서, 본 발명의 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물의 제1양태는 유효성분으로 β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 것이다. 제2양태는 유효성분으로 Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 것이다. 제3양태는 유효성분으로 β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 및 Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염;을 포함하는 것이다.
후술하는 실험예에서 알 수 있듯이, β-elemene 과 Z-guggulsterone이 배합되는 병행요법은 β-elemene 또는 Z-guggulsterone가 단독으로 포함될 때 사용되는 농도보다 50%이하 농도로 사용되어도 TGFβ에 의한 세포섬유화 단백질인α－SMA과 Fibronectin의 감소량이 고농도로 β-elemene 또는 Z-guggulsterone이 단독 사용되는 경우와 비교하여 보다 우수한 하므로 2가지 성분의 시너지 효과를 확인할 수 있다. 특히, β-elemene 과 Z-guggulsterone은 1:1 내지 2:1의 중량비로 배합되어 사용될 수 있는데, 배합비는 실험을 통해 결정된 것이다.
먼저, β-elemene은 Curcuma longa의 뿌리， 줄기 추출물이며　다양한 식물에서 발견되는 천연 화합물 그룹인　elemene family에　속하며　이러한 elemenes들은　α-, β-, γ-, δ-elemene을 포함하고 서로 구조적 이성질체를　이루며 3개의 이소프렌 단위로 구성되고 분자식 C15H24인　sesquiterpenes로 분류되는　불포화　탄화수소　화합물로　구성된　테르펜 부류로서 도 11a에 도시된 구조식을 갖는다.　β－elemene은 일부 식물의 꽃 향기에 관여하고 일부 곤충의 페로몬으로도 사용된다.　β-elemene의　분자량은　（Molecular Weight = ２０４.３５, ２０４.３５g/mol)이며　현재 연구에 따르면 β-elemene은　Rho kinase 억제제로　작용을　하여　몇몇　암에서　암세포　증식을　억제한다고　알려지는 등 여러 연구에서 광범위한 항종양 활성을 나타내는 것으로 알려져 있는데, 특히 쥐에서 CCl4로 유도된 혈청 TNF-α와 내독소를 억제하여 항염 효과를 발휘하며 결과적으로　종양 성장과 증식을 억제하고, 세포 사멸을 유도하고, 면역을 조절할 수 있다고 알려져 있을 뿐 신장 섬유화에 따른 신장 기능에서의　역할은　알려지지　않았다. 그런데 본 발명을 통해 도 12a 및 도 12에 도시된 바와 같이 β-elemene이 단독으로 또는 Z-guggulsterone와 협력하여 MyD88을　억제하여　STAT3 및 Smad3의　인산화를　감소시킴으로써 신장 섬유화증을 개선할 수 있음이 밝혀진 것이다.
또한, Z-guggulsterone는 Indian bdellium-tree, gugal, guggul, gugul　또는　mukul myrrh tree라는　이름을　가진　Commiphora wightii로　몰약이라고도 불리는　guggul 나무　식물　합성　스테로이드로서 도 11b에 도시된 구조식을 갖고, 다양한　암과　조직　및세포에서　항　염증　작용을　하며　MAPK, AKT, NF-κB등의 다양한　신호전달　작용　억제와　관련되어　있는데, Guggulsterone은 LDL 콜레스테롤과 중성지방 수치를 낮추는 능력을 보이며 FXR（파르네소이드 X 수용체)의 선택적 길항제로 작용하며　FXR의　전이　활성화（transactivation）를　억제하지만 LXRα간 X 수용체 α), PPARγ（퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체 γ) 또는 RXRα레티노이드 X 수용체 α)의 전사 활성화에는　영향을　미치지 않는다고 알려 졌을 뿐, Z-guggulsterone 또한 신장 섬유화에 따른 신장 기능에서의　역할은　알려지지 않았다. 그런데 본 발명을 통해 도 12a 및 도 12b에 도시된 바와 같이 Z-guggulsteron가 단독으로 또는 β-elemene과 협력하여 MyD88을　억제하여　STAT3 및 Smad3의　인산화를　감소시킴으로써 신장 섬유화증을 개선할 수 있음이 밝혀진 것이다. 　
