WO2023228977A1 - 育毛剤 - Google Patents

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WO2023228977A1
WO2023228977A1 PCT/JP2023/019334 JP2023019334W WO2023228977A1 WO 2023228977 A1 WO2023228977 A1 WO 2023228977A1 JP 2023019334 W JP2023019334 W JP 2023019334W WO 2023228977 A1 WO2023228977 A1 WO 2023228977A1
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WO
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rice bran
inositol
hair growth
phytic acid
oil
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PCT/JP2023/019334
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English (en)
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優歩 山内
紀夫 中村
卓夫 築野
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築野グループ株式会社
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Publication date
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    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth

Definitions

  • the present invention relates to a hair growth agent.
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • IGF-1 insulin-like growth factor
  • Treatment drugs for androgenetic alopecia include dutasteride and finasteride, which inhibit 5 ⁇ -reductase, but they have serious side effects such as decreased sexual function and liver dysfunction, and their use is contraindicated, especially in pregnant women. ing.
  • there has been increasing interest in natural product-derived alternatives that have less risk For example, it has been shown that phytic acid and inositol derived from natural products have the effect of promoting hair growth (Patent Documents 1 and 2). Furthermore, it has been shown that an extract of yacon has an antihair loss effect by inhibiting 5 ⁇ -reductase (Patent Document 3).
  • An object of the present invention is to provide a novel hair growth agent derived from natural products.
  • the present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
  • a hair growth agent containing a rice bran-derived ingredient mixture [2] The hair growth agent according to [1] above, wherein the rice bran-derived component mixture is selected from the following (1) to (4): (1) Water-soluble rice bran components (2) Esters of plant sterols and fatty acids and/or esters of triterpene alcohols and fatty acids (3) Rice bran oil unsaponifiables concentrate (4) Rice containing 20% by mass or more of ⁇ -oryzanol Oil [3] The hair growth agent according to [2] above, wherein the above (1) contains phytic acid and inositol.
  • a pharmaceutical product comprising the hair restorer according to [1] above.
  • a cosmetic product comprising the hair growth agent according to [1] above.
  • Dermal papilla cell proliferation promoter containing a rice bran-derived ingredient mixture [10] Dermal papilla cell proliferation promoter containing a rice bran-derived ingredient mixture. [11] A vascular endothelial growth factor production promoter containing a rice bran-derived component mixture. [12] An insulin-like growth factor-1 production promoter containing a rice bran-derived component mixture. [13] Type 2 5 ⁇ -reductase production inhibitor containing a rice bran-derived component mixture.
  • a novel hair growth agent derived from natural products can be provided.
  • the hair restorer of the present invention can be used as a pharmaceutical, cosmetic, or food/beverage product.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relative gene expression level of the VEGF gene in human primary dermal papilla cells treated with RSE, RTN, or RICEO relative to the negative control.
  • Figure 2 is a diagram showing the relative gene expression level of IGF-1 gene by RSE and RICEO treatment with respect to negative control in human primary dermal papilla cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relative gene expression level of the 5 ⁇ -R2 gene by GX-N or RTN treatment with respect to the negative control in human prostate cancer cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing the cell proliferation rate of human primary dermal papilla cells treated with RICEO compared to a negative control.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relative gene expression level of the VEGF gene in human primary dermal papilla cells treated with PA, IN or IN/PA mix compared to the negative control.
  • the present invention provides a hair growth agent containing a rice bran-derived ingredient mixture as an active ingredient.
  • the rice bran-derived ingredient mixture in the hair growth agent of the present invention is not particularly limited as long as it is a mixture containing two or more types of ingredients obtained using rice bran as a raw material.
  • the rice bran-derived component mixture contains, for example, 20% by mass or more of a water-soluble rice bran component, an ester of a plant sterol and a fatty acid and/or an ester of a triterpene alcohol and a fatty acid, a concentrate of rice bran oil unsaponifiables, and ⁇ -oryzanol. Rice oil, combinations thereof, etc. are included.
  • the water-soluble rice bran component is not particularly limited as long as it is a mixture of water-soluble components obtained from rice bran.
  • Water-soluble rice bran components include phytic acid, inositol, minerals (potassium, magnesium, potassium, sodium, iron, zinc, copper, selenium, etc.), dietary fiber, protein, water-soluble vitamins (vitamin B group, etc.), etc. .
  • the water-soluble rice bran component preferably contains phytic acid and inositol, more preferably contains more phytic acid than inositol, contains 15% by mass to 45% by mass of phytic acid, and contains inositol.
  • the content is 5% by mass or more and 20% by mass or less, and it is particularly preferable that the content of phytic acid is 20% by mass or more and 40% by mass or less, and the content of inositol is 7% by mass or more and 15% by mass or less.
  • the water-soluble rice bran component may be dissolved in an aqueous solution, or may be in the form of powder or the like by drying.
  • the water-soluble rice bran component may be a water-soluble rice bran component extracted from rice bran using a known method, or may be a commercially available water-soluble rice bran component.
  • the method for obtaining water-soluble rice bran components from rice bran is not particularly limited, and for example, one of the organic acids contained in rice bran, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, phosphoric acid, lactic acid, butyric acid, citric acid, succinic acid, etc. Examples include a method of extraction with two or more types of acids, a method described in JP-A-2002-20307, and the like.
  • RICEO-EX (trade name) manufactured by Tsukino Foods Co., Ltd.
  • RICEO-EX contains about 30% by mass of phytic acid and about 10% by mass of inositol.
  • composition of the water-soluble rice bran component is not limited, as an example, in 100g, carbohydrate: 30.0g, potassium: 5.3g, magnesium: 2.7g, calcium: 121mg, sodium: 30.9mg, Iron: 19.1 mg, zinc: 13.2 mg, copper: 0.4 mg, vitamin B 1 : 7.2 mg, vitamin B 2 : 0.6 mg, vitamin B 6 : 10.2 mg, dietary fiber: 11.2 g, protein : 8.2g, phytic acid: 27.8g, and inositol: 11.0g.
  • the ester of a plant sterol and a fatty acid and/or the ester of a triterpene alcohol and a fatty acid is not particularly limited as long as it is a mixture containing a sterol ester obtained from rice bran, and any mixture containing an ester of a plant sterol and a fatty acid may be used. It may contain an ester of a triterpene alcohol and a fatty acid, or a mixture thereof.
  • Sterol refers to a compound having a hydroxyl group at the 3-position among compounds (steroids) having a cyclopentanoperhydrophenanthrene skeleton (sterane skeleton). Sterols are generally widely distributed in the animal and plant kingdom in the form of free forms, ester forms, glycosides, etc., and are also important constituents of biological membranes.
  • the ester of a plant sterol and a fatty acid and/or the ester of a triterpene alcohol and a fatty acid contained in the hair growth agent of the present invention is an ester type sterol with a fatty acid.
  • the sterol may be an unsaturated compound having 27 to 30 carbon atoms and having one double bond at the 5/6 position, 7/8 position, 8/9 position or other position, It may also be a saturated compound obtained by hydrogenation.
  • plant sterols that are abundant in plants include ⁇ -sitosterol, stigmasterol, campesterol, and the like.
  • Triterpene alcohol is a sterol with 30 carbon atoms, and is a component abundantly contained in rice bran or rice oil.
  • the ester of plant sterol and fatty acid and the ester of triterpene alcohol and fatty acid have the formula (A): R'CO-OH (A) [In the formula, R'CO is a straight chain fatty acyl group having 14 to 22 carbon atoms and 0 to 3 double bonds. ] It can be derived from the carboxylic acid represented by Examples of the carboxylic acid represented by formula (A) include myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidic acid, and behenic acid.
  • the ester of a plant sterol and a fatty acid and/or the ester of a triterpene alcohol and a fatty acid may be a sterol ester purified from rice bran using a known method, or a commercially available sterol ester.
  • the method for obtaining sterol esters from rice bran is not particularly limited, and for example, a method in which by-products such as soup stock and deodorized scum produced in the process of producing rice oil from rice bran are used as raw materials, and extracted and purified with a solvent such as acetone or hexene.
  • the method described in Examples include a method of esterifying at least one species using an enzyme that esterifies non-specifically or specifically.
  • examples of commercially available sterol esters include Rice sterol ester (trade name) manufactured by Tsukino Foods Co., Ltd.
  • the rice bran oil unsaponifiables concentrate is not particularly limited as long as it is a concentrate of unsaponifiables obtained from rice bran, and is a rice bran oil deodorizing distillate that is a by-product in the deodorizing process in the process of refining rice bran to rice oil. It may also be a concentrate of unsaponifiables obtained by neutralizing and removing fatty acids from substances.
  • the rice bran oil unsaponifiables concentrate contains vitamin E (tocopherols, tocotrienols, etc.), sterols (phytosterols, triterpene alcohols, fatty acid esters thereof, etc.), squalene, and the like.
  • the plant sterols and triterpene alcohols included in the sterols include those similar to those exemplified as sterols in the esters of plant sterols and fatty acids and/or esters of triterpene alcohols and fatty acids in the present invention.
  • the total content of fatty acid esters of plant sterols and/or fatty acid esters of triterpene alcohols in the rice bran oil unsaponifiables concentrate may be 3% by mass or more and 70% by mass or less, and 5% by mass or more and 60% by mass or less. It may be.
  • the content of plant sterols in the rice bran oil unsaponifiable matter concentrate may be 5% by mass or more and 20% by mass or less.
  • the content of tocopherol in the rice bran oil unsaponifiable matter concentrate may be 1% by mass or more and 5% by mass or less.
  • the content of tocotrienols in the rice bran oil unsaponifiables concentrate may be 1% by mass or more and 5% by mass or less.
  • the squalene content in the rice bran oil unsaponifiables concentrate may be 1% by mass or more and 10% by mass or less.
  • the rice bran oil unsaponifiables concentrate may be a concentrate of unsaponifiables obtained in the process of extracting and refining oil from rice bran using a known method, and commercially available rice bran oil unsaponifiables concentrate It may be.
  • the method for obtaining rice bran oil unsaponifiables concentrate from rice bran is not particularly limited. For example, after producing rice bran oil using a known production method, the fatty acids contained in large amounts are extracted using the deodorized scum obtained in the deodorization process. Examples include a method of producing a fat-soluble rice bran oil unsaponifiable concentrate by deoxidizing the rice bran oil with a necessary minimum amount of alkali, a method described in JP-A No.
  • rice bran oil unsaponifiable concentrates examples include Rice Trienol (trade name) manufactured by Tsukino Foods Co., Ltd., and the like.
  • the composition of the rice bran oil unsaponifiables concentrate is not limited, as an example, the acid value is 0.8 mg KOH/g, and in 100 g, squalene: 5.8 g, plant sterol: 10.1 g, triterpene Examples include those containing 5.2 g of alcohol, 3.7 g of tocopherol, 3.0 g of tocotrienol, and 10.0 g of fatty acid ester of plant sterol and fatty acid ester of triterpene alcohol.
