WO2023219160A1 - 新規細胞性免疫増強アジュバント - Google Patents

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WO2023219160A1
WO2023219160A1 PCT/JP2023/017885 JP2023017885W WO2023219160A1 WO 2023219160 A1 WO2023219160 A1 WO 2023219160A1 JP 2023017885 W JP2023017885 W JP 2023017885W WO 2023219160 A1 WO2023219160 A1 WO 2023219160A1
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protein
acid sequence
cells
amino acid
seq
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悟 水野
和浩 松尾
康志 中馬
幸広 渋谷
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日本ビーシージー製造株式会社
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    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to an adjuvant that enhances cellular immunity.
  • Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG (hereinafter sometimes simply referred to as BCG), an attenuated strain of Mycobacterium tuberculosis bovis, is widely used as a vaccine against human tuberculosis. Since live BCG bacteria are required for effectiveness as a tuberculosis vaccine, there has been a theory since ancient times that proteins actively secreted by live bacteria may be responsible for important immune responses. In order to confirm this hypothesis, efforts have been made since the 1980s to purify and characterize proteins secreted by Mycobacterium tuberculosis and BCG.
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • a killer T cell-inducing adjuvant for peptide antigens but from a safety perspective cannot be used for Therefore, the cell wall skeleton (CWS) was purified by removing proteins and nucleic acids from BCG cells as much as possible and was developed as an anticancer drug (Non-Patent Documents 5, 6), but it has not yet been put into practical use. has not yet been reached.
  • Non-Patent Document 7 Intravesical injection therapy of live BCG bacteria is practiced in various countries (Non-Patent Document 7), and in the United States, treatment by intratumor administration of live BCG bacteria to melanoma lesions is actually performed (Non-Patent Document 8).
  • cell wall components that contain molecules that enhance innate immunity such as cell wall peptidoglycan, lipid components such as mycolic acid, glycolipids such as lipomannan and lipoarabinomannan, and muramyl dipeptide, each have anti-cancer effects.
  • live BCG bacteria are used because the effect is not as good as that of live BCG bacteria.
  • the present invention has been made in view of the above points, and an object of the present invention is to provide a protein having adjuvant activity that enhances cellular immunity.
  • BCG culture filtrate proteins proteins actively secreted from living bacteria
  • CFP proteins actively secreted from living bacteria
  • An adjuvant composition for enhancing cellular immunity comprising a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof.
  • the protein is a protein derived from Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG, [1] or [2] The adjuvant composition described in ].
  • the adjuvant composition according to item 1. [6] A vector for expressing the protein or a variant thereof, which has a nucleic acid sequence encoding the protein or variant thereof having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4. [7] The vector according to [6], wherein the protein or variant thereof is a protein having an amino acid sequence having at least 90% sequence identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • a nucleic acid sequence encoding a protein or a variant thereof having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 has been introduced, or the vector described in [6] or [7] has been introduced, Recombinant bacteria.
  • the recombinant bacteria are Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG, Escherichia coli (Es. cherichia coli), Bacillus subtilis The recombinant bacterium according to [8], which is selected from Bacillus subtilis, Bacillus cereus, and Pichia pastoris.
  • An adjuvant composition for enhancing cellular immunity comprising a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 4 derived from the recombinant bacterium according to [8] or [9], or a variant thereof .
  • a method for producing an adjuvant composition for enhancing cellular immunity which comprises the step of culturing the recombinant bacterium according to [8] or [9].
  • a vaccine composition comprising a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof, and a vaccine immunizing antigen.
  • the vaccine composition according to [12], wherein the protein or variant thereof is a protein having an amino acid sequence having at least 90% or more sequence identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4. .
  • a pharmaceutical composition comprising a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof.
  • a protein having adjuvant activity that enhances cellular immunity can be provided. Therefore, it can be suitably used in the treatment of diseases such as cancer and viral infections, in which killer T cells have been shown to play an important role in the protective effect, and in vaccines. Furthermore, in the present invention, since the above-mentioned protein having adjuvant activity is used, there is no need to administer live BCG bacteria, and the present invention is excellent in terms of safety.
  • FIG. 1 is a diagram showing HPLC chromatograms of MPB63, MPT63, MPB44, MPB53, MPT53, and MPB64 purified in 1-2 of Example 1.
  • FIG. 2-1 is a diagram showing SDS-PAGE images of CFP, MPB63, MPT63, MPB44, MPB53, MPT53, and MPB64 purified in 1-1 and 1-2 of Example 1.
  • FIG. 2-2 is a diagram showing Native-PAGE migration images of CFP, MPB63, MPT63, MPB44, MPB53, MPT53, and MPB64 purified in 1-1 and 1-2 of Example 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing two-dimensional electrophoretic images of CFP purified in 1-1 and protein purified in 1-2-2 of Example 1.
  • FIG. 4-1 is a diagram showing the construction method of the acid-fast bacterium expression vector pSO ⁇ Bam-6His used in Example 2, 2-1.
  • FIG. 4-2 is a diagram showing a method for constructing the MPB63, MPB64, MPB44, and MPB53 secretion expression vectors described in 2-1 of Example 2.
  • FIG. 4-3 is a diagram showing a method for constructing a plasmid in which the MPB63 and MPB44 genes described in Example 2, 2-3 are introduced into pUC18.
  • FIG. 4-4 is a diagram showing the method for constructing the natural rMPB63 secretion expression vector described in 2-3 of Example 2.
  • FIG. 4-5 is a diagram showing the method for constructing the natural rMPB44 secretion expression vector described in 2-3 of Example 2.
  • Figure 5-1 shows SDS-PAGE images of recombinant MPB63, recombinant MPB44, recombinant MPB64 and recombinant MPB53 purified in 2-2 of Example 2 and Western blot analysis using an anti-His tag monoclonal antibody.
  • FIG. 4-4 is a diagram showing the method for constructing the natural rMPB63 secretion expression vector described in 2-3 of Example 2.
  • FIG. 4-5 is a diagram showing the method for constructing the natural rMPB44 secretion expression vector described in 2-3 of
  • FIG. 2 is a diagram showing the results, SDS-PAGE images of natural recombinant MPB63 and natural recombinant MPB44 purified in 2-4 of Example 2, and the results of Western blot analysis using the respective rabbit polyclonal antibodies.
  • Figure 5-2 shows recombinant MPB63, recombinant MPB44, recombinant MPB64 and recombinant MPB53 purified in 2-2 of Example 2, and natural recombinant MPB63, natural type purified in 2-4 of Example 2.
  • FIG. 3 shows an HPLC chromatogram of recombinant MPB44.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of an in vitro cytokine assay using mouse bone marrow-derived dendritic cells in Example 3. In FIG.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of an OVA-specific killer T cell induction activity test in Example 4.
  • OVA/PBS EG7 indicates the percentage of dead cells in target cells obtained by co-culturing effector cells derived from OVA/PBS-administered mice and EG7 cells (target cells).
  • OVA/PBS EL4 indicates the percentage of dead cells in target cells obtained by co-culturing effector cells derived from OVA/PBS-administered mice and EL4 cells (target cells).
  • OVA/CFP EG7 indicates the percentage of dead cells in target cells obtained by co-culturing effector cells derived from OVA/CFP-administered mice and EG7 cells (target cells).
  • OVA/CFP EL4 indicates the percentage of dead cells in target cells obtained by co-culturing effector cells derived from OVA/CFP-administered mice and EL4 cells (target cells). The vertical axis shows the percentage of dead cells in the target cells.
  • FIG. 8-1 is a diagram showing the construction of the PepA protein secretion expression vector pSO ⁇ Bam-PepA used in 5-1 of Example 5.
  • FIG. 8-2 is a diagram showing an SDS-PAGE electrophoresis image of the recombinant PepA protein purified in 5-1 of Example 5.
  • PepA/PBS GM10-EL4 indicates the percentage of dead cells in target cells obtained by co-culturing effector cells derived from PepA/PBS-administered mice and GM10-EL4 cells (target cells).
  • PepA/PBS EL4 indicates the percentage of dead cells in target cells obtained by co-culture of effector cells derived from PepA/PBS-administered mice and EL4 cells (target cells).
  • PepA/MPT63 GM10-EL4 indicates the percentage of dead cells in target cells obtained by co-culturing Effector cells derived from PepA/MPT63-administered mice and GM10-EL4 cells (Target cells).
  • PepA/MPT63 EL4 indicates the percentage of dead cells in target cells obtained by co-culturing effector cells derived from PepA/MPT63-administered mice and EL4 cells (target cells).
  • the vertical axis shows the percentage of dead cells in the target cells.
  • the horizontal axis shows the mixing ratio of Effector cells and each Target cell (Effector cells/Target cells).
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of a melanoma-specific killer T cell induction activity test in Example 6.
  • B16 lys/PBS B16F10 indicates the percentage of dead cells in target cells obtained by co-culture of effector cells derived from B16F10 cell lysate/PBS-administered mice and B16F10 cells (target cells).
  • B16 lys/PBS EL4 indicates the percentage of dead cells in target cells obtained by co-culturing effector cells derived from B16F10 cell lysate/PBS-administered mice and EL4 cells (target cells).
  • B16 lys/CFP B16F10 indicates the percentage of dead cells in target cells obtained by co-culturing effector cells derived from B16F10 cell lysate/CFP-administered mice and B16F10 cells (target cells).
  • B16 lys/CFP EL4 indicates the percentage of dead cells in target cells obtained by co-culturing effector cells derived from B16F10 cell lysate/CFP-administered mice and EL4 cells (target cells).
  • the vertical axis shows the percentage of dead cells in the target cells.
  • the horizontal axis shows the mixing ratio of Effector cells and each Target cell (Effector cells/Target cells). Results when MPT63, MPB44, MPB53, MPB64, rMPB63, rMPB44, rMPB53, and rMPB64 were used instead of CFP (reference example) are shown in 10-2 to 10-9.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of an antitumor activity test (vaccine effect when vaccinated) against EG7 cells in Example 7.
  • the vertical axis represents the tumor diameter (major axis x short axis), and the horizontal axis represents the number of days after tumor challenge.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of an antitumor activity test (vaccine effect when vaccinated) against EG7 cells in Example 7.
  • the vertical axis represents the tumor diameter (major axis x short axis), and the horizontal axis represents the
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of an antitumor activity test (vaccine effect upon vaccination) against melanoma cells in Example 8.
  • the vertical axis represents the tumor diameter (major axis x short axis), and the horizontal axis represents the number of days after tumor challenge.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of an antitumor activity test (vaccine effect upon vaccination) against colon cancer cells in Example 9.
  • the vertical axis represents the tumor diameter (major axis x short axis), and the horizontal axis represents the number of days after tumor challenge.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of an antitumor activity test (therapeutic effect) on EG7 cells in Example 10.
  • the vertical axis represents the tumor diameter (major axis x short axis), and the horizontal axis represents the number of days after tumor challenge.
  • a first aspect of the present invention is an adjuvant composition for enhancing cellular immunity, comprising a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof.
  • the first other aspect of the present invention is a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof for use as an adjuvant for enhancing cellular immunity.
  • the adjuvant composition of the present invention contains a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof (hereinafter sometimes referred to as the protein of the present invention).
  • the variant of the protein There are no particular restrictions on the variant of the protein as long as it has adjuvant activity. The presence or absence of adjuvant activity can be easily confirmed by the cytokine assay or killer T cell induction activity evaluation test described below.
  • the protein or its variant is preferably a protein having an amino acid sequence having at least 70% or more sequence identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 4, and at least 80% or more.
  • the protein has an amino acid sequence with sequence identity, and even more preferable that the protein has an amino acid sequence with at least 90% or more sequence identity.
  • the protein or the variant thereof has at least 90% or more, at least 91% or more, at least 92% or more, at least 93% or more, at least 94% or more, at least 95% or more of the amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 4,
  • the protein may have an amino acid sequence having a sequence identity of at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%.
  • the above-mentioned protein or its variant is preferably a protein having an amino acid sequence having at least 90% or more sequence identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4;
  • the protein has an amino acid sequence that has at least 93% or more sequence identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4, and has at least 95% or more sequence identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 4.
  • It is preferably a protein having an amino acid sequence, and preferably a protein having an amino acid sequence having at least 97% sequence identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 4, and preferably a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 4.
  • the protein preferably has an amino acid sequence that has at least 99% sequence identity with the selected amino acid sequence, and has at least 99.5% sequence identity with the amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 4.
  • the protein has an amino acid sequence having the same amino acid sequence, and may have 100% sequence identity.
  • the protein or its variant preferably has at least 70% sequence identity, more preferably at least 80% sequence identity, with the amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 4. , having at least 90% sequence identity.
  • the protein or the variant thereof has at least 90% or more, at least 91% or more, at least 92% or more, at least 93% or more, at least 94% or more, at least 95% or more of the amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 4, Preferably, the sequence identity is at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%.
  • the above-mentioned protein or its variant has at least 90% or more sequence identity with the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1-4; It preferably has at least 93% sequence identity, preferably has at least 95% sequence identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4, and preferably has at least 95% sequence identity to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 4.
  • the amino acid sequence preferably has at least 97% sequence identity with the amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 4, and preferably has at least 99% sequence identity to the amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 4.
  • the amino acid sequence preferably has at least 99.5% sequence identity, and may have 100% sequence identity.
  • the protein of the present invention is preferably an isolated protein.
  • proteins having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 include MPB63 derived from Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG and MPT63 derived from Mycobacterium tuberculosis. Although MPB63 and MPT63 are expressed in different species, their amino acid sequences are the same.
  • proteins having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 include MPB44 derived from Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG and MPT44 derived from Mycobacterium tuberculosis. Although MPB44 and MPT44 are expressed in different species, their amino acid sequences are the same.
  • Examples of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 include MPB53 derived from Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG and MPT53 derived from Mycobacterium tuberculosis. Although MPB53 and MPT53 are expressed in different species, their amino acid sequences are the same.
  • Examples of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 include MPB64 derived from Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG and MPT64 derived from Mycobacterium tuberculosis. Although MPB64 and MPT64 are expressed in different species, their amino acid sequences are the same.
  • MPB63 it has been reported that preparations using some of its peptides have cytotoxicity and anticancer effects (Japanese Patent Application Publication No. 2018-512446). Furthermore, there is a report that MPB44 enhances anti-tuberculosis immunity (Brooks et al. Infect. Immun 69(4):2714-7 (2001)). However, there are no reports indicating or suggesting that MPB63, MPB44, MPB53, and MPB64 act as adjuvants to induce killer T cells against antigens (for example, patient-derived cancer antigens, etc.) administered together.
  • antigens for example, patient-derived cancer antigens, etc.
  • Adjuvants that enhance cell-mediated immunity are essential for, for example, immunotherapy using cancer vaccines, but until now there has been no excellent adjuvant that has the above-mentioned effects.
  • the present invention has found that the above-mentioned protein has excellent adjuvant activity that enhances cell-mediated immunity, which is surprising and cannot be predicted from conventional knowledge. Furthermore, in the present invention, since the above-mentioned protein having adjuvant activity is used, there is no need to administer live BCG bacteria, and the present invention is excellent in terms of safety.
  • the protein of the present invention may be in the form of a fusion protein with other proteins or polypeptides, or may be in the form of a conjugate with other compounds.
  • adjuvant compositions containing the protein of the present invention also include embodiments containing the protein of the present invention in the form of a fusion protein with another protein or polypeptide or in the form of a conjugate with another compound. shall be included. The same applies to vaccine compositions and pharmaceutical compositions described below.
  • a fusion protein is a combination of a nucleic acid sequence encoding a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 4 or a variant thereof, and a nucleic acid sequence encoding another protein or polypeptide, transcribed and expressed.
  • a fusion protein may be one in which a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof is linked to another protein or polypeptide directly or via a linker.
  • a bonding method a known method such as chemical covalent bonding using a crosslinking reagent may be used.
  • Other proteins or polypeptides, in the case of fusion proteins include glutathione S-transferase, maltose binding protein, thioredoxin, histidine tag, FLAG tag, and the like. Among these, histidine tags are preferred.
  • ovalbumin, bovine serum albumin, keyhole limpet-derived hemocyanin, polyarginine, etc. may be used. Among these, ovalbumin and bovine serum albumin are preferred.
  • Other compounds to be conjugated with proteins having amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or variants thereof include DNA, RNA, amino acids, peptides, proteins, lipids, sugar chains, organic compounds (phosphorylation, S-nitrosylation), etc.
  • a conjugate can be formed by binding other compounds directly or via a linker to a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof.
  • the bonding method known methods such as enzymatic reaction, chemical covalent bonding using a crosslinking reagent, and other chemical synthesis may be used.
  • the protein of the present invention may be a biologically derived protein, a protein expressed by introducing a gene expression vector having a nucleic acid sequence encoding the protein into a host, or an artificially synthesized protein. It may be.
  • the biologically derived protein is preferably a protein derived from bacteria, more preferably a protein derived from acid-fast bacteria, such as Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, etc.
  • Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG Mycobacterium tuberculosis variant africanum, Mycobacterium tuberculosis variant africanum Mycobacterium tuberculosis variant microti, mycobacterium Mycobacterium tuberculosis variant caprae, derived from Mycobacterium tuberculosis variant pinnipedii Even more preferably it is a protein, Mycobacterium tuberculosis Even more preferably, the protein is derived from Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG.
  • methods for artificially synthesizing the protein of the present invention include solid phase peptide chemical synthesis and methods using peptide linkage catalysts.
  • proteins expressed by introducing a gene expression vector having a nucleic acid sequence encoding the protein into a host include proteins expressed using recombinant bacteria of the following embodiments. That is, the protein of the present invention may be a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 4 derived from a recombinant bacterium according to the following embodiments or a variant thereof.
  • the adjuvant composition of the present invention is an adjuvant for enhancing cellular immunity, comprising a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof derived from a recombinant bacterium according to the following embodiments. It may be a composition.
  • the adjuvant compositions or proteins of the invention can be used to enhance cellular immunity.
  • Cell-mediated immunity is an immune mechanism in which cells are the main effectors in eliminating foreign substances such as pathogens themselves, virus-infected cells, and cancer cells, in contrast to humoral immunity mediated by antibody production.
  • the present invention relates to an immune response mediated by killer T cells, which is one of the immune mechanisms of cell-mediated immunity.
  • An adjuvant is a substance used to be administered with an antigen to increase its effectiveness (immunogenicity). By administering the adjuvant composition or protein of the present invention in combination with an antigen, it is possible to enhance the immune response by the administered antigen-specific killer T cells.
  • the adjuvant compositions or proteins of the invention can increase the amount of the cytokine IL-2 produced from cytotoxic T cells.
  • IL-2 is known to be an essential cytokine for the proliferation of T cells including CD8 T cells. Therefore, from this reaction, antigen information is transmitted to CD8 T cells via dendritic cells, and antigen-specific CD8 T cells are induced. Furthermore, it is thought that the induced antigen-specific CD8 T cells proliferate due to the produced IL-2.
  • an increase in the amount of IL-2 produced by co-administration of the adjuvant composition or protein of the present invention with an antigen suggests that the adjuvant composition or protein of the present invention exhibits adjuvant activity.
  • the protein of the present invention can be used as an adjuvant for a cancer therapeutic vaccine by mixing it with various cancer antigen proteins, proteins derived from cancer cells collected from cancer tissues of patients, and a cancer cell lysate and administering the mixture to cancer patients. Can be done. Furthermore, the protein of the present invention can be used as an adjuvant for preventive vaccines against various viral and bacterial infections in which killer T cells are important for preventing infection.
  • the protein of the present invention may also be used in patients suffering from diseases such as cancer, viral infections, and bacterial infections (preferably as antigens expressed in cancer cells, viruses, and bacteria that cause these diseases). By administering the protein (along with a protein or a fragment thereof), it enhances (activates) the immune response mediated by killer T cells against the antigen that causes the disease, thereby treating or suppressing the progression of diseases such as cancer. Or it can be delayed.
  • the adjuvant composition of the present invention may contain a solvent.
  • a solvent included, the protein of the present invention may be dissolved, suspended, liposomed, or emulsified in the solvent.
  • solvents include water for injection, physiological saline, phosphate buffer, oil, and the like.
  • the adjuvant compositions of the invention may include excipients, buffers, preservatives, surfactants, thickeners, pH adjusters and/or tonicity agents.
  • Excipients include sucrose, mannose, trehalose, and the like.
  • buffer include phosphoric acid, citric acid, or salts thereof.
  • preservatives include paraoxybenzoic acid esters.
  • surfactant include polysorbates and polyoxyethylene alkyl sulfate salts.
  • thickeners include carmellose sodium, carboxyvinyl polymer, and the like.
  • the pH adjuster include glycine, hydrochloric acid, sodium hydroxide, and the like.
  • tonicity agents include sodium chloride, glucose, and the like.
  • the adjuvant composition of the present invention may contain the above protein or its variant as the only component having adjuvant activity.
  • the adjuvant composition of the present invention may contain other components having adjuvant activity.
  • Other adjuvants include aluminum chloride, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, and the like.
  • Adjuvant compositions or proteins of the invention may be used in combination with drugs.
  • the drug include drugs effective for treating cancer, viral infections, bacterial infections, inhibiting their progression, and preventing infections.
  • Other examples include immune checkpoint inhibitors (nivolumab (drug name: Opdivo), pembrolizumab (drug name: Keytruda)) and cancer chemotherapy drugs.
  • the adjuvant composition of the present invention in combination with a drug, the effect of the drug can be enhanced.
  • the adjuvant composition or protein of the present invention may be used in combination with an immunizing antigen. Examples of the immunizing antigen include those exemplified in the vaccine composition and pharmaceutical composition described below.
  • the adjuvant composition or protein of the present invention in combination with an immunizing antigen, the cellular immune response against the immunizing antigen in the body is enhanced, and it is possible to treat, prevent, or treat diseases caused by cells, viruses, bacteria, etc. that have the immunizing antigen. can be improved or its progress delayed. Examples of the disease include those exemplified in the vaccine compositions and pharmaceutical compositions described below.
  • the adjuvant composition or protein of the present invention may be administered before the administration of the drug or the immunizing antigen, simultaneously with the administration of the drug or the immunizing antigen, or sequentially before or after the administration of the drug or the immunizing antigen. or may be administered after administration of the drug or immunizing antigen.
  • Administration methods include subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration, intradermal administration, nasal administration, inhalation administration, intratumoral administration, and intravesical administration. Among these, intravenous administration, intradermal administration, subcutaneous administration, intratumoral administration, and intravesical administration are preferred.
  • subjects to which the adjuvant composition or protein of the present invention may be administered include mammals. Among these, humans, dogs, cats, cows, pigs, goats, sheep, and monkeys (primates other than humans) are preferred, and humans are particularly preferred.
  • a second aspect of the present invention is a vector for expressing a protein or a variant thereof, which has a nucleic acid sequence encoding a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof.
  • the protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or variants thereof include those similar to those in the first embodiment.
  • Vectors of the invention may include a nucleic acid sequence encoding a signal peptide.
  • a signal peptide is a peptide that acts on protein membrane permeation, is often present at the amino terminus of a protein, and is cleaved during membrane permeation.
  • signal peptide makes it easier for the protein to pass through the cytoplasmic membrane, so in Gram-positive bacteria that do not have an outer membrane, a large amount is secreted into the culture supernatant.
  • the signal peptide include signal peptides that are provided on the N-terminal side of MPB63, MPB44, MPB53, MPB64, MPB70, MPB59, and MPB32 when these proteins are expressed by bacteria.
  • MPB63, MPB44, MPB53, MPB64, MPB70, MPB59, and MPB32 are expressed in a form (precursor) with a signal peptide on the N-terminal side, but the signal peptide portion is cleaved when passing through the cytoplasmic membrane, and MPB63 , MPB44, MPB53, MPB64, MPB70, MPB59, and MPB32.
  • the vector of the present invention may contain a promoter sequence. Examples of promoters include the hsp60 promoter derived from BCG, the MPB70 promoter, the Ag85B promoter, and the SP2 promoter derived from Mycobacterium smegmatis.
  • the SP2 promoter derived from Mycobacterium smegmatis can be suitably used.
  • the vector of the present invention may further contain a Shine-Dalgarno sequence and a transcription termination signal (terminator).
  • a phage vector, a plasmid vector, etc. can be used.
  • plasmid vectors it is preferable to use plasmid vectors.
  • the phage vector for example, mycobacteriophage can be used.
  • a plasmid vector for example, one containing the replication initiation region of pAL5000 such as pSO246 and pSO ⁇ Bam6His can be used.
  • nucleic acid sequence encoding the above protein there are no particular restrictions on the method for incorporating the nucleic acid sequence encoding the above protein into a vector, and any known method may be used.
  • a gene construct can be incorporated into a vector by ligating the DNA fragments cut with a restriction enzyme using a DNA ligase.
  • the nucleic acid sequence encoding the above protein may be optimized depending on the host into which the vector of the present invention is introduced.
  • a codon usage database Kazusa DNA Research Institute homepage
  • a third aspect of the present invention is a recombinant bacterium into which a nucleic acid sequence encoding a protein or a variant thereof having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 has been introduced, or into which the above-mentioned vector has been introduced. It is.
  • the recombinant bacterium of the present invention has a nucleic acid sequence (preferably the nucleic acid sequence derived from the above vector) encoding a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof, or a nucleic acid sequence (preferably the nucleic acid sequence derived from the above vector) or or transfection).
  • the above-mentioned nucleic acid sequence or the above-mentioned vector or a part thereof (however, it preferably includes the above-mentioned nucleic acid sequence and further includes a signal sequence and/or promoter sequence, and may further include other components in the vector), It may be integrated into the genome of the host bacterium.
  • SEQ ID NOs: 1 to 4 are present in the genome of the bacterium, separately from the introduced nucleic acid sequence or the nucleic acid sequence in the introduced vector. It may or may not contain a nucleic acid sequence encoding a protein having an amino acid sequence selected from.
  • the recombinant bacteria of the present invention include Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG, and Escherichia coli. ia coli), Bacillus subtilis ), Bacillus cereus, Pichia pastoris, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium ⁇ Selected from Mycobacterium kansasii
  • the yeast is selected from Bacillus cereus, Pichia pastoris, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG.
  • the recombinant bacterium of the present invention is Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG.
  • BCG a protein with adjuvant activity will be overexpressed in BCG used as a tuberculosis vaccine, compared to BCG in which the protein or vector of the present invention has not been introduced. It can enhance the vaccine effect against tuberculosis. Therefore, the present invention may be a tuberculosis vaccine composition comprising a recombinant Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG.
  • the present invention may be a recombinant strain of Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG for use in a tuberculosis vaccine (or for preventing tuberculosis).
  • the components contained in the composition include the above-mentioned solvents and other components.
  • the components contained in the composition include the above-mentioned solvents and other components.
  • other components in the vaccine for example, those of the sixth aspect can be mentioned.
  • methods for introducing the vector into bacteria include electroporation. Electroporation allows vectors to be introduced into bacteria by punching holes in the bacterial cell wall under high voltage.
  • a fourth aspect of the present invention is a method for producing a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof, which comprises the step of culturing the above-mentioned recombinant bacterium.
  • the protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or variants thereof include those similar to those in the first embodiment.
  • the recombinant bacteria may be cultured on a medium or in a culture solution.
  • the culture time is not particularly limited and may be 8 to 1440 hours or 24 to 170 hours.
  • the culture temperature is not particularly limited and may be adjusted as appropriate depending on the type of bacteria, and may be about 20 to 45°C or about 35 to 39°C. There are no particular restrictions on the medium or culture solution, and any medium or culture solution suitable for the host bacteria may be used.
  • the production method of the present invention involves producing a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 4 or a variant thereof after culturing a recombinant bacterium, preferably from a culture filtrate (CFP) after culturing the recombinant bacterium. It may also include a purification step.
  • Examples of methods for purifying the protein include salting out, gel filtration column chromatography, ion exchange column chromatography, hydrophobic interaction column chromatography, antibody affinity column chromatography, metal ion chelate affinity column chromatography, and the like.
  • a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof can be expressed and purified in large quantities.
  • a fifth aspect of the present invention is a method for producing an adjuvant composition for enhancing cellular immunity, which comprises the step of culturing the above recombinant bacterium.
  • the protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or variants thereof include those similar to those in the first embodiment.
  • the recombinant bacteria may be cultured on a medium or in a culture solution.
  • the culture time is not particularly limited and may be 8 to 1440 hours or 24 to 170 hours.
  • the culture temperature is not particularly limited and may be adjusted as appropriate depending on the type of bacteria, and may be about 20 to 45°C or about 35 to 39°C.
  • the production method of the present invention involves cultivating a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 4 or a variant thereof, preferably from the culture filtrate (CFP) after culturing the recombinant bacterium. It may also include a purification step. Examples of methods for purifying the protein include salting out, gel filtration column chromatography, ion exchange column chromatography, hydrophobic interaction column chromatography, antibody affinity column chromatography, metal ion chelate affinity column chromatography, and the like.
  • the production method of the present invention includes, after a purification step, a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof, a solvent, an excipient, a buffer, a preservative, a surfactant, and a thickener. , a pH adjuster, or an isotonizing agent.
  • a fifth other aspect of the present invention is a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 4 or a variant thereof, and a solvent, excipient, buffer, preservative, surfactant, and thickener.
  • This is a method for producing an adjuvant composition for enhancing cellular immunity, which includes the step of mixing the adjuvant composition with one or more selected from , a pH adjuster, or a tonicity agent.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or variants thereof include those similar to those in the first embodiment.
  • the method of the present invention may include the step of providing a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof.
