KR20240078103A

KR20240078103A - 대복피 추출물을 유효성분으로 함유하는 만성 췌장염의 예방, 개선 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20240078103A
Application number: KR1020220160719A
Authority: KR
Inventors: 배기상; 권빛나; 김동욱; 오진영; 박성주
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2022-11-25
Filing date: 2022-11-25
Publication date: 2024-06-03

Abstract

본 발명은 만성 췌장염의 예방, 개선 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 대복피 추출물을 유효성분으로 함유하는 만성 췌장염의 예방, 개선 및 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 만성 췌장염의 발병 위험성을 감소시키고, 만성 췌장염의 예방, 개선 및 치료용 의약, 식품, 의약외품 등으로 활용될 수 있다.

Description

대복피 추출물을 유효성분으로 함유하는 만성 췌장염의 예방, 개선 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTION, IMPROVEMENT AND TREATMENT OF CHRONIC PANCREATITIS CONTAINING ARECAE PERICARPIUM EXTRACT AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 만성 췌장염의 예방, 개선 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 대복피 추출물을 유효성분으로 함유하는 만성 췌장염의 예방, 개선 및 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

만성 췌장염(chronic pancreatitis)은 췌장 외분비계 및 내분비계 시스템의 기능장애를 초래하는 췌장의 비가역적인 섬유화와 췌장 조직 위축을 일으키는 췌장 만성 염증 질환으로 점차 해당 질병의 유병률(prevalence rate)이 증가하고 있다.

또한, 만성 췌장염의 환자는 암, 당뇨와 같은 다른 질병의 발병률이 정상인에 비해 높게 나타남에 따라 각별한 주의가 필요하다. 만성 췌장염의 주요 증상은 상복부의 통증, 소화불량, 혈당조절 장애 등으로 나타나며, 주로 음주, 흡연 등과 같이 일상적인 요인에 의해 유발된다고 알려져 있다.

췌장의 섬유화는 췌장 조직에 염증이 반복적으로 발생하여 증가한다고 알려져 있다. 자세히 살펴보면, 반복되는 트리거링 이벤트에 의하여 췌장 선방세포(acinar cell)에 공포가 형성됨과 동시에 손상된 췌장 선방세포의 위축, 사멸 등이 발생하여, 조직과 콜라겐(collagen) 사이에 섬유아세포(fibroblast)의 수가 증가하면서 췌장의 섬유화 내지 만성 췌장염이 발생한다.

그 결과, 췌장의 위축, 손상 및 췌장 성상세포(pancreatic stellate cell)의 활성화가 발생하여 알파 평활근 액틴(α-smooth muscle actin, α-SMA), 콜라겐 등과 같은 섬유화 분자 마커의 발현이 증가하게 된다.

현재까지 만성 췌장염의 치료는 외과수술, 생활습관 개선 및 약물 복용으로 알려져 있는데, 약물의 경우 다양한 부작용이 보고되고 있는바 새로운 치료 약물의 개발이 시급한 실정이다.

대복피(Arecae pericarpium)는 야자과에 속하는 빈랑(Areca catecthu L)의 과피로서, 빈랑의 종자에는 알칼로이드 성분인 아레콜린(arecoline), 아레카인(arecaine), 구바신(guvacine) 등이 함유되어 있고, 또한 지방산인 미리스틱산(myristic acid), 팔미틱산(palmitic acid) 등의 성분이 함유된 것으로 알려져 있다. 대복피는 특이한 냄새가 있으며 맛은 맵고 조금 떫으며 성질은 약간 따듯하다. 대복피는 기를 내려 가슴과 배가 답답한 것, 부종, 창만 등에 쓰이며 대소변을 잘 보게 하고, 약리작용으로는 빈랑의 기생충 구제작용이 보고되었다.

대복피의 효능과 관련하여 알코올성 간손상 개선용 조성물, 창상 치유용 피부 외용제 조성물, 피지분비 조절제 등에 관한 선행연구가 있지만, 아직 만성 췌장염에 대한 연구는 보고되어 있지 않다.

따라서 본 발명자들은 이번 연구에서 대복피 물 추출물이 대조군에 비해 만성 췌장염으로 인한 췌장의 조직학적 손상, PSC 활성화 및 췌장 내 섬유화 분자 마커(α-SMA, 콜라겐, 피브로넥틴 1(fibronectin 1)의 발현 억제를 통하여 췌장 섬유화를 억제하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허공보 제10-2021-0065637호 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0037204호 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0039403호

본 발명은 대복피 추출물을 유효성분으로 함유하는 만성 췌장염의 예방, 개선 및 치료용 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대복피(Arecae pericarpium) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 만성 췌장염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 개시한다.

여기서, 상기 대복피 추출물은 대복피를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 추출물일 수 있다.

여기서, 상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균된 수용액의 형태로 제형화하여 사용되는 것일 수 있다.

한편, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대복피 추출물을 포함하는, 만성 췌장염의 예방 및 개선용 식품 조성물을 추가로 개시한다.

여기서, 상기 대복피 추출물은 전체 식품 조성물에 대해 0.01 내지 99.99% 중량비로 포함될 수 있다.

한편, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대복피 추출물을 포함하는, 만성 췌장염의 예방 및 개선용 의약외품 조성물을 추가로 개시한다.

여기서, 상기 대복피 추출물은 전체 의약외품 조성물에 대해 0.01 내지 99.99% 중량비로 포함될 수 있다.

한편, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대복피를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 대복피 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는, 만성 췌장염의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조방법을 추가로 개시한다.

본 발명의 유효성분인 대복피 추출물은 췌장의 조직학적 손상 억제와 췌장의 섬유화 억제에 우수한 효과가 있음에 따라, 본 발명은 만성 췌장염의 발병 위험성을 감소시키고, 만성 췌장염의 예방, 개선 및 치료용 의약, 식품, 의약외품 등으로 활용될 수 있다.

