WO2023179462A1 - 阳离子脂质化合物及其制备方法和应用、以及mRNA递送系统 - Google Patents

阳离子脂质化合物及其制备方法和应用、以及mRNA递送系统 Download PDF

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苏焘
李红燕
李三朋
郭凤娟
何华美
万季
潘有东
王弈
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深圳市新合生物医疗科技有限公司
北京新合睿恩生物医疗科技有限公司
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to the field of medical biotechnology, and in particular to cationic lipid compounds, their preparation methods and applications, and mRNA delivery systems.
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • RNA polymerase RNA polymerase
  • A, U, G, C ribonucleoside triphosphates
  • mRNA can carry and transmit genetic information stored in DNA in the cell nucleus, and plays a key role in the conversion of genetic information into functional proteins.
  • immature mRNA is processed and modified into mature mRNA through steps such as capping, tailing, and intron splicing.
  • Mature mRNA can accurately guide the protein synthesis process in the cytoplasm. Relatively speaking, because mRNA has a much smaller molecular weight than DNA, it is easy to transfect and does not have the risk of cancer caused by integrating into host DNA and causing insertional mutations. Therefore, using mRNA as preventive and therapeutic drugs has huge advantages and potential in the prevention and treatment of various diseases.
  • mRNA nucleic acid drugs use molecular biology methods to introduce the target functional gene or the functional subunit of the target gene into the patient's body in the form of messenger ribonucleic acid.
  • targeted intracellular delivery late inclusion body escape, intracellular translation and Post-translational processing modification to express a specific function
  • Functional proteins used to prevent (functional proteins or subunits activate the host immune system to produce corresponding humoral or cellular immune responses) or treat diseases (the expressed proteins or subunits have the function of treating diseases or regulating the expression of other genes) is a prevention strategy.
  • mRNA nucleic acid drugs can directly activate the body to produce functional antibodies or cellular immune responses against specific pathogens at the molecular level, or repair disease-causing genes or correct the expression of abnormal genes in a targeted manner, thereby achieving a variety of diseases.
  • mRNA nucleic acid drugs can achieve effects that cannot be replaced by traditional drugs. For example, monoclonal antibody drugs can only act on the cell surface, while mRNA nucleic acid drugs can not only act on proteins outside the cell membrane, but also on intracellular proteins, and can even Acts within the cell nucleus and has precise targeting.
  • RNA nucleic acid drugs have huge advantages and potential in regulating gene expression and preventing and treating malignant diseases.
  • many difficulties are faced in the development, preparation and subsequent systemic administration of such drugs.
  • mRNA exists in the form of a single strand, making it extremely unstable in vitro and under physiological conditions. It is not only easily degraded by RNA nuclease (RNAase) in the air or blood, but also easily degraded by tissues and organs such as the liver and spleen.
  • RNAase RNA nuclease
  • due to the negative charge of mRNA it is difficult for it to pass through the cell membrane and enter the interior of the cell; thirdly, it is difficult for mRNA to escape from the endosome and enter the cytoplasm to play its role.
  • uracil ribonucleoside (U) of mRNA is prone to immunogenicity.
  • the generation of immunogenicity may increase the potential toxic and side effects of mRNA drugs.
  • the proneness to off-target effects is also an important challenge faced by mRNA nucleic acid drugs during the preparation and administration process. Therefore, the development of intracellular delivery system (LNP) for mRNA nucleic acid drugs has made it The key to large-scale clinical application.
  • cationic lipids are an important component of the mRNA delivery system (LNP). Therefore, there is an urgent need to develop cationic lipids with high delivery efficiency and excellent immune activation properties.
  • the present invention provides a cationic lipid compound, its preparation method and application, and an mRNA delivery system.
  • the main purpose is to develop a cationic lipid compound.
  • the cationic lipid compound is used to prepare an mRNA delivery system and has the ability to deliver It features high efficiency, organ-targeted delivery, and excellent immune activation properties.
  • the present invention mainly provides the following technical solutions:
  • embodiments of the present invention provide a cationic lipid compound, wherein the structure of the cationic lipid compound is represented by the following formula (I):
  • X is O or N; n is 2-4; m is 2-4; a is 0 or 1; R 1 is a chain structure containing a tertiary amine; R 2 is A linear fatty acyl group or a branched chain fatty acyl group; R 3 is a branched chain fatty acyl group.
  • the chain structure containing a tertiary amine is a chain structure of a tertiary amine, preferably: any of them.
  • the linear fatty acyl group is a C8-C16 linear fatty acyl group, preferably C10-C14 linear fatty acyl group, more preferably any of them.
  • the number of C atoms in the long chain is less than or equal to 16, and the number of C atoms in the short chain is less than or equal to the number of C atoms in the long chain; preferably, the number of C atoms in the long chain is less than or equal to 16.
  • the cationic lipid compound is any one of the following compounds:
  • the chemical formula for preparing compound 1 to compound 5 and compound 7 is as follows:
  • compound N and compound M are selected from:
  • the compound N and compound M are selected from:
  • the compound N and compound M are selected from:
  • the compound N and compound M are selected from:
  • the compound N and compound M are selected from:
  • the compound N and compound M are selected from:
  • the preparation steps of compound 1 include: first adding raw materials 1-10, pyridine, 4-dimethylaminopyridine, and acetonitrile into the reaction vessel at room temperature; and then adding p-nitrophenylmethyl chloride thereto.
  • Acid ester react, after the reaction set time, the TLC spot plate shows the formation of a new main point; then add 3-diethylamino-1-propanol to the reaction system, react; after the reaction is completed, perform extraction and liquid separation Treatment; wash, dry, and purify the organic phase to obtain a colorless oily product compound 1.
  • the chemical formula for preparing raw materials 1-10 is as follows:
  • the preparation steps of raw materials 1-10 include: adding raw materials 1-9, methanol, and hydrated palladium on carbon into the reaction vessel at room temperature; replacing them with inert gas and hydrogen several times in sequence, and then reacting; After completion, suction filtration is performed to remove the palladium carbon; the filtrate is spin-dried, and the colorless oily product obtained is used as raw material 1-10.
  • the preparation steps include: adding raw materials into the container under room temperature conditions Pyridine, 4-dimethylaminopyridine, acetonitrile; after dissolving, add p-nitrophenyl chloroformate to react; TLC monitor until a new fluorescent point is generated; then, add 3-nitrophenyl chloroformate to the reaction system Dimethylamino-1-propanol is reacted; after the reaction is completed, extraction and liquid separation are performed, and the organic phase is washed, dried, and purified to obtain the desired compound.