  • the method of the present invention may include the step of purifying the protein or its variant from the bacterial culture filtrate. Examples of the bacteria include those described in the first aspect.
  • the method of the present invention may include the steps described in the fourth or fifth aspect.
  • a sixth aspect of the present invention is a vaccine composition comprising a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof, and an immunizing antigen for vaccines.
  • a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or variants thereof include those similar to those in the first embodiment.
  • the vaccine composition of the present invention can act as a vaccine against various diseases.
  • the vaccine composition of the present invention can be preferably used as a vaccine against cancer, viral infection, bacterial infection, and more preferably used as a vaccine against cancer, malignant melanoma, lung cancer, It can be even more preferably used as a vaccine against one or more selected from colon cancer and bladder cancer.
  • the vaccine composition of the present invention contains immunogenic antigens against cancer, viral infections, and bacterial infections (e.g., proteins or fragments thereof expressed in cancer cells, viruses, or bacteria that cause these diseases, preferably preferably contains proteins or fragments thereof that are expressed in cancer cells, viruses, or bacteria that cause these diseases, but are not expressed in normal cells or host cells of viruses or bacteria, and are immunogenic antigens for cancer. It is more preferable to contain one or more immunizing antigens selected from malignant melanoma, lung cancer, colon cancer, and bladder cancer.
  • the protein of the present invention functions not as an immunizing antigen but as an adjuvant for enhancing cellular immunity. Therefore, the vaccine composition of the present invention contains a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof as an adjuvant for enhancing cellular immunity.
  • the immunizing antigen contained in the vaccine composition of the present invention is a substance (such as a protein) other than a protein or a variant thereof having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • the vaccine composition of the present invention may contain a solvent.
  • a solvent included, the protein of the present invention may be dissolved, suspended, liposomed, or emulsified in the solvent.
  • solvents include water for injection, physiological saline, phosphate buffer, oil, and the like.
  • Vaccine compositions of the invention may include excipients, buffers, preservatives, surfactants, thickeners, pH adjusters and/or tonicity agents.
  • Excipients include sucrose, mannose, trehalose, and the like.
  • buffer include phosphoric acid, citric acid, or salts thereof.
  • preservatives include paraoxybenzoic acid esters.
  • surfactant include polysorbates and polyoxyethylene alkyl sulfate salts.
  • thickeners include carmellose sodium, carboxyvinyl polymer, and the like.
  • pH adjuster include glycine, hydrochloric acid, sodium hydroxide, and the like.
  • tonicity agents include sodium chloride, glucose, and the like.
  • the vaccine composition of the invention may also contain the protein of the invention as the only adjuvant.
  • the vaccine composition of the invention may contain an adjuvant other than the protein of the invention.
  • Other adjuvants include aluminum chloride, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, and the like.
  • Methods for administering the vaccine composition of the present invention include subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration, intradermal administration, nasal administration, inhalation, intratumoral administration, and intravesical injection. Among these, intravenous, intradermal, subcutaneous, intratumor, and intravesical are preferred.
  • subjects to which the vaccine composition of the present invention is administered include mammals. Among these, humans, dogs, cats, cows, pigs, goats, sheep, and monkeys (primates other than humans) are preferred, and humans are particularly preferred.
  • a seventh aspect of the present invention is a pharmaceutical composition comprising a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof.
  • the seventh other aspect of the present invention is a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof for use as a medicine.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or variants thereof include those similar to those in the first embodiment.
  • the pharmaceutical composition or protein of the present invention can act as a medicine for various diseases.
  • the pharmaceutical composition or protein of the present invention can be preferably used for the treatment, inhibition of progression, and prevention of infection of cancer, viral infections, and bacterial infections, and is more preferably used for the treatment and inhibition of cancer progression.
  • the pharmaceutical composition or protein of the present invention can be suitably used for suppressing tumor growth, preventing viral infection or bacterial infection, and alleviating symptoms. Among these, it can be preferably used for suppressing tumor growth. It is believed that the pharmaceutical composition or protein of the present invention can treat various diseases by enhancing cell-mediated immunity (in particular, immune responses by antigen-specific killer T cells) against the diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably contains an immunizing antigen against the target disease.
  • an immunizing antigen there are no particular restrictions on the immunizing antigen, and a known antigen may be selected as appropriate depending on the purpose.
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably contains a protein expressed in tumor cells or a fragment thereof as an antigen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention also contains immunogenic antigens against cancer, viral infections, and bacterial infections (e.g., proteins or fragments thereof expressed in cancer cells, viruses, or bacteria that cause these diseases, preferably proteins or fragments thereof). (proteins or fragments thereof that are expressed in cancer cells, viruses, or bacteria that cause diseases, but not in normal cells), and more preferably contain immunogenic antigens against cancer, including malignant melanoma.
  • the protein of the present invention is preferably used (administered) together with an immunizing antigen for a target disease.
  • immunizing antigen examples include those mentioned above.
  • the protein of the present invention functions not as an immunizing antigen but as an adjuvant for enhancing cellular immunity. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention contains a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof as an adjuvant for enhancing cellular immunity.
  • the immunizing antigen preferably contained in the pharmaceutical composition of the present invention is a substance (such as a protein) other than a protein or a variant thereof having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a solvent.
  • a solvent included, the protein of the present invention may be dissolved, suspended, liposomed, or emulsified in the solvent.
  • solvents include water for injection, physiological saline, phosphate buffer, oil, and the like.
  • compositions of the invention may include excipients, buffers, preservatives, surfactants, thickeners, pH adjusters and/or tonicity agents.
  • Excipients include sucrose, mannose, trehalose, and the like.
  • buffer include phosphoric acid, citric acid, or salts thereof.
  • preservatives include paraoxybenzoic acid esters.
  • surfactant include polysorbates and polyoxyethylene alkyl sulfate salts.
  • thickeners include carmellose sodium, carboxyvinyl polymer, and the like.
  • pH adjuster include glycine, hydrochloric acid, sodium hydroxide, and the like.
  • tonicity agents include sodium chloride, glucose, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain drugs other than the protein of the present invention.
  • the drug is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended medical use. Examples include drugs or active ingredients thereof that are effective in treating, inhibiting the progression of, and preventing infection of cancer, viral infections, and bacterial infections.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used in combination with other drugs.
  • Other drugs include, for example, drugs effective in treating cancer, viral infections, bacterial infections, inhibiting their progression, and preventing infections.
  • Other examples include immune checkpoint inhibitors and cancer chemotherapy agents. Among these, immune checkpoint inhibitors are preferred. Immune checkpoint inhibitors include those mentioned above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered before administration of other drugs, may be administered simultaneously with administration of other drugs, or may be administered sequentially before or after administration of other drugs, It may also be administered after administration of other drugs.
  • Methods for administering the pharmaceutical composition of the present invention include subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration, intradermal administration, nasal administration, inhalation administration, intratumoral administration, and intravesical administration. Among these, intravenous administration, intradermal administration, subcutaneous administration, intratumoral administration, and intravesical administration are preferred, and intravenous administration, intradermal administration, and subcutaneous administration are more preferred.
  • subjects to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered include mammals. Among these, humans, dogs, cats, cows, pigs, goats, sheep, and monkeys (primates other than humans) are preferred, and humans are particularly preferred.
  • An eighth aspect of the present invention is the use of a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 4 or a variant thereof in the production of an adjuvant composition (adjuvant formulation) for enhancing cellular immunity.
  • an adjuvant composition adjuvant formulation
  • Examples of the protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or variants thereof include those similar to those in the first embodiment.
  • the protein of the present invention can be suitably used for producing an adjuvant composition for enhancing cellular immunity.
  • a ninth aspect of the present invention is the use of a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof in the production of a vaccine composition (vaccine formulation).
  • a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or variants thereof include those similar to those in the first or sixth embodiment.
  • the protein of the present invention can be suitably used for producing vaccine compositions.
  • a tenth aspect of the present invention is the use of a protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof in the manufacture of a medicament.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or variants thereof include those similar to those in the first or seventh aspect.
  • the protein of the present invention can be suitably used in the production of medicines (pharmaceutical compositions).
  • CFP As an example of a method for preparing CFP, after floating culture in Sorton's medium, proteins contained in the filtrate are sterilized by centrifugation and filtration, partially concentrated by ultrafiltration, precipitated with 50% saturated ammonium sulfate, and ammonium sulfate is removed by dialysis.
  • CFP can be obtained by excluding .
  • CFP can also be obtained by concentrating the culture filtrate using an ultrafiltration membrane, but the concentration method is not limited to these. Thereafter, the obtained CFP is fractionated and purified using column chromatography or the like to obtain a single protein.
  • CFP can be purified using several types of column chromatography to a single band on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • Examples of combinations of column chromatography include hydrophobic interaction chromatography ⁇ anion exchange chromatography ⁇ gel filtration column chromatography, or hydrophobic interaction chromatography ⁇ anion exchange chromatography ⁇ affinity chromatography using a lectin-bound carrier.
  • each of the obtained proteins is evaluated in an in vitro cytokine (interferon ⁇ , interleukin 2) production assay system to screen for proteins that enhance cytokine production.
  • cytokine interferon ⁇ , interleukin 2
  • Those that have been confirmed to have enhanced cytokine production will be screened for those that enhance cell-mediated immunity using a killer T cell assay system in mice. Confirm the amino acid sequence of the protein obtained as a result of screening.
  • MPB63 MPT63
  • MPB44 MPB44
  • MPB53 MPB64 proteins
  • MPT63 and MPT53 proteins can be obtained by purification from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate according to the method described in Nagai et al. Infect. Immun. 59: 372-382 (1991) (Non-Patent Document 1). You can also do it.
  • MPB63, MPB44, MPB53 and MPB64 can be obtained by PCR using BCG or Mycobacterium tuberculosis genomic DNA as a template and primers with known nucleotide sequences. It can also be obtained by chemically synthesizing a DNA fragment having a nucleotide sequence deduced from a known amino acid sequence.
  • a DNA fragment containing the gene is detected by Southern blotting, cloned into Escherichia coli, etc., and detected by colony hybridization. It can also be obtained by selecting colonies in which a DNA fragment containing the gene has been cloned.
  • an open reading frame sequence of the gene was inserted downstream of the transcription promoter and Shine-Dalgarno sequence that function in acid-fast bacteria, and a transcription terminator was connected immediately after.
  • the expression plasmid obtained by inserting the expression cassette into a plasmid such as pSO246 that can be replicated by acid-fast bacteria is introduced into acid-fast bacteria such as BCG or M. smegmatis by electroporation to obtain transformed bacteria.
  • the transformed bacteria can be purified by operations such as column chromatography from the culture supernatant obtained by floating culture on Sorton's medium.
  • Promoters used in expression vectors include, but are not limited to, sequences in regions that are recognized by the RNA polymerase of acid-fast bacteria and initiate transcription, such as the SP2, Ag85B, and hsp60 genes.
  • As the expression vector not only plasmids capable of replicating in acid-fast bacteria other than pSO246 but also bacteriophage and the like can be used.
  • the expression hosts were BCG and M.
  • the present invention is not limited to Smegmatis, and non-tuberculous acid-fast bacteria such as Mycobacterium avium-intracellulare complex and Mycobacterium kansasii can also be used.
  • a method for screening CFP and proteins purified from CFP for those capable of activating CD8-positive T cells is to use mouse bone marrow-derived dendritic cells and OT1 (OVA-specific killer T cell T cell receptor gene transgenic) mice. Origin [K A Hogquist et al. Cell. 14;76(1):17-27 (1994)], OVA alone or OVA and an adjuvant candidate protein were added to a system in which CD8-positive cells derived from splenocytes were co-cultured, and interferon from OVA-specific killer T cells was cultured.
  • cytokine production such as ⁇ and interleukin-2 using Enzyme-Linked immunosorbent assay (ELISA) can be mentioned. This makes it possible to examine the effect of enhancing killer T cell induction.
  • cytokine production was evaluated in a system in which splenocytes from mice immunized with these proteins together with CFA were co-cultured with the mouse bone marrow-derived dendritic cells described above. The effect of enhancing killer T cell activity can also be investigated by doing this.
  • GM10 cells having MHC molecules of C57BL/6 mice of PepA (MTB32: Mycobacterium tuberculosis antigen
  • MTB32 Mycobacterium tuberculosis antigen
  • a synthetic peptide of the above killer T cell epitope examples include, but are not limited to, a method in which the number of target cells killed by the induced antigen-specific killer T cells is measured using a flow cytometer.
  • killer T cells can be induced against the antigen protein originally secreted by the bacterium.
  • the effect of enhancing T cells can be investigated in the same manner as above using a synthetic peptide of the killer T cell epitope possessed by the anti
  • Example 1 ⁇ Purification of MPB63, MPB44, MPB53, MPB64 from BCG culture filtrate> (1-1) Preparation of CFP from BCG culture filtrate As a starting material, BCG bacteria: M. bovis BCG Tokyo 172 (ATCC35737) was used.
  • the above BCG bacteria were grown in Soton liquid medium (medium composition: L-asparagine monohydrate: 4 g/L, magnesium sulfate heptahydrate: 0.5 g/L, dipotassium hydrogen phosphate: 0.5 g/L, Acid monohydrate: 2.0 g/L, iron (III) ammonium citrate: 0.05 g/L, glycerin: 60.0 g/L, calcium chloride: 7 mg/L, zinc sulfate heptahydrate: 0. 7 mg/L, copper (II) sulfate: 0.28 mg/L, pH 7.0) at 37° C. until the early stationary phase as a bacterial film on the surface of the medium.
  • Soton liquid medium medium composition: L-asparagine monohydrate: 4 g/L, magnesium sulfate heptahydrate: 0.5 g/L, dipotassium hydrogen phosphate: 0.5 g/L, Acid monohydrate: 2.0 g/L, iron (III
  • the cultured cells were centrifugally filtered to obtain a culture filtrate.
  • 80 L of the culture filtrate was ultrafiltered using an ultrafiltration membrane (Pelicon casette, 5kDa, Merck Millipore), and the obtained captured fraction was then filtered using an ultrafiltration membrane (vivaflow50, 5kDa, Sartorius).
  • Ultrafiltration yielded 40 mL of captured fraction.
  • 40 mL of saturated ammonium sulfate solution was slowly added to the captured fraction, stirred at 9°C for 1 hour, and then allowed to stand at 9°C for 16 hours. This solution was transferred to a centrifuge container and centrifuged at 10,440 ⁇ g and 4° C.
  • fractionation was performed by lectin chromatography (ConA Sepharose 4B, Cytiva) using a concanavalin A (ConA)-bound carrier, and fractions not bound to ConA were collected, and further anion exchange chromatography was performed using a DEAE carrier to obtain 30 mM Fractionation was performed in a stepwise manner using Tris-HCl buffer (pH 8.7, 3% methyl cellosolve) with sodium chloride added to concentrations of 50 and 75 mM as an eluent. A 75mM sodium chloride fraction was collected as a fraction containing MPB64. Finally, the fraction separated by gel filtration chromatography using PBS was filtered and concentrated, and then the protein concentration was measured using Pierce BCA Protein Assay Kit to obtain 21.4 mg of MPB64.
  • Tris-HCl buffer pH 8.7, 3% methyl cellosolve
  • FIG. 3 shows an electrophoresis image after CBB staining.
  • the spot corresponding to MPB44 is It was confirmed that the color was getting darker. From the above results, it was confirmed that the protein purified in 1-2-2 was MPB44.
  • Example 2 ⁇ Expression and purification of recombinant MPB63 (rMPB63), recombinant MPB44 (rMPB44), recombinant MPB53 (rMPB53), and recombinant MPB64 (rMPB64) in acid-fast bacteria>
  • the restriction enzyme NdeI recognition sequence (CATATG) was placed at the N-terminal position of the gene, and a His tag (6 histidine residues A gene fragment in which a gene, a termination codon, and a restriction enzyme BamHI recognition sequence (GGATCC) were added was artificially synthesized (SEQ ID NOs: 9 to 12), and a plasmid was prepared by cloning into Escherichia coli pUC57 (GenScript). The target gene was excised from these plasmids using NdeI and BamHI to prepare four types of gene fragments.
  • KpnI (3713) to BamHI (163) of the pSO246-ACE-hupB (Rv2986c)-His6 plasmid 8024 bp: sequence 16 described in the document shown in Figure 4 of the prior patent document (JP 2019-208430)
  • This plasmid was cut with BamHI, the ends were made blunt with Klenow fragment, and the plasmid was religated to delete the BamHI site.
  • the plasmid was cut with KpnI to prepare vector DNA.
  • it contains the M. smegmatis-derived SP2 promoter sequence [Spratt et al. FEMS Microbiol Lett.
  • Insert DNA was prepared by cutting out a small fragment obtained by cutting with KpnI from the pA717N plasmid, in which a 395 bp KpnI fragment (SEQ ID NO: 14) was artificially synthesized and cloned into the KpnI site of pUC18. These vectors and inserts were ligated to prepare pSO ⁇ Bam6His plasmid (see Figure 4-1).
  • the grown colonies were picked up, subcultured onto a new OADC-containing Middlebrook 7H10 agar medium (containing 50 ⁇ g/mL kanamycin), and cultured at 37° C. for 2 days.
  • a small amount of the bacterial cells is inoculated into 20 mL of Sauton's medium and cultured stationary at 37°C for 7 days.
  • a portion of the supernatant was collected, and the concentrated protein mixture was fractionated by SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane, and the reactivity with antibodies was analyzed by Western blotting using an anti-His tag antibody.
  • M. smegmatis clones secreting and expressing each of the four MPB proteins were obtained.
  • a bacterial suspension of the same BCG strain as in 1-1 in 10% glycerin was prepared, and 2 ⁇ g of pSO ⁇ Bam-MPB63, pSO ⁇ Bam-MPB44, pSO ⁇ Bam-MPB53, and pSO ⁇ Bam-MPB64 plasmids were mixed with the above. Transformation was performed by electroporation under the same conditions. Transformants that grew after culturing at 37°C for 3 weeks were selected, subcultured onto a new 7H10-OADC agar medium (containing 50 ⁇ g/mL kanamycin), and cultured at 37°C for 2 weeks.
  • Each culture supernatant was sterilized using a 0.45 ⁇ m filter (Millex-HV filter, Merck), and the supernatant was directly applied to a His Trap FF column (Cytiva).
  • a phosphate buffer (Binding Buffer) was prepared by diluting an 8-fold concentrated phosphate buffer (pH 7.4) in His Buffer Kit (Cytiva) with distilled water at a ratio of 1:7.
  • the His Trap FF column was washed with 5 times the column volume of Milli-Q water, and then equilibrated with 5 times the column volume of Binding Buffer.
  • Elution Buffer was applied to the column five times in 1 mL portions to elute each protein bound to the column. A portion of this solution was collected and subjected to SDS-PAGE to confirm purity, and the reactivity with the anti-His tag antibody was confirmed by Western blotting in the same manner as in 2-1 above ( Figure 5-1). After each solution was concentrated while replacing the buffer with PBS using a centrifugal ultrafiltration membrane (Amicon 10K), the protein concentration was measured using a Pierce BCA Protein Assay Kit. The yield of each purified protein is shown in the table below.
  • adapters PB1 (SEQ ID NO: 15) and PB2 (SEQ ID NO: 16) having cut ends of PpuMI and BamHI were chemically inserted. Synthesized. Using 100 pmol of each of these, the 5' hydroxyl group was phosphorylated with T4 polynucleotide kinase, the enzyme was inactivated by heat treatment at 70° C. for 15 minutes, and then annealing was performed to obtain adapter DNA.
  • NdeI-PpuMI fragment and adapter DNA were ligated to the vector obtained by cutting pSO ⁇ Bam6His with NdeI and BamHI to obtain a natural MPB63 expression plasmid pSO ⁇ Bam-nMPB63 ( Figure 4-4).
  • This plasmid was introduced into M. smegmatis in the same manner as in (2-1) above to obtain a recombinant bacterium, which was then statically cultured for 7 days in Thorton's medium containing kanamycin, and the culture supernatant was collected. This supernatant was sterilized by filtration and then subjected to purification.
  • NdeI-BamHI fragment was obtained by cutting pSO ⁇ Bam-MPB44, which has the MPB44 gene (SEQ ID NO: 10) with a His tag at the C-terminus, with NdeI and BamHI, and a DNA obtained by cutting pUC18 with NdeI and BamHI.
  • the pUC18-MPB44 plasmid was obtained by ligation with the large fragment ( Figure 4-3). This plasmid was digested with XhoI and ApaI, and an approximately 180 bp XhoI-ApaI fragment obtained was separated by agarose gel electrophoresis.
  • adapters APB1 (SEQ ID NO: 17) and APB2 (SEQ ID NO: 17) and APB2 ( SEQ ID NO: 18) was chemically synthesized. Using 100 pmol of each of these, the 5' hydroxyl group was phosphorylated with T4 polynucleotide kinase, the enzyme was inactivated by heat treatment at 70° C. for 15 minutes, and then annealing was performed to obtain adapter DNA.
  • This plasmid was introduced into the BCG Tokyo strain in the same manner as in (2-1) to obtain a recombinant bacterium, which was then statically cultured for 30 days in a kanamycin-containing Sorton's medium, and the culture supernatant was collected. This supernatant was sterilized by filtration and then subjected to purification.
  • the protein sample was subjected to SDS-PAGE in the same manner as in 1-3-2 above, and the reactivity with the anti-MPB63 antibody (rMPB63-derived rabbit IgG antibody obtained in 2-2 above) was determined by Western blotting in the same manner as in 2-1 above. Confirmed ( Figure 5-1). (2-4-2) Purification of natural rMPB44 240 mL of the culture supernatant obtained in 2-3 above was concentrated and buffer replaced. Next, anion exchange chromatography using DEAE carrier was performed, and fractionation was performed using 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) with sodium chloride added to a concentration of 20 mM as an eluent.
  • Example 3 ⁇ Construction of an in vitro cytokine assay system using mouse bone marrow-derived dendritic cells> (3-1) Evaluation of OVA-specific CD8-positive T cell activation enhancement effect by CFP (reference example) Mouse bone marrow-derived dendritic cells (BMDC) were obtained by the following method. Bone marrow cells were collected from the bone marrow of a C57BL/6j mouse (Japan SLC).
  • dendritic cell induction medium (10 ng/mL Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor, 4 ng/mL Recombinant Mouse Interleukin-4, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1000 U/mL penicillin-streptomycin, 55 ⁇ M
  • the cells were plated at 1 ⁇ 10 6 cells/mL in RPMI 1640 containing 2-mercaptoethanol and cultured for 7 days in a 5% CO 2 environment. On the third day after the start of culture, floating cells were removed and replaced with the same amount of new dendritic cell induction medium. On the 6th day after the start of culture, only non-adherent cells were collected. The collected cells were adjusted with a dendritic cell induction medium to a concentration of 1.5-2.0 ⁇ 10 6 cells/mL and seeded on a Petri dish. Seven days after the start of culture, only floating cells were collected and used as BMDC.
  • OT1-CD8 T cells were obtained by the following method. Spleen cells were collected from the spleen of an OT1 mouse (a transgenic mouse that specifically recognizes the OVA epitope) (OT1 mice are available from Jackson Laboratories, etc.). After hemolyzing the spleen cells, CD8-positive T cells were collected using the EasySep Mouse CD8 + T cell isolation kit (Veritas) and designated as OT1-CD8 T cells. The EasySep Mouse CD8 + T cell isolation kit was used according to the instructions in the kit's instructions. Through the above steps, CD8 + T cells that specifically recognize OVA were obtained.
  • an OVA/CFP group Using the BMDCs and CD8 + T cells obtained above, an OVA/CFP group, a non group, and an OVA/PBS group were prepared according to the following procedures.
  • the OVA/CFP group is an adjuvanted group.
  • the OVA/CFP group was obtained by the following method. B in RPMI medium (RPMI1640 containing 10% FBS, 1000 U/mL penicilline-streptomycin, 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol) supplemented with 10 ⁇ g/mL OVA (Sigma-Aldrich) and 200 ⁇ g/mL culture filtrate protein (CFP).
  • the cells were adjusted to x10 6 cells/mL and plated at 200 ⁇ L/well in a U-bottomed 96-well plate (5 wells/group). The cells were cultured for 24 hours in a 5% CO 2 environment. Mitomycin C was added at 50 ⁇ g/mL 45 minutes before the end of the culture. After the culture was completed, the cells were washed three times with RPMI medium. OT1-CD8 T cells were added at 5 ⁇ 10 5 cells/well to a 96-well plate containing 2 ⁇ 10 5 cells/well of the obtained BMDCs (BMDCs cultured with the addition of OVA and CFP) in a 5% CO 2 environment. Samples of the OVA/CFP group were obtained by culturing for 24 hours under the following conditions.
  • the non group is an untreated group.
  • the non group was obtained by the following method.
  • BMDCs were adjusted to 1 ⁇ 10 6 cells/mL in RPMI medium to which neither OVA nor CFP was added, and were seeded at 200 ⁇ L/well in a U-bottomed 96-well plate (5 wells/group).
  • the cells were cultured for 24 hours in a 5% CO 2 environment.
  • Mitomycin C was added at 50 ⁇ g/mL 45 minutes before the end of the culture. After the culture was completed, the cells were washed three times with RPMI medium.
  • OT1-CD8 T cells were added at 5 ⁇ 10 5 cells/well to a 96-well plate containing 2 ⁇ 10 5 cells /well of the obtained BMDCs (BMDCs cultured without the addition of OVA and CFP), and incubated with 5% CO 2 .
  • a sample of the non group was obtained by culturing in an environment for 24 hours.
  • the OVA/PBS group is a control group for comparison with the OVA/BMDC group.
  • the OVA/PBS group was obtained by the following method. BMDCs were adjusted to 1 ⁇ 10 6 cells/mL in RPMI medium supplemented with 10 ⁇ g/mL OVA but not CFP, and seeded at 200 ⁇ L/well in a U-bottomed 96-well plate (5 wells/group). . The cells were cultured for 24 hours in a 5% CO 2 environment. Mitomycin C was added at 50 ⁇ g/mL 45 minutes before the end of the culture. After the culture was completed, the cells were washed three times with RPMI medium.
  • OT1-CD8 T cells were added at 5 ⁇ 10 5 cells/well to a 96-well plate containing 2 ⁇ 10 5 cells/well of the obtained BMDCs (BMDCs cultured with the addition of OVA only) under a 5% CO 2 environment.
  • a sample of the OVA/PBS group was obtained by culturing for 24 hours.
  • the amount of IL-2 in the sample supernatant of each group after culture was measured using the ELISA method (Mouse IL-2 Duoset ELISA, R&D Systems). ELISA was performed according to the kit instructions. The amount of IL-2 produced was compared between the control group (OVA/PBS group) and the CFP group (OVA/CFP group). As a result, a significant increase in IL-2 production was observed in the CFP-added group, suggesting an increase in the antigen-presenting ability of BMDC (6-1 in FIG. 6).
  • Example 4 ⁇ Evaluation of OVA-specific killer T cell induction activity in mice> (4-1) Enhancement of OVA-specific killer T cell induction by CFP (reference example) Effector cells were obtained by the following method. PBS containing 100 ⁇ g/mL OVA and 2000 ⁇ g/mL CFP was subcutaneously inoculated into the left ventral region of C57BL/6j mice in an amount of 100 ⁇ L/mouse on days 0 and 10. Spleen cells were collected from the inoculated mice on day 17. EG7 cells (used after culturing with 50 ⁇ g/mL mitomycin C for 45 minutes and washing three times) were used as the antigen.
  • EG7 cells are cells in which OVA protein is expressed by introducing the OVA gene into EL4 cells (thymic lymphoma cells) (purchased from ATCC).
  • EL4 cells thymic lymphoma cells
  • a mixture of 5 ⁇ 10 6 cells/mL inoculated mouse-derived splenocytes and 2.5 ⁇ 10 5 cells/mL antigen was cultured in RPMI culture medium in a 5% CO 2 environment for 5 days. After culturing, floating cells were collected, and lymphocytes were collected using Lympholite M Cell separation Media (Cedarlane Laboratories) to form effector cells (OVA/CFP inoculated group). Lympholite M Cell separation Media was processed according to the instructions.
  • control group was subcutaneously inoculated with 100 ⁇ g/mL OVA-containing PBS (instead of OVA- and CFP-containing PBS) in an amount of 100 ⁇ L/mouse, and then cells were obtained in the same manner as above (OVA/PBS inoculation group).
  • Target cells were obtained by the following method.
  • EL4 cells thymic lymphoma cells, purchased from Public Health England
  • EG7 cells cells in which OVA protein was expressed by introducing the OVA gene into EL4 cells
  • RPMI medium 2 ⁇ M Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) was added to the collected cells and reacted for 15 minutes at room temperature, washed with RPMI medium, adjusted to a final cell concentration of 2 ⁇ 10 6 cells/mL, and incubated in a 5% CO 2 environment for 30 minutes. Warmed for minutes.
  • CFSE Carboxyfluorescein succinimidyl ester
  • Cytotoxicity assay was performed using the 7AAD/CFSE Cell-Mediated Cytotoxicity assay kit (Cayman Chemical) according to the instructions below. Each cell was seeded at a ratio of Effector cells to Target cells of 3.125:1, 6.25:1, 12.5:1, and 25:1, and cultured for 3 hours in a 5% CO 2 environment. did. After culturing, the culture supernatant was removed, 7AAD was added, and the mixture was allowed to react at 4°C in the dark for 15 minutes. After washing once with Assay Buffer, the percentage of dead cells in the Target cells was measured using FACSCalibur (BD Biosciences).