  • the rice oil containing 20% by mass or more of ⁇ -oryzanol is not particularly limited as long as it contains 20% by mass or more of ⁇ -oryzanol in the ⁇ -oryzanol-containing rice oil.
  • the ⁇ -oryzanol content of the ⁇ -oryzanol-containing rice oil is preferably 25% by mass or more, more preferably 30% by mass or more, and the upper limit of the ⁇ -oryzanol content of the ⁇ -oryzanol-containing rice oil is particularly It is not limited, and may be, for example, 60% by mass.
  • the ⁇ -oryzanol-containing rice oil may be ⁇ -oryzanol-containing rice germ oil.
  • the ⁇ -oryzanol-containing rice oil may be rice oil to which ⁇ -oryzanol is not added externally.
  • the method for producing such ⁇ -oryzanol-containing rice oil is not particularly limited, but it can be produced, for example, by the method described in International Publication No. 2012/063794. Specifically, (A) a step of obtaining a processed fat and oil having an oil layer and a soapstock layer containing a ⁇ -oryzanol salt, and (B) adding an acid to the processed fat and oil obtained in (A).
  • a production method including a step of transferring ⁇ -oryzanol from the soapstock layer to the oil layer and recovering fats and oils with increased ⁇ -oryzanol content may be used. By using this production method, rice oil containing about 60% by mass of ⁇ -oryzanol can be produced.
  • the ⁇ -oryzanol-containing rice oil may be a commercially available ⁇ -oryzanol-containing rice oil.
  • Examples of commercially available rice oil containing ⁇ -oryzanol include rice germ oil GX-N (trade name) manufactured by Tsukino Foods Co., Ltd.
  • Rice germ oil GX-N contains about 30% by mass of ⁇ -oryzanol in rice germ oil GX-N.
  • the ⁇ -oryzanol content in rice oil can be measured by a known method. For example, this can be done by the following method. However, the method is not limited to this method.
  • rice oil containing ⁇ -oryzanol contains ferulic acid, sterols, wax, glucoside ceramide, tocopherol (vitamin E), tocotrienol, etc., which are components contained in common rice oil. It may be something that is currently in use.
  • the ⁇ -oryzanol-containing rice oil may be one that can be used as an edible fat or oil.
  • the edible oil is not particularly limited as long as it contains ⁇ -oryzanol-containing rice oil, and may be a blended oil that is a mixture of ⁇ -oryzanol-containing rice oil and other edible oils.
  • Examples of edible oils and fats other than rice oil containing ⁇ -oryzanol include palm oil, rapeseed oil, soybean oil, sesame oil, corn oil, cottonseed oil, coconut oil, olive oil, coconut oil, safflower oil, sunflower oil, almond oil, and cashew oil.
  • the blended oil may be a mixture of two or more kinds of ⁇ -oryzanol-containing rice oil and other edible fats and oils.
  • the present invention provides a hair growth agent containing purified inositol and purified phytic acid.
  • Inositol and phytic acid in the hair growth agent of the present invention may contain purified inositol and purified phytic acid, respectively.
  • “Purified inositol” means inositol obtained from a mixture containing inositol through a purification process to increase the purity of inositol.
  • “Purified inositol” may be a powder product.
  • “Purified phytic acid” means phytic acid obtained from a mixture containing phytic acid through a purification process to increase the purity of phytic acid.
  • “Purified phytic acid” may be a liquid product or a powder product.
  • Purified inositol and purified phytic acid may be extracted and purified by known methods using the same biological species as raw materials, or may be extracted and purified by known methods using different biological species as raw materials.
  • the inositol and/or phytic acid may be purified from artificially synthesized inositol and/or phytic acid.
  • the biological species that can be used as raw materials for purified inositol are not particularly limited as long as they contain inositol in their bodies, and examples include grain bran such as rice bran, legumes such as soybeans, fruits, nuts, etc. Examples include plants, meat, and fish meat.
  • the biological species that can be used as raw materials for purified phytic acid are not particularly limited as long as they contain phytic acid in their bodies, and include, for example, grains such as rice bran, legumes such as soybeans, and the like.
  • the blending ratio of inositol and phytic acid in the hair growth agent of the present invention is not particularly limited, but may be, for example, 1:2 or more and 1:9 or less in mass ratio, or 1:2.5 or more and 1:1 in mass ratio. It is preferably 5 or less.
  • the rice bran-derived ingredient mixture and the mixture of purified inositol and purified phytic acid contained in the hair growth agent of the present invention have hair growth, hair growth, hair nourishment, hair loss inhibiting effects, etc. Therefore, it can be suitably used as an active ingredient as a hair growth agent, hair growth agent, hair tonic, or hair loss inhibitor.
  • the hair growth agent of the present invention can be referred to as a hair growth agent, a hair growth agent, or a hair loss inhibitor.
  • the rice bran-derived component mixture contained in the hair growth agent of the present invention is a component that can also be used for food, so it is highly safe for living organisms and can be continuously used or ingested over a long period of time. Since the rice bran-derived ingredient mixture contained in the hair growth agent of the present invention contains a plurality of rice bran-derived ingredients, the rice bran-derived ingredients can exhibit excellent hair growth effects due to additive or synergistic effects. It is thought that it can be done. The same applies to a mixture of purified inositol and purified phytic acid.
  • the hair growth agent of the present invention is characterized by having a hair growth effect.
  • the fact that the hair growth agent of the present invention has a hair growth effect can be confirmed by, for example, treating dermal papilla cells with the hair growth agent of the present invention and measuring the cell proliferation rate of the dermal papilla cells, protein expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), etc. measuring the amount or VEGF gene expression level, measuring the protein expression level of insulin-like growth factor (IGF-1) or the IGF-1 gene expression level, and treating prostate cancer cells with the hair growth agent of the present invention. This can be confirmed by measuring the protein expression level of type 2 5 ⁇ -reductase (5 ⁇ -R2) or the 5 ⁇ -R2 gene expression level in prostate cancer cells.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the cell proliferation rate of dermal papilla cells can be measured, for example, using a commercially available cell proliferation measurement kit on the treated cell culture solution.
  • the protein expression level of VEGF, IGF-1 or 5 ⁇ -R2 can be determined by extracting proteins from treated dermal papilla cells or prostate cancer cells and using known techniques such as SDS-PAGE, Western blotting, ELISA, and immunoprecipitation. It can be measured using a method.
  • the gene expression levels of VEGF, IGF-1, or 5 ⁇ -R2 can be determined, for example, by extracting nucleic acids from treated dermal papilla cells or prostate cancer cells and using known methods such as RT-PCR, quantitative PCR, and microarray. It can be measured using
  • the content of the rice bran-derived component mixture and the mixture of purified inositol and purified phytic acid in the hair growth agent of the present invention is not particularly limited as long as the hair growth effect is exerted.
  • the total content of purified inositol and purified phytic acid may be, for example, 0.01 (wt/v)% or more and 80 (wt/v)% or less based on the entire hair growth agent. , 0.05 (wt/v)% or more and 50 (wt/v)% or less, or 0.1 (wt/v)% or more and 30 (wt/v)% or less.
  • the subjects to which the hair growth agent of the present invention can be administered are not particularly limited as long as they are animals, such as humans, non-human mammals (cows, horses, pigs, sheep, goats, llamas, alpacas, camels, rabbits, mink, foxes). , domestic animals such as chinchillas, geese, and ducks, and pet animals such as dogs and cats).
  • the frequency of use or intake of the hair growth agent of the present invention is not particularly limited, and examples include once or more a day, 1 to 5 times a day, etc.
  • the period of use or intake of the hair growth agent of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, 4 weeks or more, 8 weeks or more, or 12 weeks or more.
  • the dosage form of the hair growth agent of the present invention is not particularly limited, and includes, for example, a low-viscosity liquid, a liquid such as a lotion, a suspension, an emulsion, a gel, a paste, a cream, a foam, a sheet, an ointment, and a powder.
  • a liquid such as a lotion, a suspension, an emulsion, a gel, a paste, a cream, a foam, a sheet, an ointment, and a powder.
  • the present invention provides pharmaceuticals, cosmetics, or food and drink products.
  • the pharmaceutical products, cosmetics, or food and drink products of the present invention may be those containing the hair restorer of the present invention.
  • the pharmaceutical, cosmetic, or food/beverage product of the present invention can be used in the same dosage form as the hair growth agent described above.
  • the food or drink of the present invention may be, for example, a health food, a functional food, a food for specified health uses, a supplement, a food for the sick, or the like.
  • the form of the food and drink is not particularly limited, and may be, for example, a processed form such as a natural liquid food, a semi-digested nutritional food, an ingredient nutritional food, or a drink, including tea drinks, soft drinks, carbonated drinks, and nutritional drinks.
  • beverages such as fruit drinks and lactic acid drinks
  • noodles such as soba, udon, Chinese noodles, and instant noodles
  • sweets and breads such as candies, candies, gum, chocolate, snack foods, biscuits, jellies, jams, creams, baked goods, and bread.
  • Processed marine and livestock foods such as kamaboko, ham, and sausages, dairy products such as processed milk and fermented milk, fats and oils and processed foods such as salad oil, tempura oil, margarine, mayonnaise, shortening, whipped cream, and dressings, sauces, It may also be seasonings such as sauce, retort pouch foods such as curry, stew, rice bowls, porridge, rice porridge, etc., frozen desserts such as ice cream, sherbet, shaved ice, etc.
  • dairy products such as processed milk and fermented milk
  • fats and oils and processed foods such as salad oil, tempura oil, margarine, mayonnaise, shortening, whipped cream, and dressings, sauces
  • seasonings such as sauce, retort pouch foods such as curry, stew, rice bowls, porridge, rice porridge, etc.
  • frozen desserts such as ice cream, sherbet, shaved ice, etc.
  • the pharmaceutical products, cosmetics, or food and drink products of the present invention may contain pharmaceutically or physiologically acceptable components in addition to the hair restorer of the present invention.
  • Pharmaceutically or physiologically acceptable ingredients are not particularly limited, and include water, oils and fats, waxes, hydrocarbons, fatty acids, higher alcohols, esters, plant extracts, vitamins, and water-soluble Polymers, surfactants, alcohols, polyhydric alcohols, etc. can be used.
  • the pharmaceuticals, cosmetics, or food/beverage products of the present invention may contain known additives used in compositions of pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, food/beverage products, etc., such as antioxidants, thickeners, etc., as necessary.
  • additives used in compositions of pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, food/beverage products, etc., such as antioxidants, thickeners, etc., as necessary.
  • Preservatives, pH adjusters, stabilizers, irritation reducers, preservatives, colorants, fragrances, and the like can be added.
  • the additives can be used alone or in combination of two or more.
  • the pharmaceuticals, cosmetics, or food and drink products of the present invention may further contain other active ingredients used to promote hair growth or to promote hair growth.
  • Other active ingredients can be used alone or in combination of two or more.