  • the chemical formula for preparing compound 19 to compound 20 is as follows:
  • the preparation steps of compound 19 to compound 20 include: adding raw materials into the reaction vessel Pyridine, 4-dimethylaminopyridine, and acetonitrile; after being fully dissolved, add p-nitrophenyl chloroformate and react; monitor with TLC until a new fluorescent point is generated; then, add 3 -Dimethylamino-1-propanol, react overnight; after the reaction is completed, perform extraction and liquid separation, wash, dry and purify the organic phase to obtain compound 19-compound 20.
  • the chemical formula for preparing compound 6 is as follows:
  • the preparation steps of the compound 6 are as follows: under ice-water bath conditions, add the raw materials 1-10 and DMF to the reaction vessel, mix and dissolve, cool to 0-5°C, and then add the raw materials 1-10 and DMF to the reaction vessel. Add sodium hydride in batches to react. After setting the reaction time, add raw material 6-1 dropwise into the reaction system to react; after the reaction is completed, quench, extract and separate, dry, and purify in sequence to obtain Colorless oily compound 6.
  • the chemical formula for preparing compound 23 is as follows:
  • the preparation step of compound 23 includes: adding raw material 23-6, pyridine, 4-dimethylaminopyridine, and acetonitrile into the reaction vessel at room temperature; after being fully dissolved, adding p-nitrobenzene thereto React with chloroformate and monitor with TLC until a new fluorescent point is generated; then, add 3-dimethylamino-1-propanol to the reaction system and react overnight; after the reaction is completed, perform extraction and liquid separation After treatment, the organic phase was washed, dried and purified to obtain compound 23.
  • embodiments of the present invention also provide an mRNA delivery system, wherein the mRNA delivery system includes the cationic lipid compound described in any one of the above.
  • the cationic lipid compound Compared with the prior art, the cationic lipid compound, its preparation method and application, and the mRNA delivery system of the present invention have at least the following beneficial effects:
  • embodiments of the present invention develop a new cationic lipid compound, the structure of which is shown in formula (I).
  • the cationic lipid compound is used to prepare an mRNA delivery system and has the characteristics of high delivery efficiency, organ-targeted delivery, immunity It has the characteristics of excellent activation properties and good safety.
  • embodiments of the present invention provide an mRNA delivery system LNP. Since the mRNA delivery system includes the above-mentioned cationic lipid compound, the mRNA delivery system LNP has high delivery efficiency, organ-targeted delivery, and excellent immune activation properties. , good safety features.
  • Figure 1 is a diagram of the cell transfection efficiency of the lipid nanoparticle preparation prepared by Compound 1 of the present invention and the control; wherein, the picture (a) shows the fluorescence of the lipid nanoparticle preparation prepared by Compound 1 and the control nanoparticles after transfection of cells The relative luciferase activity; (b) The picture shows the normalized results of the relative luciferase activity of cells transfected with two lipid nanoparticles.
  • Figure 2 is a diagram of the in vivo transfection efficiency of lipid nanoparticle preparations prepared from Compound 1 of the present invention and the control; wherein, (a) is a diagram of luciferase distribution in major organs after 6 hours of tail vein injection of lipid nanoparticles in mice. and the quantitative results of liver and spleen distribution; (b) The picture shows the luciferase distribution map of major organs and the quantitative results of liver and spleen distribution in mice 6 hours after intramuscular injection of lipid nanoparticles.
  • Figure 3 is a diagram of the in vivo transfection efficiency of lipid nanoparticle preparations prepared from compounds of the present invention and controls;
  • Figure 4A, Figure 4B, and Figure 4C are diagrams of the transfection effects of different parts of the lipid nanoparticle preparation prepared by the compound of the present invention and the control; wherein, Figure 4A is the quantitative result of liver distribution in mice 6 hours after intramuscular injection; Figure 4B Figure 4C shows the quantitative results of spleen distribution in mice 6 hours after intramuscular injection. Figure 4C shows the quantitative results of lymph node distribution in mice 6 hours after intramuscular injection.
  • Figure 5 is a diagram showing the immune activation effect of the lipid nanoparticle preparation prepared from Compound 1 of the present invention and the control transfected with hIL-2 mRNA in vivo; wherein, (a) is the plasma hIL-2 concentration, (b) is the plasma hIL-2 concentration IFN- ⁇ concentration.
  • reaction solution slowly add saturated ammonium chloride solution to quench, then add ethyl acetate to extract, separate, dry, and spin dry to obtain a light yellow oily liquid, then add silica gel to mix the sample, and pass through column chromatography
  • the product compound 6 was obtained as a colorless oil.
  • ethyl acrylate (1.56 g, 15.6 mmol) was dropped into the reaction system. After the dripping was completed, the mixture was raised to room temperature and refluxed overnight. Add acetic acid aqueous solution (0.8g glacial acetic acid dissolved in 5mL water) to the system, and then continue to heat and reflux for 2 hours. The reaction system was lowered to room temperature, and the aqueous phase was adjusted to saturation with solid sodium chloride, extracted three times with diethyl ether (20 mL), the organic phase was dried and spin-dried, and then mixed with silica gel, and the product 15-2 was obtained by column chromatography.
  • acetic acid aqueous solution 0.8g glacial acetic acid dissolved in 5mL water
  • raw material 15-8 (1.0g, 1.4mmol) and tetrahydrofuran (20mL, used to dissolve raw material 15-8) into a 50mL single-necked flask; after mixing evenly, add tetrabutylene dropwise to it After the dropwise addition of a tetrahydrofuran solution of ammonium fluoride (1 mol/L, 2.1 mL), continue the reaction at room temperature for 2 hours, and then monitor by TLC until the raw material reaction is complete. Water (50 mL) was slowly added to the reaction system, most of the organic phase was removed under reduced pressure, and ethyl acetate (50 mL) was added. Extract and separate the liquids, wash the organic phase once with saturated sodium chloride solution (20 mL), dry, spin dry, use silica gel to mix the sample, and obtain product 15-9 through column chromatography.
  • N,N-dimethylformamide (50mL) solution in an ice-water bath, carefully add sodium hydride (1.5g, 37.6mmol, w/w60%) in batches to the N,N-dimethylformamide (50mL) solution in a 250mL flask with a thermometer. After mixing evenly, N,N-dimethylformamide (20 mL) of raw material 16-1 (2g, 12.5mmol) was slowly dropped into the system. React for 30 minutes. After no bubbles emerge, slowly add a solution of 4-benzyloxyiodobutane (8g, 27.6mmol) in N,N-dimethylformamide (40mL) to the system and continue the reaction for two seconds. hours, and monitored by TLC until the reaction of the raw materials was complete.