  • the percentage of dead cells in the target cells was compared between the control group and the OVA/CFP inoculated group in terms of the ratio of each effector cell to target cell. If the ratio of effector cells to target cells is 25:1 and the dead cell ratio is 1.3 times or more in the OVA/CFP inoculated group than in the control group, antigen-specific killer T cells (cytotoxic T It was determined that the activity (cell, CTL) was enhanced. As a result, when EG7 cells expressing OVA protein were used as target cells, the ratio of effector cells to target cells was increased compared to when EL4 cells that did not express OVA protein were used as target cells.
  • the proportion of dead cells in the Target cells increased (7-1 in Figure 7, comparison of results shown by white triangles and black triangles, or comparison of results shown by white circles and black circles).
  • OVA protein antigen-specific CTL activity.
  • the ratio of effector cells to target cells was increased, the percentage of dead cells in the OVA/CFP inoculated group increased compared to the control group, and the mouse survival rate increased. Enhancement of OVA-specific CTL activity in the body was suggested (compare the results shown by black circles and triangles in 7-1 of FIG. 7).
  • the ratio of Effector cells to Target cells was 25:1, the dead cell ratio in the OVA/CFP inoculated group was 2.32 times that in the control group. This revealed that CFP has cell-mediated immunity-inducing adjuvant activity.
  • Example 5 ⁇ Evaluation of PepA (MTB32)-specific killer T cell inducing activity in mice> (5-1) Expression and purification of recombinant PepA (rPepA) in M. smegmatis Amino acid sequence of BCG-derived PepA (Accession No.: BAH24430.1: encodes SEQ ID NO: 19, with a His tag added to the C-terminus) A gene with codons optimized to those commonly used in M. smegmatis was chemically synthesized (SEQ ID NO: 20).
  • the approximately 1 kbp PepA gene fragment obtained by cutting the pSO ⁇ Bam6His plasmid was ligated with the vector DNA fragment obtained by cutting the pSO ⁇ Bam6His plasmid with NdeI and BamHI (see Figure 4A) at 16 °C for 2 hours using a DNA Ligation Kit.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ competent cells (Toyobo) were transformed and kanamycin-resistant recombinant bacteria were selected on LB agar medium containing kanamycin.
  • the recombinant plasmid in which the PepA gene fragment was correctly inserted was extracted from the recombinant bacteria using QIAprep.
  • the pSO ⁇ Bam-PepA plasmid was extracted using the Spin Miniprep Kit ( Figure 8-1).A M. smegmatis bacterial solution was prepared in the same manner as in 2-1 below, and 0.5 ⁇ g of pSO ⁇ Bam-PepA was extracted. The plasmids were mixed and transformed by electroporation under the same conditions as in 2-1. Transformants were selected in the same manner as in 2-1, and recombinant M. smegmatis carrying the pSO ⁇ Bam-PepA plasmid was obtained. I got it.
  • a small amount of the obtained recombinant bacteria was floated and cultured on Sauton's medium in the same manner as in 2-2.
  • the culture supernatant was collected, sterilized, and purified using a His Trap FF column in the same manner as in 2-2.
  • the 8-fold concentrated phosphate buffer (pH 7.4) in His Buffer Kit (Cytiva) was diluted with Milli-Q water at a ratio of 1:7 to 1 mM to prevent autolysis of PepA, a serine protease.
  • a phosphate buffer (Binding Buffer) containing phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) was prepared.
  • washing Buffer and Elution Buffer were prepared by adding 1 mM PMSF to each of the 40 mM imidazole solution and 500 mM imidazole solution prepared in the same manner as in 2-2.
  • An eluate containing rPepA protein was obtained by the same column operation as in 2-2.
  • dialysis was repeated twice with 1 L of PBS at 4°C for 2 hours using a dialysis membrane (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette; Thermo Scientific), and then with 3 L of PBS for 2 days. Dialyzed.
  • the PBS was exchanged and dialysis was repeated twice for 2 hours using 1 L to completely remove the imidazole used for elution.
  • the control group was subcutaneously inoculated with 100 ⁇ L/mouse of 100 ⁇ g/mL rPepA-containing PBS (instead of PepA and MPT63-containing PBS), and then cells were obtained in the same manner as above (PepA/PBS inoculation group).
  • Target cells were obtained by the following method.
  • EL4 cells were cultured in RPMI medium supplemented with 2 ⁇ g/mL GM10 for 90 minutes in a 5% CO 2 environment (GM10-EL4).
  • EL4 cells to which GM10 was not added were cultured in RPMI medium in a 5% CO 2 environment for 90 minutes (EL4).
  • cytotoxicity assay After culturing each cell, it was washed three times, 2 ⁇ M CFSE was added, and then the cells were obtained in the same manner as in 4-1 above.
  • For the cytotoxicity assay seed the effector cells and target cells at a ratio of 6.25:1, 12.5:1, 25:1, and 50:1, and perform the cytotoxicity assay in the same manner as in 4-1 above. went.
  • the ratio of effector cells to target cells is 50:1 and the dead cell ratio is 1.3 times or more compared to the control group, it is determined that antigen-specific cytotoxic T cell (CTL) activity has been enhanced. did.
  • CTL cytotoxic T cell
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (PepA)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is lower than that of rPepA.
  • /MPT63 inoculation group was 1.63 times that of the control group (9-1 in Figure 9). This suggested that the rPepA/MPT63 inoculated group enhanced PepA-specific CTL activity in mice in vivo.
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (PepA)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is rPepA/ It was 2.63 times higher in the MPB44-inoculated group than in the control group (9-2 in Figure 9). This suggested that the rPepA/MPB44 inoculated group enhanced PepA-specific CTL activity in mice in vivo.
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (PepA)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is rPepA/ It was 2.73 times higher in the MPB64-inoculated group than in the control group (9-4 in Figure 9). This suggested that the rPepA/MPB64 inoculated group enhanced PepA-specific CTL activity in mice in vivo.
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (PepA)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is rPepA/
  • the rate in the rMPB63-inoculated group was 1.99 times that in the control group (9-5 in Figure 9). This suggested that the rPepA/rMPB63 inoculated group enhanced PepA-specific CTL activity in mice in vivo.
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (PepA)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is rPepA/
  • the rate in the rMPB44-inoculated group was 1.59 times that in the control group (9-6 in Figure 9). This suggested that the rPepA/rMPB44 inoculated group enhanced PepA-specific CTL activity in mice in vivo.
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (PepA)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is rPepA/ It was 2.11 times higher in the rMPB53-inoculated group than in the control group (9-7 in Figure 9). This suggested that the rPepA/rMPB53 inoculated group enhanced PepA-specific CTL activity in mice in vivo.
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (PepA)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is rPepA/ It was 1.63 times higher in the rMPB64-inoculated group than in the control group (9-8 in Figure 9). This suggested that the rPepA/rMPB64 inoculated group enhanced PepA-specific CTL activity in mice in vivo.
  • Example 6 ⁇ Evaluation of melanoma-specific killer T cell induction activity in mice> (6-1) Enhancement of melanoma-specific killer T cell induction by CFP (reference example)
  • a B16F10 cell lysate used as an antigen was obtained by the following method.
  • B16F10 cells (mouse melanoma cells, purchased from ATCC) were cultured in a DMEM medium (DMEM containing 10% FBS, 1000 U/mL penicillin-streptomycin, 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol) in a 5% CO 2 environment.
  • DMEM medium DMEM containing 10% FBS, 1000 U/mL penicillin-streptomycin, 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol
  • Proliferated B16F10 cells were collected, washed three times with PBS, adjusted to 1 ⁇ 10 8 cells (number of living cells + number of dead cells)/mL, and stored frozen at -80°C.
  • a B16F10 cell solution that had been cryopreserved within one week prior to use in the experiment was thawed on ice and disrupted using ultrasound.
  • Ultrasonic treatment Bioruptor UCD-250, Cosmo Bio Inc.
  • Level M (30 seconds of ultrasound and 30 seconds of no treatment were repeated). After ultrasonication, the mixture was centrifuged at 14,000 ⁇ g and 4° C. for 15 minutes, and the supernatant was collected to obtain a B16F10 cell lysate.
  • Effector cells were prepared according to method 4-1, except that 100 ⁇ L (disintegrated solution equivalent to 1 ⁇ 10 7 B16F10 cells)/mL B16F10 cell disrupted solution was used instead of OVA as the antigen to be inoculated into mice, and 2000 ⁇ g/mL was used. Mice were inoculated at a volume of 100 ⁇ L/mouse using PBS mixed with CFP. The collected splenocytes were cultured in RPMI medium supplemented with 10 ⁇ g/mL TRP2 (antigen of B16F10) peptide (SVYDFFVWL) and obtained in the same manner as in 4-1 above (B16 lys/CFP inoculated group).
  • the control group was subcutaneously inoculated with 100 ⁇ L/mouse of PBS containing 100 ⁇ L/mL B16F10 cell disruptant (instead of B16F10 cell disruptant and CFP-containing PBS), and then cells were obtained in the same manner as above (B16 lys/PBS inoculation group).
  • Target cells were obtained by the following method. B16F10 cells were cultured in DMEM medium, and EL4 cells were cultured in RPMI medium under a 5% CO 2 environment. The proliferated cells were collected and target cells were obtained in the same manner as in 4-1 above.
  • cytotoxicity assay For the cytotoxicity assay, seed the effector cells and target cells at a ratio of 6.25:1, 12.5:1, 25:1, and 50:1, and perform the cytotoxicity assay in the same manner as in 4-1 above. went. When the ratio of effector cells to target cells is 50:1 and the dead cell ratio is 1.3 times or more compared to the control group, it is determined that antigen-specific cytotoxic T cell (CTL) activity has been enhanced. did.
  • CTL cytotoxic T cell
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (B16F10 cell)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is It was 1.73 times higher in the cell lysate/CFP inoculated group than in the control group (10-1 in Figure 10). This suggests that the B16F10 cell lysate/CFP inoculated group enhances B16F10 cell-specific CTL activity in mice.
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (B16F10 cell)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is It was 1.68 times higher in the cell homogenate/MPT63 inoculated group than in the control group (10-2 in Figure 10). This suggested that the B16F10 cell lysate/MPT63 inoculated group enhanced B16F10 cell-specific CTL activity in mice.
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (B16F10 cell)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is
  • the cell homogenate/MPB44 inoculated group was 1.86 times that of the control group (10-3 in Figure 10). This suggests that the B16F10 cell lysate/MPB44 inoculated group enhances B16F10 cell-specific CTL activity in mice.
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (B16F10 cell)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is
  • the cell homogenate/MPB53 inoculated group was 1.42 times that of the control group (10-4 in Figure 10). This suggests that the B16F10 cell lysate/MPB53 inoculated group enhances B16F10 cell-specific CTL activity in mice.
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (B16F10 cell)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is It was 1.61 times higher in the cell homogenate/rMPB63 inoculated group than in the control group (10-6 in Figure 10). This suggests that the B16F10 cell lysate/rMPB63 inoculated group enhances B16F10 cell-specific CTL activity in mice.
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (B16F10 cell)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is It was 1.68 times higher in the cell homogenate/rMPB44 inoculated group than in the control group (10-7 in Figure 10). This suggested that the B16F10 cell lysate/rMPB44 inoculated group enhanced B16F10 cell-specific CTL activity in mice.
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (B16F10 cell)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is It was 1.62 times higher in the cell homogenate/rMPB53 inoculated group than in the control group (10-8 in Figure 10). This suggests that the B16F10 cell lysate/rMPB53 inoculated group enhances B16F10 cell-specific CTL activity in mice.
  • the CTL contained in Effector cells has antigen (B16F10 cell)-specific CTL activity, and furthermore, when the ratio of Effector cells to Target cells is 50:1, the dead cell ratio is It was 1.77 times higher in the cell homogenate/rMPB64 inoculated group than in the control group (10-9 in Figure 10). This suggests that the B16F10 cell lysate/rMPB64 inoculated group enhances B16F10 cell-specific CTL activity in mice.
  • Example 7 ⁇ Evaluation of EG7 tumor growth inhibitory activity> (7-1) Evaluation of EG7 tumor growth suppressive activity by CFP in mice (vaccine, reference example) PBS containing 100 ⁇ g/mL OVA and 2000 ⁇ g/mL CFP was subcutaneously inoculated into the left ventral region of C57BL/6j mice in an amount of 100 ⁇ L/mouse on days 0 and 10. On day 17, EG7 cells (cells in which OVA protein was expressed by introducing the OVA gene into EL4 cells (thymic lymphoma cells)) were injected at 1 ⁇ 10 6 cells/mouse into the left ventral region other than the OVA inoculation site. Administered intravenously.
  • Tumor diameter and body weight were measured over time until 21 days after administration of EG7 cells.
  • As a humane endpoint if the body weight decreased by 10% or more in one week, the animal was considered dead and the animal was euthanized by over-anesthesia.
  • As a result a decrease in tumor diameter was observed in the OVA/CFP inoculated group compared to the control group, suggesting that inoculation of CFP at the same time as the antigen enhances antitumor activity (11-1 in Figure 11). 1).
  • Example 8 ⁇ Evaluation of tumor growth suppressive activity using B16F10 melanoma cells (effectiveness as a vaccine)> (8-1) Evaluation of B16F10 tumor growth suppressive activity by CFP in mice (vaccine, reference example) A B16F10 cell lysate used as an antigen was obtained in the same manner as in 6-1 above. C57BL/6j mice were inoculated in the same manner as in 7-1 above, using 100 ⁇ L (1 ⁇ 10 7 cells)/mL B16F10 cell lysate instead of OVA as the antigen. On day 17, B16F10 cells were inoculated intradermally at 1 ⁇ 10 5 cells/mouse, and comparisons were made in the same manner as in 7-1 above.
  • Colon-26 cell lysate used as an antigen was obtained by the following method.
  • Colon-26 cells mouse colon cancer cells, purchased from Medical Cell Resource Center, Institute of Development and Aging, Tohoku University
  • RPMI medium in a 5% CO 2 environment.
  • a lysate of the proliferated Colon-26 cells was obtained in the same manner as in 6-1 above.
  • C57BL/6j mice were inoculated in the same manner as in 7-1 above, using 100 ⁇ L (1 ⁇ 10 7 cells)/mL Colon-26 cell lysate instead of OVA as the antigen.
  • Colon-26 cells were intradermally inoculated at 2.5 ⁇ 10 5 cells/mouse, and comparisons were made in the same manner as in 7-1 above.
  • a decrease in tumor diameter was observed in the Colon-26 cell lysate/CFP inoculated group compared to the control group, suggesting that simultaneous inoculation with CFP enhanced antitumor activity (Figure 13 13-1).
  • Example 10 ⁇ Evaluation of tumor growth suppressive activity using EG7 cells (effect as a therapeutic drug)> (10-1) Evaluation of EG7 tumor growth suppressive activity by CFP in mice (therapeutic drug, reference example) EG7 cells (cells in which OVA protein was expressed by introducing the OVA gene into EL4 cells (thymic lymphoma cells)) were intradermally administered to the left ventral region of C57BL/6j mice at 1 ⁇ 10 6 cells/mouse. On days 7, 10, 14, 17, 21, and 24 after intradermal administration, 100 ⁇ L/mouse of PBS containing 100 ⁇ g/mL OVA and 2000 ⁇ g/mL CFP was subcutaneously inoculated near the tumor.
  • Tumor diameter and body weight were measured over time until 28 days after administration of EG7 cells.
  • a group to which only OVA was administered was used as a control group for comparison.
  • the body weight decreased by 10% or more in one week, the animal was considered dead and euthanized by over-anesthesia.
  • a decrease in tumor diameter was observed in the OVA/CFP inoculated group compared to the control group, suggesting that the antitumor activity was enhanced by inoculating CFP at the same time as the antigen (14-1 in Figure 14). 1).
  • a protein having adjuvant activity that enhances cellular immunity can be provided. Therefore, the present invention is extremely useful industrially.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of MPB63 Ala Tyr Pro Ile Thr Gly Lys Leu Gly Ser Glu Leu Thr Met Thr Asp Thr Val Gly Gln Val Val Leu Gly Trp Lys Val Ser Asp Leu Lys Ser Ser Thr Ala Val Ile Pro Gly Tyr Pro Val Ala Gly Gln Val Trp Glu Ala Thr Ala Thr Val Asn Ala Ile Arg Gly Ser Val Thr Pro Ala Val Ser Gln Phe Asn Ala Arg Thr Ala Asp Gly Ile Asn Tyr Arg Val Leu Trp Gln Ala Ala Gly Pro Asp Thr Ile Ser Gly Ala Thr Ile Pro Gln Gly Glu Gln Ser Thr Gly Lys Ile Tyr Phe As
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of MPB44 Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr
  • SEQ ID NO: 3 Amino acid sequence of MPB53 Ala Asp Glu Arg Leu Gln Phe Thr Ala Thr Thr Leu Ser Gly Ala Pro Phe Asp Gly Ala Ser Leu Gln Gly Lys Pro Ala Val Leu Trp Phe Trp Thr Pro Trp Cys Pro Phe Cys Asn Ala Glu Ala Pro Ser Leu Ser Gln Val Ala Ala Ala Asn Pro Ala Val Thr Phe Val Gly Ile Ala Thr Arg Ala Asp Val Gly Ala Met Gln Ser Phe Val Ser Lys Tyr Asn Leu Asn Phe Thr Asn Leu Asn Asp Ala Asp Gly Val Ile Trp Ala Arg Tyr Asn Val Pro Trp Gln Pro Ala Phe Val Phe Tyr Arg Ala Asp Gly Thr Ser Thr Phe Val Asn Asn Pro Thr Ala Ala Met Ser Gln Asp Glu Leu Ser Gln Pro Ala Phe Val P
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of MPB64 Ala Pro Lys Thr Tyr Cys Glu Glu Leu Lys Gly Thr Asp Thr Gly Gln Ala Cys Gln Ile Gln Met Ser Asp Pro Ala Tyr Asn Ile Asn Ile Ser Leu Pro Ser Tyr Tyr Pro Asp Gln Lys Ser Leu Glu Asn Tyr Ile Ala Gln Thr Arg Asp Lys Phe Leu Ser Ala Ala Thr Ser Ser Thr Pro Arg Glu Ala Pro Tyr Glu Leu Asn Ile Thr Ser Ala Thr Tyr Gln Ser Ala Ile Pro Pro Arg Gly Thr Gln Ala Val Val Leu Lys Val Tyr Gln Asn Ala Gly Gly Thr His Pro Thr Thr Thr Tyr Lys Ala Phe Asp Trp Asp Gln Ala Tyr Arg Lys Pro Ile Thr Tyr Asp Thr Leu Trp Gln Ala Asp Thr Asp Pro Leu Pro
  • SEQ ID NO: 5 Amino acid sequence of MPB63 precursor Met Lys Leu Thr Thr Met Ile Lys Thr Ala Val Ala Val Val Ala Met Ala Ala Ile Ala Thr Phe Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Ala Tyr Pro Ile Thr Gly Lys Leu Gly Ser Glu Leu Thr Met Thr Asp Thr Val Gly Gln Val Val Leu Gly Trp Lys Val Ser Asp Leu Lys Ser Ser Thr Ala Val Ile Pro Gly Tyr Pro Val Ala Gly Gln Val Trp Glu Ala Thr Ala Thr Val Asn Ala Ile Arg Gly Ser Val Thr Pro Ala Val Ser Gln Phe Asn Ala Arg Thr Ala Asp Gly Ile Asn Tyr Arg Val Leu Trp Gln Ala Ala Gly Pro Asp Thr Ile Ser Gly Ala Thr Ile Ser Gly Ala Thr Ile Pro Gly Glu Gln Ser Thr Gly Ly
  • SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence of MPB44 precursor Met Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly Met Ser Arg Arg Leu Val Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Leu Val Ser Gly Leu Val Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr
  • SEQ ID NO: 7 Amino acid sequence of MPB53 precursor Met Ser Leu Arg Leu Val Ser Pro Ile Lys Ala Phe Ala Asp Gly Ile Val Ala Val Ala Ile Ala Val Val Leu Met Phe Gly Leu Ala Asn Thr Pro Arg Ala Val Ala Ala Asp Glu Arg Leu Gln Phe Thr Ala Thr Thr Leu Ser Gly Ala Pro Phe Asp Gly Ala Ser Leu Gln Gly Lys Pro Ala Val Leu Trp Phe Trp Thr Pro Trp Cys Pro Phe Cys Asn Ala Glu Ala Pro Ser Leu Ser Gln Val Ala Ala Ala Asn Pro Ala Val Thr Phe Val Gly Ile Ala Thr Arg Ala Asp Val Gly Ala Met Gln Ser Phe Val Ser Lys Tyr Asn Leu Asn Phe Thr Asn Leu Asn Asp Ala Asp Gly Val Ile Trp Ala Arg Tyr Asn Val Pro
  • SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence of MPB64 precursor Met Arg Ile Lys Ile Phe Met Leu Val Thr Ala Val Val Leu Leu Cys Cys Ser Gly Val Ala Thr Ala Ala Pro Lys Thr Tyr Cys Glu Glu Leu Lys Gly Thr Asp Thr Gly Gln Ala Cys Gln Ile Gln Met Ser Asp Pro Ala Tyr Asn Ile Asn Ile Ser Leu Pro Ser Tyr Tyr Pro Asp Gln Lys Ser Leu Glu Asn Tyr Ile Ala Gln Thr Arg Asp Lys Phe Leu Ser Ala Ala Thr Ser Ser Thr Pro Arg Glu Ala Pro Tyr Glu Leu Asn Ile Thr Ser Ala Thr Tyr Gln Ser Ala Ile Pro Pro Arg Gly Thr Gln Ala Val Val Leu Lys Val Tyr Gln Asn Ala Gly Gly Thr His Pro Thr Thr Thr Tyr Lys Ala Phe Asp Trp As
  • SEQ ID NO: 9 Base sequence of MPB63 precursor synthesis gene CATATTGAAGCTGACCACCATGATCAAGACCGCCGTCGCCGTCGTCGCCATGGCCGCCATCGCCACGTTCGCCGCCCCCGTCGCCCTCGCCGCCTACCCGATCACCGGCAAGCTGGGCTCGGAGCTGACCATGACCGACACCGTGGGCCAGGTGGTCCTGGGCTGGAAGGTGTCGGACCTGAAGTCGTCGACCGCGGTGATCCCGGGCTACCCGGTGGCCGGCCAGGTCTGGGAGGCCACCGCCACCGTCAAC GCCATCCGCGGCTCGGTGACCCCGGCCGTGTCGCAGTTCAACGCCCGCACCGCCGACGGCATCAACTACCGCGTGCTGTGGCAGGCGGCCGGCCCGGACACCATCTCGGGCGCCACCATCCCGCAGGGCGAGCAGTCGACCGGCAAGATCTACTTCGACGTGACCGGCCCGTCGCCGACCATCGTCGCGATGAACAACGGCATGGAGGACCTGCTGATCTGGGAGCCGCACCACCACC
  • SEQ ID NO: 10 Base sequence of MPB44 precursor synthesis gene 1-6: NdeI site 1018-1035: His tag 1036-1038: End codon 1039-1044: BamHI site
  • SEQ ID NO: 11 Base sequence of MPB53 precursor synthesis gene 1-6: NdeI site 523-540: His tag 541-543 end codon 544-549: BamHI site
  • SEQ ID NO: 12 Base sequence of MPB64 precursor synthesis gene 1-6: NdeI site 778-795: His tag 796-798: End codon 799-804: BamHI site
  • SEQ ID NO: 13 DNA base sequence of multiple cloning site GGATCC CCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCC GGTACC 1-6: BamHI site (underlined) 67-72: KpnI site (underlined)
  • SEQ ID NO: 14 Base sequence of KpnI DNA fragment containing from SP2 promoter to Ag85B terminator GGTACC ATGCAGGTGGCGCGCCGCGGCCTCACCAACGCGATTGTGAGCTATCTCGAGGACAACGGGTCAGGGCGACGTGAGTAACCAGTAACCGGGTTGTGACCTCCCTTGGTAGCGGCATTTCCGCTACCAAAAGGCTGTTGCATATCCCCGTGTGTACGACCAGCACGGCATACTCTAGAAGGAGAAGTACATATGGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGGATCCTCGCGCAACGGTTGCCG CTACTGGGCTTGACGGCAAGACGCCGTACAGTAGTGTGTTCGGCACCTTGAACGCTGGTCCGCCATGTTCAACGAGCCGGTCTACCTGCCGCACCGAACAAGCTGGTGACATCGACCCATGCGGTGC GGTACC 1-6: KpnI site (underlined) 27-180: SP2 promoter region 187-194: SD array 197-244: NdeI-BamHI multiple
  • SEQ ID NO: 15 Base sequence of adapter PB1 GACCTGCTGATCTGGGAGCCGTGAG
  • SEQ ID NO: 16 Base sequence of adapter PB2 GATCCTCAGGCTCCCAGATCAGCAG
  • SEQ ID NO: 17 Base sequence of adapter APB1 CGCGCCCCAGGGCGCCTAGG
  • SEQ ID NO: 18 Base sequence of adapter APB2 GATCCCTAGGCGCCCTGGGGCGCGGGCC
  • SEQ ID NO: 19 Amino acid sequence of PepA precursor protein Met Ser Asn Ser Arg Arg Arg Ser Leu Arg Trp Ser Trp Leu Leu Ser Val Leu Ala Ala Val Gly Leu Gly Leu Ala Thr Ala Pro Ala Gln Ala Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gln Asp Arg Phe Ala Asp Phe Pro Ala Leu Pro Leu Asp Pro Ser Ala Met Val Ala Gln Val Gly Pro Gln Val Val Asn Ile Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Val Gly Ala Gly Thr Gly Ile Val Ile Asp Pro Asn Gly Val Val Leu Thr Asn Asn His Val Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Asn Ala Phe Ser Val Gly Ser Gly Gln Thr Tyr Gly Val Asp Val Val Gly Tyr Asp Arg Thr Gln Asp Val Ala Val Leu Gln Leu Arg Gly Ala
  • SEQ ID NO: 20 Base sequence of PepA precursor protein synthesis gene 1-6: NdeI site 1069-1086: His tag 1087-1089: End codon 1090-1095: BamHI site

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Abstract

本発明は、細胞性免疫を増強するアジュバント活性を有するタンパク質を提供する。具体的には、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む、細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物を提供する。

Description

新規細胞性免疫増強アジュバント
　本発明は、細胞性免疫を増強するアジュバントに関する。
　牛型結核菌弱毒株であるマイコバクテリウム・ツベルクローシス バリアント ボビス ＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）（以下、単にＢＣＧということがある）は、人の結核に対するワクチンとして広く用いられている。結核ワクチンとしての有効性にはＢＣＧ生菌であることが必要であることから、古くから生菌が活発に分泌するタンパク質が重要な免疫反応を担っているのではないかという説がある。その仮説を確かめるために１９８０年代から、結核菌やＢＣＧが分泌するタンパク質の精製とキャラクタリゼーションが精力的に行われた。その結果、Ａｇ８５複合体（Ａｇ８５ ｃｏｍｐｌｅｘ）、“Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ＢＣＧ”（以下、ＭＰＢ）６４、ＭＰＢ６３、ＭＰＢ５３、ＭＰＢ７０、ＭＰＢ８３、Ａｐａ等の様々な抗原タンパク質が単離され（非特許文献１、２）、またそれらの遺伝子のクローニングが次々と行われ（非特許文献３、４）、組換えタンパク質を得る方法が確立されて、それらの免疫誘導能が詳しく調べられた。しかしながら、それらの機能に関してはよくわかっていないものが多い。
　一方、結核菌死菌を含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）は、タンパク抗原に対する優れたアジュバントや、ペプチド抗原に対するキラーＴ細胞誘導アジュバントとして、動物実験には汎用されているが、安全性の観点から人には用いることができない。そこで、ＢＣＧ菌体からタンパク質、核酸を極力除いた細胞壁骨格成分（ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｓｋｅｌｅｔｏｎ： ＣＷＳ）を精製し、抗癌薬としての開発が行われたが（非特許文献５、６）、実用化には至っていない。各国でＢＣＧ生菌の膀胱内注入療法が（非特許文献７）、また米国ではＢＣＧ生菌のメラノーマ病変へのｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ投与による治療が実際に行われている（非特許文献８）。つまり、細胞壁のペプチドグリカン、ミコール酸などの脂質成分、リポマンナン, リポアラビノマンナンなどの糖脂質、ムラミルジペプチドなど、それぞれが自然免疫を増強する作用がある分子を含む細胞壁成分でも、その抗癌作用はＢＣＧ生菌には及ばないため、ＢＣＧ生菌が用いられているのが実情である。
Nagai et al. Infect. Immun. 59: 372-382 (1991) Harboe et al. Infect. Immun. 66: 289-296 (1998) Matsuo et al. J. Bacterial. 170: 3847-3854 (1988) Yamaguchi et al. Infect. Immun. 57: 283-288 (1989) Miyauchi et al. Drug Discoveries Therapeutics. 6:218-225 (2012) Murata M. Cancer Sci. 99: 1435-1440 (2008) Lim et al. Front. Immunol. 11: Article 615091 (2021) Kremenovic et al. J. Intern. Med. 288:625-640 (2020)
　近年、ＢＣＧによる免疫誘導能が再度脚光を浴びており、結核ワクチンとして（静脈注射による結核菌感染の完全な防御、再接種による有効性など）（Darrah et al. Nature. 577 95-102(2020)）だけではなく、その自然免疫誘導能によるｏｆｆ-ｔａｒｇｅｔ効果が報告されている（Cirovic et al. Cell Host Microbes 28:322-334 (2020)）。しかしながら、上述の通り、ＢＣＧ生菌を人に対して頻回投与することは安全性の観点から依然として困難である。従って、ＢＣＧ生菌よりも人に対して安全に投与でき、結核ワクチンや自然免疫誘導能をもつ化合物等に対する大きな需要が存在する。
　また、例えば癌ワクチンによる免疫療法等において、細胞性免疫を増強するアジュバントは必須であるが、これまで上記作用を有する優れたアジュバントは存在しない。従って、優れたアジュバント活性を有するタンパク質及び当該タンパク質を含むアジュバント組成物に対する大きな需要が存在する。
　本発明は、以上の点に鑑みたものであり、細胞性免疫を増強するアジュバント活性を有するタンパク質を提供することを目的とする。
　本発明者は、ＢＣＧの培養ろ液タンパク質（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｉｌｔｒａｔｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ: ＣＦＰ: 生菌から活発に分泌されるタンパク質）が、ＢＣＧ細胞壁成分にはなく、ＢＣＧ生菌には存在することから、これがＢＣＧ生菌とＢＣＧ細胞壁成分での上記抗癌作用の違いをもたらしているのではないかと考え、鋭意努力の結果、ＣＦＰ中に含まれるタンパク質の中から、細胞性免疫を増強するアジュバント活性を有するタンパク質を見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、以下の構成を含む。
〔１〕　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む、細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物。
〔２〕　前記タンパク質又はその変異体が、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、〔１〕に記載のアジュバント組成物。
〔３〕　前記タンパク質が、抗酸菌由来のタンパク質である、〔１〕又は〔２〕に記載のアジュバント組成物。
〔４〕　前記タンパク質が、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）又はマイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）由来のタンパク質である、〔１〕又は〔２〕に記載のアジュバント組成物。
〔５〕　薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、粘着剤、ｐＨ調整剤及び／又は等張化剤を更に含む、〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
〔６〕　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体をコードする核酸配列を有する、前記タンパク質又はその変異体の発現用ベクター。
〔７〕　前記タンパク質又はその変異体が、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、〔６〕に記載のベクター。
〔８〕　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはその変異体をコードする核酸配列が導入されている、又は〔６〕若しくは〔７〕に記載のベクターが導入されている、組換え細菌。
〔９〕　前記組換え菌が、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）から選択される、〔８〕に記載の組換え細菌。
〔１０〕　〔８〕又は〔９〕に記載の組換え細菌由来の配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む、細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物。
〔１１〕　〔８〕又は〔９〕に記載の組換え細菌を培養する工程を有する、細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物の製造方法。
〔１２〕　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体、及びワクチン用免疫抗原を含む、ワクチン組成物。
〔１３〕　前記タンパク質又はその変異体が、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、〔１２〕に記載のワクチン組成物。
〔１４〕　前記ワクチンが、癌に対するワクチンである、〔１２〕又は〔１３〕に記載のワクチン組成物。
〔１５〕　前記ワクチンは、悪性黒色腫、肺癌、大腸癌、膀胱癌から選択される１種又は複数に対するワクチンである、〔１２〕～〔１４〕のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
〔１６〕　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む、医薬組成物。
〔１７〕　前記タンパク質又はその変異体が、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、〔１６〕に記載の医薬組成物。
〔１８〕　腫瘍細胞の増殖抑制に用いるための、〔１６〕又は〔１７〕に記載の医薬組成物。
〔１９〕　前記腫瘍細胞中で発現しているタンパク質又はその断片を抗原として含む、〔１８〕に記載の医薬組成物。
〔２０〕　癌の治療に用いるための、〔１６〕～〔１９〕のいずれか１項に記載の医薬組成物。
〔２１〕　他の薬剤を更に含む、〔１６〕～〔２０〕のいずれか１項に記載の医薬組成物。
〔２２〕　他の薬剤と併用して用いられる、〔１６〕～〔２１〕のいずれか１項に記載の医薬組成物。
〔２３〕　細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物の製造における、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体の使用。
〔２４〕　ワクチン組成物の製造における、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体の使用。
〔２５〕　医薬組成物の製造における、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体の使用。
　本発明によれば、細胞性免疫を増強するアジュバント活性を有するタンパク質を提供することができる。従って、癌やウイルス感染症といったキラーＴ細胞が防御効果に重要な役割を果たすことが明らかになっている疾患の治療やワクチンに好適に用いることができる。また、本発明では、アジュバント活性を有する上記タンパク質を用いるため、ＢＣＧ生菌を投与する必要がなく、安全性の観点でも優れている。
図１は、実施例１の１－２で精製したＭＰＢ６３，ＭＰＴ６３,ＭＰＢ４４，ＭＰＢ５３，ＭＰＴ５３，ＭＰＢ６４のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 図２－１は、実施例１の１－１及び１－２で精製したＣＦＰ，ＭＰＢ６３，ＭＰＴ６３，ＭＰＢ４４，ＭＰＢ５３，ＭＰＴ５３，ＭＰＢ６４のＳＤＳ－ＰＡＧＥ泳動像を示す図である。 図２－２は、実施例１の１－１及び１－２で精製したＣＦＰ，ＭＰＢ６３，ＭＰＴ６３，ＭＰＢ４４，ＭＰＢ５３，ＭＰＴ５３，ＭＰＢ６４のＮａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ泳動像を示す図である。 図３は、実施例１の１－１で精製したＣＦＰと１－２－２で精製したタンパク質の二次元電気泳動像を示す図である。左側の図は、ＣＦＰと１－２－２で精製したタンパク質の混合物を泳動した図であり、右側の図は、ＣＦＰのみを泳動した図である。両図の比較は、１－２－２で精製したタンパク質がＭＰＢ４４であることを示す。 図４－１は、実施例２の２－１で用いた抗酸菌発現ベクターｐＳＯΔＢａｍ―６Ｈｉｓの構築法を示す図である。 図４－２は、実施例２の２－１で記載したＭＰＢ６３，ＭＰＢ６４，ＭＰＢ４４及びＭＰＢ５３分泌発現ベクターの構築法を示す図である。 図４－３は、実施例２の２－３で記載したＭＰＢ６３およびＭＰＢ４４遺伝子をｐＵＣ１８に導入したプラスミドの構築法を示す図である。 図４－４は、実施例２の２－３で記載した天然型ｒＭＰＢ６３分泌発現ベクターの構築法を示す図である。 図４－５は、実施例２の２－３で記載した天然型ｒＭＰＢ４４分泌発現ベクターの構築法を示す図である。 図５－１は、実施例２の２－２で精製した組換えＭＰＢ６３，組換えＭＰＢ４４，組換えＭＰＢ６４及び組換えＭＰＢ５３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ泳動像と抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果と、実施例２の２－４で精製した天然型組換えＭＰＢ６３，天然型組換えＭＰＢ４４のＳＤＳ－ＰＡＧＥ泳動像とそれぞれのウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す図である。 図５－２は、実施例２の２－２で精製した組換えＭＰＢ６３，組換えＭＰＢ４４，組換えＭＰＢ６４及び組換えＭＰＢ５３と実施例２の２－４で精製した天然型組換えＭＰＢ６３，天然型組換えＭＰＢ４４のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 図６は、実施例３におけるマウス骨髄由来樹状細胞を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏサイトカインアッセイの結果を示す図である。図６中、ｎｏｎは未処置群を示し、ＯＶＡ／ＰＢＳは比較対照群を示し、ＯＶＡ／ＣＦＰ、ＯＶＡ／ＭＰＴ６３、ＭＰＢ４４、ＭＰＴ５３及びＭＰＢ６４はそれぞれＣＦＰ（参考例）或いは本発明のアジュバント添加群を示す。 図７は、実施例４におけるＯＶＡ特異的キラーＴ細胞誘導活性試験の結果を示す図である。図７中、ＯＶＡ／ＰＢＳ ＥＧ７はＯＶＡ／ＰＢＳ投与マウス由来Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＥＧ７細胞（Ｔａｒｇｅｔ細胞）との共培養によるＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。ＯＶＡ／ＰＢＳ ＥＬ４はＯＶＡ／ＰＢＳ投与マウス由来Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＥＬ４細胞（Ｔａｒｇｅｔ細胞）との共培養によるＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。ＯＶＡ／ＣＦＰ ＥＧ７はＯＶＡ／ＣＦＰ投与マウス由来Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＥＧ７細胞（Ｔａｒｇｅｔ細胞）との共培養によるＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。ＯＶＡ／ＣＦＰ ＥＬ４はＯＶＡ／ＣＦＰ投与マウス由来Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＥＬ４細胞（Ｔａｒｇｅｔ細胞）との共培養によるＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。縦軸はＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。横軸はＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞と各Ｔａｒｇｅｔ細胞の混合比（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞／Ｔａｒｇｅｔ細胞）を示す。ＣＦＰ（参考例）の代わりにＭＰＴ６３、ＭＰＢ４４、ＭＰＢ５３、ＭＰＢ６４，ｒＭＰＢ６３、ｒＭＰＢ４４、ｒＭＰＢ５３、ｒＭＰＢ６４を用いた場合の結果を７－２～７－９に示す。 図８－１は、実施例５の５－１で用いたＰｅｐＡタンパク質分泌発現ベクターｐＳＯΔＢａｍ－ＰｅｐＡの構築図を示す図である。 図８－２は、実施例５の５－１で精製した組換えＰｅｐＡタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ泳動像を示す図である。 図９は、実施例５におけるＰｅｐＡ（ＭＴＢ３２）特異的キラーＴ細胞誘導活性試験の結果を示す図である。図９中、ＰｅｐＡ／ＰＢＳ ＧＭ１０－ＥＬ４はＰｅｐＡ／ＰＢＳ投与マウス由来Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＧＭ１０－ＥＬ４細胞（Ｔａｒｇｅｔ細胞）との共培養によるＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。ＰｅｐＡ／ＰＢＳ ＥＬ４はＰｅｐＡ／ＰＢＳ投与マウス由来Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＥＬ４細胞（Ｔａｒｇｅｔ細胞）との共培養によるＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。ＰｅｐＡ／ＭＰＴ６３ ＧＭ１０－ＥＬ４はＰｅｐＡ／ＭＰＴ６３投与マウス由来Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＧＭ１０－ＥＬ４細胞（Ｔａｒｇｅｔ細胞）との共培養によるＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。ＰｅｐＡ／ＭＰＴ６３ ＥＬ４はＰｅｐＡ／ＭＰＴ６３投与マウス由来Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＥＬ４細胞（Ｔａｒｇｅｔ細胞）との共培養によるＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。縦軸はＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。横軸はＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞と各Ｔａｒｇｅｔ細胞の混合比（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞／Ｔａｒｇｅｔ細胞）を示す。ＭＰＴ６３の代わりに、ＭＰＢ４４、ＭＰＢ５３、ＭＰＢ６４，ｒＭＰＢ６３、ｒＭＰＢ４４、ｒＭＰＢ５３、ｒＭＰＢ６４を用いた場合の結果を９－２～９－８に示す。 図１０は、実施例６におけるメラノーマ特異的キラーＴ細胞誘導活性試験の結果を示す図である。図１０中、Ｂ１６ ｌｙｓ／ＰＢＳ Ｂ１６Ｆ１０はＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＰＢＳ投与マウス由来Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＢ１６Ｆ１０細胞（Ｔａｒｇｅｔ細胞）との共培養によるＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。Ｂ１６ ｌｙｓ／ＰＢＳ ＥＬ４はＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＰＢＳ投与マウス由来Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＥＬ４細胞（Ｔａｒｇｅｔ細胞）との共培養によるＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。Ｂ１６ ｌｙｓ／ＣＦＰ Ｂ１６Ｆ１０はＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＣＦＰ投与マウス由来Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＢ１６Ｆ１０細胞（Ｔａｒｇｅｔ細胞）との共培養によるＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。Ｂ１６ ｌｙｓ／ＣＦＰ ＥＬ４はＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＣＦＰ投与マウス由来Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＥＬ４細胞（Ｔａｒｇｅｔ細胞）との共培養によるＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。縦軸はＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を示す。横軸はＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞と各Ｔａｒｇｅｔ細胞の混合比（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞／Ｔａｒｇｅｔ細胞）を示す。ＣＦＰ（参考例）の代わりにＭＰＴ６３、ＭＰＢ４４、ＭＰＢ５３、ＭＰＢ６４，ｒＭＰＢ６３、ｒＭＰＢ４４、ｒＭＰＢ５３、ｒＭＰＢ６４を用いた場合の結果を１０－２～１０－９に示す。 図１１は、実施例７におけるＥＧ７細胞に対する抗腫瘍活性試験（予防接種したときのワクチン効果）の結果を示す図である。図１１中、縦軸は腫瘍径（長径×短径）、横軸は腫瘍チャレンジ後の日数を表す。 図１２は、実施例８におけるメラノーマ細胞に対する抗腫瘍活性試験（予防接種したときのワクチン効果）の結果を示す図である。図１２中、縦軸は腫瘍径（長径×短径）、横軸は腫瘍チャレンジ後の日数を表す。 図１３は、実施例９における大腸癌細胞に対する抗腫瘍活性試験（予防接種したときのワクチン効果）の結果を示す図である。図１３中、縦軸は腫瘍径（長径×短径）、横軸は腫瘍チャレンジ後の日数を表す。 図１４は、実施例１０におけるＥＧ７細胞に対する抗腫瘍活性試験（治療効果）の結果を示す図である。図１４中、縦軸は腫瘍径（長径×短径）、横軸は腫瘍チャレンジ後の日数を表す。
＜＜アジュバント組成物＞＞
　本発明の第１の態様は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む、細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物である。
　また、本発明の第１の他の態様は、細胞性免疫を増強するためのアジュバントとして用いるための、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体である。
（タンパク質）
　本発明のアジュバント組成物は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体（以下、本発明のタンパク質ということがある。）を含む。前記タンパク質の変異体としては、アジュバント活性を有する限り特に制限はない。アジュバント活性の有無は、後述するサイトカインアッセイやキラーＴ細胞誘導活性評価試験により容易に確認することができる。これらの中でも、前記タンパク質又はその変異体は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であることが好ましく、少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であることがより好ましく、少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であることがさらにより好ましい。前記タンパク質又はその変異体は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上、少なくとも９１％以上、少なくとも９２％以上、少なくとも９３％以上、少なくとも９４％以上、少なくとも９５％以上、少なくとも９６％以上、少なくとも９７％以上、少なくとも９８％以上、又は少なくとも９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。これらの中でも、上記タンパク質又はその変異体は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であることが好ましく、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９３％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であることが好ましく、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であることが好ましく、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であることが好ましく、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であることが好ましく、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９．５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であることが好ましく、１００％の配列同一性を有していてもよい。
　また、前記タンパク質又はその変異体は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有することが好ましく、少なくとも８０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、少なくとも９０％以上の配列同一性を有することがさらにより好ましい。前記タンパク質又はその変異体は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上、少なくとも９１％以上、少なくとも９２％以上、少なくとも９３％以上、少なくとも９４％以上、少なくとも９５％以上、少なくとも９６％以上、少なくとも９７％以上、少なくとも９８％以上、又は少なくとも９９％以上の配列同一性を有することが好ましい。これらの中でも、上記タンパク質又はその変異体は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有することが好ましく、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９３％以上の配列同一性を有することが好ましく、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の配列同一性を有することが好ましく、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９７％以上の配列同一性を有することが好ましく、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％以上の配列同一性を有することが好ましく、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９．５％以上の配列同一性を有することが好ましく、１００％の配列同一性を有していてもよい。
　また、本発明のタンパク質は、単離されたタンパク質であることが好ましい。
　配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質としては、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ由来のＭＰＢ６３や、マイコバクテリウム・ツベルクローシス由来のＭＰＴ６３が挙げられる。なお、ＭＰＢ６３とＭＰＴ６３は、タンパク質を発現する種が異なるもののそのアミノ酸配列は互いに同一である。
　配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質としては、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ由来のＭＰＢ４４や、マイコバクテリウム・ツベルクローシス由来のＭＰＴ４４が挙げられる。なお、ＭＰＢ４４とＭＰＴ４４は、タンパク質を発現する種が異なるもののそのアミノ酸配列は互いに同一である。
　配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質としては、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ由来のＭＰＢ５３や、マイコバクテリウム・ツベルクローシス由来のＭＰＴ５３が挙げられる。なお、ＭＰＢ５３とＭＰＴ５３は、タンパク質を発現する種が異なるもののそのアミノ酸配列は互いに同一である。
　配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質としては、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ由来のＭＰＢ６４や、マイコバクテリウム・ツベルクローシス由来のＭＰＴ６４が挙げられる。なお、ＭＰＢ６４とＭＰＴ６４は、タンパク質を発現する種が異なるもののそのアミノ酸配列は互いに同一である。
　ＭＰＢ６３については、その一部のペプチドを用いた製剤が細胞毒性を有し、抗癌作用を持つことが報告されている（特表２０１８－５１２４４６）。また、ＭＰＢ４４については、抗結核免疫を増強する報告がある（Brooks et al. Infect. Immun 69(4):2714-7(2001)）。しかしながら、ＭＰＢ６３、ＭＰＢ４４、ＭＰＢ５３及びＭＰＢ６４は、一緒に投与する抗原（たとえば患者由来のガン抗原等）に対するキラーＴ細胞を誘導するアジュバントとして働くことを示す、或いは推測させる報告はない。
　細胞性免疫を増強するアジュバントは、例えば癌ワクチンによる免疫療法等には必須であるが、これまで上記作用を有する優れたアジュバントは存在しなかった。本発明は、上記タンパク質が細胞性免疫を増強する優れたアジュバント活性を有することを見出しており、これは従来の知見からは予測し得ない驚くべきことである。また、本発明では、アジュバント活性を有する上記タンパク質を用いるため、ＢＣＧ生菌を投与する必要がなく、安全性の観点でも優れている。
　本発明のタンパク質は、他のタンパク質又はポリペプチドとの融合タンパク質の形態であってもよく、他の化合物とのコンジュゲートの形態であってもよい。特に断りのない限り、本発明のタンパク質を含むアジュバント組成物は、本発明のタンパク質を、他のタンパク質又はポリペプチドとの融合タンパク質の形態や他の化合物とのコンジュゲートの形態で含む態様をも包含するものとする。後述するワクチン組成物や医薬組成物についても同様である。
　融合タンパク質は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体をコードする核酸配列と、他のタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列とが一体となって転写・発現することで、１個のタンパク質を形成しているものであってもよい。或いは、融合タンパク質は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体と、他のタンパク質又はポリペプチドとを直接或いはリンカーを介して結合させたものであってもよい。結合方法としては、架橋試薬を用いた化学的共有結合など公知の方法を用いればよい。
　他のタンパク質又はポリペプチドとしては、融合タンパク質の場合は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、などが挙げられる。これらの中でも、ヒスチジンタグが好ましい。架橋試薬を用いる場合は、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン、スカシガイ由来ヘモシアニン、ポリアルギニンなどが挙げられる。これらの中でも、オボアルブミン、ウシ血清アルブミンが好ましい。
　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体とコンジュゲートされる他の化合物としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、糖鎖、有機化合物（リン酸化、Ｓ-ニトロシル化）等が挙げられる。他の化合物は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体と、直接或いはリンカーを介して結合させることによりコンジュゲートを形成させることが出来る。結合方法としては、酵素反応、架橋試薬を用いた化学的共有結合、その他化学合成など公知の方法を用いればよい。
　本発明のタンパク質は、生物由来のタンパク質であってもよく、当該タンパク質をコードする核酸配列を有する遺伝子発現ベクターを宿主に導入して発現させたタンパク質であってもよく、人工的に合成したタンパク質であってもよい。生物由来のタンパク質としては、細菌由来のタンパク質であることが好ましく、抗酸菌由来のタンパク質であることがより好ましく、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ミクロッティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ　ｍｉｃｒｏｔｉ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・カプレー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ　ｃａｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ピニペディー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ ｐｉｎｎｉｐｅｄｉｉ）由来のタンパク質であることがさらにより好ましく、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）又はマイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）由来のタンパク質であることがさらにより好ましい。
　本発明のタンパク質を人工的に合成する方法としては、固相ペプチド化学合成とペプチド連結触媒による方法などが挙げられる。
　当該タンパク質をコードする核酸配列を有する遺伝子発現ベクターを宿主に導入して発現させたタンパク質としては、下記の態様の組換え細菌を用いて発現させたタンパク質を挙げることができる。すなわち、本発明のタンパク質は、下記の態様の組換え細菌由来の配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体であってもよい。同様に、本発明のアジュバント組成物は、下記の態様の組換え細菌由来の配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む、細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物であってもよい。
　本発明のアジュバント組成物又はタンパク質は、細胞性免疫を増強するために用いることが出来る。
　細胞性免疫とは、抗体産生を介した体液性免疫に対して、病原体そのものやウイルス感染細胞、癌細胞などの異物排除において細胞を主なエフェクターとした免疫機構である。本発明は細胞性免疫の免疫機構の一つであるキラーＴ細胞を介した免疫応答に関する発明である。
　アジュバントとは、抗原と一緒に投与して、その効果（免疫原性）を高めるために使用される物質である。
　本発明のアジュバント組成物又はタンパク質は、抗原と混合し投与する事により、投与した抗原特異的なキラーＴ細胞による免疫応答を増強する事ができる。