  • Other active ingredients include, for example, minoxidil and finasteride.
  • the present invention includes a dermal papilla cell proliferation promoter, a vascular endothelial growth factor production promoter, an insulin-like growth factor-1 production promoter, a type 2 5 ⁇ -reductase production inhibitor, etc., which contain a rice bran-derived component mixture. .
  • the present invention also includes a dermal papilla cell proliferation promoter, a vascular endothelial growth factor production promoter, an insulin-like growth factor-1 production promoter, etc., which contain a mixture of purified inositol and purified phytic acid. included.
  • the present invention includes a method for promoting hair growth, which comprises administering an effective amount of the hair growth agent of the present invention to an animal in need of hair growth.
  • the animal is not particularly limited, and may be, for example, a human, a non-human mammal, or the like. Mammals other than humans include, but are not limited to, cows, horses, pigs, sheep, goats, llamas, alpacas, camels, rabbits, minks, foxes, chinchillas, geese, ducks, dogs, cats, and the like.
  • Rice bran-derived component mixture [Example 1: Confirmation of hair-related gene expression level] [Test materials and methods] 1 Rice bran-derived component mixture, control sample, reagent, and solvent 1.1 Rice bran-derived component mixture The following four types were used as the rice bran-derived component mixture. ⁇ RICEO-EX (product name, manufactured by Tsukino Foods Co., Ltd.) ⁇ Rice sterol ester (product name, manufactured by Tsukino Foods Co., Ltd.) ⁇ Lytrienol (product name, manufactured by Tsukino Foods Co., Ltd.) ⁇ Rice germ oil GX-N (product name, manufactured by Tsukino Foods Co., Ltd.)
  • Control Samples The following two types were used as control samples. ⁇ Phytic acid (product name, manufactured by Tsukino Foods Co., Ltd.) ⁇ Inositol (product name, manufactured by Tsukino Foods Co., Ltd.)
  • the concentration was adjusted according to the intended use, and a medium containing RICEO, phytic acid, and inositol at the desired concentration was prepared. Note that 1% FBS culture medium was used as a negative control for the medium containing RICEO, phytic acid, and inositol.
  • a medium containing RSE, RTN, and GX-N at a concentration of 0.1%, 0.01%, or 1/100 of their serial dilutions was obtained.
  • a negative control for the medium containing RSE, RTN, and GX-N a medium prepared by adding 50 ⁇ L of DMSO to 4.95 mL of 1% FBS culture medium was used.
  • test subjects were human primary dermal papilla cells (HFDPC) and human prostate cancer cells (Lymph Node Carcinoma of the Prostate: LNCaP). While maintaining sterile conditions under a cabinet, the cells of interest stored in a vial in liquid nitrogen were thawed and seeded in a 10 cm culture dish (Violamo). 10 mL of 10% FBS culture medium was used. Thereafter, all cell handling operations were performed under the cabinet after sterilization with ethanol and flame sterilization. The cells were cultured for 3 days at 37° C. in a 5% CO 2 atmosphere using a CO 2 incubator (PHC).
  • PLC CO 2 incubator
  • the supernatant of the cultured cells was aspirated using a suction pump (Hitech).
  • Cells were washed by dropping 5 mL of autoclaved Dulbecco's PBS(-) onto the dish using a 10 mL disposable pipette (Biolamo). The solution was then removed using a suction pump.
  • 0.5 mL of trypsin/EDTA solution was added to the dish using a micropipette (Thermo Scientific), and the dish was left standing for 2 minutes.
  • Cells were suspended by continuous suction and discharge operations using a micropipette, and 5 mL of 10% FBS culture medium was added using a disposable pipette to stop the reaction.
  • the solution after the reaction was stopped was transferred to a 15 mL plastic tube (Bio Lamo Co., Ltd.), and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes at room temperature using a bucket type centrifuge (Tomy Seiko Co., Ltd.) to accumulate cells.
  • the solution was removed using a suction pump, and 10 mL of 10% FBS culture medium was added using a new disposable pipette to suspend the cells.
  • Cell numbers were counted using a fully automatic cell counter (Bio-Rad). Specifically, 30 ⁇ L each of trypan blue and cell suspension supplied with the device were mixed, the mixed solution was added to two locations on a dedicated counting slide, and the added portion was inserted into the device to perform measurement. The dilution rate was calculated from the obtained concentration, and a cell suspension of 1.0 ⁇ 10 5 cells/mL was prepared.
  • the cells of interest were seeded in a 24-well culture plate (Bio Lamo) at 1.0 x 10 5 cells/well. The cells were cultured overnight at 37° C. in a 5% CO 2 atmosphere in a CO 2 incubator.
  • RICEO-containing medium 0.01%, 0.1%, 0.5%)
  • RSE-containing medium 0.01%, 0.1%)
  • RTN-containing medium 0.01%, 0.1%)
  • FBS culture medium negative control
  • Centrifugation was performed at 12,000 ⁇ g for 15 minutes at room temperature using a high-speed microcentrifuge. The supernatant was removed by decantation, and the opening of the 1.5 mL tube was placed against a Kimtowel (Nippon Paper Crecia Co., Ltd.) for several seconds to remove drips. 500 ⁇ L of 75% ethanol solution was added and mixed by inversion. Centrifugation was performed at 12,000 ⁇ g for 5 minutes at room temperature using a high-speed microcentrifuge. The supernatant was removed by decantation, and the mouth of the tube was placed on a Kimtowel for a few seconds to remove drips, and then 500 ⁇ L of 75% ethanol was added once again and mixed by inversion.
  • RNA synthesis was performed using the extracted RNA as a template.
  • PrimeScript RT Reagent kit (Takara Bio Inc.) was used for cDNA synthesis.
  • An enzymatic method was performed to convert the entire sequence starting from the complementary site of the primer and oligo-dT primer into DNA.
  • Each extracted RNA was appropriately diluted with RNase-free distilled water to form a solution of 50 ⁇ g/ ⁇ L.
  • a mixed solution was prepared in a 1.5 mL tube at the following doses. ⁇ 5 ⁇ PrimeScript Buffer (for Real Time) 26 ⁇ L ⁇ Oligo dT Primer 50 ⁇ M 6.5 ⁇ L ⁇ Random 6 mers 100 ⁇ M 6.5 ⁇ L ⁇ RNase free distilled water 84.5 ⁇ L Finally, add the following on ice. ⁇ PrimeScript RT Enzyme Mix I 6.5 ⁇ L 26 reactions total 130 ⁇ L
  • PCR tubes (Thermo Fisher Scientific) were prepared on a cooled rack, and 5 ⁇ L of the above mixture was added to each tube. 5 ⁇ L each of the 50 ⁇ g/ ⁇ L RNA solution was spotted on the lid of the 8 consecutive PCR tubes to which the mixture had been added. After closing the lid and mixing the solution by inversion or tapping, the solution was collected on the bottom of the tube using a swing-type plate centrifuge (Kubota Seisakusho Co., Ltd.). After performing a reverse transcription reaction using a thermal cycler (Applied Biosystems) according to the following program, the reaction solution was diluted by adding 50 ⁇ L of distilled water. I) 37°C 15 minutes II) 85°C 5 seconds III) 4°C Keep warm
  • RT-qPCR Real-time quantitative PCR
  • the Cyber Green method was performed using PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). The primers were designed with the following sequences based on previous literature (Kim J, Kim M, Yun JG and Hwang J (2017), Pekmezci E, Turkoglu M (2017), and Nakamura T, Yamamura H (2016)). Purchased from Thermo Fisher Scientific.
  • Figure 1 shows the relative expression of the vascular endothelial growth factor (VEGF) gene in HFDPC treated with each concentration of RSE, RTN, or RICEO, when the gene expression level of human primary dermal papilla cells (HFDPC) in the negative control is set to 1. Shows gene expression level. A significant difference was determined at p ⁇ 0.05. In RSE, it was confirmed that VEGF gene expression level increased approximately twice as much as in the negative control when treated with 0.1%, and in RTN, it was confirmed that the amount of VEGF gene expression increased approximately twice as much as in the negative control when treated with 0.01% and 0.1%, respectively. A 3-fold or approximately 6-fold increase in VEGF gene expression was confirmed, and in RICEO, an approximately 17-fold increase in VEGF gene expression compared to the negative control was confirmed with 0.5% treatment.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • 0.5% RICEO actually corresponds to about 0.15% phytic acid + about 0.05% inositol, but with 0.5% RICEO treatment, 0.15% phytic acid + about 0.05% inositol. It was confirmed that the effect of promoting VEGF gene expression was significantly higher than that of treatment with 5% phytic acid or 0.5% inositol alone. From this, RSE, RTN, and RICEO show superior hair growth effects compared to phytic acid or inositol alone. In particular, RICEO has a synergistic effect with other rice bran-derived ingredients, including phytic acid and inositol. , it was suggested that it exerts a remarkable hair growth effect.
  • Figure 2 shows the relative gene expression level of the insulin-like growth factor (IGF-1) gene in HFDPC treated with each concentration of RSE or RICEO, when the gene expression level of HFDPC in the negative control is set to 1. A significant difference was determined at p ⁇ 0.05.
  • RSE insulin-like growth factor
  • Figure 3 shows the type 2 5 ⁇ -reductase (5 ⁇ -R2) gene in LNCaP treated with GX-N or RTN at each concentration, when the gene expression level of human prostate cancer cells (LNCaP) in the negative control is set to 1.
  • the relative gene expression level is shown. A significant difference was determined at p ⁇ 0.05.
  • GX-N it was confirmed that the 5 ⁇ -R2 gene expression level decreased by about 0.85 times and about 0.75 times compared to the negative control when treated with 0.01% and 0.1%, respectively, and in RTN, With 0.1% treatment, it was confirmed that the expression level of 5 ⁇ -R2 gene was reduced by about 0.7 times compared to the negative control.
  • Example 2 Confirmation of dermal papilla cell proliferation rate
  • a cell suspension of 1.0 ⁇ 10 5 cells/mL was prepared in the same manner as in Example 1, except that the cells used were human primary dermal papilla cells (HFDPC).
  • the obtained cell suspension was seeded in a 96-well culture plate (Bio Lamo) at a density of 1.0 x 10 4 cells/well, and incubated at 37°C in a 5% CO 2 atmosphere in a CO 2 incubator. Cultured late. Add 0.1 mL of 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% RICEO-containing medium or 1% FBS culture medium (negative control) per well, and incubate at 37°C in a CO2 incubator.
  • RICEO-containing medium was mixed with phytic acid-containing medium (0.016%, 0.06%, 0.25%, 1%) or inositol-containing medium (0.016%, 0.06%, 0.25%, 1%).
  • Culture was carried out in the same manner except for changing to
  • FIG. 4 shows the cell proliferation rate when HFDPC was treated with RICEO at various concentrations. A significant difference was determined at p ⁇ 0.05. The number of cells increased significantly when treated with 0.01%, 0.05% and 0.1% RICEO, and in particular, treatment with 0.1% RICEO showed significant cell proliferation of approximately 150-160%. was confirmed.