  • sodium hydride 1.5g, 37.6mmol, w/w60%
  • the temperature of the system can be slowly raised to 50°C and monitored by TLC until the raw material reaction is complete.
  • saturated ammonium chloride solution (10 mL) to the system for quenching, and then add (200 mL) water to dilute.
  • Ethyl acetate 200 mL was used for extraction and separation.
  • the organic phase was washed once with saturated sodium chloride solution (100 mL), dried, and spin-dried. The mixture was then mixed with silica gel, and the product 16-2 was obtained by column chromatography.
  • raw material 16-7 (1.0g, 3.3mmol), undecanoic acid (614mg, 3.3mmol), 4-dimethylaminopyridine (476mg, 3.9mmol) and dichloro Methane (40 mL), mix and dissolve completely, add 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (757 mg, 3.9 mmol) in batches to the system, react overnight, and perform TLC Monitor until raw materials react completely. Then add ethyl acetate (100 mL) and water (100 mL) for extraction and separation. The organic phase is washed once with saturated sodium chloride (50 mL), dried and spin-dried. Then, silica gel is added for sample mixing, and the product is obtained by column chromatography. 16-8.
  • the preparation method of compound 20 is as follows:
  • raw material 20-4 (1.0g, 2.4mmol), methanol (20mL), and hydrous palladium on carbon (5% palladium content, 100mg, 10%wt) into a 50mL single-mouth bottle, first add nitrogen After 3 replacements, the hydrogen balloon was filled. After 3 replacements with hydrogen, the reaction was carried out overnight and monitored by TLC until the raw material reaction was complete. Then, suction filtration was performed using diatomaceous earth to remove palladium carbon, and the filtrate was spin-dried to obtain a crude product that was directly used in subsequent reactions without further purification.
  • LCMS monitors the completion of the reaction, and then adds ethyl acetate (30 mL) and water (30 mL) to the system for extraction and separation. Wash the organic phase once with saturated sodium chloride solution (20 mL), dry it, and then use silica gel. The sample was stirred, and the final product compound 23 was obtained through column chromatography (mobile phase + gradient).
  • the above compound 1 of the present invention was mixed with DSPC, cholesterol and DMG-PEG2000 at 50: Dissolve in absolute ethanol at a molar ratio of 10:38.5:1.5 to prepare an ethanol lipid solution.
  • Lipid nanoparticles were prepared by mixing the ethanol-lipid solution and the mRNA aqueous solution at a volume ratio of 1:3 using a microfluidic device, and were left to dialyze for 18 hours to remove the ethanol and complete the PBS replacement. Finally, the lipid nanoparticle solution was filtered through a 0.22 ⁇ m sterile filter and concentrated by ultrafiltration to finally obtain compound 1 lipid nanoparticle preparation encapsulating luciferase or interleukin 2 mRNA.
  • MC3 lipid nanoparticle formulation was prepared as a control.
  • compound 2 compound 3, compound 4, compound 5, compound 6, compound 7, compound 9, compound 12, compound 13, compound 15, and compound 16 were prepared into lipid nanoparticle preparations.
  • the specific preparation steps were the same as those of compound 1.
  • the preparation steps are the same.
  • Lipid nanoparticle size, polydispersity index (PDI) and potential (Zeta) were determined using Litesizer TM 500 (Anton Paar, Austria). Among them, the particle size and potential were measured in 0.1% PBS. The encapsulation efficiency of lipid nanoparticle formulations was obtained by RiboGreen detection method. The test results are shown in Table 1:
  • Compound 1 of the present invention as an ionic lipid, can form lipid nanoparticles, and its basic physical and chemical properties are almost the same as those of the control MC3.
  • the lipid nanoparticle preparation of Compound 1 encapsulating Luc mRNA in Example 1 was prepared. at the same time, An MC3 lipid nanoparticle formulation was prepared as a control.
  • the above two preparations were diluted to 320ng/mL with culture medium and added to Hek293 cells. After 24 h of transfection, the culture medium was removed and washed with PBS. Cell lysis buffer was then added and incubated for 10 min. After lysis is completed, luciferase substrate is added, and the luminescent signal is detected using a multifunctional microplate reader with a chemiluminescence module. The test results are shown in Figure 1.
  • mice were divided into four groups, with 4 mice in each group. Each group received a single injection of MC3 or Compound 1 lipid nanoparticle preparation intravenously (see (a) in Figure 2, 10 ⁇ g/animal) or intramuscularly (see (b) in Figure 2, 5 ⁇ g/animal). After 6 hours, luciferase substrate was injected intraperitoneally, and after waiting for 10 minutes, the liver, lung, kidney, and spleen were dissected and harvested, and the signals were observed and quantified using an intravital imager.
  • mice were divided into different groups, with 3 mice in each group. Each group was intramuscularly injected with MC3 or the lipid nanoparticle preparation prepared in Example 1 at a dose of 2.5 ⁇ g/animal. After 6 hours, luciferase substrate was injected intraperitoneally, and after waiting for 10 minutes, the signal at the injection site was observed and quantified using an in vivo imager. Then dissect and Organs such as the liver, spleen, lymph nodes, etc. were taken, and the signals of each organ were quantified again.
  • Figure 4A, Figure 4B, and Figure 4C are statistical diagrams of the transfection effect of different parts of the lipid nanoparticle preparation prepared by the compound of the present invention and the control; wherein, Figure 4A is the quantitative result of liver distribution in mice 6 hours after intramuscular injection; Figure 4B shows the quantitative results of spleen distribution in mice 6 hours after intramuscular injection; Figure 4C shows the quantitative results of lymph node distribution in mice 6 hours after intramuscular injection. It can be seen from Figure 4A, Figure 4B, and Figure 4C that compared to the control (MC3 lipid nanoparticle preparation), the expression of the compound lipid nanoparticle preparation in the spleen and lymph nodes of the embodiment of the present invention is significantly higher than that of MC3. It can be seen from this that the delivery organ of the cationic lipid compound of the present invention is the spleen and/or lymph nodes, indicating that it has organ targeting.
  • Lipid nanoparticle formulations were used to transfect hIL2 mRNA in vivo for immune activation.