　本発明のアジュバント組成物又はタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞から産生されるサイトカインＩＬ－２の量を増大させることができる。これは樹状細胞内でのクロスプレゼンテーションの増強によるＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ上に抗原情報提示が増強され、その情報がＣＤ８ Ｔ細胞へと伝達されたことを意味する。さらにＩＬ－２はＣＤ８ Ｔ細胞を含むＴ細胞の増殖に必須のサイトカインであることが知られている。従って、この反応より抗原情報が樹状細胞を介してＣＤ８ Ｔ細胞へ伝達され、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が誘導される。さらに誘導された抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が産生したＩＬ－２によって増殖する事が考えられる。このように、本発明のアジュバント組成物又はタンパク質と抗原との共投与によるＩＬ－２産生量の増大は、本発明のアジュバント組成物又はタンパク質がアジュバント活性を発揮することを示唆するものである。
　本発明のタンパク質は、種々の癌抗原タンパクや患者の癌組織から採取した癌細胞由来等のタンパク質や癌細胞破砕液と混合して癌患者に投与することにより、癌治療ワクチンのアジュバントとして用いることができる。また本発明のタンパク質は、キラーＴ細胞が感染防御に重要である種々のウイルス感染症や細菌感染症に対する予防ワクチンのアジュバントとして用いることができる。
　また、本発明のタンパク質は、癌、ウイルス感染症、細菌感染症などの疾患に罹患している患者に（好ましくはこれらの疾患を引き起こす癌細胞、ウイルス、細菌中で発現している抗原としてのタンパク質又はその断片とともに）投与することにより、当該疾患の原因となる抗原に対するキラーＴ細胞を介した免疫応答を増強（活性化）させ、これにより癌などの疾患を治療する又はその進行を抑制する若しくは遅延させることができる。
（溶媒）
　本発明のアジュバント組成物は、溶媒を含んでいてもよい。溶媒を含む場合、本発明のタンパク質が、溶媒に溶解、懸濁、リポソーム化、エマルジョン化されていてよい。
　溶媒としては、注射用水、生理食塩水、リン酸緩衝液、油などが挙げられる。
　溶媒中に本発明のタンパク質が含まれる場合、その濃度に特に制限はない。
（他の成分）
　本発明のアジュバント組成物は、賦形剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、増粘剤、ｐＨ調整剤及び／又は等張化剤を含んでいてもよい。
　賦形剤としては、スクロース、マンノース、トレハロースなどが挙げられる。
　緩衝剤としては、リン酸、クエン酸、又はそれらの塩などが挙げられる。
　保存剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類などが挙げられる。
　界面活性剤としてはポリソルベート類、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩類などが挙げられる。
　増粘剤としては、カルメロースナトリウム、カルボキシビニルポリマー等が挙げられる。
　ｐＨ調整剤としては、グリシン、塩酸、水酸化ナトリウム等が挙げられる。
　等張化剤としては、塩化ナトリウム、グルコース等が挙げられる。
　また、本発明のアジュバント組成物は、上記タンパク質又はその変異体を、アジュバント活性を有する唯一の成分として含んでいてもよい。或いは、本発明のアジュバント組成物は、アジュバント活性を有する他の成分を含んでいてもよい。他のアジュバントとしては、塩化アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどが挙げられる。
　本発明のアジュバント組成物又はタンパク質は、薬剤と併用されてもよい。薬剤としては、例えば、癌、ウイルス感染症、細菌感染症の治療や進行抑制、感染予防に有効な薬剤を挙げることが出来る。また、免疫チェックポイント阻害薬（ニボルマブ（医薬品名：オプジーボ）、ペムブロリズマブ（医薬品名：キイトルーダ））やガン化学療法剤なども挙げられる。本発明のアジュバント組成物は、薬剤と併用することにより、薬剤の効果を高めることができる。
　また、本発明のアジュバント組成物又はタンパク質は、免疫抗原と併用されてもよい。免疫抗原としては、後述するワクチン組成物や医薬組成物の中で例示したものを挙げることができる。本発明のアジュバント組成物又はタンパク質を免疫抗原と併用することにより、体内での免疫抗原に対する細胞性免疫応答が増強され、当該免疫抗原を有する細胞、ウイルス又は細菌などによって生じる疾患を治療、予防若しくは改善し、又はその進行を遅延させることができる。当該疾患としては、後述するワクチン組成物や医薬組成物の中で例示したものを挙げることができる。
　本発明のアジュバント組成物又はタンパク質は、薬剤又は免疫抗原の投与前に投与してもよく、薬剤又は免疫抗原の投与と同時に投与してもよく、薬剤又は免疫抗原の投与の前或いは後に順次投与してもよく、薬剤又は免疫抗原の投与の後に投与してもよい。
　投与方法としては、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、経鼻投与、吸入投与、腫瘍内投与、膀胱内投与などが挙げられる。これらの中でも、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、腫瘍内投与、膀胱内投与が好ましい。
　本発明のアジュバント組成物又はタンパク質の投与対象としては、例えば、哺乳動物が挙げられる。これらの中でも、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル（ヒト以外の霊長類）が好ましく、ヒトが特に好ましい。
＜＜発現用ベクター＞＞
　本発明の第２の態様は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体をコードする核酸配列を有する、前記タンパク質又はその変異体の発現用ベクターである。
　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体としては、第１の態様と同様のものを挙げることができる。
　本発明のベクターは、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含んでいてもよい。シグナルペプチドとは、タンパク質膜透過に働き、多くの場合タンパク質のアミノ末端に存在し、膜透過の際に切断されるペプチドである。シグナルペプチドを有することにより、タンパク質が細胞質膜を透過しやすくなるため、外膜が存在しないグラム陽性菌では、培養上清により多くが分泌される。シグナルペプチドとしては、細菌がＭＰＢ６３、ＭＰＢ４４、ＭＰＢ５３、ＭＰＢ６４，ＭＰＢ７０、ＭＰＢ５９、ＭＰＢ３２を発現する際に、これらのタンパク質のＮ末端側に備わっているシグナルペプチドなどが挙げられる。これらの中でも、配列番号５のＭＰＢ６３のシグナルペプチド（配列番号５の第１番目～第２９番目の配列）を用いることが好ましい。なお、シグナルペプチドは、膜透過した後にシグナルペプチダーゼにより切断される。従って、細菌内で、ＭＰＢ６３、ＭＰＢ４４、ＭＰＢ５３、ＭＰＢ６４，ＭＰＢ７０、ＭＰＢ５９、ＭＰＢ３２はシグナルペプチドをＮ末端側に有する形（前駆体）で発現するものの、細胞質膜通過時にシグナルペプチド部分が切断され、ＭＰＢ６３、ＭＰＢ４４、ＭＰＢ５３、ＭＰＢ６４，ＭＰＢ７０、ＭＰＢ５９、ＭＰＢ３２となる。
　また、本発明のベクターは、プロモーター配列を含んでいてもよい。プロモーターとしては、ＢＣＧ由来のｈｓｐ６０プロモーター、ＭＰＢ７０プロモーター、Ａｇ８５Ｂプロモーター、マイコバクテリウム・スメグマティス由来のＳＰ２プロモーターなどが挙げられる。これらの中でも、マイコバクテリウム・スメグマティス由来のＳＰ２プロモーターを好適に用いることが出来る。
　また、本発明のベクターは、シャイン・ダルガノ配列、転写終結シグナル（ターミネーター）を更に含んでいてもよい。
　ベクターとしては、ファージベクターやプラスミドベクターなどを用いることができる。これらの中でも、プラスミドベクターを用いることが好ましい。ファージベクターとしては、例えば、マイコバクテリオファージなどを用いることが出来る。プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＳＯ２４６、ｐＳＯΔＢａｍ６ＨｉｓなどのｐＡＬ５０００の複製開始領域を含むものを用いることが出来る。
　上記タンパク質をコードする核酸配列をベクターに組み込む方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いればよい。例えば、制限酵素で切断した当該ＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼにより連結することによりベクターに遺伝子コンストラクトを組み込むことが出来る。
　また、上記タンパク質をコードする核酸配列は、本発明のベクターを導入する宿主に応じて最適化してもよい。最適化方法としては、例えば、コドンをその宿主で頻繁に使用されているものに変換するために、ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｄａｔａｂａｓｅ（かずさＤＮＡ研究所ホームページ）などを参照することができる。
＜＜組換え細菌＞＞
　本発明の第３の態様は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはその変異体をコードする核酸配列が導入されている、又は上記ベクターが導入されている、組換え細菌である。本発明の組換え細菌は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはその変異体をコードする核酸配列（好ましくは上記ベクター由来の当該核酸配列）又は上記ベクターが（電気穿孔法やトランスフェクションなどにより）人工的に導入されている。上記核酸配列又は上記ベクター若しくはその一部（但し、上記核酸配列を含み、シグナル配列及び／又はプロモーター配列を更に含むことが好ましく、ベクター中の他の構成が更に含まれていてもよい）は、宿主となる細菌のゲノム中に組み込まれていてもよい。本発明の組換え細菌は、上記核酸配列又はベクターが導入されている限り、当該導入された核酸配列又は当該導入されたベクター中の核酸配列とは別個に、そのゲノム中に配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列を内在していても内在していなくてもよい。
　本発明の組換え菌は、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｋａｎｓａｓｉｉ）から選択されることが好ましく、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）から選択されることがより好ましく、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）から選択されることがさらにより好ましく、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）がさらにより好ましい。
　また、本発明の組換え菌は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）であることも好ましい。組換え菌としてＢＣＧを用いることにより、結核ワクチンとして使用されるＢＣＧ内でアジュバント活性を有するタンパク質が過剰発現されることになるため、本発明のタンパク質又はベクターが導入されていないＢＣＧに比べて、結核に対するワクチン作用を増強することが出来る。従って、本発明は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧの組換え菌を含む、結核用ワクチン組成物であってもよい。或いは、本発明は、結核用ワクチンに用いる（又は結核を予防する）ための、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧの組換え菌であってもよい。当該組成物中に含まれる成分に特に制限はなく、例えば、上述した溶媒や他の成分などを挙げることができる。ワクチン中のその他の構成については、例えば、第６の態様のものを挙げることができる。
　上記ベクターを細菌に導入する方法としては、例えば、電気穿孔法など挙げられる。
　電気穿孔法では、高電圧下で細菌の細胞壁に孔をあけることにより、ベクターを細菌に導入することが出来る。
＜＜タンパク質の製造方法＞＞
　本発明の第４の態様は、上記の組換え細菌を培養する工程を有する、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体の製造方法である。
　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体としては、第１の態様と同様のものを挙げることができる。
　組換え細菌を培養する工程は、組換え細菌を培地上又は培養液中で培養すればよい。培養時間に特に制限はなく、８～１４４０時間であってもよく、２４～１７０時間であってもよい。培養温度に特に制限はなく、細菌の種類に応じて適時調整すればよく、２０～４５℃程度であってもよく、３５～３９℃程度であってもよい。
　培地又は培養液に特に制限はなく、宿主となる細菌に適した培地又は培養液を用いればよい。
　本発明の製造方法は、組換え細菌の培養後に、好ましくは組換え細菌の培養後の培養ろ液（ＣＦＰ）から、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を精製する工程を有していてもよい。
　当該タンパク質の精製方法としては、塩析、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィー、金属イオンキレートアフィニティーカラムクロマトグラフィーなどが挙げられる。
　本発明の製造方法を用いることにより、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を大量に発現・精製させることが出来る。
＜＜アジュバント組成物の製造方法＞＞
　本発明の第５の態様は、上記の組換え細菌を培養する工程を有する、細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物の製造方法である。
　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体としては、第１の態様と同様のものを挙げることができる。
　組換え細菌を培養する工程は、組換え細菌を培地上又は培養液中で培養すればよい。培養時間に特に制限はなく、８～１４４０時間であってもよく、２４～１７０時間であってもよい。培養温度に特に制限はなく、細菌の種類に応じて適時調整すればよく、２０～４５℃程度であってもよく、３５～３９℃程度であってもよい。
　培地又は培養液に特に制限はなく、宿主となる細菌に適した培地又は培養液を用いればよい。
　本発明の製造方法は、組換え細菌の培養後に、好ましくは組換え細菌の培養後の培養ろ液（ＣＦＰ）から、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を精製する工程を有していてもよい。
　当該タンパク質の精製方法としては、塩析、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィー、金属イオンキレートアフィニティーカラムクロマトグラフィーなどが挙げられる。
　本発明の製造方法を用いることにより、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含むアジュバント組成物を得ることが出来る。
　本発明の製造方法は、精製工程後に、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体と、溶媒、賦形剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、増粘剤、ｐＨ調整剤又は等張化剤から選択される１種以上とを混合する工程を更に有していてもよい。
　本発明の第５の他の態様は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体と、溶媒、賦形剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、増粘剤、ｐＨ調整剤又は等張化剤から選択される１種以上とを混合する工程を含む細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物の製造方法である。
　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体としては、第１の態様と同様のものを挙げることができる。
　本発明の方法は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を用意する工程を有していてもよい。
　また、本発明の方法は、細菌の培養ろ液から、前記タンパク質又はその変異体を精製する工程を有していてもよい。細菌としては、第１の態様に記載したものを挙げることができる。
　また、本発明の方法は、第４又は第５の態様に記載の工程を含んでいてもよい。
＜＜ワクチン組成物＞＞
　本発明の第６の態様は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体、及びワクチン用免疫抗原を含む、ワクチン組成物である。
　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体としては、第１の態様と同様のものを挙げることができる。
　本発明のワクチン組成物は、種々の疾患に対するワクチンとして作用することができる。これらの中でも、本発明のワクチン組成物は、癌、ウイルス感染症、細菌感染症に対するワクチンとして好ましく用いることができ、癌に対するワクチンとしてより好ましく用いることができ、悪性黒色腫（メラノーマ）、肺癌、大腸癌、膀胱癌から選択される１種又は複数に対するワクチンとしてさらにより好ましく用いることができる。
　ワクチン用免疫抗原に特に制限はなく、目的のワクチン用途に合わせて適宜公知の抗原を選択すればよい。これらの中でも、本発明のワクチン組成物は、癌、ウイルス感染症、細菌感染症に対する免疫抗原（例えば、これらの疾患を引き起こす癌細胞、ウイルス又は細菌中で発現しているタンパク質又はその断片、好ましくはこれらの疾患を引き起こす癌細胞、ウイルス又は細菌中では発現しているが正常細胞中或いはウイルスや細菌の宿主細胞中では発現していないタンパク質又はその断片）を含むことが好ましく、癌に対する免疫抗原を含むことがより好ましく、悪性黒色腫、肺癌、大腸癌、膀胱癌から選択される１種又は複数に対する免疫抗原を含むことがさらにより好ましい。このような免疫抗原としては、ＴＲＰ２，ＧＰ１００，癌細胞破砕液などが知られている。
　また、本発明のタンパク質は、免疫抗原としてではなく、細胞性免疫を増強するためのアジュバントとして機能する。従って、本発明のワクチン組成物は、細胞性免疫を増強するためのアジュバントとして、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む。本発明のワクチン組成物に含まれる免疫抗原は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体以外の物質（タンパク質等）である。
（溶媒）
　本発明のワクチン組成物は、溶媒を含んでいてもよい。溶媒を含む場合、本発明のタンパク質が、溶媒に溶解、懸濁、リポソーム化、エマルジョン化されていてよい。
　溶媒としては、注射用水、生理食塩水、リン酸緩衝液、油などが挙げられる。
　溶媒中に本発明のタンパク質が含まれる場合、その濃度に特に制限はない。
（他の成分）
　本発明のワクチン組成物は、賦形剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、増粘剤、ｐＨ調整剤及び／又は等張化剤を含んでいてもよい。
　賦形剤としては、スクロース、マンノース、トレハロースなどが挙げられる。
　緩衝剤としては、リン酸、クエン酸、又はそれらの塩などが挙げられる。
　保存剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類などが挙げられる。
　界面活性剤としてはポリソルベート類、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩類などが挙げられる。
　増粘剤としては、カルメロースナトリウム、カルボキシビニルポリマー等が挙げられる。
　ｐＨ調整剤としては、グリシン、塩酸、水酸化ナトリウム等が挙げられる。
　等張化剤としては、塩化ナトリウム、グルコース等が挙げられる。
　また、本発明のワクチン組成物は、本発明のタンパク質を、唯一のアジュバントとして含んでいてもよい。或いは、本発明のワクチン組成物は、本発明のタンパク質以外のアジュバントを含んでいてもよい。他のアジュバントとしては、塩化アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどが挙げられる。
　本発明のワクチン組成物の投与方法としては、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内、経鼻、吸入、腫瘍内投与、膀胱内注入などが挙げられる。これらの中でも、静脈内、皮内、皮下、腫瘍内、膀胱内が好ましい。
　本発明のワクチン組成物の投与対象としては、例えば、哺乳動物が挙げられる。これらの中でも、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル（ヒト以外の霊長類）が好ましく、ヒトが特に好ましい。
＜＜医薬組成物＞＞
　本発明の第７の態様は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む、医薬組成物である。
　また、本発明の第７の他の態様は、医薬として用いるための、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体である。
　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体としては、第１の態様と同様のものを挙げることができる。
　本発明の医薬組成物又はタンパク質は、種々の疾患に対する医薬として作用することができる。これらの中でも、本発明の医薬組成物又はタンパク質は、癌、ウイルス感染症、細菌感染症の治療や進行抑制、感染予防のために好ましく用いることができ、癌の治療や進行抑制のためにより好ましく用いることができる。
　また、本発明の医薬組成物又はタンパク質は、腫瘍増殖の抑制、ウイルス感染や細菌感染の予防や症状の軽減などのために好適に用いることが出来る。これらの中でも、腫瘍増殖の抑制のために好ましく用いることが出来る。
　本発明の医薬組成物又はタンパク質は、種々の疾患に対する細胞性免疫（なかでも抗原特異的キラーＴ細胞による免疫応答）を高めることにより、当該疾患を治療することができると考えられる。
　本発明の医薬組成物は、対象となる疾患に対する免疫抗原を含むことが好ましい。免疫抗原に特に制限はなく、用途に合わせて適宜公知の抗原を選択すればよい。これらの中でも、本発明の医薬組成物は、腫瘍細胞中に発現しているタンパク質又はその断片を抗原として含むことが好ましい。また、本発明の医薬組成物は、癌、ウイルス感染症、細菌感染症に対する免疫抗原（例えば、これらの疾患を引き起こす癌細胞、ウイルス又は細菌中で発現しているタンパク質又はその断片、好ましくはこれらの疾患を引き起こす癌細胞、ウイルス又は細菌中では発現しているが正常細胞中では発現していないタンパク質又はその断片）を含むことが好ましく、癌に対する免疫抗原を含むことがより好ましく、悪性黒色腫、肺癌、大腸癌、膀胱癌から選択される１種又は複数に対する免疫抗原を含むことがさらにより好ましい。このような免疫抗原としては、ＴＲＰ２，ＧＰ１００，癌細胞破砕液などが知られている。
　また、本発明のタンパク質は、対象となる疾患に対する免疫抗原とともに用いる（投与する）ことが好ましい。免疫抗原としては上述のものを挙げることができる。
　また、本発明のタンパク質は、免疫抗原としてではなく、細胞性免疫を増強するためのアジュバントとして機能する。従って、本発明の医薬組成物は、細胞性免疫を増強するためのアジュバントとして、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む。本発明の医薬組成物に好ましく含まれる免疫抗原は、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体以外の物質（タンパク質等）である。
　本発明の医薬組成物又はタンパク質は、目的の疾患に対する免疫抗原とともに本発明のタンパク質を投与することで、当該疾患に対する細胞性免疫を高め、当該疾患を治療することができる。
（溶媒）
　本発明の医薬組成物は、溶媒を含んでいてもよい。溶媒を含む場合、本発明のタンパク質が、溶媒に溶解、懸濁、リポソーム化、エマルジョン化されていてよい。
　溶媒としては、注射用水、生理食塩水、リン酸緩衝液、油などが挙げられる。
　溶媒中に本発明のタンパク質が含まれる場合、その濃度に特に制限はない。
（他の成分）
　本発明の医薬組成物は、賦形剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、増粘剤、ｐＨ調整剤及び／又は等張化剤を含んでいてもよい。
　賦形剤としては、スクロース、マンノース、トレハロースなどが挙げられる。
　緩衝剤としては、リン酸、クエン酸、又はそれらの塩などが挙げられる。
　保存剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類などが挙げられる。
　界面活性剤としてはポリソルベート類、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩類などが挙げられる。
　増粘剤としては、カルメロースナトリウム、カルボキシビニルポリマー等が挙げられる。
　ｐＨ調整剤としては、グリシン、塩酸、水酸化ナトリウム等が挙げられる。
　等張化剤としては、塩化ナトリウム、グルコース等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、本発明のタンパク質以外の薬剤を含んでいてもよい。薬剤としては特に制限はなく、目的の医薬用途に応じて適宜選択すればよい。例えば、癌、ウイルス感染症、細菌感染症の治療や進行抑制、感染予防に有効な薬剤或いはその有効成分を挙げることができる。
　また、本発明の医薬組成物は、他の薬剤と併用されてもよい。他の薬剤としては、例えば、癌、ウイルス感染症、細菌感染症の治療や進行抑制、感染予防に有効な薬剤を挙げることができる。また、免疫チェックポイント阻害薬やガン化学療法剤なども挙げられる。これらの中でも、免疫チェックポイント阻害薬が好ましい。免疫チェックポイント阻害薬としては、上述したものを挙げることができる。
　本発明の医薬組成物は、他の薬剤の投与前に投与してもよく、他の薬剤の投与と同時に投与してもよく、他の薬剤の投与の前或いは後に順次投与してもよく、他の薬剤の投与の後に投与してもよい。
　本発明の医薬組成物の投与方法としては、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、経鼻投与、吸入投与、腫瘍内投与、膀胱内投与などが挙げられる。これらの中でも、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、腫瘍内投与、膀胱内投与が好ましく、静脈内投与、皮内投与、皮下投与がより好ましい。
　本発明の医薬組成物の投与対象としては、例えば、哺乳動物が挙げられる。これらの中でも、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル（ヒト以外の霊長類）が好ましく、ヒトが特に好ましい。
＜＜タンパク質の使用＞＞
　本発明の第８の態様は、細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物（アジュバント製剤）の製造における、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体の使用である。
　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体としては、第１の態様と同様のものを挙げることができる。
　本発明のタンパク質は、細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物の製造に好適に用いることができる。
　本発明の第９の態様は、ワクチン組成物（ワクチン製剤）の製造における、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体の使用である。
　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体としては、第１又は第６の態様と同様のものを挙げることができる。
　本発明のタンパク質は、ワクチン組成物の製造に好適に用いることができる。
　本発明の第１０の態様は、医薬の製造における、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体の使用である。
　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体としては、第１又は第７の態様と同様のものを挙げることができる。
　本発明のタンパク質は、医薬（医薬組成物）の製造に好適に用いることができる。
＜＜タンパク質の調製と細胞性免疫活性の評価方法＞＞
　以下、本発明のタンパク質の調製と細胞性免疫活性の評価方法の具体的な態様を記載する。
　本発明のタンパク質を得る方法としては、まず、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ或いは結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス）を培養し、その培養ろ液を濃縮してタンパク質の混合物（培養ろ液タンパク質：ＣＦＰ）を得る。ＣＦＰの調製方法の一例として、ソートン培地での浮上培養後に、遠心操作及びろ過により除菌したろ液に含まれるタンパク質を限外ろ過で部分濃縮後、５０％飽和硫酸アンモニウムにより沈殿させ、透析で硫酸アンモニウムを除いてＣＦＰを得ることができる。その他、限外ろ過膜を用いて培養ろ液を濃縮することにより、ＣＦＰを得ることもできるが、濃縮方法はこれらに限るものではない。
　その後、得られたＣＦＰを、カラムクロマトグラフィー等を用いて分画・精製して単一のタンパク質を得る。ＣＦＰを数種類のカラムクロマトグラフィーを用いて精製することで、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）上で単一バンドまで精製することができる。カラムクロマトグラフィーの組み合わせの一例として、疎水性相互作用クロマトグラフィー→陰イオン交換クロマトグラフィー→ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの順や、疎水性相互作用クロマトグラフィー→陰イオン交換クロマトグラフィー→レクチン結合担体によるアフィニティークロマトグラフィー→陰イオン交換クロマトグラフィー→ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの順があるが、これらの組み合わせに限るものではない。
　その後、得られたタンパク質のそれぞれを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのサイトカイン（インターフェロンγ、インターロイキン２）産生アッセイ系で評価し、サイトカイン産生を増強するものをスクリーニングする。サイトカイン産生の増強が確認できたものについて、マウスでのキラーＴ細胞アッセイ系を用いて、細胞性免疫を増強するものをスクリーニングする。スクリーニングの結果得られたタンパク質のアミノ酸配列を確認する。このようにして、ＭＰＢ６３（ＭＰＴ６３）、ＭＰＢ４４、ＭＰＢ５３（ＭＰＴ５３）及びＭＰＢ６４タンパク質を得ることが出来る。
　また、ＭＰＴ６３、ＭＰＴ５３タンパク質については、結核菌培養ろ液から、Nagai et al. Infect. Immun. 59: 372-382 (1991)（非特許文献１）に記載の方法に従って精製を行うことで得ることもできる。
（組換え菌によるＭＰＢ６３、ＭＰＢ４４、ＭＰＢ５３及びＭＰＢ６４の発現と精製）
　ＭＰＢ６３、ＭＰＢ４４、ＭＰＢ５３及びＭＰＢ６４をコードする遺伝子は、ＢＣＧないし結核菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、既知のヌクレオチド配列を持つプライマーを用いたＰＣＲ法によって得ることができる。また、既知のアミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列を持つＤＮＡ断片を化学合成することによっても得ることができる。また、ＢＣＧや結核菌のゲノムＤＮＡから既知のヌクレオチド配列を持つ合成ＤＮＡプローブを用いて、当該遺伝子を含むＤＮＡ断片をサザンブロット法により検出し、大腸菌等にクローニングしてコロニーハイブリダイゼーション法により目的の遺伝子を含むＤＮＡ断片がクローニングされたコロニーを選択することにより得ることもできる。
　得られた遺伝子の抗酸菌での分泌発現には、抗酸菌で機能する転写プロモーター及びシャイン・ダルガノ配列の下流に当該遺伝子のｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ配列を挿入し、その直後に転写ターミネーターを繋いだ発現カセットを、抗酸菌で複製できるｐＳＯ２４６等のプラスミドに挿入して得られる発現プラスミドを、ＢＣＧ或いはＭ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓ等の抗酸菌に電気穿孔法で導入して形質転換菌を得た後、当該形質転換菌をソートン培地で浮上培養して得られる培養上清からカラムクロマトグラフィー等の操作により精製することができる。発現ベクターに用いるプロモーターとしては、ＳＰ２, Ａｇ８５Ｂ, ｈｓｐ６０遺伝子等の抗酸菌のＲＮＡポリメラーゼに認識され、転写を開始する領域の配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。発現ベクターは、ｐＳＯ２４６以外の抗酸菌で複製可能なプラスミドだけでなくバクテリオファージ等を用いることもできる。また、発現宿主はＢＣＧとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに限られるものではなく、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ－ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｋａｎｓａｓｉｉ等の非結核性抗酸菌も用いることができる。
（ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化の検証）
　ＣＦＰ及びＣＦＰから精製したタンパク質の中からＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化できるものをスクリーニングする方法としては、マウス骨髄由来樹状細胞とＯＴ１（ＯＶＡ特異的キラーＴ細胞のＴ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ遺伝子トランスジェニック）マウス由来［Ｋ　Ａ　Ｈｏｇｑｕｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ．１４；７６（１）：１７－２７（１９９４）］の脾細胞由来のＣＤ８陽性細胞を共培養する系に、ＯＶＡ単独又はＯＶＡとアジュバント候補タンパク質を加えて、ＯＶＡ特異的キラーＴ細胞からのインターフェロンγやインターロイキン-２のサイトカイン産生を、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）で評価する方法が挙げられる。これによりキラーＴ細胞誘導増強効果を調べることができる。他にもＯＶＡ以外のキラーＴ細胞エピトープが同定されているタンパク質を用い、それをＣＦＡとともに免疫したマウスの脾細胞を用いて上記マウス骨髄由来樹状細胞と共培養する系でのサイトカイン産生を評価することでもキラーＴ細胞活性増強効果を調べることができる。
（ｉｎ ｖｉｖｏでのキラーＴ細胞誘導活性の検証）
　キラーＴ細胞誘導アジュバント活性をｉｎ ｖｉｖｏで調べる方法として、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにアジュバント候補物質をＯＶＡ若しくはＰｅｐＡ若しくはＢ１６Ｆ１０ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅと混合して皮下接種した後に、回収した脾臓から脾細胞を調製しそれぞれの抗原で一定時間刺激したエフェクター細胞と、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと主要組織適合性抗原複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ： ＭＨＣ）がマッチしたＥＬ４細胞（胸腺リンパ腫細胞）及びＥＬ４細胞にＯＶＡ遺伝子を導入することによってＯＶＡタンパク質を発現させたＥＧ７細胞若しくはＧＭ１０(ＰｅｐＡ（ＭＴＢ３２：結核菌抗原）のＣ５７ＢＬ／６マウスのＭＨＣ分子を持つ細胞に上記キラーＴ細胞エピトープの合成ペプチド)をパルスしたＥＬ４細胞若しくはＢ１６Ｆ１０細胞（ターゲット細胞）をそれぞれ共培養して、誘導された抗原特異的キラーＴ細胞により傷害され死んだ各ターゲット細胞数をフローサイトメーターで測定する方法が挙げられるが、この方法に限られるものではない。また、アジュバント候補物質の遺伝子を導入して分泌発現するように構築したＢＣＧ等の遺伝子組換え菌を動物に投与することにより、元来その菌が分泌している抗原タンパク質に対するキラーＴ細胞の誘導を増強する効果を、当該抗原タンパク質が持つキラーＴ細胞エピトープの合成ペプチドを用いて、上記と同様の方法で調べることができる。
（抗腫瘍効果の検証）
　同系のマウスで増殖可能な種々の癌細胞をマウス皮下に移植する担癌マウスモデル系で、それぞれの癌細胞由来の癌抗原タンパク質とアジュバント候補物質を混合して投与した後に、増殖した癌組織の大きさや重量を測定することにより抗腫瘍効果を検証することができる。癌細胞として、ＥＧ７、Ｂ１６Ｆ１０（メラノーマ）、ＬＬＣ（肺癌）、ＣＭＴ-９３（大腸癌）、 ＣＴ-２６（大腸癌）、Ｐａｎｃ １０．０５（膵臓癌）、ＭＢＴ２(膀胱癌）等、様々なものが挙げられる。
　以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
＜ＭＰＢ６３，ＭＰＢ４４，ＭＰＢ５３，ＭＰＢ６４のＢＣＧ培養ろ液からの精製＞
（１－１）　ＢＣＧ培養ろ液からのＣＦＰの調製
　出発原料としては、ＢＣＧ菌：Ｍ．ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ　Ｔｏｋｙｏ　１７２（ＡＴＣＣ３５７３７）を用いた。
　上記ＢＣＧ菌をソートン液体培地（培地組成は、Ｌ－アスパラギン一水和物：４ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物：０．５ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム：０．５ｇ／Ｌ、くえん酸一水和物：２．０ｇ／Ｌ、くえん酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム：０．０５ｇ／Ｌ、グリセリン：６０．０ｇ／Ｌ、塩化カルシウム：７ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物：０．７ｍｇ／Ｌ、硫酸銅（ＩＩ）：０．２８ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０とした）中３７℃で初期定常期まで培地表面に菌膜として培養した。培養細胞を遠心ろ過し、培養ろ液を得た。培養ろ液８０Ｌを限外ろ過膜（Ｐｅｌｉｃｏｎ　ｃａｓｅｔｔｅ、５ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて限外ろ過し、得られた捕捉画分を次いで限外ろ過膜（ｖｉｖａｆｌｏｗ５０、５ｋＤａ、ザルトリウス社）を用いて限外ろ過し、４０ｍＬの捕捉画分を得た。捕捉画分に４０ｍＬの飽和硫酸アンモニウム（硫安）溶液を緩やかに添加し、９℃で１時間攪拌した後、次いで９℃で１６時間静置した。この溶液を遠心容器に移し、１０，４４０×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、沈殿物に５０％飽和硫安を加え、３回洗浄した。得られた沈殿物をＰＢＳに溶解させた後、透析を行い、タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いて測定し、培養ろ液タンパク質（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｉｌｔｒａｔｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ: ＣＦＰ）を１．０４ｇ得た。
（１－２）　カラムクロマトグラフィーによるＭＰＢ６３，ＭＰＢ４４，ＭＰＢ５３，ＭＰＢ６４の精製
（１－２－１）　ＭＰＢ６３及びＭＰＴ６３の精製
　２ｇのＣＦＰのＰＢＳ溶液に硫安を加え、最終濃度５００ｍＭとして、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ－４Ｂ、Ｃｙｔｉｖａ社）を行った。１０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．４）に、濃度が５００、２００、１００及び０ｍＭとなるように硫安を加えたもの及び蒸留水を溶出液として、５段階のステップワイズ法で溶出を行った。ＭＰＢ６３を含む画分として、５００ｍＭ硫安画分を採取した後、０．２２μｍのフィルターで除菌（フィルターろ過）し遠心式限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ社）により濃縮及びＰＢＳによるバッファー置換を行った。次いでジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ）担体による陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｐｔｏ　ＤＥＡＥ、Ｃｙｔｉｖａ社）を行い、ｐＨが７．５、６．０、５．０、４．５、４．０、３．０の２０ｍＭトリス塩酸溶液を用いてステップワイズ法により分画を行い、ｐＨ４．０溶出液をＭＰＢ６３含有画分とした。さらにゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、Ｃｙｔｉｖａ社）を用いてｐＨ４．０に調整したリン酸溶液を溶離液として計２回分離し、フィルターろ過・濃縮・バッファー置換を行った。最後にＰＢＳによるゲルろ過クロマトグラフィーで分離した画分のフィルターろ過・濃縮を行った後、タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔを用いて測定し、ＭＰＢ６３を０．７ｍｇ得た。
　また、ＭＰＴ６３については、Nagai et al. Infect. Immun. 59: 372-382 (1991)（非特許文献１）に記載の方法に従って精製を行い、４９．６ｍｇのＭＰＴ６３を得た。
（１－２－２）　ＭＰＢ４４の精製
　上記１－２－１と同様の疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、蒸留水溶出画分を採取し、フィルターろ過・濃縮・バッファー置換を行った。次いでＤＥＡＥ担体による陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．４）に、濃度が２０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加えたものを溶出液として分画を行った。最後にＰＢＳによるゲルろ過クロマトグラフィーで分離した画分のフィルターろ過・濃縮を行った後、Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔを用いてタンパク質濃度を測定し、ＭＰＢ４４と思われるタンパク質（１－２－２で精製したタンパク質）を１０．１ｍｇ得た。
（１－２－３）　ＭＰＢ５３の精製
　上記１－２－１と同様の疎水性相互作用クロマトグラフィーにより０ｍＭ硫安溶出画分を採取し、フィルターろ過・濃縮・バッファー置換を行った。次いでＤＥＡＥ担体による陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．４）に、濃度が２０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加えたものを溶出液として分画を行った。最後にＰＢＳによるゲルろ過クロマトグラフィーで分離した画分のフィルターろ過・濃縮を行った後、Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔを用いてタンパク質濃度を測定し、ＭＰＢ５３を１．３ｍｇ得た。