  • Example 3 Verification of the effect of a mixture of inositol and phytic acid on VEGF gene expression level
  • Test material The following two types of purified inositol and purified phytic acid were used.
  • ⁇ Phytic acid product name, manufactured by Tsukino Foods Co., Ltd.
  • Inositol product name, manufactured by Tsukino Foods Co., Ltd.
  • HFDPC human primary dermal papilla cells
  • phytic acid-containing medium (0.1%, 0.5%)
  • inositol-containing medium (0.1%, 0.5%)
  • IN/PA mixture-containing medium Cell culture and VEGF gene expression level were carried out in the same manner as in Example 1, except that 1 mL of 0.05%, 0.1%, 0.5%) or 1% FBS culture medium (negative control) was added per well. An analysis was performed.
  • Figure 5 shows that when the gene expression level of human primary dermal papilla cells (HFDPC) in the negative control is set to 1, phytic acid (PA), inositol (IN), or a mixture of inositol and phytic acid (IN/PA) at various concentrations
  • the relative gene expression level of the vascular endothelial growth factor (VEGF) gene in HFDPC treated with (mix) is shown. A significant difference was determined at p ⁇ 0.05. When treated with 0.1% and 0.5% phytic acid or inositol, respectively, no significant change in VEGF gene expression was observed with 0.1% treatment, and negative with 0.5% treatment. It was confirmed that the expression level of the VEGF gene increased approximately twice as compared to the control.
  • PA phytic acid
  • IN inositol
  • I/PA a mixture of inositol and phytic acid
  • inositol With inositol, no significant change in VEGF gene expression was observed with 0.1% treatment, and an approximately 1.5-fold increase in VEGF gene expression was confirmed with 0.5% treatment compared to the negative control.
  • the amount of VEGF gene expression was about 2.5 times and about 4 times higher at lower treatment concentrations of 0.05% and 0.1% than treatment with phytic acid or inositol alone, respectively. An increase was confirmed.

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Abstract

本発明は、米糠由来成分混合物を含有する育毛剤であって、前記米糠由来成分混合物が、（１）水溶性米糠成分、（２）植物ステロールと脂肪酸とのエステルおよび／もしくはトリテルペンアルコールと脂肪酸のエステル、（３）米糠油不ケン化物濃縮物、または（４）γ－オリザノールを２０質量％以上含有する米油であることを特徴とする育毛剤を提供する。

Description

育毛剤
　本発明は、育毛剤に関するものである。
　加齢、遺伝的素因、社会的ストレスなどの原因による頭部の薄毛や脱毛に悩んでいる人は多く、優れた育毛剤、発毛剤および脱毛抑制剤を提供すべく様々な試みがなされている。育毛に関与する因子として、血管内皮増殖因子（VEGF）やインスリン様増殖因子（IGF-1）等が報告されている。ミノキシジルはVEGFやIGF-1の産生を促進する働きがあり、これを有効成分とする医薬品が販売されているが、女性において皮膚疾患等の副作用が報告されており、使用量が制限されている。男性型脱毛症の治療薬としては、５α－リダクターゼを阻害するデュタステリドやフィナステリドがあるが、性機能低下や肝機能障害などの重篤な副作用があり、特に妊娠中の女性の使用は禁忌となっている。近年、このような状況からリスクの少ない天然物由来の代替品に関心が高まっている。例えば、天然物に由来するフィチン酸やイノシトールに育毛を促す作用があることが示されている（特許文献１、２）。また、ヤーコンの抽出物が５α－リダクターゼを阻害することにより抗脱毛効果を有することが示されている（特許文献３）。
特開２０１８－２４６９２号公報 特開平３－７４３１８号公報 特開２００６－２７３７５５号公報
　本発明は、天然物に由来する新規な育毛剤を提供することを課題とする。
　本発明は、上記の課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］米糠由来成分混合物を含有する育毛剤。
［２］前記米糠由来成分混合物が、以下の（１）～（４）から選択される、前記［１］に記載の育毛剤：
（１）水溶性米糠成分
（２）植物ステロールと脂肪酸とのエステルおよび／またはトリテルペンアルコールと脂肪酸のエステル
（３）米糠油不ケン化物濃縮物
（４）γ－オリザノールを２０質量％以上含有する米油
［３］前記（１）が、フィチン酸およびイノシトールを含有する、前記［２］に記載の育毛剤。
［４］前記（１）が、フィチン酸を１５質量％以上４５質量％以下含有し、イノシトールを５質量％以上２０質量％以下含有する、前記［３］に記載の育毛剤。
［５］精製されたイノシトールおよび精製されたフィチン酸を含有する育毛剤。
［６］イノシトールおよびフィチン酸の配合比率が、質量比で１：２以上１：９以下である、前記［５］に記載の育毛剤。
［７］前記［１］に記載の育毛剤を含むことを特徴とする医薬品。
［８］前記［１］に記載の育毛剤を含むことを特徴とする化粧品。
［９］前記［１］に記載の育毛剤を含むことを特徴とする飲食品。
［１０］米糠由来成分混合物を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤。
［１１］米糠由来成分混合物を含有する血管内皮増殖因子産生促進剤。
［１２］米糠由来成分混合物を含有するインシュリン様増殖因子－１産生促進剤。
［１３］米糠由来成分混合物を含有する２型５α－リダクターゼ産生抑制剤。
　本発明により、天然物に由来する新規な育毛剤を提供することができる。本発明の育毛剤は、医薬品、化粧品または飲食品として利用することができる。
図１は、ヒト初代毛乳頭細胞において、陰性コントロールに対するRSE、RTNまたはRICEO処理によるVEGF遺伝子の相対遺伝子発現量を示す図である。 図２は、ヒト初代毛乳頭細胞において、陰性コントロールに対するRSE、RICEO処理によるIGF-1遺伝子の相対遺伝子発現量を示す図である 図３は、ヒト前立腺がん細胞において、陰性コントロールに対するGX-NまたはRTN処理よる5α-R2遺伝子の相対遺伝子発現量を示す図である。 図４は、ヒト初代毛乳頭細胞において、陰性コントロールに対するRICEO処理による細胞増殖率を示す図である。 図５は、ヒト初代毛乳頭細胞において、陰性コントロールに対するPA、INまたはIN/PA mix処理によるVEGF遺伝子の相対遺伝子発現量を示す図である。
〔育毛剤〕
　本発明は、米糠由来成分混合物を有効成分として含有する育毛剤を提供する。本発明の育毛剤における米糠由来成分混合物は、米糠を原料として得られる成分を２種以上含有する混合物であれば、特に限定されない。米糠由来成分混合物としては、例えば、水溶性米糠成分、植物ステロールと脂肪酸とのエステルおよび／またはトリテルペンアルコールと脂肪酸とのエステル、米糠油不ケン化物濃縮物、γ－オリザノールを２０質量％以上含有する米油、これらの組み合わせ等が挙げられる。
　水溶性米糠成分は、米糠から得られる水溶性成分の混合物であれば、特に限定されない。水溶性米糠成分には、フィチン酸、イノシトール、無機質（カリウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、亜鉛、銅、セレン等）、食物繊維、タンパク質、水溶性ビタミン（ビタミンＢ群等）等が含まれる。水溶性米糠成分は、フィチン酸およびイノシトールを含有することが好ましく、イノシトールに比べてフィチン酸を多く含有していることがより好ましく、フィチン酸を１５質量％以上４５質量％以下含有し、イノシトールを５質量％以上２０量％以下含有することがさらに好ましく、フィチン酸を２０質量％以上４０質量％以下含有し、イノシトールを７質量％以上１５質量％以下含有していることが特に好ましい。
　水溶性米糠成分は、水溶液中に溶解しているものであってもよく、乾燥により粉末等の形態を有しているものであってもよい。
　水溶性米糠成分は、米糠から公知の方法を用いて抽出した水溶性米糠成分であってもよく、市販の水溶性米糠成分であってもよい。米糠から水溶性米糠成分を得る方法は、特に限定されず、例えば、米糠中に含まれる有機酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、リン酸、乳酸、酪酸、クエン酸、こはく酸等の１種または２種以上の酸で抽出する方法、特開２００２－２０３０７号公報に記載の方法などが挙げられる。市販の水溶性米糠成分としては、例えば、築野食品工業株式会社製のRICEO-EX（商品名）等が挙げられる。RICEO-EXはフィチン酸を約３０質量％含有し、イノシトールを約１０質量％含有する。水溶性米糠成分の組成を限定するものではないが、一例としては、１００ｇ中に、炭水化物：３０．０ｇ、カリウム：５．３ｇ、マグネシウム：２．７ｇ、カルシウム：１２１ｍｇ、ナトリウム：３０．９ｍｇ、鉄：１９．１ｍｇ、亜鉛：１３．２ｍｇ、銅：０．４ｍｇ、ビタミンＢ１：７．２ｍｇ、ビタミンＢ２：０．６ｍｇ、ビタミンＢ６：１０．２ｍｇ、食物繊維：１１．２ｇ、タンパク質：８．２ｇ、フィチン酸：２７．８ｇ、イノシトール：１１．０ｇを含有するものが挙げられる。