  • mice were divided into 2 groups according to body weight, with 4 mice in each group. Each group was intravenously injected with two lipid nanoparticle preparations, MC3 or Compound 1, at a dose of 10 ⁇ g/animal. Blood was collected at 3h, 6h, and 24h after administration, and Elisa was used to detect the concentration of plasma hIL-2 (see Figure 5 (a)) and IFN- ⁇ (see Figure 5 (b)).
  • the cationic lipid compound developed in the present invention has the technical effects of high delivery effect, organ-targeted delivery, and excellent immune activation properties when used for mRNA delivery.

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Abstract

本发明公开一种阳离子脂质化合物及其制备方法和应用、以及mRNA递送系统；解决亟需开发递送效率高、免疫激活特性优异的阳离子脂质的问题。其中，阳离子脂质化合物的结构如式(I)所示；其中，在式(I)：X为O或N；n为2-4；m为2-4；a为0或1；R 1为包含三级胺的链状结构；R 2为直链状脂肪酰基或具有支链的链状脂肪酰基；R 3为具有支链的链状脂肪酰基。本发明主要用于开发一种阳离子脂质化合物，该阳离子脂质化合物用于制备mRNA递送系统，具有递送效率高、器官靶向递送、以及免疫激活特性优异的特点。

Description

阳离子脂质化合物及其制备方法和应用、以及mRNA递送系统
本公开要求于2022年03月25日提交中国专利局、申请号为2022103011731、发明名称为“阳离子脂质化合物及其制备方法和应用、以及mRNA递送系统”的中国专利申请的优先权，以及要求于2023年03月06日提交中国专利局、申请号为2023102039819、发明名称为“阳离子脂质化合物及其制备方法和应用、以及mRNA递送系统”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本公开中。
技术领域
本发明涉及一种医药生物技术领域，特别是涉及阳离子脂质化合物及其制备方法和应用、以及mRNA递送系统。
背景技术
mRNA(信使核糖核酸)是由DNA(脱氧核糖核酸)双链中的一条链为模板(template)，在RNA聚合酶(RNA polymerase)的催化作用下，以4种三磷酸核糖核苷(A、U、G、C)为底物，通过磷酸二酯键聚合而成的一类单链核糖核酸。mRNA能够携带并传递细胞核内DNA所存储的遗传信息，在遗传信息向功能性蛋白的转换过程中发挥着关键作用。在细胞质中，未成熟的mRNA通过加帽，加尾，以及内含子剪切等步骤完成加工修饰变成成熟的mRNA，成熟的mRNA能够精确指导细胞质中蛋白质的合成过程。相对来说，由于mRNA比DNA的分子量小得多，易于转染，并且不会有整合到宿主DNA而引发插入突变的致癌风险。因此，以mRNA为预防性和治疗性药物，在多种疾病的防治方面有着巨大的优势和潜力。
mRNA核酸类药物是利用分子生物学的方法将目的功能基因或者目的基因的功能亚单位通过信使核糖核酸的形式导入患者体内，经靶向性胞内递送，晚期内含体逃逸，细胞内翻译及翻译后加工修饰，表达出具有特定功 能的蛋白质，用以预防(功能性蛋白或者亚单位激活宿主免疫系统产生相应体液免疫或细胞免疫反应)或治疗疾病(表达出的蛋白或者亚单位具有治疗疾病的功能或调节其他基因表达的作用)的一种防治策略。
mRNA核酸类药物的优势在于它可以直接在分子水平上激活机体产生针对特定病原体的功能性抗体或细胞免疫反应，或者有针对性地修复致病基因或纠正异常基因的表达，从而达到多种疾病预防和治疗的作用。mRNA核酸类药物可以达到传统药物无法替代的效果，例如单克隆抗体药物只能作用于细胞表面，而mRNA核酸类药物不仅可以针对细胞膜外蛋白发挥作用，也可以对细胞内蛋白发挥作用，甚至可以在细胞核内发挥作用，并具有精确的靶向性。在人类面临的7000多种疾病中，约1/3的疾病是由于功能性基因的表达出现了问题(缺失、降低或过表达)，如血友病(Hemophilia)、杜氏肌营养不良(DMD)、囊性纤维化(Cysticfibrosis)和严重的免疫缺陷综合征(SCID)等，在临床上几乎是无药可治，而mRNA核酸类药物对这种单基因疾病非常有优势。在个性化医疗以及精准医疗普及的时代背景下。理论上，由患者基因差异或基因表达异常引起的疾病，都可利用mRNA核酸药物对其进行精准有效的治疗。
mRNA核酸类药物虽然在调控基因表达及恶性疾病的预防和治疗中有巨大的优势和潜力。但此类药物的研发、制备以及后续系统给药中均面临着诸多困难。首先，mRNA是以单链的形式存在，导致mRNA在体外及生理条件下极不稳定，不仅易被空气中或血液中的RNA核酸酶(RNAase)所降解，还易被肝脏、脾脏等组织器官中单核巨噬细胞清除；其次，由于mRNA带负电性，使其难以穿过细胞膜进入到细胞内部；再次，mRNA难以从内涵体逃逸并进入细胞质中发挥作用。此外，mRNA的尿嘧啶核糖核苷(U)易产生免疫原性，在某些情况下，免疫原性的产生有可能会增加mRNA药物潜在的毒副作用。最后，易产生脱靶效应也是mRNA核酸类药物在制备以及给药过程中面临的重要挑战。因此，mRNA核酸类药物胞内递送系统(LNP)的开发，使其 能够大规模临床应用的关键所在。在此，阳离子质脂是mRNA递送系统(LNP)的重要组成部分，所以，亟需开发递送效率高、免疫激活特性优异的阳离子质脂。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种阳离子脂质化合物及其制备方法和应用、以及mRNA递送系统，主要目的在于开发一种阳离子脂质化合物，该阳离子脂质化合物用于制备mRNA递送系统，具有递送效率高、器官靶向递送、以及免疫激活特性优异的特点。
为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：
一方面，本发明的实施例提供一种阳离子脂质化合物，其中，所述阳离子脂质化合物的结构如下述式(I)所示：
其中，在所述式(I)中：X为O或N；n为2-4；m为2-4；a为0或1；R1为包含三级胺的链状结构；R2为直链状脂肪酰基或具有支链的链状脂肪酰基；R3为具有支链的链状脂肪酰基。
优选的，所述包含三级胺的链状结构为三级胺的链状结构，优选为： 中的任一种。
优选的，所述直链状脂肪酰基为C8-C16的直链状脂肪酰基，优选为 C10-C14的直链状脂肪酰基，进一步优选为 中的任一种。