　また、ＭＰＴ５３については、Nagai et al. Infect. Immun. 59: 372-382 (1991)（非特許文献１）に記載の方法に従って精製を行い、１０．０ｍｇのＭＰＴ５３を得た。
（１－２－４）　ＭＰＢ６４の精製
　上記１－２－１と同様の疎水性相互作用クロマトグラフィーにより２００ｍＭ硫安溶出画分を採取し、フィルターろ過・濃縮・バッファー置換を行った。次いでＤＥＡＥ担体による陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．４）に、濃度が２０、５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加えたものを溶出液としてステップワイズ法で分画を行った。ＭＰＢ６４を含む画分として、５０ｍＭ塩化ナトリウム画分を採取した後、フィルターろ過・濃縮・バッファー置換をした。続いてコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）結合担体によるレクチンクロマトグラフィー（ＣｏｎＡ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ、Ｃｙｔｉｖａ社）による分画を行い、ＣｏｎＡに非結合の画分を集め、さらにＤＥＡＥ担体による陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、３０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．７、３％メチルセロソルブ）に、濃度が５０、７５ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加えたものを溶出液としてステップワイズ法で分画を行った。ＭＰＢ６４を含む画分として、７５ｍＭ塩化ナトリウム画分を採取した。最後にＰＢＳによるゲルろ過クロマトグラフィーで分離した画分のフィルターろ過・濃縮を行った後、Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔを用いてタンパク質濃度を測定し、ＭＰＢ６４を２１．４ｍｇ得た。
（１－３）　精製タンパク質の同定
（１－３－１）　高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による評価
　各タンパク質試料を２．０ｍｇ/ｍＬを超えないよう調製し、下記条件で分析した。
ＨＰＬＣ条件　システム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社）、カラム温度：４０℃、検出波長：２２０ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／分、注入量：１～１０μＬ、測定時間：３５分、移動相：０．１％　トリフルオロ酢酸水、０．１％　トリフルオロ酢酸水：アセトニトリル（３：７）のグラジエント、カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＢＥＨ　Ｃ４，２．１ｘ５０　ｍｍ，　３００Å（Ｗａｔｅｒｓ社）
　得られたクロマトグラム（図１）中の検出ピーク面積より純度を計算した結果、ＭＰＢ６３：９６．３％、ＭＰＴ６３：９６．６％、ＭＰＢ４４：９９．５％、ＭＰＢ５３：９８．１％、ＭＰＴ５３：９６．０％、ＭＰＢ６４：９７．０％であった。
（１－３－２）　ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる評価
　各タンパク質試料をサンプルバッファー（トリスＳＤＳ　β－ＭＥ、コスモバイオ社）と等量混合し、９５℃で５分間加熱した。放冷後、タンパク質試料各５μｇをゲル（マルチゲル II ミニ １５/２５（１３Ｗ）、コスモバイオ社）にアプライし、２０ｍＡで９０分間泳動を行った。分子量マーカーは１０～１００ＫＤａ（ＳＩＭＡＳＩＭＡ　ＳＳ１１００、コスモバイオ社）を用いた。クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色後の泳動像を図２－１に示す。ＭＰＴ６３は２量体も検出された。
（１－３－３）　Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥによる評価
　各タンパク質試料をサンプルバッファー（トリス塩酸ｂｕｆｆｅｒ、コスモバイオ社）と等量混合した後、タンパク質試料各１０μｇをゲル（Ｅ－Ｔ７．５Ｌ　ｅ・パジェル　７．５％（１４Ｗ）、アトー社）にアプライし、１０℃、２０ｍＡで６０分間泳動を行った。ＣＢＢ染色後の泳動像を図２－２に示す。
（１－３－４）　Ｎ末端アミノ酸配列解析による評価
　各タンパク質試料をサンプルバッファーと等量混合し、９５℃で５分間加熱した。放冷後、タンパク質試料各１０μｇを４レーンずつゲル（マルチゲル II ミニ １５/２５（１３Ｗ）、コスモバイオ社）にアプライし、２０ｍＡで９０分間泳動を行った。泳動後のゲルを、メタノールにより親水処理を施したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに６０ｍＡ、１００Ｖ、９０分間の条件で転写した。転写後のメンブレンをＣＢＢ染色し、エドマン分解法によるＮ末端アミノ酸配列解析を実施した。各精製タンパク質のＮ末端から５残基分のアミノ酸配列結果を以下に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（１－３－５）　二次元電気泳動による評価
　１－３－１～１－３－４の解析により、１－２－１、１－２－３、１－２－４で精製したタンパク質がそれぞれＭＰＢ６３、ＭＰＢ５３、ＭＰＢ６４であることを同定した。
　他方、１－２－２で精製したＭＰＢ４４と考えられるタンパク質については、上記の方法だけでは、ＭＰＢ４４であることが断定できなかったため、以下の試験を更に行った。すなわち、ＭＰＢ４４（別名：Ａｇ８５Ａ）には、ＭＰＢ５９（別名：Ａｇ８５Ｂ、α－ａｎｔｉｇｅｎ）とＭＰＢ４５（別名：Ａｇ８５Ｃ）の２つの相同タンパク質が存在し、Ａｇ８５ファミリーと呼ばれている［Ｓ．Ｄ‘Ｓｏｕｚａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　４８３－４９３（２００３）］。１－３－４の解析で、１－２－２で得られたタンパク質がＡｇ８５ファミリーに属するタンパク質であることを確認（Ａｇ８５ファミリーはＮ末端から５残基分のアミノ酸配列が同じ）したが、これがＭＰＢ４４であることを確認するため、引き続き二次元電気泳動法による公知（Ａｇ８５ファミリーのスポット位置が特定されている）の同定方法［Ｎａｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｅｐｒｏｓｙ　２０８－２１３（１９９８）］を行った。一次元目の等電点電気泳動はタンパク質試料としてＣＦＰを５０μｇ、１－２－２で得られたタンパク質を１．５μｇ用いてＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ　ＤｒｙＳｔｒｉｐ　Ｋｉｔ（Ｃｙｔｉｖａ社）の手順書に準じて行った。二次元目のＳＤＳ－ＰＡＧＥはゲル（マルチゲル II ミニ １４/１６（１Ｗ）、コスモバイオ社）を用いて、２０ｍＡで９０分間泳動を行った。ＣＢＢ染色後の泳動像を図３に示す。図３に示す通り、ＣＦＰと１－２－２で得られたタンパク質の混合物を試料として泳動した場合と、ＣＦＰを試料として泳動した場合とを比較すると、前者ではＭＰＢ４４に相当する部分のスポットが濃くなっていることが確認できた。以上の結果から、１－２－２で精製したタンパクが、ＭＰＢ４４であることを確認した。
［実施例２］
＜組換えＭＰＢ６３（ｒＭＰＢ６３）, 組換えＭＰＢ４４（ｒＭＰＢ４４）,組換えＭＰＢ５３（ｒＭＰＢ５３）及び組換えＭＰＢ６４（ｒＭＰＢ６４）の抗酸菌での発現と精製＞
（２－１）　Ｍ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓ及びＢＣＧにおけるＭＰＢ６３, ＭＰＢ４４, ＭＰＢ５３, ＭＰＢ６４の分泌発現
　ＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースより取得したＭＰＢ６３前駆体 (Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.: ＢＡＨ２６２３４．１：配列番号５), ＭＰＢ４４前駆体 (Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.: ＢＡＨ２８１３８．１：配列番号６),　ＭＰＢ５３前駆体（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.: ＢＡＨ２７１７３．１：配列番号７) 及びＭＰＢ６４前駆体 (Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.: ＢＡＨ２６２７６．１：配列番号８)（それぞれのシグナルペプチド部分を含む）のアミノ酸配列を基に、Ｍ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓの最適コドンを使用してデザインした遺伝子のＮ末端位置に制限酵素ＮｄｅＩ認識配列（ＣＡＴＡＴＧ）を、Ｃ末端下流にＨｉｓタグ（６個のヒスチジン残基）遺伝子と終始コドン及び制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列(ＧＧＡＴＣＣ)を付加した遺伝子断片を人工合成し（配列番号９～１２）、大腸菌ｐＵＣ５７にクローニングしたプラスミドを調製した（ジェンスクリプト社）。これらのプラスミドから目的遺伝子をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切り出して４種の遺伝子断片を調製した。
　一方、先行特許文献（ＪＰ ２０１９-２０８４３０）の図４に示されたｐＳＯ２４６-ＡＣＥ-ｈｕｐＢ (Ｒｖ２９８６ｃ)-Ｈｉｓ６プラスミド（８０２４ ｂｐ: 文献に記載の配列１６）のＫｐｎＩ (３７１３)からＢａｍＨＩ (１６３)までの配列を持つ４４８０ ｂｐのＤＮＡ断片を人工合成し、マルチクローニングサイトを持つ７２ ｂｐのＢａｍＨＩ-ＫｐｎＩ断片（配列番号１３）とライゲーションして、大腸菌と抗酸菌のシャトルベクターであるｐＳＯ２４６プラスミドを得た。このプラスミドをＢａｍＨＩで切断し、ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔで末端平滑化した後に再ライゲーションしてＢａｍＨＩサイトを欠失させたプラスミドをＫｐｎＩで切断してベクターＤＮＡを調製した。一方、Ｍ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓ由来ＳＰ２プロモーター配列 [Ｓｐｒａｔｔ ｅｔ ａｌ. ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ. ２２４:１３９-４２ (２００３)]、リボゾーム結合部位（ＳＤ配列）、ＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩマルチクローニングサイト、Ａｇ８５Ｂ遺伝子のターミネーター領域を含む３９５ ｂｐのＫｐｎＩ断片（配列番号１４）を人工合成してｐＵＣ１８のＫｐｎＩサイトにクローニングしたｐＡ７１７Ｎプラスミドから、ＫｐｎＩで切断して得られる小断片を切り出してインサートＤＮＡを調製した。これらベクターとインサートをライゲーションして、ｐＳＯΔＢａｍ６Ｈｉｓプラスミドを調製した（図４―１参照）。このプラスミドをＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化して生じる大断片と、上述の４種の遺伝子断片をそれぞれＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ (タカラバイオ社)を用いてライゲーションし（図４―２参照）、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル (東洋紡社)に形質転換してカナマイシン含有ＬＢ寒天培地で目的クローンを選択した。生育したコロニーから組換えプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ (ＱＩＡＧＥＮ社)を使用して抽出し、ＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩ切断によって挿入断片を確認した後に、それらの０．５ μｇをＭ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ＡＴＣＣ６０７株の菌液（１０％グリセリン溶液）０．１ ｍＬと混合して、ジーンパルサー（Ｂｉｏ-Ｒａｄ社）を用いて電気穿孔法（２５００Ｖ, ２５ μＦ, １０００Ω, ０．４ ｃｍ ｇａｐのキュベット使用）により遺伝子を導入した。菌液にＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９-ＡＤＣ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ培地（ベクトンディッキンソン社）を０．１ ｍＬ混合して３７℃で１．５時間インキュベートした後に、ＯＡＤＣ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ含有Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０寒天培地（ベクトンディッキンソン社）（５０ μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に播き、３７℃で３日間インキュベートした。生育したコロニーをピックアップし、新しいＯＡＤＣ含有Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０寒天培地（５０ μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）に植え継いで、３７℃で２日間培養した。その菌体の少量をソートン培地２０ ｍＬに植菌し、３７℃で７日間静置培養する。上清の一部を採取し、濃縮したタンパク質混合物をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分画した後にＰＶＤＦ膜に転写して抗体との反応性を、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロット法で解析して、４種のＭＰＢタンパク質それぞれを分泌発現するＭ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓクローンを得た。
　一方、１―１と同じＢＣＧ菌株を１０％グリセリンに懸濁した菌液を調製し、２ μｇのｐＳＯΔＢａｍ－ＭＰＢ６３、ｐＳＯΔＢａｍ－ＭＰＢ４４、ｐＳＯΔＢａｍ－ＭＰＢ５３及びｐＳＯΔＢａｍ－ＭＰＢ６４プラスミドをそれぞれ混合して、上記と同じ条件でエレクトロポレーションを行い形質転換した。３７℃で３週間培養して生育した形質転換菌を選択し、新しい７Ｈ１０－ＯＡＤＣ寒天培地（５０ μｇ／ｍＬのカナマイシン含有）に植え継いで、３７℃で２週間培養した。生育した組換え菌の少量を、上記と同様にソートン培地３０ ｍＬで浮上培養した。８週間後に培養上清を回収して除菌後、その０．１ ｍＬからタンパク質を濃縮してＳＤＳ－ＰＡＧＥで分画後、上記と同様に抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロット法で解析して、ｒＭＰＢ６３、ｒＭＰＢ４４、ｒＭＰＢ５３及びｒＭＰＢ６４それぞれを分泌発現する組換えＢＣＧ株を得た。
（２－２）　ｒＭＰＢ６３, ｒＭＰＢ４４, ｒＭＰＢ５３，ｒＭＰＢ６４の精製 
　ｒＭＰＢ６３, ｒＭＰＢ４４, ｒＭＰＢ５３及びｒＭＰＢ６４を発現するＭ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌株を２０ ｍＬから１００ ｍＬのソートン培地中、３７℃で７日間浮上培養した。また、ｒＭＰＢ６３, ｒＭＰＢ４４, ｒＭＰＢ５３及びｒＭＰＢ６４を発現する組換えＢＣＧ株を３０ ｍＬのソートン培地中、３７℃で４～８週間浮上培養した。それぞれの培養上清を０．４５ μｍのフィルター(Ｍｉｌｌｅｘ-ＨＶ フィルター, Ｍｅｒｃｋ社)で除菌し、上清をそのままＨｉｓ Ｔｒａｐ ＦＦカラム (ｃｙｔｉｖａ社)に供した。Ｈｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ (ｃｙｔｉｖａ社)中の８倍濃縮リン酸バッファー(ｐＨ ７．４)を蒸留水と１：７の割合で混合して希釈し、リン酸バッファー(Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ)を調製した。Ｈｉｓ Ｔｒａｐ ＦＦカラムをカラム容量の５倍のＭｉｌｌｉ-Ｑ水で洗浄した後、カラム容量の５倍の Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで平衡化した。次に、除菌した培養上清をカラムに通し、カラム容量の１５ 倍の Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを流してカラムを洗浄した。更にＨｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ (ｃｙｔｉｖａ社)中の２ Ｍイミダゾール溶液 (ｐＨ ７．４)とＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを１：４９の割合で混合し、４０ ｍＭイミダゾール溶液を調製した。カラム容量の５倍の４０ ｍＭイミダゾール溶液を流してカラムを洗浄した。一方、Ｈｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ (ｃｙｔｉｖａ社)中の２ Ｍイミダゾール(ｐＨ ７．４)とＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを１：３の割合で混合し、５００ ｍＭイミダゾール溶液 (Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ)を調製した。Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを１ ｍＬずつ５回カラムにアプライし、カラムに結合している各タンパク質を溶出した。この溶液の一部を採取してＳＤＳ-ＰＡＧＥに供し、純度を確認するとともに、上記２－１と同様にウエスタンブロット法により抗Ｈｉｓタグ抗体との反応性を確認した（図５－１）。それぞれの溶液を遠心式限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ　１０Ｋ）でＰＢＳにバッファー置換するとともに濃縮した後に、タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて測定した。各精製タンパク質の得量は以下の表の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２－３）Ｍ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓにおける天然型ｒＭＰＢ６３の分泌発現及びＢＣＧにおける天然型ｒＭＰＢ４４の分泌発現
　Ｃ末端にＨｉｓ ｔａｇを持つＭＰＢ６３遺伝子（配列番号９）を持つｐＳＯΔＢａｍ-ＭＰＢ６３からＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断して得られるＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩ小断片を、ｐＵＣ１８をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断して得られるＤＮＡ大断片とライゲーションして、ｐＵＣ１８-ＭＰＢ６３プラスミドを得た（図４－３）。このプラスミドからＮｄｅＩとＰｐｕＭＩで切断して得られる約４６０ ｂｐのＮｄｅＩ-ＰｐｕＭＩ断片をアガロースゲル電気泳動で分離した。一方、ＰｐｕＭＩ-ＢａｍＨＩサイトにＨｉｓ ｔａｇを持たないＭＰＢ６３遺伝子のＣ末端領域のＤＮＡ断片を挿入するため、ＰｐｕＭＩとＢａｍＨＩの切断末端を持つアダプターＰＢ１（配列番号１５）およびＰＢ２（配列番号１６）を化学合成した。これらそれぞれ１００ ｐｍｏｌを用いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５´水酸基をリン酸化し、７０℃で１５分間加熱処理して酵素を失活させた後にアニーリングして、アダプターＤＮＡを得た。ｐＳＯΔＢａｍ６ＨｉｓをＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断して得られるベクターに、上述したＮｄｅＩ-ＰｐｕＭＩ断片とアダプターＤＮＡをライゲーションし、天然型ＭＰＢ６３発現プラスミドｐＳＯΔＢａｍ-ｎＭＰＢ６３（図４－４）を得た。このプラスミドを上記（２－１）と同様にＭ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓに導入し、組換え菌を得た後にカナマイシン含有ソートン培地で７日間静置培養し、培養上清を回収した。この上清をフィルターろ過滅菌した後、精製に供した。
　一方、Ｃ末端にＨｉｓ ｔａｇを持つＭＰＢ４４遺伝子（配列番号１０）を持つｐＳＯΔＢａｍ-ＭＰＢ４４からＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断して得られるＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩ小断片を、ｐＵＣ１８をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断して得られるＤＮＡ大断片とライゲーションして、ｐＵＣ１８-ＭＰＢ４４プラスミドを得た（図４－３）。このプラスミドをＸｈｏＩとＡｐａＩで切断して得られる約１８０ ｂｐのＸｈｏＩ-ＡｐａＩ断片をアガロースゲル電気泳動で分離した。一方、ＭＰＢ４４のＣ末端近傍のＡｐａＩ-ＢａｍＨＩサイトにＨｉｓ ｔａｇを持たないＭＰＢ４４遺伝子のＣ末端領域のＤＮＡ断片を挿入するため、ＡｐａＩとＢａｍＨＩの切断末端を持つアダプターＡＰＢ１（配列番号１７）およびＡＰＢ２（配列番号１８）を化学合成した。これらそれぞれ１００ ｐｍｏｌを用いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５´水酸基をリン酸化し、７０℃で１５分間加熱処理して酵素を失活させた後にアニーリングして、アダプターＤＮＡを得た。ｐＵＣ１８-ＭＰＢ４４をＸｈｏＩとＢａｍＨＩで切断して得られるベクターに、上述したＸｈｏＩ-ＡｐａＩ断片とアダプターＤＮＡをライゲーションし、天然型ＭＰＢ４４遺伝子を持つプラスミドｐＵＣ-ｎＭＰＢ４４を得た。このプラスミドからＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断して得られる、天然型ＭＰＢ４４遺伝子を含むＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩ断片を、ｐＳＯΔＢａｍ６ＨｉｓをＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断して得られるベクターとライゲーションし、天然型ＭＰＢ４４発現プラスミドｐＳＯΔＢａｍ-ｎＭＰＢ４４を得た（図４－５）。このプラスミドを（２－１）と同様にＢＣＧ東京株に導入し、組換え菌を得た後にカナマイシン含有ソートン培地で３０日間静置培養し、培養上清を回収した。この上清をフィルターろ過滅菌した後、精製に供した。
（２－４）天然型ｒＭＰＢ６３および天然型ｒＭＰＢ４４の精製
（２－４－１）天然型ｒＭＰＢ６３の精製
　上記２－３で得た培養上清４０ｍＬの濃縮・バッファー置換を行った。次いでＤＥＡＥ担体による陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、３０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．７、３％メチルセロソルブ）に、濃度が４０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加えたものを溶出液として分画を行った。最後にＰＢＳによるゲルろ過クロマトグラフィーで分離した画分のフィルターろ過・濃縮を行った後、Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔを用いてタンパク質濃度を測定し、天然型ｒＭＰＢ６３を４．１ｍｇ得た。タンパク質試料を上記１－３－２と同様ＳＤＳ-ＰＡＧＥに供し、上記２－１と同様にウエスタンブロット法により抗ＭＰＢ６３抗体（上記２－２で得たｒＭＰＢ６３由来ウサギＩｇＧ抗体）との反応性を確認した（図５－１）。
（２－４－２）天然型ｒＭＰＢ４４の精製
　上記２－３で得た培養上清２４０ｍＬの濃縮・バッファー置換を行った。次いでＤＥＡＥ担体による陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．４）に、濃度が２０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加えたものを溶出液として分画を行った。最後にＰＢＳによるゲルろ過クロマトグラフィーで分離した画分のフィルターろ過・濃縮を行った後、Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔを用いてタンパク質濃度を測定し、天然型ｒＭＰＢ４４を３．７ｍｇ得た。タンパク質試料を上記１－３－２と同様ＳＤＳ-ＰＡＧＥに供し、上記２－１と同様にウエスタンブロット法により抗ＭＰＢ４４抗体（上記２－２で得たｒＭＰＢ４４由来ウサギＩｇＧ抗体）との反応性を確認した（図５－１）。
　上記１－３－１と同様に組換えタンパク質のＨＰＬＣ分析を行い、得られたクロマトグラム（図５－２）中の検出ピーク面積より純度を計算した結果、ｒＭＰＢ６３：９７．４％、ｒＭＰＢ４４：９７．５％、ｒＭＰＢ５３：９６．５％、ｒＭＰＢ６４：９９．７％、ｒＭＰＢ６３（ＢＣＧ）：１００％、ｒＭＰＢ４４（ＢＣＧ）：９９．７％、ｒＭＰＢ５３（ＢＣＧ）：９９．８％、ｒＭＰＢ６４（ＢＣＧ）：９９．９％、天然型ｒＭＰＢ６３（ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）：９８．３％、天然型ｒＭＰＢ４４（ＢＣＧ）：９９．５％であった。
［実施例３］
＜マウス骨髄由来樹状細胞を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏサイトカインアッセイ系構築＞
（３－１）　ＣＦＰによるＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化増強効果の評価（参考例）
　マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）は下記の方法で得た。Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（日本ＳＬＣ社）骨髄より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞を溶血後、樹状細胞誘導用培地（１０ｎｇ／ｍＬ　Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ，４ｎｇ／ｍＬリコンビナントマウスインターロイキン－４，１０％　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ），１０００Ｕ／ｍＬ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，　５５μＭ　２－メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ１６４０）に１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播き５％　ＣＯ2環境下で７日間培養した。培養開始３日目で浮遊細胞を除去しつつ同量の新しい樹状細胞誘導用培地と交換した。培養開始６日目に非接着細胞のみを回収した。回収した細胞を１．５－２．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように樹状細胞誘導用培地で調整しペトリディッシュに播いた。培養開始７日後に浮遊細胞のみを回収しＢＭＤＣとした。
　ＯＴ１－ＣＤ８　Ｔ細胞は下記の方法で得た。ＯＴ１マウス（ＯＶＡエピトープを特異的に認識するトランスジェニックマウス）の脾臓より脾臓細胞を採取した（ＯＴ１マウスは、ジャクソン・ラボラトリー等から入手可能である）。脾臓細胞を溶血した後、ＥａｓｙＳｅｐ　Ｍｏｕｓｅ　ＣＤ８+　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ｖｅｒｉｔａｓ社）を用いてＣＤ８陽性Ｔ細胞を回収しＯＴ１－ＣＤ８　Ｔ細胞とした。ＥａｓｙＳｅｐ　Ｍｏｕｓｅ　ＣＤ８+　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔはｋｉｔの説明書通りの手順で行った。以上により、ＯＶＡを特異的に認識するＣＤ８+Ｔ細胞を得た。
　上記で得られたＢＭＤＣ及びＣＤ８+Ｔ細胞を用いて、ＯＶＡ／ＣＦＰ群、ｎｏｎ群、ＯＶＡ／ＰＢＳ群をそれぞれ以下の手順で用意した。
　ＯＶＡ／ＣＦＰ群は、アジュバント添加群である。ＯＶＡ／ＣＦＰ群は、以下の方法で得た。１０μｇ／ｍＬ　ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社），２００μｇ／ｍＬ　培養ろ液タンパク質（ＣＦＰ）を添加したＲＰＭＩ培地 （１０％　ＦＢＳ，１０００Ｕ／ｍＬ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，　５５μＭ　２－メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ１６４０)にＢＭＤＣを１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整しＵ底の９６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに２００μＬ／ｗｅｌｌで播いた（５ｗｅｌｌ／群）。５％　ＣＯ2環境下で２４時間培養した。培養終了４５分前に５０μｇ／ｍＬでマイトマイシンＣを加えた。培養終了後、ＲＰＭＩ培地で３回洗浄した。得られたＢＭＤＣ（ＯＶＡ，ＣＦＰ添加で培養したＢＭＤＣ）　２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの入った９６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに、ＯＴ１－ＣＤ８　Ｔ細胞を５×１０5　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで加え、５％　ＣＯ2環境下で２４時間培養することにより、ＯＶＡ／ＣＦＰ群のサンプルを得た。
　ｎｏｎ群は、未処置群である。ｎｏｎ群は、以下の方法で得た。ＯＶＡもＣＦＰも添加していないＲＰＭＩ培地にＢＭＤＣを１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整しＵ底の９６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに２００μＬ／ｗｅｌｌで播いた（５ｗｅｌｌ／群）。５％　ＣＯ2環境下で２４時間培養した。培養終了４５分前に５０μｇ／ｍＬでマイトマイシンＣを加えた。培養終了後、ＲＰＭＩ培地で３回洗浄した。得られたＢＭＤＣ（ＯＶＡ及びＣＦＰ未添加で培養したＢＭＤＣ）　２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの入った９６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに、ＯＴ１－ＣＤ８　Ｔ細胞を５×１０5　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで加え、５％　ＣＯ2環境下で２４時間培養することにより、ｎｏｎ群のサンプルを得た。
　ＯＶＡ／ＰＢＳ群は、ＯＶＡ／ＢＭＤＣ群と比較するための対照群である。ＯＶＡ／ＰＢＳ群は、以下の方法で得た。１０μｇ／ｍＬ　ＯＶＡを添加し且つＣＦＰを添加していないＲＰＭＩ培地にＢＭＤＣを１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整しＵ底の９６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに２００μＬ／ｗｅｌｌで播いた（５ｗｅｌｌ／群）。５％　ＣＯ2環境下で２４時間培養した。培養終了４５分前に５０μｇ／ｍＬでマイトマイシンＣを加えた。培養終了後、ＲＰＭＩ培地で３回洗浄した。得られたＢＭＤＣ（ＯＶＡのみ添加で培養したＢＭＤＣ）　２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの入った９６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに、ＯＴ１－ＣＤ８　Ｔ細胞を５×１０5　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで加え、５％　ＣＯ2環境下で２４時間培養することにより、ＯＶＡ／ＰＢＳ群のサンプルを得た。
　培養後の各群のサンプル上清中のＩＬ－２量をＥＬＩＳＡ法（Ｍｏｕｓｅ　ＩＬ－２　Ｄｕｏｓｅｔ　ＥＬＩＳＡ，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。ＥＬＩＳＡはｋｉｔの説明書通りに行った。産生されたＩＬ－２量を対照群（ＯＶＡ／ＰＢＳ群）とＣＦＰ群（ＯＶＡ／ＣＦＰ群）とで比較した。その結果ＣＦＰ添加群ではＩＬ－２産生量の有意な増加が認められ、ＢＭＤＣの抗原提示能の増加が示唆された（図６の６－１）。
（３－２）　ＭＰＴ６３によるＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化増強効果の評価
　ＢＭＤＣは上記３－１と同様の方法で得た。ＯＶＡ／ＭＰＴ６３群は、１０μｇ／ｍＬ ＯＶＡ, ２００μｇ／ｍＬ ＣＦＰを添加したＲＰＭＩ培地の代わりに、１０μｇ／ｍＬ ＯＶＡ，１２．４μｇ／ｍＬ ＭＰＴ６３を添加したＲＰＭＩ培地を用いて培養を行い、３－１と同様の方法でＯＶＡ／ＭＰＴ６３群のサンプルを得た。
　培養後の各サンプル上清中のＩＬ－２量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。その結果ＭＰＴ６３添加群ではＩＬ－２産生量の有意な増加が認められ、ＢＭＤＣの抗原提示能の増加が示唆された（図６の６－２）
（３－３）　ＭＰＢ４４によるＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化増強効果の評価
　ＢＭＤＣは上記３－１と同様の方法で得た。ＯＶＡ／ＭＰＢ４４群は、１０μｇ／ｍＬ ＯＶＡ, ２００μｇ／ｍＬ ＣＦＰを添加したＲＰＭＩ培地の代わりに、１０μｇ／ｍＬ ＯＶＡ，６．３２μｇ／ｍＬ ＭＰＢ４４を添加したＲＰＭＩ培地を用いて培養を行い、３－１と同様の方法でＯＶＡ／ＭＰＢ４４群のサンプルを得た。
　培養後の各サンプル上清中のＩＬ－２量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。その結果ＭＰＢ４４添加群ではＩＬ－２産生量の有意な増加が認められ、ＢＭＤＣの抗原提示能の増加が示唆された（図６の６－３）。
（３－４）　ＭＰＴ５３によるＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化増強効果の評価
　ＢＭＤＣは上記３－１と同様の方法で得た。ＯＶＡ／ＭＰＴ５３群は、１０μｇ／ｍＬ ＯＶＡ, ２００μｇ／ｍＬ ＣＦＰを添加したＲＰＭＩ培地の代わりに、１０μｇ／ｍＬ ＯＶＡ, ５．６μｇ／ｍＬ ＭＰＴ５３を添加したＲＰＭＩ培地を用いて培養を行い、３－１と同様の方法でＯＶＡ／ＭＰＴ５３群のサンプルを得た。
　培養後の各サンプル上清中のＩＬ－２量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。その結果ＭＰＴ５３添加群ではＩＬ－２産生量の有意な増加が認められ、ＢＭＤＣの抗原提示能の増加が示唆された（図６の６－４）。
（３－５）　ＭＰＢ６４によるＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化増強効果の評価
　ＢＭＤＣは上記３－１と同様の方法で得た。ＯＶＡ／ＭＰＢ６４群は、１０μｇ／ｍＬ ＯＶＡ, ２００μｇ／ｍＬ ＣＦＰを添加したＲＰＭＩ培地の代わりに、１０μｇ／ｍＬ ＯＶＡ, １２．４μｇ／ｍＬ ＭＰＢ６４を添加したＲＰＭＩ培地を用いて培養を行い、３－１と同様の方法でＯＶＡ／ＭＰＢ６４群のサンプルを得た。
　培養後の各サンプル上清中のＩＬ－２量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。その結果ＭＰＢ６４添加群ではＩＬ－２産生量の有意な増加が認められ、ＢＭＤＣの抗原提示能の増加が示唆された（図６の６－５）。
［実施例４］
＜マウスでのＯＶＡ特異的キラーＴ細胞誘導活性評価＞
（４－１）　ＣＦＰによるＯＶＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強（参考例）
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は以下の方法で得た。Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス左腹側部に０日目と１０日目に１００μｇ／ｍＬ ＯＶＡ及び２０００μｇ／ｍＬ ＣＦＰ含有ＰＢＳを１００μＬ／匹の量で皮下接種した。１７日目に接種マウスより脾臓細胞を採取した。抗原としてＥＧ７細胞（５０μｇ／ｍＬマイトマイシンＣで４５分間培養した後、３回洗浄した後使用）を用いた。ＥＧ７細胞は、ＥＬ４細胞（胸腺リンパ腫細胞）にＯＶＡ遺伝子を導入することによってＯＶＡタンパク質を発現させた細胞である（ＡＴＣＣ社から購入）。５×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ接種マウス由来脾細胞と２．５×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ抗原との混合液をＲＰＭＩ培養液で５％　ＣＯ2環境下で５日間培養した。培養後に浮遊細胞を回収しＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ　Ｍ　Ｃｅｌｌ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉａ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社)を用いてリンパ球を回収しＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とした（ＯＶＡ／ＣＦＰ接種群）。Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ　Ｍ　Ｃｅｌｌ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉａは説明書通りに処理を行った。対照群は（ＯＶＡ及びＣＦＰ含有ＰＢＳの代わりに）１００μｇ／ｍＬ ＯＶＡ含有ＰＢＳを１００μＬ／匹の量で皮下接種し、その後は上記と同様の方法で細胞を得た（ＯＶＡ／ＰＢＳ接種群）。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は以下の方法で得た。ＥＬ４細胞（胸腺リンパ腫細胞、Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｅｎｇｌａｎｄ社から購入）若しくはＥＧ７細胞（ＥＬ４細胞にＯＶＡ遺伝子を導入することによってＯＶＡタンパク質を発現させた細胞)をＲＰＭＩ培地で培養した。回収した細胞に２μＭ Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ（ＣＦＳＥ）を加え１５分室温で反応させた後、ＲＰＭＩ培地で洗浄し、最終細胞濃度２×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製して５％　ＣＯ2環境下で３０分間加温した。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは７ＡＡＤ／ＣＦＳＥ　Ｃｅｌｌ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ　ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を用いて説明書通り以下の方法で行った。Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、３．１２５：１、６．２５：１、１２．５：１、２５：１となるようにそれぞれの細胞を播き、５％　ＣＯ2環境下で３時間培養した。培養後、培養上清を除去し ７ＡＡＤを加え４℃遮光下で１５分間反応させた。Ａｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を測定した。対照群とＯＶＡ／ＣＦＰ接種群とで各細胞の各Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合におけるＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞割合を比較した。Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、２５：１の時の死細胞割合が、ＯＶＡ／ＣＦＰ接種群で対照群の１．３倍以上あった場合、抗原特異的なキラーＴ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞，ＣＴＬ）活性が増強したと判定した。その結果、ＯＶＡタンパク質を発現していないＥＬ４細胞をＴａｒｇｅｔ細胞として用いた場合と比較してＯＶＡタンパク質を発現しているＥＧ７細胞をＴａｒｇｅｔ細胞として用いた場合では、Ｔａｒｇｅｔ細胞に対するＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞の割合を大きくなるとＴａｒｇｅｔ細胞中の死細胞の割合が増大した（図７の７－１、白三角と黒三角で示す結果の比較、若しくは白丸と黒丸で示す結果の比較の事）。この事より、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＯＶＡタンパク質）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになった。また、ＯＶＡタンパク質を発現しているＥＧ７細胞を用いた場合には、Ｔａｒｇｅｔ細胞に対するＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞の割合を大きくすると、ＯＶＡ／ＣＦＰ接種群における死細胞割合が対照群よりも増加しており、マウス生体内でのＯＶＡ特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された（図７の７－１、黒丸と黒三角で示す結果を比較のこと）。さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、２５：１の時の死細胞割合が、ＯＶＡ／ＣＦＰ接種群で対照群の２．３２倍であった。この事よりＣＦＰは細胞性免疫誘導型のアジュバント活性を有する事が明らかになった。
（４－２）　ＭＰＴ６３によるＯＶＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに１１０μｇ／ｍＬ ＭＰＴ６３を添加し、以下上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記４－１と同様の方法で行った。その結果、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＯＶＡタンパク質）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、２５：１の時の死細胞割合が、ＯＶＡ／ＭＰＴ６３接種群で対照群の２．１１倍であった（図７の７－２）。この事よりＭＰＴ６３は細胞性免疫誘導型のアジュバント活性を有する事が明らかになった。