그 결과 본 발명의 약학조성물은 경구 또는 비경구적으로 투여되어 인간을 포함한 포유류의 신장섬유화증을 예방, 개선 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 유효성분으로서 β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및/또는 Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있으며, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 혼합물로 제공되는 경우, 유효성분은 약학조성물에 0.0001 내지 50 중량%로 포함될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 본 발명의 약학조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로서 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고 형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 경구 또는 비경구로 투여할 수 있는데, 비경구로 투여되는 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 발명의 약학적 조성물은 투여될 수 있는데, 본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 물질의 활성, 물질에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 물질을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및/또는 Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 특히 1ng 내지 약 40 mg/kg로 투여할 수 있다. 경우에 따라서는 본 발명의 약학조성물은 성인 1인당 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 특히 0.001 내지 60 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.01 내지 40mg/kg으로 투여함이 바람직하며, 본 발명의 약학조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
다음으로, 본 발명의 신장섬유화증 예방 및 개선용 건강기능성식품은 상술된 약학조성물에 포함되는 β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및/또는 Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함함으로써 신장섬유화증의 증상을 예방 및 개선하기 위한 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 '건강기능성식품'이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 건강기능성식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다. 추가로, 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 건강보조식품, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상술된 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 물, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이와 같이 본 발명의 건강기능성식품은 상술된 바와 같이 다양한 제형을 갖는데, 특히 분말, 과립, 정제, 캡슐 및 음료 중 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
일 구현예로서, 본 발명의 건강기능성식품을 음료로 구현하는 경우 필수 성분으로서 β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및/또는 Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 신장섬유화증의 예방 및 개선을 목적으로 하는 건강기능성식품에서도 유효성분인 β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및/또는 Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 함량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 신장섬유화증 치료방법은 상술된 약학조성물을 인간을 제외한 포유류의 신장섬유화증을 치료하기 위해 경구 또는 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하여 신장섬유화증을 치료할 수 있다. 여기서, 신장섬유화증이 효과적으로 억제되면 신장 손상에 의한 만성신장질환의 진행을 억제하는데 유용하므로, 만성진장질환을 치료하게 되는 효과가 있을 수 있다.
실시예 1
에탄올(순도 99.9%)에 β－elemene을 용해시켜 β－elemene의 농도가 20μM인 약학조성물1을 준비하였다.
실시예 2
에탄올(순도 99.9%)에 g-guggulsteronee을 용해시켜 g-guggulsteronee의 농도가 10μM인 약학조성2를 준비하였다.
실시예 3
에탄올(순도 99.9%)에 β－elemene 및 g-guggulsteronee을 용해시켜 각각의 농도가 5μM 및 2.5μM인 약학조성물3을 준비하였다.
실시예 4
에탄올(순도 99.9%)에 β－elemene 및 g-guggulsteronee을 용해시켜 각각의 농도가 10μM 및 5μM인 약학조성물4를 준비하였다.
실험예 1
UUO 모델에서 β－elemene 처리에　의한　조직병리학적 손상과 신장 섬유화증의 약화를 다음과 같이 실험하고 그 결과를 도 1a 내지 도 1c에 나타냈다.
마우스는 8주된 male C57BL/6J 마우스로 무게는 20~２5g에 속하는 마우스를 사용하였다. 만성 신손상을 유도하기 위하여 왼쪽 신장과 연결된 뇨관을 묶어 unilateral ureteral obstruction (UUO) 한 그룹에 6마리씩 4그룹으로 대조군, β-elemene, UUO, UUO＋β-elemene으로 나누어 진행하였으며 마취는 케타민을 사용하여 마취를 진행하였다. UUO＋β-elemene그룹은　UUO 모델을　만든　２４시간 후 ４０mg/kg/day 6일　동안　IP injection 한　후　7일째에　마우스를 sacrificed 하였고, 왼쪽 신장은 단백질 발현 분석 및 면역 형광법 분석을 위하여 준비하였다. H&E 및 PAS 염색으로 조직학적 변화를 평가하였고，간질성 섬유화증은 MT 염색에 의해 평가하였다. 도 1a는 조직염색 사진이고, 도 1b 및 도 1c는 관찰된 세포손상을 정량화한 결과로서, 통계적 유의성은 평균 ± SD, n = 6으로 표시되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ns: 유의하지 않음을 나타낸다.