优选的，在所述具有支链的链状脂肪酰基中：长链的C原子个数小于等于16，短链的C原子个数小于等于长链的C原子个数；优选的，所述具有支链的链状脂肪酰基；进一步优选的，所述具有支链的链状脂肪酰基为、中的任一种。
优选的，所述阳离子脂质化合物为以下化合物中的任一种：




优选的，所述化合物1-化合物5、化合物7的制备化学方程式如下：
其中，当所制备的化合物为化合物1时，所述化合物N、化合物M选用：
当所制备的化合物为化合物2时，所述化合物N、化合物M选用：
当所制备的化合物为化合物3时，所述化合物N、化合物M选用：
当所制备的化合物为化合物4时，所述化合物N、化合物M选用：
当所制备的化合物为化合物5时，所述化合物N、化合物M选用：
当所制备的化合物为化合物7时，所述化合物N、化合物M选用：
优选的，所述化合物1的制备步骤包括：在室温条件下，先向反应容器中加入原料1-10、吡啶、4-二甲氨基吡啶、乙腈；再向其中加入对硝基苯基氯甲酸酯，进行反应，反应设定时间后，TLC点板显示形成一个新的主点；再向反应体系中加入3-二乙氨基-1-丙醇，进行反应；反应结束后进行萃取分液处理；对有机相进行洗涤、干燥、纯化处理，得到无色的油状产品化合物1。
优选的，原料1-10的制备化学方程式如下：
优选的，原料1-10的制备步骤包括：在室温条件下，向反应容器中加入原料1-9、甲醇，以及有水钯碳；依次用惰性气体、氢气置换多次后，进行反应；反应结束后，进行抽滤处理以除去钯碳；将滤液旋干，得到的无色的油状产品为原料1-10。
优选的，所述化合物9、化合物12、化合物13、化合物15、化合物16、化合物18的制备化学方程式如下：
其中，制备步骤包括：在室温条件下，向容器中加入原料吡啶、4-二甲氨基吡啶、乙腈；溶解后，向其中加入对硝基苯基氯甲酸酯，进行反应；TLC监控，直至产生一个新的荧光点；然后，向反应体系中加入3-二甲氨基-1-丙醇，进行反应；反应结束后，进行萃取分液处理，并对有机相进行洗涤、干燥、纯化处理，得到所需化合物。
优选的，所述化合物19-化合物20的制备化学方程式如下：
优选的，所述化合物19-化合物20的制备步骤包括：向反应容器中加入原料吡啶、4-二甲氨基吡啶、乙腈；充分溶解后，向其中加入对硝基苯基氯甲酸酯，进行反应；TLC监控，直至产生一个新的荧光点；然后，向反应体系中加入3-二甲氨基-1-丙醇，反应过夜；反应完成后，进行萃取分液处理，对有机相进行洗涤、干燥、纯化后，得到化合物19-化合物20。
优选的，所述化合物6的制备化学方程式如下：
其中，所述化合物6的制备步骤如下：在冰水浴条件下，向反应容器中，加入原料1-10和DMF，混合溶解，冷却至0-5℃，然后再向反应容器 中分批加入氢化钠进行反应，反应设定时间后，将原料6-1加入滴到反应体系中，进行反应；反应结束后，依次进行淬灭、萃取分液、干燥、纯化处理后，得到无色的油状化合物6。
优选的，所述化合物23的制备化学方程式如下：
优选的，所述化合物23的制备步骤包括：在室温条件下，向反应容器中加入原料23-6、吡啶、4-二甲氨基吡啶、乙腈；充分溶解后，再向其中加入对硝基苯基氯甲酸酯进行反应，TLC监控，直至产生一个新的荧光点；然后，再向反应体系中在加入3-二甲氨基-1-丙醇，反应过夜；反应结束后，进行萃取分液处理，将有机相洗涤、干燥及纯化处理后，得到化合物23。
再一方面，上述任一项所述的阳离子脂质化合物在制备mRNA递送系统中的应用。
再一方面，本发明实施例还提供一种mRNA递送系统，其中，所述mRNA递送系统包括上述任一项所述的阳离子脂质化合物。
与现有技术相比，本发明的阳离子脂质化合物及其制备方法和应用、以及mRNA递送系统至少具有下列有益效果：
一方面，本发明实施例开发一种新的阳离子脂质化合物，其结构如式(I)所示，该阳离子脂质化合物用于制备mRNA递送系统，具有递送效率高、器官靶向递送、免疫激活特性优异、安全性好的特点。
另一方面，本发明实施例提供一种mRNA递送系统LNP，由于该mRNA递送系统包括上述的阳离子脂质化合物，因此，该mRNA递送系统LNP具有递送效率高、器官靶向递送、免疫激活特性优异、安全性好的特点。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的 技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是由本发明的化合物1制备的脂质纳米颗粒制剂和对照的细胞转染效率图；其中，(a)图为由化合物1制备的脂质纳米颗粒制剂和对照纳米颗粒转染细胞后荧光素酶相对活性；(b)图为两种脂质纳米颗粒转染细胞荧光素酶相对活性归一化结果。
图2是由本发明的化合物1制备的脂质纳米颗粒制剂和对照的体内转染效率图；其中，(a)图为小鼠尾静脉注射脂质纳米颗粒6小时后主要器官荧光素酶分布图及肝、脾分布定量结果；(b)图为小鼠肌肉注射脂质纳米颗粒6小时后主要器官荧光素酶分布图及肝、脾分布定量结果。
图3是由本发明的化合物制备的脂质纳米颗粒制剂和对照的体内转染效率图；
图4A、图4B、图4C是由本发明的化合物制备的脂质纳米颗粒制剂和对照的不同部位的转染效果图；其中，图4A为小鼠肌肉注射6小时后肝脏分布定量结果；图4B为小鼠肌肉注射6小时后脾分布定量结果；图4C为小鼠肌肉注射6小时后淋巴结分布定量结果。
图5是由本发明的化合物1制备的脂质纳米颗粒制剂和对照在体内转染hIL-2mRNA的免疫激活效果图；其中，(a)图是血浆hIL-2浓度，(b)图是血浆中的IFN-γ浓度。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定 特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
在此详细说明本发明的阳离子脂质化合物的制备方法，具体如下：
1.化合物1
化合物1的制备方法如下：
在冰水浴条件下，于插入温度计的500mL三口瓶中，分别加入化合物顺式-1,2-二羟甲基乙烯1-1(原料1-1，33.0g，0.375mol)、以及无水四氢呋喃(300mL，用于溶解原料1-1)；冷却至0-5℃后，向该反应体系中分批、缓慢地加入已经称量好的氢化钠(60％含量，0.45mol，18.0g),反应30分钟后，将溴化苄(63.75g，0.375mol)通过恒压滴液漏斗加入到上述反应体系中，滴加完毕，反应2小时后，TLC(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)高锰酸钾显色显示原料已反应完全，有一新的主点产生，停止反应。向反应液中，缓慢加入饱和的氯化铵溶液进行淬灭，然后加入乙酸乙酯进行萃取分液处理，将有机相干燥，旋干，得到淡黄色油状液体，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝20:1到5:1)得到无色的油状产品1-2(34g,50.9％)。
在室温条件，于250mL的密封管中，分别加入原料1-2(34g，0.19mol)、正丙酸(4.94g，0.07mol),原甲酸三乙酯(184.7g，1.14mol)，混合均匀密封后，然后升温至150℃的温度，反应3小时后，冷却，TLC点板，显示原料反应完全，然后加入乙酸乙酯(500mL)与水(500mL)进行萃取分液，将有机相在用碳酸氢钠溶液(300mL)洗涤2-3次，直到无气泡冒出，将有机相干燥旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝10：1到4：1)得到淡黄色的油状产品1-3(33g，69.7％)。