　植物ステロールと脂肪酸とのエステルおよび／またはトリテルペンアルコールと脂肪酸とのエステルは、米糠から得られるステロールエステルを含む混合物であれば特に限定されず、植物ステロールと脂肪酸とのエステルを含有するものであってもよく、トリテルペンアルコールと脂肪酸とのエステルを含有するものであってもよく、これらの混合物を含有するものであってもよい。
　ステロールとは、シクロペンタノペルヒドロフェナントレン骨格（ステラン骨格）を有する化合物（ステロイド）のうち、３位に水酸基を有する化合物をいう。ステロールは、通常、遊離状、エステル型、配糖体等の形で、動植物界に幅広く分布しており、生体膜の重要な構成成分でもある。本発明の育毛剤に含有される植物ステロールと脂肪酸とのエステルおよび／またはトリテルペンアルコールと脂肪酸とのエステルは、脂肪酸とのエステル型のステロールである。
　ステロールは、炭素数２７～３０であり、１個の二重結合を５／６位、７／８位、８／９位またはその他の位置に有している不飽和化合物であってもよく、水素化により得られる飽和化合物であってもよい。ステロールのうち植物に多く存在する植物ステロールとしては、β－シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール等が挙げられる。トリテルペンアルコールは、炭素数３０のステロールであり、米糠または米油中に多く含まれる成分である。
　植物ステロールと脂肪酸とのエステルおよびトリテルペンアルコールと脂肪酸とのエステルにおけるエステルは、式（Ａ）：
Ｒ’ＣＯ－ＯＨ　　　　　　　　（Ａ）
［式中、Ｒ’ＣＯは炭素数１４～２２であり、二重結合数０～３のいずれかの直鎖脂肪酸アシル基である。］
で示されるカルボン酸に由来し得る。式（Ａ）で示されるカルボン酸としては、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、ベヘン酸等が挙げられる。
　植物ステロールと脂肪酸とのエステルおよび／またはトリテルペンアルコールと脂肪酸とのエステルは、米糠から公知の方法を用いて精製したステロールエステルであってもよく、市販のステロールエステルであってもよい。米糠からステロールエステルを得る方法は、特に限定されず、例えば、米糠から米油を製造する過程で生じるスープストックや脱臭スカム等の副産物を原料とし、アセトンやヘキセン等の溶媒で抽出、精製する方法、公知文献（特開２０１４－４７３１１号公報、谷口ら、日本食品科学工学会誌、2012年、59巻、7号、p301-318）に記載の方法、米糠から得られた植物ステロールおよびトリテルペンアルコールの少なくとも１種を、非特異的または特異的にエステル化する酵素を使用してエステル化する方法などが挙げられる。市販のステロールエステルとしては、例えば、築野食品工業株式会社製のライステロールエステル（商品名）等が挙げられる。
　米糠油不ケン化物濃縮物は、米糠から得られる不ケン化物を濃縮したものであれば、特に限定されず、米糠から米油を精製する過程での脱臭工程において副生する米油脱臭留出物から脂肪酸を中和し除去することで得られる不ケン化物の濃縮物であってもよい。米糠油不ケン化物濃縮物には、ビタミンＥ類（トコフェロール、トコトリエノール等）、ステロール類（植物ステロール、トリテルペンアルコール、それらの脂肪酸エステル等）、スクワレン等が含まれる。
　ステロール類に含まれる植物ステロールおよびトリテルペンアルコールとしては、本発明における植物ステロールと脂肪酸とのエステルおよび／またはトリテルペンアルコールと脂肪酸とのエステルにおいて、ステロールとして例示したものと同様のものが挙げられる。
　米糠油不ケン化物濃縮物中の植物ステロールの脂肪酸エステルおよび／またはトリテルペンアルコールの脂肪酸エステルの合計含有量は、３質量％以上７０質量％以下であってもよく、５質量％以上６０質量％以下であってもよい。米糠油不ケン化物濃縮物中の植物ステロールの含有量は、５質量％以上２０質量％以下であってもよい。米糠油不ケン化物濃縮物中のトコフェロールの含有量は、１質量％以上５質量％以下であってもよい。米糠油不ケン化物濃縮物中のトコトリエノールの含有量は、１質量％以上５質量％以下であってもよい。米糠油不ケン化物濃縮物中のスクワレンの含有量は、１質量％以上１０質量％以下であってもよい。
　米糠油不ケン化物濃縮物は、米糠から公知の方法を用いて油を抽出・精製する過程で得られた不ケン化物を濃縮したものであってもよく、市販の米糠油不ケン化物濃縮物であってもよい。米糠から米糠油不ケン化物濃縮物を得る方法は、特に限定されず、例えば、公知の製造方法を用いて米糠油を製造した後、脱臭工程で得られる脱臭スカムを用いて多量に含まれる脂肪酸を必要最小限のアルカリによって脱酸することで脂溶性の米糠油不ケン化物濃縮物を製造する方法、特開２００５－２５５７４６号公報に記載の方法などが挙げられる。市販の米糠油不ケン化物濃縮物としては、例えば築野食品工業株式会社製のライストリエノール（商品名）等が挙げられる。米糠油不ケン化物濃縮物の組成を限定するものではないが、一例としては、酸価：０．８ｍｇＫＯＨ／ｇであり、１００ｇ中に、スクワレン：５．８ｇ、植物ステロール：１０．１ｇ、トリテルペンアルコール：５．２ｇ、トコフェロール：３．７ｇ、トコトリエノール：３．０ｇ、植物ステロールの脂肪酸エステルおよびトリテルペンアルコールの脂肪酸エステル：１０．０ｇを含有するものが挙げられる。
　γ－オリザノールを２０質量％以上含有する米油は、γ－オリザノール含有米油中にγ－オリザノールを２０質量％以上含有する米油であれば、特に限定されない。γ－オリザノール含有米油のγ－オリザノール含有量は、好ましくは２５質量％以上であり、より好ましくは３０質量％以上であり、γ－オリザノール含有米油のγ－オリザノール含有量の上限は、特に限定されず、例えば６０質量％であってもよい。γ－オリザノール含有米油は、γ－オリザノール含有米胚芽油であってもよい。
　γ－オリザノール含有米油は、γ－オリザノールが外部から添加されていない米油であってもよい。そのようなγ－オリザノール含有米油の製造方法は特に限定されないが、例えば、国際公開第２０１２／０６３７９４号に記載の方法で製造することができる。具体的には、（Ａ）油層と、γ－オリザノール塩を含有するアルカリ油滓層とを有する油脂処理物を得る工程、ならびに（Ｂ）（Ａ）で得られた油脂処理物に酸を添加し、γ－オリザノールをアルカリ油滓層から油層に移行させ、γ－オリザノール含量が増加した油脂を回収する工程を包含する製造方法を利用するものであってもよい。当該製造方法を利用すれば、約６０質量％程度のγ－オリザノールを含有する米油を製造することができる。
　γ－オリザノール含有米油は、市販のγ－オリザノール含有米油であってもよい。市販のγ－オリザノール含有米油としては、例えば、築野食品工業株式会社製の米胚芽油GX-N（商品名）等が挙げられる。米胚芽油GX-Nは、米胚芽油GX-N中にγ－オリザノールを約３０質量％含有する。
　米油中のγ－オリザノール含有量は、公知の方法で測定することができる。例えば、以下の方法で行うことができる。ただし、この方法に限定されない。
　油脂を２～５ｇ秤量し、ｎ－ヘキサンで１００ｍＬとする。このうちの２ｍＬを取り、ｎ－ヘキサンで１００ｍＬに希釈したものについて、３１５ｎｍの吸光度を測定する。油脂重量をＸ（ｇ）、吸光度をＡとすると、γ－オリザノール含有量Ｇ（質量％）は、以下の式（Ｂ）で算出される。
　　Ｇ＝（Ａ×５０００）／（Ｘ×３５９）　　　　（Ｂ）
　γ－オリザノール含有米油は、γ－オリザノールの他に、一般的な米油に含有される成分である、フェルラ酸、ステロール、ワックス、グルコシドセラミド、トコフェノール（ビタミンＥ）、トコトリエノール等を含有しているものであってもよい。
　γ－オリザノール含有米油は食用油脂として実施することができるものであってもよい。食用油脂としては、γ－オリザノール含有米油を含むものであれば特に限定されず、γ－オリザノール含有米油とそれ以外の食用油脂を混合したブレンド油であってもよい。γ－オリザノール含有米油以外の食用油脂としては、例えば、パーム油、ナタネ油、大豆油、ゴマ油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、オリーブ油、ヤシ油、サフラワー油、ヒマワリ油、アーモンド油、カシュー油、ヘーゼルナッツ油、マカデミアナッツ油、モンゴンゴ油、ペカン油、松の実油、クルミ油、ツバキ油、茶油、牛脂、ラード、鶏油、馬油、魚油などが挙げられる。ブレンド油は、γ－オリザノール含有米油とそれ以外の食用油脂を２種以上混合したものあってもよい。
　本発明は、精製されたイノシトールおよび精製されたフィチン酸を含有する育毛剤を提供する。本発明の育毛剤におけるイノシトールおよびフィチン酸は、それぞれ精製されたイノシトールおよび精製されたフィチン酸を含有するものであればよい。
　「精製されたイノシトール」はイノシトールを含む混合物からイノシトールの純度を高めるための精製工程を経て得られたイノシトールを意味する。「精製されたイノシトール」は粉末品であってもよい。「精製されたフィチン酸」はフィチン酸を含む混合物からフィチン酸の純度を高めるための精製工程を経て得られたフィチン酸を意味する。「精製されたフィチン酸」は液体品であってもよく、粉末品であってもよい。
　精製されたイノシトールおよび精製されたフィチン酸は、同じ生物種を原料として公知の方法により抽出および精製されたものであってもよく、それぞれ異なる生物種を原料として公知の方法により抽出および精製されたものであってもよく、人工的に合成されたイノシトールおよび／またはフィチン酸が精製されたものであってもよい。
　精製されたイノシトールの原料となる生物種としては、生体内にイノシトールを含有している生物であれば特に限定されず、例えば、米糠等の穀類の糠、大豆等の豆類、果物、ナッツ類等の植物や、食肉、魚の肉類などが挙げられる。
　精製されたフィチン酸の原料となる生物種としては、生体内にフィチン酸を含有している生物であれば特に限定されず、例えば、米糠等の穀類、大豆等の豆類などが挙げられる。
　本発明の育毛剤におけるイノシトールおよびフィチン酸の配合比率は、特に限定されないが、例えば、質量比で１：２以上１：９以下であってもよく、質量比で１：２．５以上１：５以下であることが好ましい。
　本発明の育毛剤に含有される米糠由来成分混合物、および精製されたイノシトールと精製されたフィチン酸との混合物は、育毛作用、発毛作用、養毛作用、脱毛抑制作用等を有しているので、育毛剤、発毛剤、養毛剤、脱毛抑制剤としての有効成分として好適に用いることができる。本発明の育毛剤は、発毛剤、養毛剤、脱毛抑制剤と言い換えることができる。
　本発明の育毛剤に含有される米糠由来成分混合物は、食用にも利用される成分であるため、生体への安全性が高く、継続的に長期間の使用または摂取が可能である。本発明の育毛剤に含有される米糠由来成分混合物は、複数の米糠由来成分が混在しているので、米糠由来成分同士の相加的または相乗的な効果により、優れた育毛作用を奏することができると考えられる。精製されたイノシトールと精製されたフィチン酸との混合物についても同様である。
　本発明の育毛剤は、育毛作用を有することを特徴とする。本発明の育毛剤が育毛作用を有することは、例えば、毛乳頭細胞を本発明の育毛剤で処理し、毛乳頭細胞の細胞増殖率を測定すること、血管内皮増殖因子（VEGF）のタンパク質発現量またはVEGF遺伝子発現量を測定すること、インシュリン様増殖因子（IGF-1）のタンパク質発現量またはIGF-1遺伝子発現量を測定すること、および前立腺がん細胞を本発明の育毛剤で処理し、前立腺がん細胞の２型５α－リダクターゼ（5α-R2）のタンパク質発現量または5α-R2遺伝子発現量を測定することにより、確認することができる。