도 1a 내지 도 1c에 도시된 바와 같이, β-elemene을　주사한　마우스　UUO 모델에서　hematoxylin and eosin (H&E)，　Periodic acid-Schiff (PAS)，Masson's trichrome (MT)의 신장세포　조직염색법으로　관찰한　결과　신장세포 조직　손상및　섬유화가　β-elemene　주사에　의해　억제　되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 2
UUO 모델에서 β-elemene　처리에　의한 조직병리학적 손상과 신장 섬유화증의 단백질　발현을 다음과 같이　관찰하고 그 결과를 도 2a 내지 도 2h에 나타냈다. 도 2a는 신장 조직에서　간질성 섬유화증은　α-SMA의 면역조직화학 및 시리우스 레드 염색에 의해 평가한 것이고, 도 2b 및 도 2c는　관찰된　세포손상을　정량화한 결과이다. 통계적 유의성은 평균 ± SD, n = 6으로 표시되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ns: 유의하지 않음을 의미한다. 도 2d는 α-SMA, vimentin, CTGF 및 fibronectin의 발현을 단백질　추출　후　웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다．도 2e내지 도 2h는 관찰된　단백량을　정량화한 결과이다．통계적 유의성은 평균 ± SD, n = 6으로 표시되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ns: 유의하지 않음을 의미한다.
도 2a 내지 도 2h에 도시된 바와 같이, β-elemene을　주사한　마우스　UUO 모델에서　신장　섬유화와　관련된　마커들이　감소하는　것을　조직염색법으로 확인한　결과　α－SMA이　감소하였으며　섬유화가　진행되었을　때　축적되는　Collagen I/III의　발현을　Sirius red로　확인한　결과　Collagen의　발현이　감소함을　확인하였다．　또한，　웨스턴　블롯팅을　사용하여 대표적인　섬유화　마커들인　α-SMA, vimentin，CTGF，Fibronectin의　단백질　발현이　β-elemene에　의해서　감소하는　것을　확인하였다
실험예 3
NRK49F 세포에서 TGF-β로 자극된 섬유성 변화가 β-elemene에　의해 약화됨을 다음과 같이　관찰하고 그 결과를 도 3a 내지 도 3e에 나타냈다．도 3a는 NRK49F 세포를 24시간 동안 β-elemene으로 처리하고 세포독성 분석을 수행한 결과로서 β-elemene 처리　４０μM에서　부터　독성이　관찰되었다． 본　발명에서는 β-elemene　농도를　２０μM　까지만　수행한 결과를 도시하였다．도 3b는 TGF-β로 자극된 NRK49F 세포에서 α-SMA, CTGF 및 Vimentin의　단백질 발현을 다음과 같이 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다. 세포는 0.5% FBS 배지로 ２４시간　처리 후 2시간 동안 β-elemene을 전처리하고, TGF-β(10　ng/ml)로 30분 동안 처리하고, 5% FBS 배지에서 24시간 동안 인큐베이션　하였다. 도 3c 내지 도 3e는 관찰된　단백량을 정량화한 결과이다. 통계적 유의성은 평균 ± SD, n = 6으로 표시되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ns: 유의하지 않음을 의미한다.
도 3a 내지 도 3e에 도시된 바와 같이, 신장　섬유아세포（NRK49F 세포）에서　β-elemene이　세포독성을　띄지　않고　섬유화를　감소시키는　농도를　찾았고　세포　독성이　없는　２０μM에서　α-SMA, vimentin，CTGF과　같은　섬유화 관련　마커들이　감소하는　것을 관찰하였다. 이러한 결과로부터 세포　독성이 없으며　섬유화　마커들을　감소시키는 β-elemene의 농도를　５-２０μM로　결정하였다.