在冰水浴下条件，于500mL的三口瓶中，加入原料1-3(33.0g，0.133mol，1.0eq.)与无水四氢呋喃(300mL)，然后分批小心的加入四氢铝锂固体(6.87g，0.146mol)，加入完毕后，将反应液的温度缓慢升至室温，反应2小时后，TLC监控，原料反应完全。然后，向反应液中加入乙酸乙酯(50mL)进行稀释，再向反应液中缓慢加入水(6.8mL)、15％NaOH水溶液(6.8mL)与水(20mL)进行淬灭，然后抽滤，将滤饼用乙酸乙酯(50mL)洗涤3次；合并有机相后旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50：1到20：1)得到淡黄色的油状产品1-4(17g，62％)。
在室温条件下，于250mL的单口瓶中，加入原料1-4(17.0g，82.5mmol)、咪唑(8.42g，123.8mmol)与无水二氯甲烷，然后缓慢加入叔丁基二甲基氯硅烷(14.85g，99mmol)，滴加完毕，反应过夜，TLC监控，原料大部分反应完全。然后向反应中加入二氯甲烷(200mL)与水(200mL)进行萃取分液；将有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次后，进行干燥，旋干，然后加入 硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝20：1到10：1)得到淡黄色的油状产品1-5(14g，53.0％)。
在室温条件下，于250mL的三口瓶中，加入原料1-5(13.0g，40.6mmol)、无水四氢呋喃(100mL)，真空置换氮气3次后，然后加入硼烷二甲硫醚溶液(10mol/L，6.1mL，60.9mmol)，室温反应3小时后，TLC监控，原料点消失，然后缓慢加入3mol/mL的NaOH溶液(13.5mL，40.6mmol)和双氧水(37％含量，13.5mL)反应过夜。TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入饱和的亚硫酸氢钠溶液进行淬灭，用乙酸乙酯(100mL)与水(100mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次后进行干燥、旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5：1到2：1)得到无色的油状产品1-6(9g，60.8％)。
在室温条件下，于250mL的单口瓶中，加入原料1-6(9.0g，26.6mmol)、十二酸(6.4g，32.0mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(6.1g，32.0mmol)、N,N-二甲基吡啶(3.9g，32.0mmol)和二氯甲烷(150mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全；然后向反应液中加入乙酸乙酯(200mL)与水(200mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次后，进行干燥、旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝50：1到20：1)得到无色的油状产品1-7(13g，94％)。
在室温条件下，于500mL的单口瓶中，加入原料1-7(13.0g，25.0mmol)和二氯甲烷溶液(150mL)，然后加入三氟乙酸(50mL)，反应1小时，TLC监控，原料大部分反应完全；将反应液旋干，然后向其中加入乙酸乙酯(100mL)与水(100mL)进行萃取分液，将有机相在用饱碳酸氢钠洗涤2-3次后，进行干燥、旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝10：1到5：1)得到无色的油状产品1-8(9.0g，88.7％)。
在室温条件下，于500mL的单口瓶中，加入原料1-8(9.0g，22.1mmol)、2-辛基癸酸(7.55g，26.6mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(5.1g，26.6mmol)、4-二甲氨基吡啶(3.27g，26.6mmol)和二氯甲烷(150mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全。然后向反应液中加入乙酸乙酯(200mL)与水(200mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次后进行干燥、旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝100：1到20：1)得到淡黄色的油状产品1-9(12g，80.5％)。
在室温条件下，于250mL的单口瓶中，加入原料1-9(12.0g，17.8mmol)、甲醇(100mL)、以及有水钯碳(5％钯含量，1.2g，10％wt)，先氮气置换3次后，然后充氢气球，氢气置换3次后，反应过夜，TLC监控，原料反应完全，用硅藻土进行抽滤，除去钯碳，将滤液旋干，得到无色的油状产品1-10(10g，96.1％)，粗产物不经过进一步纯化，直接用于后续反应。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料1-10(1.0g，1.71mmol)、吡啶(0.27g，3.42mmol)、4-二甲氨基吡啶(41mg、0.34mmol)与乙腈(50mL)，再先加入对硝基苯基氯甲酸酯(515mg，2.56mmol)，反应2小时后，TLC点板显示形成一个新的主点，然后再向反应体系中加入3-二乙氨基-1-丙醇(448mg，3.42mmol)，反应过夜后，LCMS监控有产物生成。然后向反应液中加入乙酸乙酯(100mL)与水(100mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次后进行干燥、旋干，得到粗品2.27g，然后在重复投入一批原料，共投入2g，混合，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝50：1到20：1)得到无色的油状产品化合物(750mg，29.5％)。
其中，化合物1的核磁数据1H NMR(400Mz,CDCl3)如下：4.22-4.11(m,8H),2.62-2.57(q,J1＝8.0Hz,J2＝8.0Hz,6H),2.32-2.28(t,J＝8.0Hz,3H),2.04-1.96(m,3H),1.91-1.85(m,2H),1.81-1.71(m,4H),1.64-1.57(m,4H),1.47-1.42(m,2H),1.31-1.27(m,38H),1.08-1.05(t,J＝12.0Hz,6H),0.91-0.88(t,J＝8.0Hz,9H)。LCMS：Rt：1.767min；MS m/z(ESI):740.60[M+H]+.