（４－３）　ＭＰＢ４４によるＯＶＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６３．２μｇ／ｍＬ ＭＰＢ４４を添加し、以下上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記４－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＯＶＡタンパク質）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、２５：１の時の死細胞割合が、ＯＶＡ／ＭＰＢ４４接種群で対照群の２．１９倍であった（図７の７－３）。この事よりＭＰＢ４４は細胞性免疫誘導型のアジュバント活性を有する事が明らかになった。
（４－４）　ＭＰＢ５３によるＯＶＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６０μｇ／ｍＬ ＭＰＢ５３を添加し、以下上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記４－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＯＶＡタンパク質）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、２５：１の時の死細胞割合が、ＯＶＡ／ＭＰＢ５３接種群で対照群の２．７５倍であった（図７の７－４）。この事よりＭＰＢ５３は細胞性免疫誘導型のアジュバント活性を有する事が明らかになった。
（４－５）　ＭＰＢ６４によるＯＶＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに１００μｇ／ｍＬ ＭＰＢ６４を添加し、以下上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記４－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＯＶＡタンパク質）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、２５：１の時の死細胞割合が、ＯＶＡ／ＭＰＢ６４接種群で対照群の１．５３倍であった（図７の７－５）。この事よりＭＰＢ６４は細胞性免疫誘導型のアジュバント活性を有する事が明らかになった。
（４－６）　ｒＭＰＢ６３によるＯＶＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに１１０μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ６３を添加し、以下上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記４－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＯＶＡタンパク質）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、２５：１の時の死細胞割合が、ＯＶＡ／ｒＭＰＢ６３接種群で対照群の２．３５倍であった（図７の７－６）。この事よりｒＭＰＢ６３は細胞性免疫誘導型のアジュバント活性を有する事が明らかになった。
（４－７）　ｒＭＰＢ４４によるＯＶＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６３．２μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ４４を添加し、以下上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記４－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＯＶＡタンパク質）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、２５：１の時の死細胞割合が、ＯＶＡ／ｒＭＰＢ４４接種群で対照群の１．５３倍であった（図７の７－７）。この事よりｒＭＰＢ４４は細胞性免疫誘導型のアジュバント活性を有する事が明らかになった。
（４－８）　ｒＭＰＢ５３によるＯＶＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６０μｇ／ｍＬ　ｒＭＰＢ５３を添加し、以下上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記４－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＯＶＡタンパク質）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、２５：１の時の死細胞割合が、ＯＶＡ／ｒＭＰＢ５３接種群で対照群の２．４９倍であった（図７の７－８）。この事よりｒＭＰＢ５３は細胞性免疫誘導型のアジュバント活性を有する事が明らかになった。
（４－９）　ｒＭＰＢ６４によるＯＶＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに９５．６μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ６４を添加し、以下上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記４－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記４－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＯＶＡタンパク質）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、２５：１の時の死細胞割合が、ＯＶＡ／ｒＭＰＢ６４接種群で対照群の１．６０倍であった（図７の７－９）。この事よりｒＭＰＢ６４は細胞性免疫誘導型のアジュバント活性を有する事が明らかになった。
［実施例５］
＜マウスでのＰｅｐＡ (ＭＴＢ３２)特異的キラーＴ細胞誘導活性評価＞
（５－１）　組換えＰｅｐＡ（ｒＰｅｐＡ）のＭ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓでの発現と精製
　ＢＣＧ由来のＰｅｐＡのアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.: ＢＡＨ２４４３０．１：配列番号１９をコードし、Ｃ末端にＨｉｓタグを付加して、コドンをＭ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓでよく使用されるものに至適化した遺伝子を化学合成し（配列番号２０、ｐＵＣ５７プラスミドのＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩサイトにクローニングしたプラスミド（ジェンスクリプト社）をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断して得られる約１ ｋｂｐのＰｅｐＡ遺伝子断片を、ｐＳＯΔＢａｍ６ＨｉｓプラスミドをＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断して得られるベクターＤＮＡ断片（図４Ａ参照）と、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて１６ ℃で２時間ライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル (東洋紡社)を形質転換して、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地上でカナマイシン耐性の組換え菌を選択した。ＰｅｐＡ遺伝子断片が正しく挿入された組換えプラスミドを組換え菌からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して抽出し、ｐＳＯΔＢａｍ－ＰｅｐＡプラスミドを得た（図８－１）。以下２－１と同様の方法でＭ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌液を調製し、０．５ μｇのｐＳＯΔＢａｍ－ＰｅｐＡプラスミドを混合して、２－１と同じ条件でエレクトロポレーションを行って形質転換した。２－１と同様の方法で形質転換菌を選択し、ｐＳＯΔＢａｍ－ＰｅｐＡプラスミドを保持する組換えＭ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓを得た。
　得られた組換え菌の少量を、２－２と同様にソートン培地で浮上培養した。培養上清を回収し除菌後、２－２と同様にＨｉｓ Ｔｒａｐ ＦＦカラムによる精製に供した。Ｈｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ (ｃｙｔｉｖａ社)中の８倍濃縮リン酸バッファー(ｐＨ ７．４)をＭｉｌｌｉ-Ｑ水と１：７の割合で希釈し、セリンプロテアーゼであるＰｅｐＡの自己消化を防ぐために１ ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含むリン酸バッファー(Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ)を調製した。また２－２と同様の方法で調製した４０ ｍＭイミダゾール溶液と５００ ｍＭイミダゾール溶液それぞれに１ｍＭ ＰＭＳＦを添加して、Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ及びＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した。２－２と同様のカラム操作により、ｒＰｅｐＡタンパク質を含む溶出液を得た。この溶液から、透析膜 (Ｓｌｉｄｅ-Ａ-Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ; Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社)を使用して、４℃で１ ＬのＰＢＳで２時間の透析を２回繰り返した後、３ ＬのＰＢＳで２日間透析した。さらにＰＢＳを交換して１ Ｌで２時間の透析を２回繰り返して行い、溶出に用いたイミダゾールを完全に除いた。最後に、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用してタンパク質濃度を測定し、８０ ｍＬの培養ろ液から２．８７ ｍｇのｒＰｅｐＡが得られた。精製ｒＰｅｐＡタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの写真を図８－２に示す。
（５－２）　ＭＰＴ６３によるｒＰｅｐＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、４－１に記載の方法に従い、但し、マウスに接種する抗原としてＯＶＡの代わりに１００μｇ／ｍＬ ｒＰｅｐＡを用い、ＣＦＰの代わりに１１０μｇ／ｍＬ ＭＰＴ６３と混合してＰＢＳを用いて、１００μＬ／匹の量で接種した。回収した脾細胞は１０μｇ／ｍＬ　ＰｅｐＡペプチド(ＧＭ１０　ＧＡＰＩＮＳＡＴＡＭ)添加したＲＰＭＩ培地で培養を行い、以下上記４－１と同様の方法で得た（ＰｅｐＡ／ＭＰＴ６３接種群）。対照群は（ＰｅｐＡ及びＭＰＴ６３含有ＰＢＳの代わりに）１００μｇ／ｍＬ ｒＰｅｐＡ含有ＰＢＳを１００μＬ／匹の量で皮下接種し、その後は上記と同様の方法で細胞を得た（ＰｅｐＡ／ＰＢＳ接種群）。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は以下の方法で得た。ＥＬ４細胞を２μｇ／ｍＬ ＧＭ１０を添加したＲＰＭＩ培地で５％　ＣＯ2環境下で９０分間培養した（ＧＭ１０－ＥＬ４）。また、ＧＭ１０未添加ＥＬ４細胞は、ＥＬ４細胞をＲＰＭＩ培地で５％　ＣＯ2環境下で９０分間培養した（ＥＬ４）。それぞれの細胞を培養後３回洗浄し、２μＭ　ＣＦＳＥを加えその後は上記４－１と同様の方法で細胞を得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙはＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、６．２５：１、１２．５：１、２５：１、５０：１となるようにそれぞれの細胞を播き、上記４－１と同様の方法で行った。Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、対照群の１．３倍以上あった場合、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性が増強したと判定した。その結果、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＰｅｐＡ）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、ｒＰｅｐＡ／ＭＰＴ６３接種群で対照群の１．６３倍であった（図９の９－１）。この事よりｒＰｅｐＡ／ＭＰＴ６３接種群によりマウス生体内でのＰｅｐＡ特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（５－３）　ＭＰＢ４４によるＰｅｐＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ｒＰｅｐＡをマウスに接種する際にＭＰＴ６３の代わりに６３．２μｇ／ｍＬ ＭＰＢ４４を添加し、以下上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記５－２と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＰｅｐＡ）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、ｒＰｅｐＡ／ＭＰＢ４４接種群で対照群の２．６３倍であった（図９の９－２）。この事よりｒＰｅｐＡ／ＭＰＢ４４接種群によりマウス生体内でのＰｅｐＡ特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（５－４）　ＭＰＢ５３によるＰｅｐＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ｒＰｅｐＡをマウスに接種する際にＭＰＴ６３の代わりに６０μｇ／ｍＬ ＭＰＢ５３を添加し、以下上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記５－２と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＰｅｐＡ）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、ｒＰｅｐＡ／ＭＰＢ５３接種群で対照群の４．７４倍であった（図９の９－３）。この事よりｒＰｅｐＡ／ＭＰＢ５３接種群によりマウス生体内でのＰｅｐＡ特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（５－５）　ＭＰＢ６４によるＰｅｐＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ｒＰｅｐＡをマウスに接種する際にＭＰＴ６３の代わりに９５．６μｇ／ｍＬ ＭＰＢ６４を添加し、以下上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記５－２と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＰｅｐＡ）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、ｒＰｅｐＡ／ＭＰＢ６４接種群で対照群の２．７３倍であった（図９の９－４）。この事よりｒＰｅｐＡ／ＭＰＢ６４接種群によりマウス生体内でのＰｅｐＡ特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（５－６）　ｒＭＰＢ６３によるＰｅｐＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ＰｅｐＡをマウスに接種する際にＭＰＴ６３の代わりに１１０μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ６３を添加し、以下上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記５－２と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＰｅｐＡ）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、ｒＰｅｐＡ／ｒＭＰＢ６３接種群で対照群の１．９９倍であった（図９の９－５）。この事よりｒＰｅｐＡ／ｒＭＰＢ６３接種群によりマウス生体内でのＰｅｐＡ特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（５－７）　ｒＭＰＢ４４によるＰｅｐＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ｒＰｅｐＡをマウスに接種する際にＭＰＴ６３の代わりに６３．２μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ４４を添加し、以下上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記５－２と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＰｅｐＡ）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、ｒＰｅｐＡ／ｒＭＰＢ４４接種群で対照群の１．５９倍であった（図９の９－６）。この事よりｒＰｅｐＡ／ｒＭＰＢ４４接種群によりマウス生体内でのＰｅｐＡ特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（５－８）　ｒＭＰＢ５３によるＰｅｐＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ｒＰｅｐＡをマウスに接種する際にＭＰＴ６３の代わりに６０μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ５３を添加し、以下上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記５－２と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＰｅｐＡ）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、ｒＰｅｐＡ／ｒＭＰＢ５３接種群で対照群の２．１１倍であった（図９の９－７）。この事よりｒＰｅｐＡ／ｒＭＰＢ５３接種群によりマウス生体内でのＰｅｐＡ特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（５－９）　ｒＭＰＢ６４によるＰｅｐＡ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、ｒＰｅｐＡをマウスに接種する際にＭＰＴ６３の代わりに９５．６μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ６４を添加し、以下上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記５－２と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記５－２と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（ＰｅｐＡ）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、ｒＰｅｐＡ／ｒＭＰＢ６４接種群で対照群の１．６３倍であった（図９の９－８）。この事よりｒＰｅｐＡ／ｒＭＰＢ６４接種群によりマウス生体内でのＰｅｐＡ特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
［実施例６］
＜マウスでのメラノーマ特異的キラーＴ細胞誘導活性評価＞
（６－１）　ＣＦＰによるメラノーマ特異的キラーＴ細胞誘導の増強（参考例）
　抗原として使用するＢ１６Ｆ１０細胞破砕液は以下の方法で得た。Ｂ１６Ｆ１０細胞（マウスメラノーマ細胞、ＡＴＣＣ社から購入）をＤＭＥＭ培地（１０%ＦＢＳ，１０００Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，５５μＭ　２－メルカプトエタノール含有ＤＭＥＭ）で５％　ＣＯ2環境下で培養した。増殖したＢ１６Ｆ１０細胞を回収し、ＰＢＳを用いて３回洗浄を行い１×１０8ｃｅｌｌｓ（生細胞数＋死細胞数）／ｍＬに調製後－８０℃で凍結保存した。実験に使用する１週間前以内に凍結保存したＢ１６Ｆ１０細胞液を氷中で解凍し、超音波で破砕した。超音波処理（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ　ＵＣＤ－２５０，コスモバイオ社）はＬｅｖｅｌ　Ｍで１０分間（３０秒間超音波・３０秒間未処置の繰り返した）、氷水中で処理を２回行った。超音波処理を行った後、１４，０００×ｇ，４℃で１５分間遠心分離し上清を回収しＢ１６Ｆ１０細胞破砕液とした。
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、４－１の方法に従い、但し、マウスに接種する抗原としてＯＶＡの代わりに１００μＬ（Ｂ１６Ｆ１０細胞１×１０7ｃｅｌｌｓ分相当の破砕液）／ｍＬ Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液を用い、２０００μｇ／ｍＬ ＣＦＰと混合したＰＢＳを用いて、１００μＬ／匹の量でマウスに接種した。回収した脾細胞は１０μｇ／ｍＬ ＴＲＰ２ (Ｂ１６Ｆ１０の抗原)ペプチド（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ)を添加したＲＰＭＩ培地で培養を行い、以下上記４－１と同様の方法で得た（Ｂ１６ ｌｙｓ／ＣＦＰ接種群）。対照群は（Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液及びＣＦＰ含有ＰＢＳの代わりに）１００μＬ／ｍＬ Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液含有ＰＢＳを１００μＬ／匹の量で皮下接種し、その後は上記と同様の方法で細胞を得た（Ｂ１６ ｌｙｓ／ＰＢＳ接種群）。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は以下の方法で得た。Ｂ１６Ｆ１０細胞はＤＭＥＭ培地を用いて、ＥＬ４細胞はＲＰＭＩ培地でそれぞれ５％　ＣＯ2環境下で培養した。増殖した各細胞を回収し、上記４－１と同様の方法でＴａｒｇｅｔ細胞を得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙはＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、６．２５：１、１２．５：１、２５：１、５０：１となるようにそれぞれの細胞を播き、上記４－１と同様の方法で行った。Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、対照群の１．３倍以上あった場合、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性が増強したと判定した。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（Ｂ１６Ｆ１０細胞）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＣＦＰ接種群で対照群の１．７３倍であった（図１０の１０－１）。この事よりＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＣＦＰ接種群によりマウス生体内でのＢ１６Ｆ１０細胞特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（６－２）　ＭＰＴ６３によるメラノーマ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液は上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液をマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに１１０μｇ／ｍＬ ＭＰＴ６３を添加し、以下上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記６－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（Ｂ１６Ｆ１０細胞）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＭＰＴ６３接種群で対照群の１．６８倍であった（図１０の１０－２）。この事よりＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＭＰＴ６３接種群によりマウス生体内でのＢ１６Ｆ１０細胞特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（６－３）　ＭＰＢ４４によるメラノーマ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液は上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液をマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６３．２μｇ／ｍＬ ＭＰＢ４４を添加し、以下上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記６－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（Ｂ１６Ｆ１０細胞）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＭＰＢ４４接種群で対照群の１．８６倍であった（図１０の１０－３）。この事よりＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＭＰＢ４４接種群によりマウス生体内でのＢ１６Ｆ１０細胞特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（６－４）　ＭＰＢ５３によるメラノーマ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液をマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６０μｇ／ｍＬ ＭＰＢ５３を添加し、以下上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記６－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（Ｂ１６Ｆ１０細胞）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＭＰＢ５３接種群で対照群の１．４２倍であった（図１０の１０－４）。この事よりＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＭＰＢ５３接種群によりマウス生体内でのＢ１６Ｆ１０細胞特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（６－５）　ＭＰＢ６４によるメラノーマ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液をマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに９５．６μｇ／ｍＬ ＭＰＢ６４を添加し、以下上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記６－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（Ｂ１６Ｆ１０細胞）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＭＰＢ６４接種群で対照群の１．３９倍であった（図１０の１０－５）。この事よりＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＭＰＢ６４接種群によりマウス生体内でのＢ１６Ｆ１０細胞特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（６－６）　ｒＭＰＢ６３によるメラノーマ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液をマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに１１０μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ６３を添加し、以下上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記６－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（Ｂ１６Ｆ１０細胞）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液／ｒＭＰＢ６３接種群で対照群の１．６１倍であった（図１０の１０－６）。この事よりＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ｒＭＰＢ６３接種群によりマウス生体内でのＢ１６Ｆ１０細胞特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（６－７）　ｒＭＰＢ４４によるメラノーマ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液をマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６３．２μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ４４を添加し、以下上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記６－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（Ｂ１６Ｆ１０細胞）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液／ｒＭＰＢ４４接種群で対照群の１．６８倍であった（図１０の１０－７）。この事よりＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ｒＭＰＢ４４接種群によりマウス生体内でのＢ１６Ｆ１０細胞特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（６－８）　ｒＭＰＢ５３によるメラノーマ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液をマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６０μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ５３を添加し、以下上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記６－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（Ｂ１６Ｆ１０細胞）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液／ｒＭＰＢ５３接種群で対照群の１．６２倍であった（図１０の１０－８）。この事よりＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ｒＭＰＢ５３接種群によりマウス生体内でのＢ１６Ｆ１０細胞特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
（６－９）　ｒＭＰＢ６４によるメラノーマ特異的キラーＴ細胞誘導の増強
　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞は、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液をマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに９５．６μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ６４を添加し、以下上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｔａｒｇｅｔ細胞は上記６－１と同様の方法で得た。
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙは上記６－１と同様の方法で行った。その結果Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞中に含まれるＣＴＬは抗原（Ｂ１６Ｆ１０細胞）特異的なＣＴＬ活性である事が明らかになり、さらにＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞とＴａｒｇｅｔ細胞の割合が、５０：１の時の死細胞割合が、Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液／ｒＭＰＢ６４接種群で対照群の１．７７倍であった（図１０の１０－９）。この事よりＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ｒＭＰＢ６４接種群によりマウス生体内でのＢ１６Ｆ１０細胞特異的ＣＴＬ活性の増強が示唆された。
［実施例７］
＜ＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価＞
（７－１）　マウスでのＣＦＰによるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン、参考例）
　Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス左腹側部に０日目と１０日目に１００μｇ／ｍＬ ＯＶＡ及び２０００μｇ／ｍＬ ＣＦＰ含有ＰＢＳを１００μＬ／匹の量で皮下接種した。１７日目にＯＶＡ接種部位以外の左腹側部にＥＧ７細胞（ＥＬ４細胞（胸腺リンパ腫細胞）にＯＶＡ遺伝子を導入することによってＯＶＡタンパク質を発現させた細胞）を１×１０6ｃｅｌｌｓ／匹で皮内投与した。ＥＧ７細胞投与後２１日まで経時的に腫瘍径及び体重を測定した。（２０００μｇ／ｍＬ ＣＦＰ含有ＰＢＳを投与せず）ＯＶＡのみを投与した群を対照群とした。人道的エンドポイントとして体重が１週間で１０％以上減少した場合は死亡とみなし過麻酔により安楽死させた。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ＣＦＰ接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＣＦＰを抗原と同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１１の１１－１）。
（７－２）　マウスでのＭＰＴ６３によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに１１０μｇ／ｍＬ ＭＰＴ６３を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ＭＰＴ６３接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＭＰＴ６３を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１１の１１－２）。
（７－３）　マウスでのＭＰＢ４４によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６３．２μｇ／ｍＬ ＭＰＢ４４を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ＭＰＢ４４接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＭＰＢ４４を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１１の１１－３）。
（７－４）　マウスでのＭＰＢ５３によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６０μｇ／ｍＬ ＭＰＢ５３を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ＭＰＢ５３接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＭＰＢ５３を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１１の１１－４）。
（７－５）　マウスでのＭＰＢ６４によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに９５．６μｇ／ｍＬ ＭＰＢ６４を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ＭＰＢ６４接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＭＰＢ６４を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１１の１１－５）。
（７－６）　マウスでのｒＭＰＢ６３によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに１１０μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ６３を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ｒＭＰＢ６３接種群では腫瘍径の減少が認められ、ｒＭＰＢ６３を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１１の１１－６）。
（７－７）　マウスでのｒＭＰＢ４４によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６３．２μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ４４を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ｒＭＰＢ４４接種群では腫瘍径の減少が認められ、ｒＭＰＢ４４を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１１の１１－７）。
（７－８）　マウスでのｒＭＰＢ５３によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６０μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ５３を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ｒＭＰＢ５３接種群では腫瘍径の減少が認められ、ｒＭＰＢ５３を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１１の１１－８）。
（７－９）　マウスでのｒＭＰＢ６４によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに９５．６μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ６４を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ｒＭＰＢ６４接種群では同等であった（図１１の１１－９）。
［実施例８］
＜Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞による腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチンとしての効果）＞
（８－１）　マウスでのＣＦＰによるＢ１６Ｆ１０腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン、参考例）
　抗原として使用するＢ１６Ｆ１０細胞破砕液は上記６－１と同様の方法で得た。Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスに接種する抗原としてＯＶＡの代わりに１００μＬ （１×１０7 ｃｅｌｌｓ)／ｍＬ Ｂ１６Ｆ１０細胞破砕液を用いて、上記７－１と同様の方法で接種した。１７日目にＢ１６Ｆ１０細胞を１×１０5ｃｅｌｌｓ／匹で皮内接種し、以下上記７－１と同様の方法で比較した。その結果、対照群と比較してＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＣＦＰ接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＣＦＰを同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１２の１２－１）。
（８－２）　マウスでのＭＰＴ６３によるＢ１６Ｆ１０腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　上記８－１と同様の方法でＢ１６Ｆ１０細胞破砕液を接種する際にＣＦＰの代わりに１１０μｇ／ｍＬ　ＭＰＴ６３を接種し比較検討した。その結果、対照群と比較してＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＭＰＴ６３接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＭＰＴ６３を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１２の１２－２）。
（８－３）　マウスでのＭＰＢ４４によるＢ１６Ｆ１０腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　上記８－１と同様の方法でＢ１６Ｆ１０細胞破砕液を接種する際にＣＦＰの代わりに６３．２μｇ／ｍＬ ＭＰＢ４４を接種し比較検討した。その結果、対照群と比較してＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＭＰＢ４４接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＭＰＢ４４を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１２の１２－３）。
（８－４）　マウスでのＭＰＢ５３によるＢ１６Ｆ１０腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　上記８－１と同様の方法でＢ１６Ｆ１０細胞破砕液を接種する際にＣＦＰの代わりに６０μｇ／ｍＬ ＭＰＢ５３を接種し比較検討した。その結果、対照群と比較してＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＭＰＢ５３接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＭＰＢ５３を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１２の１２－４）。
（８－５）　マウスでのＭＰＢ６４によるＢ１６Ｆ１０腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　上記８－１と同様の方法でＢ１６Ｆ１０細胞破砕液を接種する際にＣＦＰの代わりに９５．６μｇ／ｍＬ ＭＰＢ６４を接種し比較検討した。その結果、対照群と比較してＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ＭＰＢ６４接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＭＰＢ６４を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１２の１２－５）。
（８－６）　マウスでのｒＭＰＢ４４によるＢ１６Ｆ１０腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　上記８－１と同様の方法でＢ１６Ｆ１０細胞破砕液を接種する際にＣＦＰの代わりに６３．２μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ４４を接種し比較検討した。その結果、対照群と比較してＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ｒＭＰＢ４４接種群では腫瘍径の減少が認められ、ｒＭＰＢ４４を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１２の１２－６）。