본 발명의 만성 췌장염의 예방, 개선 및 치료용 조성물은 천연 소재인 대복피 추출물을 유효성분으로 함유함에 따라, 부작용이 적고 장기간 사용하더라도 내성이 생길 가능성이 적은 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물에 함유된 대복피 추출물이 췌장 형태 변화에 미치는 영향을 조사하기 위한 마우스 대상 만성 췌장염 유도 동물 모델 설계를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 췌장 중량/체중 비율과 췌장 형태학적 변화를 조사한 결과를 그래프와 이미지로 도시한 것이다.
도 3은 대복피 물 추출물이 만성 췌장염 중 췌장 성상세포의 활성화에 미치는 영향을 조사한 결과를 이미지와 그래프로 도시한 것이다.
도 4는 대복피 물 추출물이 만성 췌장염 동안 ECM 성분 생성에 미치는 영향을 조사한 결과를 이미지와 그래프로 도시한 것이다.
도 5는 분리된 췌장 성상세포에서 대복피 물 추출물이 췌장 성상세포의 활성화에 미치는 영향을 조사한 결과를 이미지와 그래프로 도시한 것이다.
도 6은 분리된 췌장 성상세포에서 췌장 성상세포의 활성화를 조절하는 대복피 물 추출물의 메커니즘 분석 결과를 그래프로 도시한 것이다.

본 출원에서 사용하는 용어는 단지 특정한 예시를 설명하기 위하여 사용되는 것이다. 때문에 가령 단수의 표현은 문맥상 명백하게 단수여야만 하는 것이 아닌 한, 복수의 표현을 포함한다. 덧붙여, 본 출원에서 사용되는 "포함하다" 또는 "구비하다"등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 기능, 구성요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 명확히 지칭하기 위하여 사용되는 것이지, 다른 특징들이나 단계, 기능, 구성요소 또는 이들을 조합한 것의 존재를 예비적으로 배제하고자 사용되는 것이 아님에 유의해야 한다.

한편, 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진 것으로 보아야 한다. 따라서, 본 명세서에서 명확하게 정의하지 않는 한, 특정 용어가 과도하게 이상적이거나 형식적인 의미로 해석되어서는 안 된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "만성 췌장염"은 췌장이 만성 염증과 섬유화에 의해 비가역적이고, 형태학적 또는 기능적으로 변화되는 질환으로써, 구체적으로, 만성 염증, 섬유화 및 외분비와 내분비 조직의 파괴를 동반한 영구적이고 비가역적인 손상을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 만성 췌장염에 관한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 식품 조성물의 투여에 의해 만성 췌장염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

한편, 본 발명에 따른 식품 조성물은 만성 췌장염의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

본 명세서는 대복피(Arecae pericarpium) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 만성 췌장염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 개시한다.

본 발명의 대복피는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한없이 사용할 수 있으며, 상기 대복피는 통상적인 추출 방법에 의해 얻을 수 있고, 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 상기 추출물은 추출 처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나를 포함하는 것으로 한다.

상기 추출물을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출물을 제조하는 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법, 침지 추출법, 고온 및 고압 증기 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

또한, 본 발명의 대복피 추출물은 친수성 용매(hydrophilic solvent)로 하여 추출된 것일 수 있다. 상기 친수성 용매는 물, C1 내지 C10의 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C10, C1 내지 C6 또는 C1 내지 C4의 하나 이상의 -OH기를 갖는 화합물일 수 있다. 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올, tert-부탄올 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 나아가, 상기 대복피 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출된 추출물인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

나아가, 본 발명의 대복피 추출물은 80 내지 120 ℃의 온도 범위에서 약 1 내지 3 시간동안 열수 추출하여 얻어지는 추출액인 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명의 대복피 추출물은 상기 추출물을 다시 한번 분획한 분획물을 포함하는 것이며, 상기 분획물을 추출물을 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 메탄올 및 물로부터 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 제조한 분획물일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 대복피 추출물은 투여 대상 1kg 당 10 내지 400 mg의 범위 이내의 양으로 투여되는 것이 바람직하고, 투여 대상 1kg 당 100 내지 200 mg의 범위 이내의 양으로 투여되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

가령, 본 발명의 대복피 추출물이 투여 대상 1kg 당 10 mg 미만으로 투여되는 경우, 만성 췌장염이 발병된 췌장 조직의 조직학적 손상 및 췌장의 섬유화를 유의성 있게 억제하지 못하는 문제가 발생할 수 있다.

반대로, 본 발명의 대복피 추출물이 투여 대상 1kg 당 400 mg 초과하여 투여되는 경우, 현실적으로 너무 많은 양이 투입되는 결과 임상시험에서 적절하지 않고, 세포 독성을 일으킬 우려가 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 이밖에 다른 약학적 활성 성분이나 활성 혼합물을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 패치제, 피복제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균된 수용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

조성물에 포함 될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (Witepsol), 마크로골, 트윈 (Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 경피, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향료 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다.

한편, 본 명세서는 대복피 추출물을 포함하는, 만성 췌장염의 예방 및 개선용 식품 조성물을 추가로 개시한다. 나아가, 본 명세서는 대복피 추출물을 포함하는, 만성 췌장염의 예방 및 개선용 의약외품 조성물을 추가로 개시한다.

본 발명의 대복피 추출물은 대복피를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 추출물일 수 있다.

본 발명의 대복피 추출물은 전체 식품 조성물에 대해 0.01 내지 99.99% 중량비로 포함될 수 있다.