2.化合物2
化合物2的制备步骤如下：
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料1-10(9.0g,15.3mmol)、氯甲酸对硝基苯酯(4.7g,23mmol)、三乙胺(3.1g,30.6mmol)、及四氢呋喃(50mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(200mL)与水(200mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝50:1到20:1)得到无色的油状产品1-11(10.68g,92％)。
在室温条件下，于25mL的单口瓶中，加入原料1-11(1.5g,2mmol)，搅拌条件下，缓慢加入二甲氨基丙醇(0.62g，23mmol)，反应2小时后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(200mL)与水(200mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50:1)得到黄色的油状产品。
化合物2的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.21–4.09(m,8H),2.41–2.17(m,11H),2.01–1.36(m,13H),1.24(s,40H),0.91–0.83(m,9H).C42H81NO7 Exact Mass:711.60,found[M+H]+:712.7.
3.化合物3：
化合物3的制备步骤如下：
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料1-10(1.5g,2.57mmol)、溴戊酸(1.29g,3.09mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(12.2g,64.0mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.63g，5.15mmol)和四氢呋喃(15mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(100mL)与水(100mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝50:1到20:1)得到无色的油状产品3-1(1.8g)。
在室温条件下，于100mL的三口瓶中，加入原料3-1(1.8g，2.41mmol)、碳酸钾(1.59g，4.82mmol)、碘化钾(0.4g，2.41mmol)以及二乙胺(0.26g，3.62mmol)和无水四氢呋喃(15mL)，回流反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(100mL)与水(100mL)进行萃取，洗涤，分液，然后有机相在用氯化铵水溶液洗涤2-3次，有机相干燥，旋 干，得到无色的油状粗产品，经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝200:1到40:1)纯化得到终产品。
化合物3的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.13(m,J＝6.8,1.7Hz,4H),4.04(d,J＝5.4Hz,2H),2.66–2.46(m,6H),2.37–2.25(m,5H),1.91(m,J＝6.1Hz,1H),1.76–1.38(m,15H),1.35–1.19(m,39H),1.06(t,J＝7.2Hz,6H),0.87(t,J＝6.7Hz,9H).C45H87NO6 Exact Mass:737.65,found[M+H]+:738.67.
4.化合物4：
化合物4的制备步骤如下：
在室温条件下，于25mL的单口瓶中，加入原料1-10(1.5g,2.57mmol)，搅拌条件下，缓慢加入固体光气(0.28g，2.83mmol)、吡啶(0.31g，3.86mmol)反应1小时后，加入二乙氨基丙胺(0.34g，2.57mmol)，反应1小时。TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(200mL)与水(200mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1到50:1)得到黄色的油状产品化合物4(530mg)。
化合物4的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.10(t,J＝5.4Hz,1H),4.21–3.95(m,6H),3.26(m,J＝6.0Hz,2H),2.58(m,J＝7.3Hz,6H),2.28(m,J＝6.8Hz,3H),1.97–1.83(m,1H),1.79–1.50(m,10H),1.26(dd,J＝13.3,4.0Hz,42H),1.07(t,J＝7.1Hz,6H),0.87(t,J＝6.6Hz,9H).C44H86N2O6 Exact Mass:738.65,found[M+H]+:739.7.
5.化合物5：
化合物5的制备步骤如下：
在室温条件下，于25mL的单口瓶中，加入原料1-11(1.5g,2mmol)，搅拌条件下，缓慢加入二乙氨基乙醇(0.7g，6.02mmol)，反应2小时后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(100mL)与水(100mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1到50:1)得到黄色的油状产品化合物5(550mg)。
化合物5的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.25(t,J＝6.2Hz,2H),4.12(dd,J＝8.4,5.6Hz,6H),2.80(t,J＝6.2Hz,2H),2.65(m,J＝7.1Hz,4H),2.35–2.23(m,3H),1.94(m,J＝6.0Hz,1H),1.81–1.50 (m,8H),1.49–1.16(m,42H),1.08(t,J＝7.1Hz,6H),0.93–0.81(m,9H).C43H83NO7 Exact Mass:725.62,found[M+H]+:726.63.
6.化合物6：
化合物6的制备步骤如下：
在冰水浴条件下，于插入温度计的500mL三口瓶中，分别加入原料1-10(500mg，0.86mmol)、以及DMF(30mL)溶解，冷却至0-5℃，向该反应体系分批，缓慢，加入已经称量好的氢化钠(60％含量1.1mmol，44mg)，反应30分钟后，6-1(163mg，0.94mmol)缓慢加入到上述体系中，滴加完毕，反应2小时后，TLC显色显示原料已反应完全。在反应液中，缓慢加入饱和的氯化铵溶液进行淬灭，然后加入乙酸乙酯进行萃取，分液，干燥，旋干，得到淡黄色油状液体，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到无色的油状产品化合物6。
其中，原料6-1的合成参考：J.Med.Chem.2003,46,6,936–953。
化合物6的核磁数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.28–9.03(m,1H),4.50–4.30(m,2H),4.23–4.07(m,4H),3.61(t,J＝6.1Hz,1H),3.39(m,J＝5.5Hz,1H),2.60–2.48(m,5H),2.29(m,J＝6.9,3.3Hz,3H),2.00(m,J＝12.2,6.4Hz,1H),1.82–1.15(m,53H),1.06(m,J＝16.3, 7.1Hz,6H),0.87(t,J＝6.6Hz,9H).C44H86N2O5S Exact Mass:754.63,found[M+H]+:755.69.
7.化合物7：
化合物7的制备步骤如下：
在室温条件下，于25mL的单口瓶中，加入原料1-11(1.5g,2mmol)，搅拌条件下，缓慢加入二乙氨基丙硫醇(0.89g，6.02mmol)，反应2小时后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(100mL)与水(100mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1到80:1)得到棕褐色的油状产品化合物7(570mg)。
化合物7的核磁数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.20(d,J＝5.2Hz,2H),4.16–4.09(m,4H),2.90(t,J＝7.1Hz,2H),2.76–2.56(m,5H),2.29(m,J＝6.7Hz,3H),1.94(dd,J＝17.7,11.4Hz,3H),1.75–1.67(m,4H),1.66–1.50(m,5H),1.48–1.38(m,2H),1.36–1.18(m,40H),1.11(s,6H),0.87(t,J＝6.7Hz,9H).C44H85NO6S Exact Mass:755.61,found[M+H]+:756.62.