실험예 4
UUO 마우스　모델에서　β-elemene　주사에　의한 섬유화　신호 전달 경로 억제와 MyD88 발현의　감소를 다음과 같이　관찰하고 그 결과를 도 4a 내지 도 4f에 나타냈다． 도 4a는 UUO 마우스　신장　모델에서 P-JAK2, P-STAT3, P-Smad3 및 MyD88의 단백질　발현을 웨스턴 블롯　확인한 결과이고, 도 4b 내지 도 4f는　정량한 결과로서 통계적 유의성은 평균 ± SD, n = 6으로 표시되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ns: 유의하지 않음을 의미한다.
도 4a 내지 도 4f에 도시된 바와 같이, Sham과　β－elemene을　처리한　group은　MyD88, P-JAK2, P-STAT3, P-Smad3의　신호전달　발현에　변화가　없고，UUO　group에서는　크게　증가되며，β－elemene이　주사된　UUO group에서는　잘감소되는　것을 확인하였다．이와 같이 섬유화　억제에　관련된　세포내　신호　전달을　확인한　결과　UUO 동물모델에서 β-elemene에 의해　MyD88, P-JAK2, P-STAT3, P-Smad3의　인산화가　감소하는　것을　확인할 수 있었다.
실험예 5
TGF-β로 자극된 NRK49F 세포에서　β-elemene　처리에　의한　섬유화　신호 전달 경로를 관찰하고 그 결과를 도 5a 내지 도 5e에 나타냈다．도 5a는 NRK49F 세포에서　β-elemene　처리에　의해　TGF-β로　증가된　P-JAK2, P-STAT3, P-Smad3 및 MyD88의 단백질 발현이　감소되는　것을　웨스턴　블롯을　통하여　관찰한 결과이고,　도 5b 내지 도 5e는 관찰된　단백량을　정량화한 것이다．통계적 유의성은 평균 ± SD, n = 3으로 표시되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ns: 유의하지 않음을 의미한다.
도 5a 내지 도 5e에 도시된 바와 같이 Control과　β－elemene이　처리된　세포는　MyD88, P-JAK2, P-STAT3, P-Smad3의　신호전달　발현에　변화가　없고，10 ng/ml의　TGFβ가　처리된　세포에서는　섬유화　관련　신호전달　단백질들의　인산화가　크게　증가되며，β－elemene이　처리된　세포와　β－elemene　전처리 후　TGFβ가　처리된　세포에서는　MyD88, P-JAK2, P-STAT3, P-Smad3이　잘　감소되는　것을　확인할 수 있었다．
이처럼 신장　섬유아세포（NRK49F 세포）에서도　섬유화　신호　전달을　확인한　결과　TGFβ에　의해　증가된　MyD88, P-JAK2, P-STAT3, P-Smad3의　인산화가　β-elemene　처리에　의해　감소하는　것을　알 수 있었다.
실험예 6
NRK49F 세포에서 TGF-β로 자극된　섬유화증에　NSC와　SIS3　억제제에　대한　섬유화　신호전달　억제　효과를　관찰하고 그 결과를 도 6a 내지 도 6g에 나타냈다．도 6a는 NRK49F 세포에서　웨스턴 블롯팅에　의해 NSC와　SIS3　억제제 처리가 TGF-β로 자극된　P-STAT3, P-Smad3의 단백질 발현을　감소시킴을　확인한 결과이고, 도 6b 내지 도 6c는 관찰된　단백량을　정량화한 결과이다. 통계적 유의성은 평균 ± SD, n = 3으로 표시되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ns: 유의하지 않음을 나타낸다. 도 6d는 NRK49F 세포에서　웨스턴 블로팅에　의해 NSC와　SIS3　억제제　처리가 TGF-β로 자극된　α-SMA, Vimentin, CTGF의　단백질　발현을　감소시키는　것을　확인한 결과이다. 도 6e 내지 도 6g는 관찰된　단백량을　정량화한 결과이다．　통계적 유의성은 평균 ± SD, n = 3으로 표시되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ns: 유의하지 않음을 의미한다.