본 발명의 대복피 추출물은 전체 의약외품 조성물에 대해 0.01 내지 99.99% 중량비로 포함될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 또는 식품 조성물은 대복피 추출물을 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 포함할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 총 중량에 대하여 15 중량부 이하, 10 중량부 이하, 1중량 내지 15중량부, 1중량 내지 10중량부, 1중량 내지 5중량부, 또는 0.1중량 내지 15중량부의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 식품 조성물은 예를 들어, 우유, 요플레 등의 식품 소재, 식음료, 기능성 식품으로 이용될 수 있다. 상기 식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제는 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물은 질병에 대한 치료, 경감, 처치 또는 예방의 효과를 나타내나 의약품보다 인체에 미치는 작용이 경미한 물품을 의미한다. 약사법에 따른 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외하며, 보건복지부가 따로 정한 분류 기준에 의한 물품을 포함한다. 구체적으로 피부 외용제 또는 개인 위생용품일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물을 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

한편, 본 명세서는 대복피를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 대복피 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는, 만성 췌장염의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조방법을 추가로 개시한다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 첨부한 도면 및 실시예들을 참조하여 본 명세서가 청구하는 바에 대하여 더욱 자세히 설명한다. 다만, 본 명세서에서 제시하고 있는 도면 내지 실시예 등은 통상의 기술자에게 의하여 다양한 방식으로 변형되어 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 본 명세서의 기재사항은 본 발명을 특정 개시 형태에 한정되는 것이 아니고 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 균등물 내지 대체물을 포함하고 있는 것으로 보아야 한다. 또한, 첨부된 도면은 본 발명을 통상의 기술자로 하여금 더욱 정확하게 이해할 수 있도록 돕기 위하여 제시되는 것으로서 실제보다 과장되거나 축소되어 도시될 수 있다.

{실시예 및 평가}

재료 및 방법

(1) 화학물질 및 시약

Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), 고 포도당, 피루베이트(11,995-065), Fetal Bovine Serum(FBS)(16,000-044), 페니실린/스트렙토마이신(15140-122) 및 2-머캅토에탄올(21985-023)을 Thermo Fisher Scientific에서 구입했다. (Waltham, MA, United States). Surgipath Paraplast Paraffin Wax(39601006) 및 FSC 22 Frozen Section Media(3801480)는 Leica Biosystems에서 구입했다. (Chicago, IL, United States). SIS3(S0447), 포스파타제 억제제 칵테일(p5726) 및 글리세롤(G6279)은 Sigma-Aldrich Chemical Co.에서 구입했다. (St. Louis, MO, United States). Tris-HCl 완충액(pH 6.8)(T8102-050) 및 Tween 20(T9100-010)은 GenDEPOT에서 구입했다. (Katy, TX, United States). Radioimmunoprecipitation assay(RIPA) Buffer(IBS-BR004)는 iNtRON Biotechnology에서 구입했다. (Sungnam, Republic of Korea). EZ 블록 프로테아제 억제제 칵테일(K272-1) (EZ block Protease inhibitor cocktail)(K272-1) 은 Biovision에서 구입했다. (Milpitas, CA, United States).

(2) 식물 재료

대복피는 광명당 메디컬허브(Kwang Myung Dang Medical Herbs)에서 구입했다. (Ulsan, South Korea). 대복피 추출물은 건조된 대복피(100g)를 증류수(1L)로 150분 동안 끓였다. 물 추출물(aqueous extract)을 동결 건조하여 분말을 제조하였고 수율은 11.2g이었다. 생성된 분말을 증류수에 녹이고 여과하였다. 여과액은 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.

(3) 동물 모델

모든 실험은 원광대학교 동물보호위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다. C57BL/6 마우스(6~8주령, 암컷, 체중 15~20g)는 Samtako Biokorea Co. Ltd.에서 구입했다. 마우스는 번식을 허용하고 23 ± 2 ℃의 주변 온도와 7일 동안 12시간 명암 주기로 유지되는 기후 제어실의 표준 신발 상자 케이지에 수용되었다. 그들은 표준 실험용 음식과 물을 임의로 제공받았고 대조군과 실험군에 무작위로 할당했다. CO2 흡입은 마취와 안락사를 위해 사용되었다.

(4) 실험 디자인

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물에 함유된 대복피 추출물이 췌장 형태 변화에 미치는 영향을 조사하기 위한 마우스 대상 만성 췌장염 유도 동물 모델 설계를 개략적으로 도시한 것이다. 도 1을 참조하면, 마우스 대상 만성 췌장염 유도 동물 모델을 설계하기 위하여, 일정 주기에 따라 세룰레인를 주입하고, 대복피 물 추출물이 췌장 형태 변화에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 일정 주기에 따라 대복피 물 추출물을 투여하는 것을 확인할 수 있다.

3주 동안 1시간 간격으로 1일 6회, 1주일에 4회 세룰레인(cerulein) 50㎍/kg(H-3220; Bachem AG, Switzerland)을 마우스에 복강 내 주사하였다. 전처리군에서 마우스는 첫 번째 주사 1시간 전에 대복피 물 추출물(50, 100, 또는 200mg/kg) 또는 식염수(대조군)를 복강 내 주사하였다. 치료 후 그룹에서는 대복피 물 추출물(200 mg/kg)을 첫 세룰레인 주사 후 2주 또는 1주 후에 투여하였다. 대조군에는 동일한 조건에서 대복피 물 추출물(200 mg/kg) 또는 식염수를 복강 내 투여하였다. 3주 후, 마우스를 희생시키고 췌장을 신속하게 제거하고 추가 연구를 위해 -80°C에서 보관했다.

(5) 조직학적 분석(Histological analysis)

마우스를 희생시킨 후, 췌장 조직을 얼음처럼 차가운 생리 식염수(stroke-physiological saline solution)로 세척하고 10% 중성 완충 포르말린 용액(HT-501128; Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, United States)에 24시간 동안 고정했다. 알코올 탈수 및 자일렌 투과화(xylene permeabilization) 과정 후 조직을 파라핀에 포매하고(tissues were embedded in paraffin) 4μm 두께로 절편하고 헤마톡실린(hematoxylin)으로 8분간, 에오신(eosin)으로 2분간 염색하였다. 샘플은 염증 및 선 위축(glandular atrophy)의 출현(presence)에 기초하여 0에서 3까지의 척도로 점수를 매겼다(0은 정상에 해당하고 3은 심각한 질병에 해당).