　毛乳頭細胞の細胞増殖率は、例えば、処理後の細胞培養液に、市販の細胞増殖測定キットを用いて測定することができる。VEGF、IGF-1または5α-R2のタンパク質発現量は、例えば、処理後の毛乳頭細胞または前立腺がん細胞からタンパク質を抽出して、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、ELISA、免疫沈降等の公知の方法を用いて測定することができる。VEGF、IGF-1または5α-R2の遺伝子発現量は、例えば、処理後の毛乳頭細胞または前立腺がん細胞から核酸を抽出して、RT-PCR、定量的PCR、マイクロアレイ等の公知の方法を用いて測定することができる。
　本発明の育毛剤における米糠由来成分混合物、および精製されたイノシトールと精製されたフィチン酸との混合物の含有量は、育毛作用が奏される範囲であれば、特に限定されず、米糠由来成分混合物、および精製されたイノシトールと精製されたフィチン酸の合計含有量は、例えば、育毛剤全体に対して、０．０１（ｗｔ／ｖ）％以上８０（ｗｔ／ｖ）％以下であってもよく、０．０５（ｗｔ／ｖ）％以上５０（ｗｔ／ｖ）％以下であってもよく、０．１（ｗｔ／ｖ）％以上３０（ｗｔ／ｖ）％以下であってもよい。
　本発明の育毛剤の投与対象は、動物であれば特に限定されず、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、リャマ、アルパカ、ラクダ、ウサギ、ミンク、キツネ、チンチラ、ガチョウ、アヒル等の家畜動物、イヌ、ネコ等の愛玩動物）等が挙げられる。
　本発明の育毛剤の使用または摂取頻度としては、特に限定されず、例えば、１日１回以上、１日１～５回の範囲内等が挙げられる。
　本発明の育毛剤の使用または摂取期間としては、特に限定されず、例えば、４週間以上、８週間以上、１２週間以上であってもよい。
　本発明の育毛剤の剤形は、特に限定されず、例えば、低粘度液体、ローション等の液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、ペースト剤、クリーム剤、フォーム剤、シート剤、軟膏、粉剤、エアゾール剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤、貼付剤等の外用剤であってもよく、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、内服用液剤等の内服剤であってもよく、筋肉、血管内に直接投与する注射剤であってもよい。
〔医薬品、化粧品または飲食品〕
　本発明は、医薬品、化粧品または飲食品を提供する。本発明の医薬品、化粧品または飲食品は、本発明の育毛剤を含有するものであればよい。本発明の医薬品、化粧品または飲食品の形態は、上述の育毛剤の剤形と同様の形態で使用することができる。
　本発明が飲食品である場合、本発明の飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、サプリメント、病者用食品等であってもよい。飲食品の形態は、特に限定されず、例えば、自然流動食、半消化態栄養食、成分栄養食、ドリンク剤等の加工形態であってもよく、茶飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料、そば、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、飴、キャンディー、ガム、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子およびパン類、かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品、加工乳、発酵乳等の乳製品、サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂および油脂加工食品、ソース、たれ等の調味料、カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊等のレトルトパウチ食品、アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の冷菓などであってもよい。
　本発明の医薬品、化粧品または飲食品は、本発明の育毛剤の他に、薬学的もしくは生理学的に許容される成分を含んでいてもよい。薬学的もしくは生理学的に許容される成分としては、特に限定されず、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、ビタミン類、水溶性高分子、界面活性剤、アルコール、多価アルコール等を使用することができる。
　本発明の医薬品、化粧品または飲食品は、必要に応じて、医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品等の組成物に使用される公知の添加剤、例えば、酸化防止剤、増粘剤、保存剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、刺激軽減剤、防腐剤、着色剤、香料等を添加することができる。添加剤は、１種単独、または２種以上を組み合わせて使用することができる。
　本発明の医薬品、化粧品または飲食品は、育毛促進または発毛促進のために使用される他の有効成分をさらに添加することができる。他の有効成分は、１種単独、または２種以上を組み合わせて使用することができる。他の有効成分としては、例えば、ミノキシジル、フィナステリド等が挙げられる。
　本発明には、米糠由来成分混合物を含有する、毛乳頭細胞増殖促進剤、血管内皮増殖因子産生促進剤、インシュリン様増殖因子－１産生促進剤、２型５α－リダクターゼ産生抑制剤等が含まれる。また、本発明には、精製されたイノシトールと精製されたフィチン酸との混合物を含有する、毛乳頭細胞増殖促進剤、血管内皮増殖因子産生促進剤、インシュリン様増殖因子－１産生促進剤等が含まれる。
　本発明は、本発明の育毛剤の有効量を、育毛を必要とする動物に投与することを特徴
とする育毛促進方法を包含する。動物は、特に限定されないが、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳動物等であってもよい。ヒト以外の哺乳動物は、特に限定されないが、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、リャマ、アルパカ、ラクダ、ウサギ、ミンク、キツネ、チンチラ、ガチョウ、アヒル、イヌ、ネコ等が挙げられる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：毛髪関連遺伝子発現量の確認〕
［試験材料および方法］
１　米糠由来成分混合物、対照試料、試薬および溶媒
１．１　米糠由来成分混合物
　米糠由来成分混合物として、以下の４種を使用した。
・RICEO-EX（商品名、築野食品工業株式会社製）
・ライステロールエステル（商品名、築野食品工業株式会社製）
・ライストリエノール（商品名、築野食品工業株式会社製）
・米胚芽油GX-N（商品名、築野食品工業株式会社製）
１．２　対照試料
　対照試料として、以下の２種を使用した。
・フィチン酸（商品名、築野食品工業株式会社製）
・イノシトール（商品名、築野食品工業株式会社製）
１．３　試薬
　試薬として以下を使用した。
・D-MEM（高グルコース）（製造元：富士フィルム和光純薬株式会社）
・ウシ胎児血清（製造元：Biosera）
・0.25w/v% トリプシン-1mmol/1EDTA・4Na Solution with phenol Red (トリプシン／EDTA溶液)（製造元：富士フィルム和光純薬株式会社）
・ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（×100）（製造元：富士フィルム和光純薬株式会社）
・ダルベッコPBS（－）「ニッスイ」（製造元：日水製薬株式会社）
・ジメチルスルホキシド（DMSO）（製造元：富士フィルム和光純薬株式会社）
・アイソジェンII（製造元：富士フィルム和光純薬株式会社(株式会社ニッポンジーン)）
・2-プロパノール（製造元：富士フィルム和光純薬株式会社）
・エタノール（99.5）（製造元：富士フィルム和光純薬株式会社）
・Distilled Water, Deionized, Sterile(RNase free蒸留水)（製造元：株式会社ニッポンジーン）
・PrimeScript RT Reagent kit（製造元：タカラバイオ株式会社）
・PowerUp SYBR Green Master Mix（製造元：applied biosystems）
２　試薬の調製
２．１　培養培地
　Ｄ－ＭＥＭ（高グルコース）５００ｍＬに５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン溶液および５５ｍＬのウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加え１０％ＦＢＳ培養培地とした。また、Ｄ－ＭＥＭおよびペニシリン／ストレプトマイシン溶液の混合溶液を用いて１０％ＦＢＳ培養培地を１０倍希釈し、１％ＦＢＳ培養培地とした。
２．２　ダルベッコＰＢＳ（－）
　電子天秤で秤量した粉末のダルベッコＰＢＳ（－）「ニッスイ」９．８ｇを蒸留水１０００ｍＬに溶解した後、オートクレーブ滅菌し、細胞培養用のダルベッコＰＢＳ（－）を得た。
２．３　７５％エタノール溶液
　３０ｍＬのエタノール（99.5）および１０ｍＬのRNase free蒸留水を混合し、４０ｍＬの７５％エタノール溶液を得た。
３　各試料含有培地調製
３．１　RICEO-EX含有培地の調製
　微量電子天秤（ザルトリウス社）を用いてRICEO-EX（RICEO）５０ｍｇを１５ｍＬ容プラスチックチューブに秤量し、ディスポーザブルピペットにて１０ｍＬの１％ＦＢＳ培養培地を添加、溶解した。夾雑固形物を除くため、作製した溶液を０．４５μｍのフィルターを取り付けた１０ｍＬ容シリンジに移して濾過し、０．５％RICEO含有培地を得た。０．５％RICEO含有培地２ｍＬに１％ＦＢＳ培養培地を８ｍＬ添加、溶解して、０．１％RICEO含有培地を得た。さらに、０．１％RICEO含有培地１ｍＬに１％ＦＢＳ培養培地を９ｍＬ添加、溶解して、０．０１％RICEO含有培地を得た。
３．２　フィチン酸含有培地の調製
　５０％フィチン酸溶液を１５ｍＬ容プラスチックチューブにディスポーザブルピペットにて４．５ｍＬ分注し、２５％ＮａＯＨ水溶液５．５ｍＬを加えて２２．５％フィチン酸中和溶液（ｐＨ６．１３）を得た。この溶液に１．２５ｍＬの蒸留水を加え、２０％フィチン酸中和液とした。１５ｍＬ容プラスチックチューブに１％ＦＢＳ培養培地をディスポーザブルピペットにて４.８７５ｍＬ添加し、マイクロピペットにて前述の２０％フィチン酸中和液を１２５μＬ溶解し、それぞれ０．５％フィチン酸含有培地を得た。その培地を１％ＦＢＳ培養培地にて５倍希釈し、０．１％フィチン酸含有培地を得た。
３．３　イノシトール含有培地の調製
　微量電子天秤（ザルトリウス社）を用いてイノシトール粉体を１５ｍＬ容プラスチックチューブに５０ｍｇ秤量し、ディスポーザブルピペットにて１０ｍＬの１％ＦＢＳ培養培地を添加、溶解し、０．５％イノシトール含有培地を得た。０．５％イノシトール含有培地を１％ＦＢＳ培養培地にて５倍希釈し、０．１％イノシトール含有培地を作製した。
　用途に応じて濃度調整を行い、目的濃度のRICEO、フィチン酸、イノシトール含有培地を作製した。なお、RICEO、フィチン酸、イノシトール含有培地に対する陰性コントロールとして１％ＦＢＳ培養培地を使用した。
３．４　ライステロールエステル、ライストリエノール、米胚芽油GX-N含有培地の調製