도 6a 내지 도 6g에 도시된 바와 같이, TGFβ　처리에　의해　증가되는　세포　신호　전달이　각각의　억제제를　처리했을　때　섬유화　마커들이　감소되는것을　확인하였다．　STAT3의　억제제인　NSC（５nM)　처리가　STAT3의　인산화를감소　시키고　Smad3 억제제인　SIS3가　Smad3를　억제하는　것을　확인한　후　α-SMA, vimentin，CTGF의　단백질　발현　감소를　확인하였다
실험예 7
NRK49F 세포에서　MyD88 siRNA에　의한　세포신호　전달　효과를　관찰하고 그 결과를 도 7a 내지 도 7d에 나타냈다．도 7a는 NRK49F 세포에서　웨스턴 블로팅에　의해 MyD88 siRNA로　형질　감염된　세포를 TGF-β로 자극한　후 P-STAT3, P-Smad3의　단백질 발현이　감소됨을　확인한 결과이고, 도 7b 내지 도 7d는 관찰된단백량을　정량화한 결과이다. 통계적 유의성은 평균 ± SD, n = 3으로 제시되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ns: 의미 없음을 의미한다.
도 7a 내지 도 7d에 도시된 바와 같이, 세포내　섬유화　신호전달의　순서를확인하기　위하여　MyD88 siRNA를　세포에　형질감염　시킨　후　STAT3, Smad3의 인산화를　단백질　발현으로　확인한　결과　MyD88 siRNA에　의해　P-STAT3, P-Smad3의　발현이　감소한　결과에　따라　TGFβ에　의해　증가되는　섬유화　신호 전달이　MyD88을　경유하여　STAT3, Smad3의　인산화를　증가시킨다는　것을　알 수 있었다.
그 결과 MyD88　siRNA를　통한　P-STAT3, P-Smad3의　발현　감소는　MyD88이　STAT3와 Smad3의　상위에　존재함으로　MyD88의　발현　증가　및　감소　조절에　의해　STAT3와 Smad3가　조절된다는　것을　확인할 수 있었다．
실험예 8
TGF-β로 자극된 HK-2 세포에서　Z-guggulsterone 처리에　의한　섬유화　마커　 및　세포　신호전달　억제　효과를　관찰하고 그 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타냈다．도 8a는 HK-2 세포에서　Z-guggulsterone 처리에　의해　TGF-β로　증가된　α-SMA, Vimentin, CTGF의　단백질　발현이　감소되는　것을　웨스턴　블롯팅으로　확인하고 관찰된 단백량을 정량화한 것이고, 도 8b는 HK-2 세포에서　Z-guggulsterone 처리에　의해　TGF-β로　증가된 MyD88, P-STAT3, P-Smad3의 단백질 발현이　감소되는　것을　웨스턴　블롯을　통하여　확인하고 관찰된　단백량을　정량화한 것이다. 통계적 유의성은 평균 ± SD, n = 3으로 표시되었다. *p < 0.05,　vs. Control, #p < 0.05, vs. TGFβ treated, ns: 유의하지 않음을 의미한다.
도 8에 도시된 바와 같이, 10 ng/ml의　TGFβ가　처리된　세포에서는　섬유화　관련마커　및　신호전달　단백질들의　인산화가　크게　증가되며，
Z-gugglesterone이　처리된　세포에서는　섬유화　마커및　신호전달　MyD88, P-STAT3, P-Smad3이　잘　감소되는　것을　확인하였다．신장　세뇨관세포（HK-2 세포）에서도　섬유화　마커　및　신호　전달을　확인한　결과　TGFβ에　의해　증가된　α-SMA, vimentin，CTGF　단백질　발현과　MyD88, P-STAT3, P-Smad3의　인산화가　Z-guggulsterone　처리에　의해　감소하는　것을　확인하였다.　