(6) 생화학적 분석(Biochemical analysis)

대복피 물 추출물은 마우스에 복강 내 투여되었다(그룹당 n = 3). 투여 24시간 후, 혈청을 수득하고 5분 동안 2339x g에서(at 2339Х g for 5 min) 원심분리하였다. 생화학적 키트(NX700i; Fujifilm, Japan)를 사용하여 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase, ALP), 알라닌 트랜스아미나제(alanine transaminase, ALT), 아스파르테이트 트랜스아미나제(aspartate transaminase, AST), 혈액 요소 질소(blood urea nitrogen, BUN) 및 크레아티닌(creatinine, CREA) 수준을 분석하기 위해 신선한 혈청을 사용했다.

(7) Masson의 삼색 염색(Masson's trichrome staining)

콜라겐 침착을 평가하기 위해 MT 염색을 수행하였다. 탈파라핀화되고 재수화된 슬라이드(Deparaffinized and rehydrated slides)는 제조업체의 지침에 따라 Masson's trichrome(MT) 염색 키트(25,088; Polysciences, Warrington, Pennsylvania, United States)를 사용하여 염색되었다. 상대적 강도는 Leica 현미경 소프트웨어(Wetzlar, Germany)를 사용하여 측정되었다.

(8) 면역형광 염색(Immunofluorescence staining)

췌장 조직을 이용하여 α-평활근 액틴(α-SMA) 및 콜라겐 I의 면역형광 분석을 수행하였다. 췌장 조직을 10% 중성 완충 포르말린 용액에 24시간 동안 고정하고 최적의 절단 온도 화합물에 포매하고 9μm으로 절단했다. 조직을 4°C에서 밤새 α-SMA(1:500; sc-32251; Santa Cruz Biotechnology, Texas, Dallas, United Kingdom) 및 콜라겐 I(1:250; ab34710; Abcam, Cambridge, United Kingdom)에 대한 1차 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 형광 표지된 2차 항체 Alexa Fluor® 594 염소 항마우스(1:2,000; A11032; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States) 및 Alexa Fluor® 488 염소 항토끼(1 :2,000, A27034, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States)를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 핵은 실온에서 5분 동안 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI; 5ng/ml; D1306; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States)으로 대조 염색되었다(were counter-stained). 공초점 레이저 현미경(Olympus Corporation, Tokyo, Japan)을 사용하여 염색된 섹션을 시각화하였다.

(9) 실시간 RT-PCR

Easy-Blue^TM RNA 추출 키트(17061; iNtRON Biotechnology, Sungnam, Republic of Korea)를 사용하여 췌장 또는 PSC에서 총 RNA를 분리했다. Gene Quant Pro RNA 계산기(Biochrom, Inc., Cambridge, United Kingdom)를 사용하여 RNA 순도를 확인했다. RNA의 cDNA로의 역전사(Reverse transcription)를 ABI cDNA 합성 키트(4,387,406; Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States)를 사용하여 수행했다. 이어서, StepOne Plus Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, MA, USA)을 사용하여 SYBR Premix 키트(4,367,659; Applied Biosystems, MA, United States)를 사용하여 cDNA를 증폭하였다.

이 실험에 사용된 프라이머 서열(primer sequences)은 다음과 같다:

Acta-2: forward (5'-GTC CCA GAC ATC AGG GAG TAA-3') and reverse (5'-TCG GAT ACT TCA GCG TCA GGA-3'); FN1: forward (5'-GAT GTC CGA ACA GCT ATT TAC CA-3') and reverse (5'-CCT TGC GAC TTC AGC CAC T-3'); Collagen Ⅰ: forward (5'-GTG GTG ACA AGG GTG AGA CA-3') and reverse (5'-GAG AAC CAG GAG AAC CAG GA-3'); PPP2R2A: forward (5'-CCG TGG AGA CAT ACC AGG TA -3') and reverse (5'- AAC ACT GTC AGA CCC ATT CC -3') and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH): forward (5'-TCC CAC TCT TCC ACC TTC GA-3') and reverse (5'-AGT TGG GAT AGG GCC TCT CTT G-3').

증폭 조건(amplification conditions)은 다음과 같다:

30 s at 95℃, 40 cycles at 95℃ for 5 s and 60℃ for 60 s each, dissociation for 15 s at 95℃ and 30 s at 60℃, and then 15 s at 95℃ on ABI Step one Plus. 데이터 분석에는 StepOne 소프트웨어(Applied Biosystems, MA, United States)를 사용했다. 상대 유전자 발현(내인성 대조군 유전자의 것으로 정규화된 표적 유전자 발현)은 비교 Ct 방법(2-ΔΔCt)을 사용하여 계산되었다. 분석은 독립적으로 세 번 수행되었다.

(10) 췌장 성상세포 분리(Pancreatic stellate cells isolation)

이전에 설명한 바와 같이 췌장 조직의 소화 및 Nycodenz 밀도 구배 원심분리를 통해 췌장 성상세포(PSC)를 C57BL/6 마우스에서 분리했다 (Zang et al., 2015). 간단히 말해서, C57BL/6 마우스의 췌장을 제거하고 실험용 가위로 잘게 다진 후 GBSS 소화용액에 넣어 37℃ 물에서 15분 동안 교반했다. 콜라게나아제 소화 후, 세포 현탁액을 100 μm 나일론 메쉬(352360; Falcon Life Sciences Ltd., 영국)를 통해 여과하고 Nycodenz를 사용하여 밀도 구배 원심분리를 수행하였다. 이어서, 세포를 구배의 상부로부터 수집하고, 2회 세척하고, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/고글루코스에 재현탁시키고, 95% O2 및 5% CO2가 있는 환경에서 인큐베이션하였다. 모든 실험은 계대 0과 3 사이에 세포를 배양하여(by culturing cells between passages 0 and 3) 수행되었다. 대복피 물 추출물이 지정된 농도에서 췌장 성상세포에 대한 세포 독성 효과를 나타내지 않음을 확인한 후 다음 실험을 계속했다.