　微量電子天秤（ザルトリウス社）を用いてライステロールエステル（RSE）、ライストリエノール（RTN）および米胚芽油GX-N（GX-N）をそれぞれ１００ｍｇずつ１．５ｍＬ容チューブに秤量した後、マイクロピペットにてそれぞれ１ｍＬのＤＭＳＯを添加した。小型ヒートブロック（アズワン社）で５０℃に加温し、転倒混和により澄明なRSE、RTN、GX-Nの１０％溶液を得た。４５０μＬのＤＭＳＯを１．５ｍＬ容チューブに添加したものを５０℃に加温し、そこにそれぞれRSE、RTN、GX-Nの１０％溶液を５０μＬ加え、RSE、RTN、GX-Nの１％溶液を得た。用途に応じて濃度調整を行い、目的濃度のRSE、RTN、GX-Nの溶液を作製した。１５ｍＬ容プラスチックチューブに１％ＦＢＳ培養培地をディスポーザブルピペットにて４．９５ｍＬ添加し、マイクロピペットにてそれぞれRSE、RTN、GX-Nの１０％溶液および１％溶液、あるいはその段階希釈液を各５０μＬ添加して、RSE、RTN、GX-Nを、それぞれ０．１％、０．０１％、あるいはその段階希釈液の１／１００濃度で含有する培地を得た。なお、RSE、RTN、GX-N含有培地に対する陰性コントロールとして、１％ＦＢＳ培養培地４．９５ｍＬにＤＭＳＯを５０μＬ添加した培地を使用した。
４　細胞培養
　ヒト初代毛乳頭細胞（Human Follicle Dermal Papilla Cells：HFDPC）およびヒト前立腺がん細胞（Lymph Node Carcinoma of the Prostate：LNCaP）を試験対象とした。
　キャビネット下で無菌状態を維持しつつ、液体窒素中のバイアルに保管されている目的の細胞を解凍し、１０ｃｍカルチャーディッシュ（ビオラモ社）に播種した。１０％ＦＢＳ培養培地を１０ｍＬ使用した。以降細胞取り扱いの一切の操作はキャビネット下にてエタノール除菌および火炎滅菌のうえ実施した。ＣＯ２インキュベーター（PHC社）により３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
　培養後の培養細胞の上清をサクションポンプ（ハイテック社）で吸引した。オートクレーブ滅菌したダルベッコＰＢＳ(－)５ｍＬを１０ｍＬ容ディスポーサブルピペット（ビオラモ社）で、ディッシュ上に滴下して細胞を洗浄した。その後サクションポンプにより溶液を除いた。０．５ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液をマイクロピペット（サーモサイエンティフィック社）にてディッシュに添加し、２分静置した。マイクロピペットの連続的な吸引排出操作により細胞を懸濁し、ディスポーザブルピペットにて１０％ＦＢＳ培養培地５ｍＬを加えて反応を停止した。
　１５ｍＬ容プラスチックチューブ（ビオラモ社）に反応停止後の溶液を移し、バケットタイプ遠心機（トミー精工社）にて、１２００ｒｐｍ、５分、室温で遠心して細胞を集積した。サクションポンプにより溶液を除き、新しいディスポーザブルピペットにて１０％ＦＢＳ培養培地１０ｍＬを加え細胞を懸濁した。全自動セルカウンター（バイオラッド社）にて細胞数を計測した。具体的には機器に付属のトリパンブルーと細胞懸濁液各３０μＬを混合し、専用カウンティングスライドの２か所に混合溶液を添加し、添加部分を機器内に挿入して計測を実施した。得られた濃度から希釈率を算出し、１．０×１０５細胞／ｍＬの細胞懸濁液を作製した。
　２４ウェルカルチャープレート（ビオラモ社）に１．０×１０５細胞／ウェルとなるよう目的の細胞を播種した。ＣＯ２インキュベーターにより３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で一晩培養した。
　ヒト初代毛乳頭細胞（HFDPC）に対して、RICEO含有培地（０．０１％、０．１％、０．５％）、RSE含有培地（０．０１％、０．１％）、RTN含有培地（０．０１％、０．１％）または１％ＦＢＳ培養培地（陰性コントロール）を１ウェルあたり１ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベーターにより３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。各群４ウェルを使用した(ｎ＝４)。
　各米糠由来成分混合物含有培地を、フィチン酸含有培地（０．１％、０．５％）、イノシトール含有培地（０．１％、０．５％）に変更すること以外は、同様にして細胞培養を行った。
　ヒト前立腺がん細胞（LNCaP）に対して、RTN含有培地（０．０１％、０．１％）、GX-N含有培地（０．０１％、０．１％）、または０．０５（ｖ／ｖ）％ＤＭＳＯ、１％ＦＢＳ培養培地（陰性コントロール）を１ウェルあたり１ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベーターにより３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。各群４ウェルを使用した(ｎ＝４)。
５　遺伝子発現量解析
５．１　ＲＮＡ抽出
　４にて得られた培養細胞を用い、グアニジンチオイソシアネート－フェノールクロロホルム変法（Chomczynski P and Sacchi N (1987) Anal. Biochem., 162(1); 156-159）に準じ、以下の操作にてＲＮＡ抽出を実施した。
　培養した２４ウェルカルチャープレートの培地をサクションポンプにて吸引除去し、１ウェルあたり１ｍＬの滅菌ダルベッコＰＢＳ（－）を添加して培地残渣を水洗した。その後、再度サクションポンプにて溶液を除去した。
　２５０μＬのISOGEN II（ニッポンジーン社）を各ウェルに加え、ピペッテイングで細胞を溶解し、溶解液を１．５ｍＬ容チューブに回収した。１００μＬのRNase free蒸留水（ニッポンジーン社）を加えボルテックスで混合した。室温で１５分静置した後、微量高速遠心機（トミー精工社）を用い、１２，０００×ｇで１５分間、室温で遠心した。沈殿を吸引しないように２５０μＬを目安に上清を回収し、新しい１．５ｍＬ容チューブに移した。２５０μＬの２－プロパノール（富士フィルム和光純薬社）を加え、転倒混和した後、室温で１５分静置した。
　微量高速遠心機を用い、１２，０００×ｇで１５分間、室温で遠心した。デカントにより上清を除き、１．５ｍＬ容チューブの口をキムタオル（日本製紙クレシア社）に数秒当てて液だれを除去した。５００μＬの７５％エタノール溶液を加え、転倒混和した。微量高速遠心機を用い、１２，０００×ｇで５分間、室温で遠心した。デカントにより上清を除き、チューブの口をキムタオルに数秒当てて液だれを除去した後、もう一度５００μＬの７５％エタノールを加え、転倒混和した。微量高速遠心機を用い、１２，０００×ｇで５分間、室温で遠心した。デカントにより上清を除き、チューブの口をキムタオルに数秒当てて水分を切り、再度軽い遠心を行うことで１．５ｍＬ容チューブ底面に溶液を集積した。底面の溶液をマイクロピペットで除去し、その後キムワイプの上に口が下になるように１．５ｍＬ容チューブを立て、１５分間風乾した。各１．５ｍＬ容チューブに１０μＬのRNase free蒸留水を加え、ＲＮＡを溶解した。Epoch吸光度プレートリーダー（BioTek社）を用い、ＲＮＡの濃度を算出した。
５．２　ｃＤＮＡ合成
　抽出されたＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成はPrimeScript RT Reagent kit（タカラバイオ社）を用いた。具体的にはＭ－ＭＬＶ逆転写酵素（Roth MJ, Tanese N and Goff SP (1985) J. Biol. Chem., 260(16); 9326-9335）の改変体の活性を利用し、ランダムヘキサマープライマーおよびオリゴdTプライマーの相補部位を起点とする全配列をＤＮＡに変換する酵素法を実施した。
　各抽出ＲＮＡをRNase free蒸留水にて適宜希釈し、５０μｇ／μＬの溶液とした。マイクロピペットを用い、１．５ｍＬ容チューブにて以下の用量で混合液を調製した。
　・　5 × PrimeScript Buffer (for Real Time)　　 26μＬ
　・　Oligo dT Primer 50μM　　　　　　　　　　　6.5μＬ
　・　Random 6 mers 100μM　　　　　　　　　　　 6.5μＬ
　・　RNase free蒸留水　　　　　　　　　　　　　84.5μＬ
　最後に氷上で以下を添加する。  
　・　PrimeScript RT Enzyme Mix I　　　　　　　　6.5μＬ
　　　２６反応分　　　　　　　　　　total　　　　130μＬ
　冷却したラック上に８連ＰＣＲチューブ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を準備し、前記混合液を５μＬずつ加えた。混合液を加えた８連ＰＣＲチューブの蓋に５０μｇ／μＬ ＲＮＡ溶液を５μＬずつスポットした。蓋を閉め、転倒混和またはタッピングで溶液を混合後、スイング型プレート遠心機（久保田製作所社）にて溶液をチューブ底面に集積した。サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社）を用い、以下のプログラムで逆転写反応を実施した後、反応液に５０μＬの蒸留水を加え希釈した。
　I)　　　 ３７℃　 １５分
　II)　　　８５℃　　 ５秒
　III)　　　 ４℃　　 保温
５．３　リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
　５．２にて合成されたｃＤＮＡライブラリーを用い、各目的遺伝子の発現量をリアルタイム定量ＰＣＲ（Higuchi R, Fockler C, Dollinger G and Watson R (1993) Biotechnology， 11: 1026-1030）で評価した。PowerUp SYBR Green Master Mix（アプライドバイオシステムズ社）による、サイバーグリーン法（Kitahara T, Li HS and Balaban CD (2004) Hear Res., 196: 39-48）を実施した。プライマーは過去の文献（Kim J, Kim M, Yun JG and Hwang J (2017), Pekmezci E, Turkoglu M (2017), およびNakamura T, Yamamura H (2018)）を参考に以下の配列をデザインし、サーモフィッシャーサイエンティフィック社より購入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　各目的遺伝子を増幅するためのフォワードおよびリバースプライマー溶液(濃度１００μＭ) のそれぞれ１０μＬを使用し、８０μＬの蒸留水で希釈し、１００μＬの各プライマーが１０μＭとなるプレミックス溶液を調製した。以下の溶液を１．５ｍＬ容チューブにて混合し、反応溶液を調製した(一種のプライマーセットにつき１本作製した)。
　Power Up SYBR Green Master Mix(2×)　　130μＬ
　プライマー　10μＭ プレミックス溶液　 20.8μＬ
　滅菌精製水　　　　　　　　　　　　　　57.2μＬ
　　　　　　　　　　　　　　 Total　　　 208μＬ
　ｃＤＮＡ合成により得られたｃＤＮＡを２μＬずつＰＣＲ専用プレートの各ウェルに加えた。ｃＤＮＡを加えたＰＣＲ専用プレートの各ウェルにマイクロピペットにて８μＬの反応溶液を加え、吸引排出を繰り返すことで混合した。専用のシールで専用プレートを密閉した。以下のプログラムで反応させた。各目的遺伝子の発現量は、ハウスキーピング遺伝子と標的遺伝子のサイクル数の差から比較ＣＴ法（Livak KJ and Schmittgen TD (2001) Methods., 25(4); 402-408）により算出した。統計解析は、大阪大学遺伝情報実験センターの提供する医薬学データ用統計解析プログラムＭＥＰＨＡＳを用い、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重検定を実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［結果］