실험예 9
TGF-β로 자극된 HK-2 및　NRK49F 세포에서 β-elemene과　Z-guggulsterone 처리에　의한　섬유화　마커 억제　효과를　관찰하고 그 결과를 도 9a 및 도 9b에 각각 나타냈다．　도 9a는 HK-2 세포에서　β-elemene（２０　μM)과　Z-guggulsterone (1０　μM)의　단독　처리　및　β-elemene（5 and 10　μM)과　Z-guggulsterone（２.5 and 5　μM)의　복합 처리에　의해　TGF-β로　증가된　α-SMA, Vimentin, CTGF의　단백질　발현이　감소되는　것을　웨스턴　블롯팅으로　확인하고 관찰된 단백량을 정량화한 결과이다. 도 9b는 NRK49F 세포에서　β-elemene（２０μM)과　Z-guggulsterone (1０　μM)의　단독　처리 및　β-elemene （5 and 10　μM)과　Z-guggulsterone （２.5 and 5　μM)의　복합 처리에　의해　TGF-β로증가된　α-SMA, Vimentin, CTGF의　단백질　발현이　감소되는　것을　웨스턴　블롯팅으로　확인하고 관찰된 단백량을 정량화한 결과이다. 통계적 유의성은 평균 ± SD, n = 3으로 표시되었다. *p < 0.05,　vs. Control, #p < 0.05, vs. TGFβ treated, ns: 유의하지 않음을 의미한다.
도 9a 및 도 9b에 도시된 바와 같이, 신장　섬유아세포（NRK49F 세포）와　신장　세뇨관세포（HK-2 세포）에서　섬유화　마커를　확인한　결과　TGFβ에　의해　증가된　α-SMA, vimentin，CTGF　단백질　발현이　β-elemene과　Z-guggulsterone의　단독 및　복합처리를　비교해　볼　때　단독처리보다　농도를　감소시킨　복합처리에서　단백질　발현이　더　감소하는　것을　확인할 수 있었다.
즉, 두　세포에서　TGFβ　처리에　의해　증가된　α-SMA, vimentin，CTGF의　발현이　크게　증가하는　반면　β－elemene과　Z-gugglesterone의　combination 처리　농도를　１／４과　１／２로　감소시킨　군에서의　단백질　발현이 β－elemene과　Z-gugglesterone을　단독으로　처리한　군에　비하여　저농도에서　현저히　감소되는　것을　확인하였기 때문이다．
실험예 10
TGF-β로 자극된 HK-2 및　NRK49F 세포에서 β-elemene과　Z-guggulsterone 처리에　의한　세포　신호전달　억제　효과를　관찰하고 그 결과를 도 10a 및 도 10b에 나타냈다．　도 10a는 HK-2 세포에서　β-elemene(２０　μM)과　Z-guggulsterone (1０μM)의　단독　처리　및　β-elemene（5 and 10　μM)과　Z-guggulsterone(２.5 and 5　μM)의　복합 처리에　의해　TGF-β로　증가된 MyD88, P-STAT3, P-Smad3의 단백질 발현　이　감소되는　것을　웨스턴　블롯팅으로　확인하고, 관찰된 단백량을 정량화한 결과를 나타낸 것이고, 도 10b는 NRK49F 세포에서β-elemene（２０　μM)과　Z-guggulsterone(1０　μM)의　단독　처리 및　β-elemene（5 and 10　μM)과　Z-guggulsterone (２.5 and 5　μM)의　복합 처리에　의해　TGF-β로　증가된　MyD88, P-STAT3, P-Smad3의 단백질 발현이　감소되는　것을　웨스턴　블롯팅으로　확인하고, 관찰된　단백량을　정량화하여 나타낸 것이다. 통계적 유의성은 평균 ± SD, n = 3으로 표시되었다. *p < 0.05,　vs. Control, #p < 0.05, vs. TGFβ treated, ns: 유의하지 않음을 의미한다.