(11) 세포 처리(Cell treatment)

mRNA 수준을 평가하기 위해 마우스 췌장 성상세포를 다양한 농도(50, 100 및 250μg/ml)의 대복피 물 추출물로 1시간 동안 전처리한 다음 PDGF-BB 25ng/ml (315-18; PeproTech, Cranbury) 또는 TGF-β 0.5ng/ml(7666-MB; R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, United States)로 24시간 동안 자극했다. 단백질 발현을 검출하기 위해서는 마우스 췌장 성상세포를 대복피 물 추출물(250μg/ml) 또는 SIS3(5μM)로 1시간 동안 전처리한 다음 TGF-β(0.5ng/ml)로 30분 동안 처리하였다. 실험을 위해 전체 세포 용해물(whole-cell lysates)을 수확했다.

(12) 웨스턴 블랏(Western blot)

췌장 성상세포의 단백질을 얻기 위해 1% 프로테아제 억제제 칵테일 및 1% 포스파타제(phosphatase) 억제제를 함유하는 1x RIPA 용해 완충액에 넣어 얼음위에 두어서 용해시켰다 (lysed). 샘플은 2% Sodium dodecyl sulfate(SDS)(S1377.0500; Duchefa biochemie, Netherlands), 20% 글리세롤 및 10% 2-mercaptoethanol을 포함하는 pH 6.8의 62.5mM Tris-HCl 완충액에서 5분 동안 끓였다. 단백질을 8% 및 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔(SDS-polyacrylamide gels)에서 분리하고 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membranes)으로 옮겼다. 멤브레인(membrane)을 Tween 20 (PBST)을 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS; CNP010-1000; CellNest, Hanam, KyungKiDo, South Korea)에서로 희석한 5% 탈지유 (232,100; Becton-Dickinson and Co., United Kingdom)로 실온에서 1시간 동안 blocking한 다음 인산화된 Smad2/3 (1:500; cat. No. 8828S, Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, United States), Smad2/3 (1:500; cat. No. 3102S; Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA), α-SMA (1:1000; cat. No. ab5694; Abcam, Cambridge, United Kingdom), GAPDH (1:1000; cat. No. 2118S; Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, United States) 및 Actin (1:1000; cat. No. 8457S; Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, United States)과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 3회 세척한 후, 멤브레인을 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 향상된 화학발광 검출 시스템(Amersham, Buckinghamshire, United Kingdom)을 사용하여 단백질을 시각화했다.

(13) 대복피 물 추출물의 고성능 액체 크로마토그래피 분석

추출물을 이용하여 시료를 제조하기 위해 대복피 물 추출물 10mg을 증류수 1ml에 녹인 후 0.45μm 시린지(syringe) 필터로 여과하였다. (+)-카테킨((+)-catechin)(99% 순도, 카탈로그 C1251) 및 4-하이드록시벤조산(4-hydroxybenzoic acid)(99% 순도, 카탈로그 H20059)과 같은 참조 화합물은 Sigma-Aldrich Chemical Co.에서 구입했다. 화합물의 농도는 정량 및 정성 분석을 위해 메탄올에서 0.125, 0.25 및 0.5 mg/ml로 제조되었다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분리는 샘플 주입기와 UV/V 검출기가 장착된 YL-9100 시리즈 HPLC 기기(YoungLin. Republic of Korea)를 사용하여 수행되었다. YMC ODS-pack 컬럼(10mm Х 150mm I.D., 5μm, 일본)을 사용하여 분리했다. 대복피 물 추출물 샘플(10 mg/ml)을 20 μl로 주입하였다. 이어서, 각 화합물을 10㎕씩 주입하고, 모든 시료 주입은 3회 수행하였다. HPLC 분석을 위해 물(A)/아세토니트릴(B)(water (A)/acetonitrile(B))에 첨가된 0.1% 포름산을 구배 용출 방법으로 이동상(mobile phase)으로 사용했다: 0-10분, 등용매 5% B;10-40분, 5% B에서 15% B로의 기울기; 40-55분, 15% B에서 100% B로의 기울기; 100% B에서 55-60분 유지. 유속은 0.7 ml/min이었고, 검출 파장은 254 및 280 nm였다.

(14) 통계 분석(Statistical analysis)

결과는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시된다. 시간 및 용량 매개변수를 사용하여 이원 분산 분석(ANOVA)(two-way analysis of variance)을 사용하여 유의성(Significance)을 평가했다. 유의미한 ANOVA 테스트는 그룹 간의 다중 비교를 위해 Duncan 방법을 사용하는 사후 분석에 의해 추가로 조사되었다. p < 0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 받아들였다.

실험 및 평가

(1) 마우스의 생화학적 매개변수에 대한 대복피 물 추출물의 효과

아래 표 1은 급성 독성 시험에서 대복피 물 추출물을 사용한 마우스의 생화학적 매개변수를 각각 정리한 것이다.

그룹(mg/kg)	ALP(IU/L)	ALT(IU/L)	AST(IU/L)	BUN(mg/dl)<	CREA(mg/dl)
식염수	268.00 ± 30.35	24.33 ± 6.11	119.33 ± 37.54	21.00 ± 7.00	0.17 ± 0.03
대복피 10	247.00 ± 44.24	24.00 ± 2.65	133.00 ± 13.00	25.33 ± 4.93	0.17 ± 0.02
대복피 100	236.00 ± 19.08	24.33 ± 1.53	141.67 ± 32.87	21.00 ± 5.57	0.14 ± 0.03
대복피 200	238.33 ± 9.87	25.00 ± 4.58	124.00 ± 22.63	20.00 ± 2.65	0.15 ± 0.01
대복피 300	191.67 ± 43.84	24.00 ± 2.00	132.00 ± 26.91	20.67 ± 3.51	0.15 ± 0.01
대복피 400	231.33 ± 20.98	40.00 ± 16.37	142.33 ± 30.53	21.00 ± 3.61	0.17 ± 0.01