　図１は、陰性コントロールにおけるヒト初代毛乳頭細胞（HFDPC）の遺伝子発現量を１とした場合に、各濃度のRSE、RTNまたはRICEOで処理したHFDPCにおける血管内皮細胞増殖因子（VEGF）遺伝子の相対遺伝子発現量を示す。ｐ＜０．０５で有意差ありとした。RSEでは、０．１％処理で陰性コントロールに比べて約２倍のVEGF遺伝子発現量の増加が確認でき、RTNでは、０．０１％および０．１％処理で陰性コントロールに比べて、それぞれ約３倍または約６倍のVEGF遺伝子発現量の増加が確認でき、RICEOでは、０．５％処理で陰性コントロールに比べて約１７倍のVEGF遺伝子発現量の増加が確認できた。
　同様に、それぞれ０．１％、０．５％のフィチン酸またはイノシトールで処理した場合、フィチン酸では、０．１％処理で有意なVEGF遺伝子発現量の変化は見られず、０．５％処理で陰性コントロールに比べて約２倍のVEGF遺伝子発現量の増加が確認できた。イノシトールでは、０．１％処理で有意なVEGF遺伝子発現の変化は見られず、０．５％処理で陰性コントロールに比べて約１．５倍のVEGF遺伝子発現量の増加が確認できた。RSEおよびRTNでは、フィチン酸またはイノシトールによる単体での処理よりも低い処理濃度でVEGF遺伝子発現量の増加が確認できた。また、０．５％のRICEOは、実際には、約０．１５％のフィチン酸＋約０．０５％のイノシトールを含有するものに相当するが、０．５％のRICEO処理により、０．５％のフィチン酸または０．５％のイノシトールの単体での処理よりも顕著に高いVEGF遺伝子発現の促進効果が確認できた。このことから、RSE、RTNおよびRICEOは、フィチン酸またはイノシトールの単体と比べて、優れた育毛作用を示し、特に、RICEOは、フィチン酸およびイノシトールをはじめ、他の米糠由来成分同士の相乗効果により、顕著な育毛作用を奏することが示唆された。
　図２は、陰性コントロールにおけるHFDPCの遺伝子発現量を１とした場合に、各濃度のRSEまたはRICEOで処理したHFDPCにおけるインスリン様成長因子（IGF-1）遺伝子の相対遺伝子発現量を示す。ｐ＜０．０５で有意差ありとした。RSEでは、０．０１％および０．１％処理で陰性コントロールに比べて、それぞれ約２倍または約３倍のIGF-1遺伝子発現量の増加が確認でき、RICEOでは、０．１％および０．５％処理で陰性コントロールに比べて、それぞれ約４倍または約６．５倍のIGF-1遺伝子発現量の増加が確認できた。
　同様に、それぞれ０．１％、０．５％のフィチン酸またはイノシトールで処理した場合、フィチン酸では、０．１％処理で陰性コントロールに比べてIGF-1遺伝子発現量が増加しているものの、有意差はなく、０．５％処理で陰性コントロールに比べて約６．５倍のIGF-1遺伝子発現量の増加が確認でき、イノシトールでは、０．１％および０．５％処理の両方でIGF-1遺伝子発現量の増加に有意差はなかった。RSEでは、フィチン酸またはイノシトールによる単体での処理よりも低い処理濃度でIGF-1遺伝子発現量の増加が確認できた。また、０．１％のRICEO（約０．０３％のフィチン酸＋約０．０１％のイノシトールを含有するものに相当）処理では、０．１％のフィチン酸または０．１％のイノシトールによる単体での処理よりも顕著に高いIGF-1遺伝子発現量の増加効果が確認できた。このことから、RSEおよびRICEOは、フィチン酸およびイノシトールと比べて、優れた育毛作用を示し、特に、RICEOは、フィチン酸およびイノシトールをはじめ、他の米糠由来成分との相乗効果により、顕著な育毛作用を奏することが示唆された。
　図３は、陰性コントロールにおけるヒト前立腺がん細胞（LNCaP）の遺伝子発現量を１とした場合に、各濃度のGX-NまたはRTNで処理したLNCaPにおける２型５α－リダクターゼ（5α-R2）遺伝子の相対遺伝子発現量を示す。ｐ＜０．０５で有意差ありとした。GX-Nでは、０．０１％および０．１％処理で陰性コントロールに比べて、それぞれ約０．８５倍または約０．７５倍の5α-R2遺伝子発現量の減少が確認でき、RTNでは、０．１％処理で陰性コントロールに比べて約０．７倍の5α-R2遺伝子発現量の減少が確認できた。
〔実施例２：毛乳頭細胞増殖率の確認〕
［試験方法］
　使用する細胞をヒト初代毛乳頭細胞（HFDPC）とすること以外は、実施例１と同様の方法で１．０×１０５細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を、９６ウェルカルチャープレート（ビオラモ社）に１．０×１０４細胞／ウェルとなるよう細胞を播種し、ＣＯ２インキュベーターにより３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で一晩培養した。０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％ RICEO含有培地または１％ＦＢＳ培養培地（陰性コントロール）を、１ウェルあたりそれぞれ０．１ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベーターにより３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。各群５ウェルを使用した（ｎ＝５）。培養した後、培地を除き、１０％テトラゾリウム塩試薬（CCK-8）を含む培養培地（0%FBS）を１００μＬ／ウェルで添加し、ＣＯ２インキュベーターで２時間培養した。マイクロプレートリーダー（テカン社）を用い、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。陰性コントロールにおける細胞数を１００％とした相対細胞割合を算出した。統計解析は大阪大学遺伝情報実験センターの提供する医薬学データ用統計解析プログラムＭＥＰＨＡＳを用い、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重検定を実施した。
　RICEO含有培地を、フィチン酸含有培地（０．０１６％、０．０６％、０．２５％、１％）またはイノシトール含有培地（０．０１６％、０．０６％、０．２５％、１％）に変更すること以外は、同様にして培養を行った。
［結果］
　図４は、HFDPCを各濃度のRICEOで処理した場合の細胞増殖率を示す。ｐ＜０．０５で有意差ありとした。０．０１％、０．０５％および０．１％ RICEOで処理した場合に細胞数が顕著に増加し、特に０．１％RICEO処理で約１５０～１６０％の顕著な細胞増殖を示したことが確認できた。
　同様に、それぞれ０．０１６％、０．０６％、０．２５％、１％のフィチン酸またはイノシトールで処理した場合、フィチン酸では、０．０１６％、０．０６％、０．２５％処理で約１２０～１３０％の細胞増殖を示した一方、１％処理により約７０％まで細胞数が減退していたことが確認できた。また、イノシトールでは、０．０６％、０．２５％、１％処理にかけて濃度依存的に、約１２０％～約１５０％まで段階的に細胞数が顕著に増加したことが確認できた。０．１％のRICEO（約０．０３％のフィチン酸＋約０．０１％のイノシトールを含有するものに相当）処理では、０．０６％のフィチン酸または０．０１６％のイノシトールによる単体での処理よりも、顕著な細胞増殖効果が確認できた。このことから、RICEOは、フィチン酸およびイノシトールをはじめ、他の米糠由来成分との相乗効果により、顕著な育毛作用を奏することが示唆された。
〔実施例３：イノシトールおよびフィチン酸の混合物によるVEGF遺伝子発現量に対する影響の検証〕
［試験材料］
　精製されたイノシトールおよび精製されたフィチン酸として以下の２種を使用した。
・フィチン酸（商品名、築野食品工業株式会社製）
・イノシトール（商品名、築野食品工業株式会社製）
　イノシトール（IN）およびフィチン酸（PA）の配合比率（IN：PA＝約1：3）によるVEGF遺伝子発現量に対する影響の検証を行った。０．５％イノシトール含有培地および０．５％フィチン酸含有培地を１：３の割合で混合し、０．５％ IN/PA混合物含有培地を得た。その培地を１％ＦＢＳ培養培地にて５倍希釈または１０倍希釈し、０．１％ IN/PA混合物含有培地および０．０５％ IN/PA混合物含有培地を得た。各IN/PA混合物含有培地におけるイノシトールおよびフィチン酸の含有割合を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ヒト初代毛乳頭細胞（HFDPC）に対して、フィチン酸含有培地（０．１％、０．５％）、イノシトール含有培地（０．１％、０．５％）、IN/PA混合物含有培地（０．０５％、０．１％、０．５％）または１％ＦＢＳ培養培地（陰性コントロール）を１ウェルあたり１ｍＬ添加したこと以外は、実施例１と同様にして細胞培養およびVEGF遺伝子発現量解析を行った。
［結果］
　図５は、陰性コントロールにおけるヒト初代毛乳頭細胞（HFDPC）の遺伝子発現量を１とした場合に、各濃度のフィチン酸（PA）、イノシトール（IN）、またはイノシトールおよびフィチン酸混合物（IN/PA mix）で処理したHFDPCにおける血管内皮細胞増殖因子（VEGF）遺伝子の相対遺伝子発現量を示す。ｐ＜０．０５で有意差ありとした。それぞれ０．１％、０．５％のフィチン酸またはイノシトールで処理した場合、フィチン酸では、０．１％処理で有意なVEGF遺伝子発現量の変化は見られず、０．５％処理で陰性コントロールに比べて約２倍のVEGF遺伝子発現量の増加が確認できた。イノシトールでは、０．１％処理で有意なVEGF遺伝子発現量の変化は見られず、０．５％処理で陰性コントロールに比べて約１．５倍のVEGF遺伝子発現量の増加が確認できた。イノシトールおよびフィチン酸混合物では、フィチン酸またはイノシトールによる単体での処理よりも低い処理濃度の０．０５％処理および０．１％処理でそれぞれ約２．５倍または約４倍のVEGF遺伝子発現量の増加が確認できた。このことから、イノシトールおよびフィチン酸を混合して使用することにより、フィチン酸またはイノシトールを単体で使用する場合に比べて、イノシトールおよびフィチン酸の相乗効果により、低濃度で顕著に高いVEGF遺伝子発現の促進効果が得られることが確認できた。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (13)

  1. 　米糠由来成分混合物を含有する育毛剤。
  2. 　前記米糠由来成分混合物が、以下の（１）～（４）から選択される、請求項１に記載の育毛剤：
    （１）水溶性米糠成分
    （２）植物ステロールと脂肪酸とのエステルおよび／またはトリテルペンアルコールと脂肪酸のエステル
    （３）米糠油不ケン化物濃縮物
    （４）γ－オリザノールを２０質量％以上含有する米油
  3. 　前記（１）が、フィチン酸およびイノシトールを含有する、請求項２に記載の育毛剤。
  4. 　前記（１）が、フィチン酸を１５質量％以上４５質量％以下含有し、イノシトールを５質量％以上２０質量％以下含有する、請求項３に記載の育毛剤。
  5. 　精製されたイノシトールおよび精製されたフィチン酸を含有する育毛剤。
  6. 　イノシトールおよびフィチン酸の配合比率が、質量比で１：２以上１：９以下である、請求項５に記載の育毛剤。
  7. 　請求項１に記載の育毛剤を含むことを特徴とする医薬品。
  8. 　請求項１に記載の育毛剤を含むことを特徴とする化粧品。
  9. 　請求項１に記載の育毛剤を含むことを特徴とする飲食品。
  10. 　米糠由来成分混合物を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤。
  11. 　米糠由来成分混合物を含有する血管内皮増殖因子産生促進剤。
  12. 　米糠由来成分混合物を含有するインシュリン様増殖因子－１産生促進剤。
  13. 　米糠由来成分混合物を含有する２型５α－リダクターゼ産生抑制剤。
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