도 10a 및 도 10b에 도시된 바와 같이, 신장　섬유아세포（NRK49F 세포）와　신장　세뇨관세포（HK-2 세포）에서　섬유화 신호전달을　확인한　결과　TGFβ에　의해　증가된　MyD88의 발현량 및 P-STAT3와 P-Smad3의　인산화가　β-elemene과　Z-guggulsterone의　단독 및　복합처리를　비교해　볼　때　단독처리보다　농도를　감소시킨　복합처리에서　단백질　인산화가　더　감소하는　것을　알 수 있었다.
즉, 두　세포에서　TGFβ처리에　의해　증가된　MyD88, P-STAT3, P-Smad3의신호전달의　발현이　크게　증가하는　반면　β－elemene과　Z-gugglesterone의　combination 처리　농도를　１／４과　１／２로　감소시킨　군에서의　단백질　발현이 β－elemene과　Z-gugglesterone을　단독으로　처리한　군에　비하여　저농도에서　현저히　감소되는　것을　확인하였기 때문이다．
도 12a 및 도 12b를 참조하면, β－elemene 처리는　신장　섬유화　기전으로　이어지는　MyD88을　억제　시키고　그　하위　그룹에　존재하는　STAT3와 Smad3의　인산화를　감소　시키므로　결국　신장　섬유화를　감소시킨다는　것과　Z-gugglesterone의　처리에　의해　　신장 세뇨관　（HK-2　세포）에서　MyD88을　억제　시키고　그　하위　그룹에　존재하는　STAT3와 Smad3의　인산화를　감소　시키므로　결국　신장　섬유화를　감소시킨다는　것을　보여주는데, β-elemene 및　Z-guggulsterone이　신장　섬유아세포에서　섬유화　관련　신호　전달을　조절함으로써　섬유화　마커들이　감소하고　이러한　기전에　MyD88이　중요한　첫　번째　Target으로　작용되며　신장세포　섬유화 억제의 치료제를 위한 작용점을 체계적으로 밝혔음을　나타낸다.
상술된 실험결과로부터, β-elemene 및　Z-guggulsterone의 단독 또는 병행처리가 신장　세뇨관　 및　섬유아세포에서　섬유화　관련　신호　전달을　조절함으로써　섬유화　마커들이　감소하고　그와　관련된 MyD88／STAT3/Smad3 신호전달을　억제하여　작용됨을　밝힘으로써　β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및/또는　Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 신장세포　염증 및　섬유화 억제 효과를 통해 신장 섬유화증을 예방, 개선 및/또는 치료하는데 유효성분으로 작용할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims (11)

  1. β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물.
  2. Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물.
  3. β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 및
    Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염;을 유효성분으로 포함하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 β-elemene 과 상기 Z-guggulsterone은 ２：１　내지　１：１의　중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유효성분은 MyD88을　억제함으로써 STAT3 및 Smad3의　인산화를 감소시켜 신장섬유화를 억제하는 것을 특징으로 하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항의 약학조성물을 인간을 제외한 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 신장섬유화증 치료방법.
  7. β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 신장섬유화증 예방 및 개선용 건강기능성식품.
  8. Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 신장섬유화증 예방 및 개선용 건강기능성식품.
  9. β-elemene 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 및
    Z-guggulsterone 또는 이의 약학적으로 허용되는 염;을 유효성분으로 포함하는 신장섬유화증 예방 및 개선용 건강기능성식품.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 β-elemene 과 상기 Z-guggulsterone은 １：１　내지　２：１의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 신장섬유화증 예방 및 개선용 건강기능성식품.
  11. 제 7항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분말, 과립, 정제, 캡슐 및 음료 중 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 신장섬유화증 예방 및 개선용 건강기능성식품.
PCT/KR2023/006375 2022-05-31 2023-05-10 1개 이상의 유효성분을 포함하는 신장섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 조성물 WO2023234583A1 (ko)

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