최대의 생물학적 효능을 지닌 무독성인 대복피 물 추출물의 효율적인 농도를 결정하기 위해 마우스의 정상적인 조건에서 생화학적 매개변수를 조사했다. 마우스에 대복피 물 추출물 또는 식염수(대조군)를 복강 내 투여하고, 생화학적 인자를 조사하기 위해 24시간 후에 혈청 샘플을 채취했다. 식염수 처리와 비교하여 대복피 물 추출물의 투여는 400 mg/kg 미만의 농도에서도 독성을 나타내지 않았다(표 1 참조). HED(Human Equivalent Dose) 계산에 따르면 400mg/kg 이상의 농도는 투여되는 약물의 양이 많기 때문에 임상 연구에서 현실적이지 않다. 따라서 만성 췌장염에 대한 유익한 효과를 조사하기 위해 후속 실험에서 400mg/kg 미만의 농도에서 대복피 물 추출물을 사용했다.

(2) 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대복피 물 추출물이 형태학적 손상에 미치는 영향

도 2는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 췌장 중량/체중 비율과 췌장 형태학적 변화를 조사한 결과를 그래프와 이미지로 도시한 것이다. 구체적으로, 도 2a는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)의 췌장 중량/체중 비율을 측정하여 그래프로 도시한 것이다. 또한, 도 2b는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)의 헤마톡실린 및 에오신 염색 결과를 이미지로 도시한 것이다. 또한, 도 2c 및 2d는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)의 췌장 조직의 병리학적 점수를 평가하여 그래프로 도시한 것이다. 데이터는 평균 ±SEM(그룹당 n=3)으로 표시되며, *p < 0.05 vs. 식염수 단독; †p < 0.05 vs. CP(만성 췌장염). 원본 배율(origin magnification), Х400. scale bar = 50μm.

췌장 선방세포(pancreatic acinar cell)의 사멸은 만성 췌장염의 초기 단계에서 발생하며, 반복적으로 손상된 췌장 포상세포 위축은 췌장 크기 및 관형 구조와 같은 형태적 변화를 일으켜 만성 염증을 유발하는 것으로 알려져 있다.

대복피 물 추출물이 만성 췌장염의 발병을 예방할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 세룰레인으로 유발된 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 췌장 중량/체중(PW/BW) 비율과 췌장 형태적 변화를 조사했다. 도 2a를 참조하면, 예상대로 만성 췌장염 유도군의 PW/BW 비율은 췌장 조직의 위축으로 인해 대조군보다 유의하게 낮았으나, PW/BW 비율의 감소는 대복피 물 추출물 처리군에서 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있다. 도 2b, 2c 및 2d를 참조하면, 만성 췌장염 유도군에서 췌장의 조직학적 특징은 면역 세포 침윤, 선방 세포 위축 및 증가된 덕트 유사 구조를 보였고, 대조적으로, 대복피 물 추출물 투여군은 용량 의존적으로 선 위축 및 염증의 유의한 개선을 통한 보호 효과를 나타낸 것을 확인할 수 있다. 만성 췌장염 유도된 형태학적 손상에 대한 대복피 물 추출물의 효과 결정에서, 400 mg/kg의 대복피 물 추출물 처리는 200 mg/kg의 대복피 물 추출물 처리에서 관찰된 것과 유사한 억제 활성을 나타냈다(데이터는 표시되지 않음). 따라서 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 항섬유화 활성을 나타내기 위해 200 mg/kg 대복피 물 추출물을 최고 농도로 사용했다.

(3) 대복피 물 추출물이 만성 췌장염 중 췌장 성상세포의 활성화에 미치는 영향

췌장이 반복적으로 손상되면 정지된 췌장 성상세포가 근섬유아세포와 유사한 표현형으로 변형되어 활성화되고 나중에 섬유증 인자를 합성 및 분비한다. α-SMA의 분비는 췌장 성상세포의 활성화의 주요 지표로 간주된다.

대복피 물 추출물이 만성 췌장염에서 췌장 성상세포의 활성화를 조절하는지 확인하기 위해 면역형광(IF) 염색을 수행했다.

도 3은 대복피 물 추출물이 만성 췌장염 중 췌장 성상세포의 활성화에 미치는 영향을 조사한 결과를 이미지와 그래프로 도시한 것이다. 구체적으로 도 3a는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)의 α-SMA에 대한 면역형광 염색의 공초점 이미지(confocal image)를 도시한 것이며, 빨간색은 α-SMA 양성 세포를 나타내고 파란색은 DAPI 양성 세포를 나타낸다. 또한, 도 3b는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)의 α-SMA의 상대 강도를 측정하여 그래프로 도시한 것이다. 또한, 도 3c는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)에서 RT-qPCR을 사용하여 췌장의 Acta-2 mRNA 수준을 평가한 결과를 그래프로 도시한 것이다. 또한, 도 3d는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)의 a-SMA와 GAPDH의 단백질 발현 결과 및 비율을 그래프로 도시한 것이며, α-SMA의 단백질 발현은 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 평가되었고 GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었다. 데이터는 평균 ±SEM(그룹당 n=3)으로 표시되며, *p < 0.05 vs. 식염수 단독; †p < 0.05 vs. CP(만성 췌장염). 원본 배율(origin magnification), Х400. scale bar = 50μm.

도 3a 및 3b를 참조하면, α-SMA로 염색된 세포의 수는 만성 췌장염 조직에서 현저히 증가한 반면 대복피 물 추출물로 전처리된 조직에서는 그 수가 크게 감소한 것을 확인할 수 있다.

이를 명확히 하기 위해 Acta-2의 mRNA 수준과 α-SMA의 단백질 발현도 측정했다. 도 3c 및 3d를 참조하면, Acta-2의 mRNA 수준과 만성 췌장염에서 α-SMA의 단백질 발현은 상당히 증가했으며, 대복피 물 추출물로 전처리한 그룹에서 잘 억제된 것을 확인 할 수 있다.