（８－７）　マウスでのｒＭＰＢ５３によるＢ１６Ｆ１０腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　上記８－１と同様の方法でＢ１６Ｆ１０細胞破砕液を接種する際にＣＦＰの代わりに６０μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ５３を接種し比較検討した。その結果、対照群と比較してＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ｒＭＰＢ５３接種群では腫瘍径の減少が認められ、ｒＭＰＢ５３を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１２の１２－７）。
（８－８）　マウスでのｒＭＰＢ６４によるＢ１６Ｆ１０腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　上記８－１と同様の方法でＢ１６Ｆ１０細胞破砕液を接種する際にＣＦＰの代わりに９５．６μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ６４を接種し比較検討した。その結果、対照群と比較してＢ１６Ｆ１０細胞破砕液／ｒＭＰＢ６４接種群では腫瘍径の減少が認められ、ｒＭＰＢ６４を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１２の１２－８）。
［実施例９］
＜Ｃｏｌｏｎ―２６大腸癌細胞による腫瘍増殖抑制活性の評価（ワクチンとしての効果）＞
（９－１）　マウスでのＣＦＰによるＣｏｌｏｎ―２６細胞増殖抑制活性の評価（ワクチン、参考例）
　抗原として使用するＣｏｌｏｎ―２６細胞破砕液は以下の方法で得た。Ｃｏｌｏｎ―２６細胞（マウス大腸がん細胞、東北大学加齢医科学研究所　医用細胞資源センターより購入）をＲＰＭＩ培地で５％　ＣＯ2環境下で培養した。増殖したＣｏｌｏｎ―２６細胞の破砕液を、上記６－１と同様の方法で得た。Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスに接種する抗原としてＯＶＡの代わりに１００μＬ （１×１０7 ｃｅｌｌｓ)／ｍＬ Ｃｏｌｏｎ―２６細胞破砕液を用いて、上記７－１と同様の方法で接種した。１７日目にＣｏｌｏｎ―２６細胞を２．５×１０5ｃｅｌｌｓ／匹で皮内接種し、以下上記７－１と同様の方法で比較した。その結果、対照群と比較してＣｏｌｏｎ―２６細胞破砕液／ＣＦＰ接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＣＦＰを同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１３の１３－１）。
（９－２）　マウスでの天然型ｒＭＰＢ６３によるＣｏｌｏｎ―２６細胞増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　上記９－１と同様の方法でＣｏｌｏｎ―２６細胞破砕液を接種する際にＣＦＰの代わりに１１０μｇ／ｍＬ　天然型ｒＭＰＢ６３を接種し比較検討した。その結果、対照群と比較してＣｏｌｏｎ―２６細胞破砕液／天然型ｒＭＰＢ６３接種群では腫瘍径の減少が認められ、天然型ｒＭＰＢ６３を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１３の１３－２）。
（９－３）　マウスでの天然型ｒＭＰＢ４４によるＣｏｌｏｎ―２６細胞増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　上記９－１と同様の方法でＣｏｌｏｎ―２６細胞破砕液を接種する際にＣＦＰの代わりに６３．２μｇ／ｍＬ 天然型ｒＭＰＢ４４を接種し比較検討した。その結果、対照群と比較してＣｏｌｏｎ―２６細胞破砕液／天然型ｒＭＰＢ４４接種群では腫瘍径の減少が認められ、天然型ｒＭＰＢ４４を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１３の１３－３）。
（９－４）　マウスでのｒＭＰＢ５３によるＣｏｌｏｎ―２６細胞増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　上記９－１と同様の方法でＣｏｌｏｎ―２６細胞破砕液を接種する際にＣＦＰの代わりに６０μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ５３を接種し比較検討した。その結果、対照群と比較してＣｏｌｏｎ―２６細胞破砕液／ｒＭＰＢ５３接種群では腫瘍径の減少が認められ、ｒＭＰＢ５３を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１３の１３－４）。
（９－５）　マウスでのｒＭＰＢ６４によるＣｏｌｏｎ―２６細胞増殖抑制活性の評価（ワクチン）
　上記９－１と同様の方法でＣｏｌｏｎ―２６細胞破砕液を接種する際にＣＦＰの代わりに９５．６μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ６４を接種し比較検討した。その結果、対照群と比較してＣｏｌｏｎ―２６細胞破砕液／ｒＭＰＢ６４接種群では腫瘍径の減少が認められ、ｒＭＰＢ６４を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１３の１３－５）。
［実施例１０］
＜ＥＧ７細胞による腫瘍増殖抑制活性の評価（治療薬としての効果）＞
（１０－１）　マウスでのＣＦＰによるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（治療薬、参考例）
　Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス左腹側部にＥＧ７細胞（ＥＬ４細胞（胸腺リンパ腫細胞）にＯＶＡ遺伝子を導入することによってＯＶＡタンパク質を発現させた細胞）を１×１０6ｃｅｌｌｓ／匹で皮内投与した。皮内投与後７、１０、１４、１７、２１、２４日目それぞれに１００μｇ／ｍＬ ＯＶＡ及び２０００μｇ／ｍＬ ＣＦＰ含有ＰＢＳを１００μＬ／匹の量で腫瘍近傍に皮下接種した。ＥＧ７細胞投与後２８日まで経時的に腫瘍径及び体重を測定した。ＯＶＡのみを投与した群を対照群とし比較した。人道的エンドポイントとして体重が１週間で１０％以上減少した場合は死亡とみなし過麻酔により安楽死させた。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ＣＦＰ接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＣＦＰを抗原と同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１４の１４－１）。
（１０－２）　マウスでのＭＰＢ４４によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（治療薬）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６３．２μｇ／ｍＬ ＭＰＢ４４を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ＭＰＢ４４接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＭＰＢ４４を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１４の１４－２）。
（１０－３）　マウスでのＭＰＢ５３によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（治療薬）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６０μｇ／ｍＬ ＭＰＢ５３を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ＭＰＢ５３接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＭＰＢ５３を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１４の１４－３）。
（１０－４）　マウスでのＭＰＢ６４によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（治療薬）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに９５．６μｇ／ｍＬ ＭＰＢ６４を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ＭＰＢ６４接種群では腫瘍径の減少が認められ、ＭＰＢ６４を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１４の１４－４）。
（１０－５）　マウスでのｒＭＰＢ６３によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（治療薬）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに１１０μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ６３を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ｒＭＰＢ６３接種群では腫瘍径の減少が認められ、ｒＭＰＢ６３を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１４の１４－５）。
（１０－６）　マウスでのｒＭＰＢ４４によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（治療薬）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６３．２μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ４４を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ｒＭＰＢ４４接種群では腫瘍径の減少が認められ、ｒＭＰＢ４４を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１４の１４－６）。
（１０－７）　マウスでのｒＭＰＢ５３によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（治療薬）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに６０μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ５３を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ｒＭＰＢ５３接種群では腫瘍径の減少が認められ、ｒＭＰＢ５３を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１４の１４－７）。
（１０－８）　マウスでのｒＭＰＢ６４によるＥＧ７腫瘍増殖抑制活性の評価（治療薬）
　ＯＶＡをマウスに接種する際にＣＦＰの代わりに９５．６μｇ／ｍＬ ｒＭＰＢ６４を添加し、以下上記７－１と同様の方法で対照群と比較検討した。その結果、対照群と比較してＯＶＡ／ｒＭＰＢ６４接種群では腫瘍径の減少が認められ、ｒＭＰＢ６４を同時に接種する事により抗腫瘍活性が増強されることが示唆された（図１４の１４－８）。
　本発明によれば、細胞性免疫を増強するアジュバント活性を有するタンパク質を提供することができる。よって、本発明は、産業上極めて有用である。
［配列情報］
　配列番号１～２０の核酸配列又はアミノ酸配列を以下に示す。なお、タンパク質のアミノ酸配列は３文字表記で記した。
配列番号１：ＭＰＢ６３のアミノ酸配列
Ala Tyr Pro Ile Thr Gly Lys Leu Gly Ser Glu Leu Thr Met Thr Asp Thr Val Gly Gln Val Val Leu Gly Trp Lys Val Ser Asp Leu Lys Ser Ser Thr Ala Val Ile Pro Gly Tyr Pro Val Ala Gly Gln Val Trp Glu Ala Thr Ala Thr Val Asn Ala Ile Arg Gly Ser Val Thr Pro Ala Val Ser Gln Phe Asn Ala Arg Thr Ala Asp Gly Ile Asn Tyr Arg Val Leu Trp Gln Ala Ala Gly Pro Asp Thr Ile Ser Gly Ala Thr Ile Pro Gln Gly Glu Gln Ser Thr Gly Lys Ile Tyr Phe Asp Val Thr Gly Pro Ser Pro Thr Ile Val Ala Met Asn Asn Gly Met Glu Asp Leu Leu Ile Trp Glu Pro
配列番号２：ＭＰＢ４４のアミノ酸配列
Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly Pro Thr Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp Met Trp Gly Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu Leu Asn Val Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp Phe Pro Asp Ser Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Pro Asp Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro Asn Thr Gly Pro Ala Pro Gln Gly Ala
配列番号３：ＭＰＢ５３のアミノ酸配列
Ala Asp Glu Arg Leu Gln Phe Thr Ala Thr Thr Leu Ser Gly Ala Pro Phe Asp Gly Ala Ser Leu Gln Gly Lys Pro Ala Val Leu Trp Phe Trp Thr Pro Trp Cys Pro Phe Cys Asn Ala Glu Ala Pro Ser Leu Ser Gln Val Ala Ala Ala Asn Pro Ala Val Thr Phe Val Gly Ile Ala Thr Arg Ala Asp Val Gly Ala Met Gln Ser Phe Val Ser Lys Tyr Asn Leu Asn Phe Thr Asn Leu Asn Asp Ala Asp Gly Val Ile Trp Ala Arg Tyr Asn Val Pro Trp Gln Pro Ala Phe Val Phe Tyr Arg Ala Asp Gly Thr Ser Thr Phe Val Asn Asn Pro Thr Ala Ala Met Ser Gln Asp Glu Leu Ser Gly Arg Val Ala Ala Leu Thr Ser
配列番号４：ＭＰＢ６４のアミノ酸配列
Ala Pro Lys Thr Tyr Cys Glu Glu Leu Lys Gly Thr Asp Thr Gly Gln Ala Cys Gln Ile Gln Met Ser Asp Pro Ala Tyr Asn Ile Asn Ile Ser Leu Pro Ser Tyr Tyr Pro Asp Gln Lys Ser Leu Glu Asn Tyr Ile Ala Gln Thr Arg Asp Lys Phe Leu Ser Ala Ala Thr Ser Ser Thr Pro Arg Glu Ala Pro Tyr Glu Leu Asn Ile Thr Ser Ala Thr Tyr Gln Ser Ala Ile Pro Pro Arg Gly Thr Gln Ala Val Val Leu Lys Val Tyr Gln Asn Ala Gly Gly Thr His Pro Thr Thr Thr Tyr Lys Ala Phe Asp Trp Asp Gln Ala Tyr Arg Lys Pro Ile Thr Tyr Asp Thr Leu Trp Gln Ala Asp Thr Asp Pro Leu Pro Val Val Phe Pro Ile Val Gln Gly Glu Leu Ser Lys Gln Thr Gly Gln Gln Val Ser Ile Ala Pro Asn Ala Gly Leu Asp Pro Val Asn Tyr Gln Asn Phe Ala Val Thr Asn Asp Gly Val Ile Phe Phe Phe Asn Pro Gly Glu Leu Leu Pro Glu Ala Ala Gly Pro Thr Gln Val Leu Val Pro Arg Ser Ala Ile Asp Ser Met Leu Ala
配列番号５：ＭＰＢ６３前駆体のアミノ酸配列
Met Lys Leu Thr Thr Met Ile Lys Thr Ala Val Ala Val Val Ala Met Ala Ala Ile Ala Thr Phe Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Ala Tyr Pro Ile Thr Gly Lys Leu Gly Ser Glu Leu Thr Met Thr Asp Thr Val Gly Gln Val Val Leu Gly Trp Lys Val Ser Asp Leu Lys Ser Ser Thr Ala Val Ile Pro Gly Tyr Pro Val Ala Gly Gln Val Trp Glu Ala Thr Ala Thr Val Asn Ala Ile Arg Gly Ser Val Thr Pro Ala Val Ser Gln Phe Asn Ala Arg Thr Ala Asp Gly Ile Asn Tyr Arg Val Leu Trp Gln Ala Ala Gly Pro Asp Thr Ile Ser Gly Ala Thr Ile Pro Gln Gly Glu Gln Ser Thr Gly Lys Ile Tyr Phe Asp Val Thr Gly Pro Ser Pro Thr Ile Val Ala Met Asn Asn Gly Met Glu Asp Leu Leu Ile Trp Glu Pro
配列番号６：ＭＰＢ４４前駆体のアミノ酸配列
Met Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly Met Ser Arg Arg Leu Val Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Leu Val Ser Gly Leu Val Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly Pro Thr Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp Met Trp Gly Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu Leu Asn Val Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp Phe Pro Asp Ser Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Pro Asp Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro Asn Thr Gly Pro Ala Pro Gln Gly Ala
配列番号７：ＭＰＢ５３前駆体のアミノ酸配列
Met Ser Leu Arg Leu Val Ser Pro Ile Lys Ala Phe Ala Asp Gly Ile Val Ala Val Ala Ile Ala Val Val Leu Met Phe Gly Leu Ala Asn Thr Pro Arg Ala Val Ala Ala Asp Glu Arg Leu Gln Phe Thr Ala Thr Thr Leu Ser Gly Ala Pro Phe Asp Gly Ala Ser Leu Gln Gly Lys Pro Ala Val Leu Trp Phe Trp Thr Pro Trp Cys Pro Phe Cys Asn Ala Glu Ala Pro Ser Leu Ser Gln Val Ala Ala Ala Asn Pro Ala Val Thr Phe Val Gly Ile Ala Thr Arg Ala Asp Val Gly Ala Met Gln Ser Phe Val Ser Lys Tyr Asn Leu Asn Phe Thr Asn Leu Asn Asp Ala Asp Gly Val Ile Trp Ala Arg Tyr Asn Val Pro Trp Gln Pro Ala Phe Val Phe Tyr Arg Ala Asp Gly Thr Ser Thr Phe Val Asn Asn Pro Thr Ala Ala Met Ser Gln Asp Glu Leu Ser Gly Arg Val Ala Ala Leu Thr Ser
配列番号８：ＭＰＢ６４前駆体のアミノ酸配列
Met Arg Ile Lys Ile Phe Met Leu Val Thr Ala Val Val Leu Leu Cys Cys Ser Gly Val Ala Thr Ala Ala Pro Lys Thr Tyr Cys Glu Glu Leu Lys Gly Thr Asp Thr Gly Gln Ala Cys Gln Ile Gln Met Ser Asp Pro Ala Tyr Asn Ile Asn Ile Ser Leu Pro Ser Tyr Tyr Pro Asp Gln Lys Ser Leu Glu Asn Tyr Ile Ala Gln Thr Arg Asp Lys Phe Leu Ser Ala Ala Thr Ser Ser Thr Pro Arg Glu Ala Pro Tyr Glu Leu Asn Ile Thr Ser Ala Thr Tyr Gln Ser Ala Ile Pro Pro Arg Gly Thr Gln Ala Val Val Leu Lys Val Tyr Gln Asn Ala Gly Gly Thr His Pro Thr Thr Thr Tyr Lys Ala Phe Asp Trp Asp Gln Ala Tyr Arg Lys Pro Ile Thr Tyr Asp Thr Leu Trp Gln Ala Asp Thr Asp Pro Leu Pro Val Val Phe Pro Ile Val Gln Gly Glu Leu Ser Lys Gln Thr Gly Gln Gln Val Ser Ile Ala Pro Asn Ala Gly Leu Asp Pro Val Asn Tyr Gln Asn Phe Ala Val Thr Asn Asp Gly Val Ile Phe Phe Phe Asn Pro Gly Glu Leu Leu Pro Glu Ala Ala Gly Pro Thr Gln Val Leu Val Pro Arg Ser Ala Ile Asp Ser Met Leu Ala
配列番号９：ＭＰＢ６３前駆体合成遺伝子の塩基配列
CATATGAAGCTGACCACCATGATCAAGACCGCCGTCGCCGTCGTCGCCATGGCCGCCATCGCCACGTTCGCCGCCCCCGTCGCCCTCGCCGCCTACCCGATCACCGGCAAGCTGGGCTCGGAGCTGACCATGACCGACACCGTGGGCCAGGTGGTCCTGGGCTGGAAGGTGTCGGACCTGAAGTCGTCGACCGCGGTGATCCCGGGCTACCCGGTGGCCGGCCAGGTCTGGGAGGCCACCGCCACCGTCAACGCCATCCGCGGCTCGGTGACCCCGGCCGTGTCGCAGTTCAACGCCCGCACCGCCGACGGCATCAACTACCGCGTGCTGTGGCAGGCGGCCGGCCCGGACACCATCTCGGGCGCCACCATCCCGCAGGGCGAGCAGTCGACCGGCAAGATCTACTTCGACGTGACCGGCCCGTCGCCGACCATCGTCGCGATGAACAACGGCATGGAGGACCTGCTGATCTGGGAGCCGCACCACCACCACCACCACTGAGGATCC
1-6: NdeIサイト
481-498: Hisタグ
499-501: 終始コドン
502-507: BamHIサイト
配列番号１０：ＭＰＢ４４前駆体合成遺伝子の塩基配列
CATATGCAGCTTGTCGACAGGGTTCGTGGCGCCGTCACGGGTATGTCGCGTCGACTCGTGGTCGGGGCCGTCGGCGCGGCCCTAGTGTCGGGTCTGGTCGGCGCCGTCGGTGGCACGGCGACCGCGGGGGCATTTTCCCGGCCGGGCTTGCCGGTGGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGTGACATCAAGGTCCAATTCCAAAGTGGTGGTGCCAACTCGCCCGCCCTGTACCTGCTCGACGGCCTGCGCGCCCAGGACGACTTCAGCGGCTGGGATATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGGTACGACCAGTCGGGCCTGTCGGTGGTCATGCCGGTGGGTGGCCAGTCAAGCTTCTACTCCGACTGGTACCAGCCCGCCTGCGGCAAGGCCGGTTGCCAGACTTACAAGTGGGAGACCTTCCTGACCAGCGAGCTGCCGGGGTGGCTGCAAGCCAACAGGCACGTCAAGCCCACCGGAAGCGCTGTCGTCGGTCTTTCGATGGCTGCTTCTTCGGCGCTGACGCTGGCGATCTATCACCCCCAGCAGTTCGTCTACGCGGGAGCGATGTCGGGCCTGTTGGACCCCTCCCAGGCGATGGGGCCCACCCTGATCGGCCTGGCGATGGGTGACGCTGGCGGCTACAAGGCCTCCGACATGTGGGGGCCGAAGGAGGACCCGGCGTGGCAGCGCAACGACCCGCTGTTGAACGTCGGGAAGCTGATCGCCAACAACACCCGCGTCTGGGTGTACTGCGGCAACGGCAAGCCGTCGGATCTGGGTGGCAACAACCTGCCGGCCAAGTTCCTCGAGGGCTTCGTGCGGACCAGCAACATCAAGTTCCAAGACGCCTACAACGCCGGTGGCGGCCACAACGGCGTGTTCGACTTCCCGGACAGCGGTACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGCGCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGACCTGCAGCGGGCACTGGGTGCCACGCCCAACACCGGGCCCGCGCCCCAGGGCGCCCACCACCACCACCACCACTAGGGATCC
1-6: NdeIサイト
1018-1035: Hisタグ
1036-1038: 終始コドン
1039-1044: BamHIサイト
配列番号１１：ＭＰＢ５３前駆体合成遺伝子の塩基配列
CATATGTCGCTGCGGCTGGTCTCCCCCATCAAGGCGTTCGCGGACGGCATCGTGGCGGTCGCCATCGCGGTGGTGCTCATGTTCGGCCTCGCGAACACCCCGCGCGCGGTGGCGGCCGACGAGCGCCTGCAGTTCACCGCGACCACCCTGTCGGGCGCCCCGTTCGACGGCGCCTCGCTGCAGGGCAAGCCGGCGGTCCTGTGGTTCTGGACCCCGTGGTGCCCGTTCTGCAACGCCGAGGCCCCGTCGCTGTCGCAGGTGGCGGCCGCCAACCCGGCGGTGACCTTCGTGGGCATCGCCACCCGCGCGGACGTGGGCGCCATGCAGTCGTTCGTCTCGAAGTACAACCTGAACTTCACCAACCTGAACGACGCCGACGGCGTGATCTGGGCCCGCTACAACGTCCCGTGGCAGCCGGCCTTCGTGTTCTACCGCGCGGACGGCACCTCGACCTTCGTGAACAACCCGACCGCGGCCATGTCGCAGGACGAGCTGTCGGGCCGGGTCGCCGCCCTCACGAGCCACCACCACCACCACCACTGAGGATCC
1-6: NdeIサイト
523-540: Hisタグ
541-543終始コドン
544-549: BamHIサイト
配列番号１２：ＭＰＢ６４前駆体合成遺伝子の塩基配列
CATATGCGCTCGTTCTCCGTGGCGGCGTTCGCGGCGGCCCTGGTGCTGGCGGGCCCGGCGGGCGCGGCGGCGGCGGCGCCCAAGGACTACTGCGCGGACCTGAAGGGCGCCAACACCGGCCAGACCTGCCAGATCCAGATGGCGGACCCGGGCTACAACGTGGACATCTCGTTCCCGGCCAACTACCCGGACGAGCAGCCGGTCGCCGACTTCATCTCGAAGCAGCGCGACGACTTCCTGAACGCGGCCAAGTCGTCGGCCCCGCGCGACCAGCCGTACCAGCTGACCATCACCTCGGCCAAGTACGGCTCGGCCATCCCGCCGCGCGGCACCGAGGCCGTGGTCCTGAAGGTGGTCCAGAACACCGGCGCGGGCCCGCACACCACCTACAAGTCGTTCAACTGGGACCAGGCGTACCGCAAGGAGATCGTGTGGACCGCGGCCGCGGACGACAAGAAGAACACCCCGCTGTGGCGCGTGGACGACCCGCTGGCCACCGTGGCCCCGATCGTCCAGTCGGAGCTGCAGAAGCAGACCGCACCGCCGGCCAACCCGAACCAGCCGGCACCGCCGGCGAACCAGCCGGCCTCGCCGACCCCGACCGCACCGCCGGTGACCGTCGCCTCGGCGGCCGCGTACGACCCGGCGAACTACCAGTCGTTCGCCATCACCAACGACGGCGTGATCTTCTTCTTCGACCAGGGCCGCCTGCTGCCGGACTCGGCCGGCGCGCCGCAGGTCCTCGTCCCCCGCTCCGCCATCGACCCCATGCTCGCCCACCACCACCACCACCACTGAGGATCC
1-6: NdeIサイト
778-795: Hisタグ
796-798: 終始コドン
799-804: BamHIサイト
配列番号１３：マルチクローニングサイトのＤＮＡ塩基配列
GGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACC
1-6: BamHIサイト（下線部）
67-72: KpnIサイト（下線部）
配列番号１４：ＳＰ２プロモーターからＡｇ８５Ｂターミネーターまでを含むＫｐｎＩ ＤＮＡ断片の塩基配列
GGTACCATGCAGGTGGCGCGCCGCGGCCTCACCAACGCGATTGTGAGCTATCTCGAGGACAACGGGTCAGGGCGACGTGAGTAACCAGTAACCGGGTTGTGACCTCCCTTGGTAGCGGCATTTCCGCTACCAACAAGTAGGCTGTTGCATATCCCCGTGTGTACGACCAGCACGGCATACTCTAGAAGGAGAAGTACATATGGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGGATCCTCGCGCAACGGTTGCCGCTACTGGGCTTGACGGCAAGACGCCGTACAGTAGTGTGTTCGGCACCTTGAACGCTGGTCCGCCATGTTCAACGAGCCGGTCTACCTGCCCGCACCGAACAAGCTGGTGACATCGACCCATGCGGTGCGGTACC
1-6: KpnIサイト（下線部）
27-180: SP2プロモーター領域
187-194: SD配列
197-244: NdeI-BamHIマルチクローニングサイト
255-389: Ag85Bターミネーター領域
390-395: KpnIサイト（下線部）
配列番号１５：アダプターＰＢ１の塩基配列
GACCTGCTGATCTGGGAGCCGTGAG
配列番号１６：アダプターＰＢ２の塩基配列
GATCCTCACGGCTCCCAGATCAGCAG
配列番号１７：アダプターＡＰＢ１の塩基配列
CGCGCCCCAGGGCGCCTAGG
配列番号１８：アダプターＡＰＢ２の塩基配列
GATCCCTAGGCGCCCTGGGGCGCGGGCC
配列番号１９：ＰｅｐＡ前駆体タンパク質のアミノ酸配列
Met Ser Asn Ser Arg Arg Arg Ser Leu Arg Trp Ser Trp Leu Leu Ser Val Leu Ala Ala Val Gly Leu Gly Leu Ala Thr Ala Pro Ala Gln Ala Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gln Asp Arg Phe Ala Asp Phe Pro Ala Leu Pro Leu Asp Pro Ser Ala Met Val Ala Gln Val Gly Pro Gln Val Val Asn Ile Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Val Gly Ala Gly Thr Gly Ile Val Ile Asp Pro Asn Gly Val Val Leu Thr Asn Asn His Val Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Asn Ala Phe Ser Val Gly Ser Gly Gln Thr Tyr Gly Val Asp Val Val Gly Tyr Asp Arg Thr Gln Asp Val Ala Val Leu Gln Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu Pro Ser Ala Ala Ile Gly Gly Gly Val Ala Val Gly Glu Pro Val Val Ala Met Gly Asn Ser Gly Gly Gln Gly Gly Thr Pro Arg Ala Val Pro Gly Arg Val Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Gln Ala Ser Asp Ser Leu Thr Gly Ala Glu Glu Thr Leu Asn Gly Leu Ile Gln Phe Asp Ala Ala Ile Gln Pro Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Asn Gly Leu Gly Gln Val Val Gly Met Asn Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln Gly Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile Arg Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Val Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln Arg Val Val Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly Asp Val Ile Thr Ala Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr Ala Met Ala Asp Ala Leu Asn Gly His His Pro Gly Asp Val Ile Ser Val Thr Trp Gln Thr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala
配列番号２０：ＰｅｐＡ前駆体タンパク質合成遺伝子の塩基配列
CATATGTCCAACTCCCGCCGCCGCTCGCTCCGCTGGTCCTGGCTGCTCTCCGTGCTCGCCGCCGTGGGCCTGGGCCTCGCCACCGCCCCGGCCCAGGCGGCACCGCCGGCCCTGTCGCAGGACCGCTTCGCCGACTTCCCGGCCCTGCCGCTGGACCCGTCGGCGATGGTGGCCCAGGTCGGCCCGCAGGTGGTCAACATCAACACCAAGCTGGGCTACAACAACGCCGTGGGCGCGGGCACCGGCATCGTCATCGACCCGAACGGCGTGGTCCTGACCAACAACCACGTGATCGCCGGCGCGACCGACATCAACGCGTTCTCGGTGGGCTCGGGCCAGACCTACGGCGTGGACGTGGTGGGCTACGACCGCACCCAGGACGTGGCGGTCCTGCAGCTGCGCGGCGCCGGCGGCCTGCCGTCGGCCGCGATCGGCGGCGGCGTGGCGGTCGGCGAGCCGGTGGTCGCCATGGGCAACTCGGGCGGCCAGGGCGGCACCCCGCGCGCCGTGCCGGGCCGCGTGGTCGCCCTGGGCCAGACCGTCCAGGCCTCGGACTCGCTGACCGGCGCGGAGGAGACGCTGAACGGCCTGATCCAGTTCGACGCGGCCATCCAGCCGGGCGACTCGGGCGGCCCGGTGGTCAACGGCCTGGGCCAGGTGGTGGGCATGAACACCGCCGCGTCGGACAACTTCCAGCTGTCGCAGGGCGGCCAGGGCTTCGCGATCCCGATCGGCCAGGCCATGGCCATCGCGGGCCAGATCCGCTCGGGCGGCGGCTCGCCGACCGTGCACATCGGCCCGACCGCCTTCCTGGGCCTGGGCGTGGTCGACAACAACGGCAACGGCGCGCGCGTGCAGCGCGTGGTGGGCTCGGCCCCGGCCGCGTCGCTGGGCATCTCGACCGGCGACGTGATCACCGCCGTGGACGGCGCCCCGATCAACTCGGCGACCGCCATGGCCGACGCCCTGAACGGCCACCACCCGGGCGACGTGATCTCGGTCACCTGGCAGACCAAGTCGGGCGGCACCCGGACCGGCAACGTCACGCTCGCCGAGGGCCCGCCCGCCCACCACCACCACCACCACTGAGGATCC
1-6: NdeIサイト
1069-1086: Hisタグ
1087-1089: 終始コドン
1090-1095: BamHIサイト

Claims (25)

  1. 　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む、細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物。
  2. 　前記タンパク質又はその変異体が、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項１に記載のアジュバント組成物。
  3. 　前記タンパク質が、抗酸菌由来のタンパク質である、請求項１又は２に記載のアジュバント組成物。
  4. 　前記タンパク質が、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）又はマイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）由来のタンパク質である、請求項１又は２に記載のアジュバント組成物。
  5. 　薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、粘着剤、ｐＨ調整剤及び／又は等張化剤を更に含む、請求項１又は２に記載のアジュバント組成物。
  6. 　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体をコードする核酸配列を有する、前記タンパク質又はその変異体の発現用ベクター。
  7. 　前記タンパク質又はその変異体が、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項６に記載のベクター。
  8. 　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはその変異体をコードする核酸配列が導入されている、又は請求項６若しくは７に記載のベクターが導入されている、組換え細菌。
  9. 　前記組換え菌が、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・バリアント・ボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｖａｒｉａｎｔ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）から選択される、請求項８に記載の組換え細菌。
  10. 　請求項８に記載の組換え細菌由来の配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む、細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物。
  11. 　請求項８に記載の組換え細菌を培養する工程を有する、細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物の製造方法。
  12. 　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体、及びワクチン用免疫抗原を含む、ワクチン組成物。
  13. 　前記タンパク質又はその変異体が、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項１２に記載のワクチン組成物。
  14. 　前記ワクチンが、癌に対するワクチンである、請求項１２又は１３に記載のワクチン組成物。
  15. 　前記ワクチンは、悪性黒色腫、肺癌、大腸癌、膀胱癌から選択される１種又は複数に対するワクチンである、請求項１２又は１３に記載のワクチン組成物。
  16. 　配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む、医薬組成物。
  17. 　前記タンパク質又はその変異体が、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 　腫瘍細胞の増殖抑制に用いるための、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
  19. 　前記腫瘍細胞中で発現しているタンパク質又はその断片を抗原として含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 　癌の治療に用いるための、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
  21. 　他の薬剤を更に含む、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
  22. 　他の薬剤と併用して用いられる、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
  23. 　細胞性免疫を増強するためのアジュバント組成物の製造における、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体の使用。
  24. 　ワクチン組成物の製造における、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体の使用。
  25. 　医薬組成物の製造における、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体の使用。
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