(4) 대복피 물 추출물이 만성 췌장염 동안 ECM 성분 생성에 미치는 영향

섬유화 과정에서 ECM 성분의 분비와 생산이 주요 과정이다. 이 과정에서 가장 눈에 띄는 특징인 콜라겐과 콜라겐 침착 이전에 발생하여 콜라겐의 축적을 조절하는 피브로넥틴이 중요한 요소로 평가되어야 한다.

콜라겐 침착에 대한 대복피 물 추출물의 예방 효과를 평가하기 위해 MT 및 IF 염색을 수행하였다.

도 4는 대복피 물 추출물이 만성 췌장염 동안 ECM 성분 생성에 미치는 영향을 조사한 결과를 이미지와 그래프로 도시한 것이다. 구체적으로, 도 4a는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)에서 콜라겐 침착을 위한 Masson's trichrome staining 결과를 이미지로 도시한 것이다. 또한, 도 4b는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)에서 콜라겐 I에 대한 면역형광 염색의 공초점 이미지를 도시한 것이며, 녹색은 콜라겐 I 양성 세포를 나타내고 파란색은 DAPI 양성 세포를 나타낸다. 또한, 도 4c는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)에서 Masson's trichrome staining의 상대적 강도를 그래프로 도시한 것이다. 또한, 도 4d는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)에서 콜라겐 I의 상대적 강도를 그래프로 도시한 것이다. 또한, 도 4e는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)에서 RT-qPCR을 사용하여 췌장의 콜라겐 I의 mRNA 수준을 평가를 그래프로 도시한 것이다. 또한, 도 4f는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)에서 RT-qPCR을 사용하여 췌장의 피브로넥틴 1의 mRNA 수준을 평가하여 그래프로 도시한 것이다. 데이터는 평균 ±SEM(그룹당 n=3)으로 표시되며, *p < 0.05 vs. 식염수 단독; †p < 0.05 vs. CP(만성 췌장염). 원본 배율(origin magnification), Х400. scale bar = 50μm.

도 4a, 4b, 4c 및 4d를 참조하면, 만성 췌장염 유도군의 조직에서 콜라겐 침착 및 콜라겐 I 염색 영역(녹색)이 상당히 증가하였으나, 대복피 물 추출물로 전처리한 췌장에서는 MT와 IF 염색 모두에서 전반적인 콜라겐 침착이 눈에 띄게 감소한 것을 확인할 수 있다.

또한, 콜라겐 I과 피브로넥틴 1(fibronectin 1)의 mRNA 수준을 조사했다. 도 4e 및 4f를 참조하면, 염색 결과와 유사하게 만성 췌장염 유도군에서 증가된 콜라겐 I 및 피브로넥틴 1의 mRNA 수치는 대복피 물 추출물로 전처리한 군에서 유의하게 억제된 것을 확인할 수 있다.

(5) 분리된 췌장 성상세포에서 대복피 물 추출물이 췌장 성상세포의 활성화에 미치는 영향

만성 췌장염의 가장 두드러진 특징은 섬유증이며, 활성화된 췌장 성상세포는 이 과정에서 ECM 구성요소의 생산에서 중추적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 췌장 성상세포의 활성화에 대한 대복피 물 추출물의 효과를 평가하기 위해 분리된 췌장 성상세포에서 Acta-2, 콜라겐 I 및 피브로넥틴 1의 mRNA 수준을 측정했다.

도 5는 분리된 췌장 성상세포에서 대복피 물 추출물이 췌장 성상세포의 활성화에 미치는 영향을 조사한 결과를 이미지와 그래프로 도시한 것이다. 구체적으로, 도 5a, 5b 및 5c는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)의 분리된 췌장 성상세포에서 PDGF-BB 유도 Acta-2, 콜라겐 I 및 피브로넥틴 1 mRNA 수준을 RT-qPCR을 사용하여 평가한 결과를 그래프로 각각 도시한 것이다. 또한, 도 5d, 5e 및 5f는 만성 췌장염 유도 동물 모델에서 대조군(식염수 처리), 만성 췌장염 유도군, 대복피 물 추출물 처리군(50, 100 및 200mg/kg)의 분리된 췌장 성상세포에서 TGF-β 유도된 Acta-2, 콜라겐 I 및 피브로넥틴 1 mRNA 수준을 RT-qPCR을 사용하여 평가한 결과를 그래프로 각각 도시한 것이다. 데이터는 평균 ±SEM으로 표시되며, *p < 0.05 vs. 증류수 단독; †p < 0.05 vs. PDGF-BB 또는 TGF-β1.

도 5a 내지 5f를 참조하면, Acta-2, 콜라겐 I 및 피브로넥틴 1의 mRNA 수준은 대조군에 비해 PDGF 또는 TGF-β 처리군에서 증가하였으나, 대복피 물 추출물은 PDGF 또는 TGF-β에 의해 상향 조절된 Acta-2, collagen I, 피브로넥틴 1의 mRNA 수치를 감소시킨 것을 확인할 수 있다.

(6) 분리된 췌장 성상세포에서 췌장 성상세포의 활성화를 조절하는 대복피 물 추출물의 메커니즘 분석

도 6은 분리된 췌장 성상세포에서 췌장 성상세포의 활성화를 조절하는 대복피 물 추출물의 메커니즘 분석 결과를 그래프로 도시한 것이다. 구체적으로, 도 6a는 분리된 췌장 성상세포에서 TGF-β 유도된 PPP2R2A mRNA 수준을 RT-qPCR을 사용하여 평가한 결과를 그래프로 도시한 것이다. 또한, 도 6b 및 6c는 인산화된 Smad2(Ser465/467)의 단백질 발현을 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 평가하고 액틴을 로딩 대조군으로 사용한 결과를 그래프로 도시한 것이다. 또한, 도 6d 및 6e는 분리된 췌장 성상세포에서 TGF-β 유도된 Acta2 및 콜라겐 Ⅰ의 mRNA 수준을 RT-qPCR을 사용하여 평가한 결과를 그래프로 각각 도시한 것이다. 데이터는 평균 ±SEM으로 표시되며, *p < 0.05 vs. 증류수 단독; †p < 0.05 vs. TGF-β1.

대복피 물 추출물이 췌장 성상세포의 활성화를 어떻게 조절하는지 조사하기 위해 먼저 PPP2R2A의 mRNA 수준을 측정했다. 도 6a를 참조하면, TGF-β 자극 후에 PPP2R2A의 mRNA 수준이 상향 조절되는 반면에, 대복피 물 추출물을 처리한 그룹에서는 수치가 감소한 것을 확인할 수 있다.

그리고 Smad2의 단백질 발현을 확인했다. 도 6b를 참조하면, 대조군과 비교하여, TGF-β로 처리된 췌장 성상세포에서 Smad2 인산화가 발생하였고, 대복피 물 추출물의 존재하에 인산화된 Smad2가 현저하게 억제된 것을 확인할 수 있다. 대복피 물 추출물이 Smad2를 통해 췌장 성상세포의 활성화를 억제하는지 확인하기 위해 수용체 활성화 Smads(R-Smads) 억제제인 SIS3를 전처리하여 실험을 추가로 수행했다. 도 6c를 참조하면, TGF-β로 인한 증가된 Samd2는 SIS3 처리군에서 효과적으로 감소된 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 6d 및 6e를 참조하면, SIS3는 TGF-β 단독 처리군과 비교하여 TGF-β에 의해 유도된 Acta-2 및 콜라겐 I의 mRNA 수준을 감소시킨 것을 확인할 수 있다.

(7) 종합 평가

대복피 물 추출물을 전처리한 경우, 만성 췌장염의 주요 증상에 해당하는 선상 위축 및 염증을 포함한 췌장 실질 파괴가 용량 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 2 참조).

또한, 대복피 물 추출물은 만성 췌장염의 진행 중에 발생하는 α-SMA 및 콜라겐 침착의 발현을 효과적으로 감소시켜 췌장 성상세포의 활성화 및 ECM 생성을 방지한다(도 3 및 4 참조).

또한, 대복피 물 추출물이 PDGF 또는 TGF-β에 노출된 췌장 성상세포에서 Acta-2, 콜라겐 I 및 피브로넥틴 1의 mRNA 수준을 효과적으로 억제했기 때문에 대복피 물 추출물이 췌장 성상세포의 증식(proliferation) 및 활성화(activation)를 제어할 수 있다고 추정할 수 있다(도 5 참조).

PPP2R2A의 mRNA 수준이 TGF-β 처리된 췌장 성상세포에서 더 높고 대복피 물 추출물이 처리된 췌장 성상세포에서 더 낮다는 것을 발견했다(도 6a 참조). 이것은 TGF-βR1에 영향을 주어 Samd2의 인산화 과정에 직간접적으로 참여할 가능성을 나타낸다. 대복피 물 추출물과 SIS3는 TGF-β로 활성화된 췌장 성상세포에서 phospho-Smad2와 Smad2(Ser465/467)의 단백질 발현을 효과적으로 억제했다(도 6b 및 6c 참조). 해당 데이터를 참조하여, SIS3를 전처리하고 mRNA 수준에서 Acta2와 콜라겐 Ⅰ을 평가하여 대복피 물 추출물이 TGF-β1/Smad2를 통해 췌장 성상세포의 활성화를 조절함을 확인했다. 대복피 물 추출물의 결과와 유사하게, SIS3는 TGF-β로 처리된 PSC에서 Acta2 및 콜라겐 Ⅰ의 mRNA 증가를 억제하였다(도 6d 및 6e 참조). 따라서 대복피 물 추출물이 TGF-β/Smad2 축을 표적으로 하여 췌장 성상세포의 활성화와 ECM 생성을 억제한다는 결론을 도출할 수 있다.

종합하면, 대복피 추출물이 췌장 형태학적 손상을 억제한다는 것을 입증했다. 또한 대복피 추출물은 만성 췌장염에서 α-SMA, 콜라겐 I 및 피브로넥틴 1과 같은 섬유증 관련 인자를 감소시켰다. 또한, 대복피 추출물이 TGF-β/Smad 경로를 차단함으로써 췌장 섬유증의 진행을 방지한다는 것을 발견했고, 이러한 결과들은 본 발명의 대복피 추출물을 유효성분으로 함유하는 만성 췌장염의 예방, 개선 및 치료용 조성물이 만성 췌장염의 예방, 개선 및 치료를 위한 약학적 조성물은 물론, 식품 조성물, 의약외품 조성물 등으로 활용될 수 있음을 시사한다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다.

따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

대복피(Arecae pericarpium) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 만성 췌장염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 대복피 추출물은 대복피를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 추출물인, 만성 췌장염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균된 수용액의 형태로 제형화하여 사용되는 것을 특징으로 하는, 만성 췌장염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
대복피 추출물을 포함하는, 만성 췌장염의 예방 및 개선용 식품 조성물.
제4항에 있어서,
상기 대복피 추출물은 대복피를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 추출물인, 만성 췌장염의 예방 및 개선용 식품 조성물.
제4항에 있어서,
상기 대복피 추출물은 전체 식품 조성물에 대해 0.01 내지 99.99% 중량비로 포함되는, 만성 췌장염의 예방 및 개선용 식품 조성물.
대복피 추출물을 포함하는, 만성 췌장염의 예방 및 개선용 의약외품 조성물.
제7항에 있어서,
상기 대복피 추출물은 대복피를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 추출물인, 만성 췌장염의 예방 및 개선용 의약외품 조성물.
제7항에 있어서,
상기 대복피 추출물은 전체 의약외품 조성물에 대해 0.01 내지 99.99% 중량비로 포함되는, 만성 췌장염의 예방 및 개선용 의약외품 조성물.
대복피를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 대복피 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는, 만성 췌장염의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조방법.