8.化合物9：
化合物9的制备步骤如下：
在室温条件，于500mL的茄型瓶中，加入磷酸乙酸三甲酯(11.5g，63.2mmol)和四氢呋喃(500mL),逐渐加入叔丁醇钾(8.7g，77.7mmol)，搅拌反应1小时,缓慢加入9-1(11g，48.6mmol)。回流搅拌反应3h后，TLC点板，显示原料反应完全，然后加入乙酸乙酯(500mL)与水(500mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化钠溶液(300mL)洗涤2-3次，然后有机相干燥旋干，加入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝100:1到30:1)得到淡黄色的液体状产品9-2(8g)。
在室温条件下，于250mL的三口瓶中，加入原料9-2(8g，111mmol)与无水乙醇(20mL)，然后加入氢氧化钠的水溶液40mL(5.4g,134.9mmol)，加入完毕后，然后反应液缓慢升温回流，反应2h后，TLC监控，原料反应完全，然后挥发乙醇，用3mol/L盐酸水溶液调节pH至2，用乙酸乙酯(50mL)洗涤有机相3次后，有机相合并，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50:1到20:1)得到无色的液体状产品9-3(3.5g)
在室温条件，于250mL的茄型瓶中，加入化合物9-3(3.5g，13mmol)和甲醇40mL,加入钯碳(0.14g)，置换氢气，室温搅拌反应18小时后，TLC点板，显示原料反应完全，然后抽滤，有机相旋干，加入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝100:1到5:1)得到无色的液体状产品9-4(3.3g)。
在室温条件下，于250mL的单口瓶中，加入原料1-8(7.3g,17.9mmol)，化合物9-4(3.3g,12.2mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.1g，21.5mmol)、4-二甲氨基吡啶(2.63g，21.5mmol)和二氯甲烷(100mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入二氯甲烷(200mL)与水(200mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝100:1到20:1)得到淡黄色的油状产品9-5(7.6g)。
在室温条件，于250mL的茄型瓶中，加入化合物9-5(7.6g，6.4mmol)和甲醇(60mL),加入钯碳(760mg)，置换瓶中空气为氢气。室温搅拌反应过夜后，TLC点板，显示原料反应完全，抽滤去除钯碳，然后有机相旋干，加 入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝30:1到5:1)得到无色的液体状产品9-6(5g)。
在室温条件，于250mL的密封管中，加入化合物9-6(5g，8.8mmol)和四氢呋喃(37mL)。加入氯甲酸对硝基苯酯(2.7g，13.2mmol)，搅拌反应10分钟，加入三乙胺(1.8g，17.6mmol)，室温反应15分钟，再升温。回流反应3小时，TLC点板，显示原料反应完全，加水淬灭反应。然后加入乙酸乙酯(300mL)与水(300mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化钠溶液(300mL)洗涤2-3次，然后有机相干燥旋干，加入硅胶进行拌样，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝100:1到10:1)得到无色的液体状产品9-7(4.7g)。
在室温条件，于50mL的茄型瓶中，加入化合物9-7(2.5g，3.4mmol)。逐渐缓慢加入3-二乙胺基丙醇(2.2g，17mmol)，搅拌反应50分钟，TLC点板，显示原料反应完全，加水淬灭反应。然后加入乙酸乙酯(200mL)与水(200mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化钠溶液(200mL)洗涤2-3次，然后有机相干燥旋干，加入硅胶进行拌样，通过柱层析(二氯甲烷：甲醇＝300:1到80:1)得到粗品，再经进一步纯化，得到黄色的液体状化合物9(639mg)。
化合物9的核磁数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.21(t,J＝6.4Hz,2H), 4.18–4.10(m,5H),2.65(s,5H),2.30(t,J＝7.6Hz,2H),2.24(d,J＝6.9Hz,2H),1.96(dd,J＝13.3,7.1Hz,3H),1.80(s,2H),1.80–1.67(m,4H),1.62(q,J＝7.3Hz,2H),1.28(d,J＝5.6Hz,39H),1.11(t,J＝7.3Hz,6H),0.90(t,J＝6.7Hz,9H).C43H83NO7 Exact Mass:725.62,found[M+H]+:726.67.
9.化合物12
化合物12的制备步骤如下：
在2000mL的三口瓶中加入化合物12-1(40.0g,249.74mmol)，溶于四氢呋喃(800.0mL)，水浴缓慢加入氢化钠(39.96g,998.94mmol)，搅拌5分钟，加入化合物12-2(178.91g,998.94mmol)，反应80℃回流搅拌过夜，TLC和LCMS监测反应。LCMS有检测到目标分子量，TLC(石油醚：乙酸乙酯＝20:1)碘显色显示原料已反应完全，有一新的主点产生，停止反应。加入水溶液洗涤，加乙酸乙酯萃取三次，收集有机相，硫酸钠干燥，减压浓缩，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(先用纯石油醚柱层析，再用20:1的石油醚和乙酸乙酯进行柱层析)得到无色油状液体化合物12-3(39g)化合物分子量356.55，LC-MS(m/z)[M+H]＝357Rt＝3.492min。
在500mL的单口瓶中加入化合物12-3(39g，109.38mmol)，溶于乙醇(39.0mL)。将氢氧化钾(61.37g,1093.82mmol)溶于H2O(109.0mL),搅拌至清后，将其加入到含化合物12-3的反应液中，在95℃搅拌反应过夜，TLC监测反应。LCMS有检测到目标分子量，TLC(石油醚：乙酸乙酯＝20:1)碘显色显示原料已反应完全，有一新的主点产生，停止反应。减压浓缩，旋掉大部分乙醇，用6mol/L的盐酸溶液调至pH＝2-3,。用乙酸乙酯和水萃取，分液，收集有机相，干燥，减压浓缩,得到白色固体化合物12-4(31.11g)化合物的分子量300.44，LC-MS(m/z)[M-H]＝299Rt＝2.791min。
在500mL的单口瓶中加入化合物12-4(31.11g,103.55mmol)，接上冷凝管，插上气球，升温至170℃，回流搅拌5小时，观察气球，气球不再膨胀，气体释放停止，停止反应，核磁监测反应。得到褐色液体化合物,减压浓缩，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(先用纯石油醚柱层析，再用10:1的石油醚和乙酸乙酯进行柱层析)得到黄色粘稠固体化合物12-5(25.5g)。
在250mL的单口瓶中加入化合物12-6(4.40g,23.63mmol)，溶于四氢呋喃(80.0mL)，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(6.79g, 35.44mmol)，室温搅拌0.5小时，加入4-二甲氨基吡啶(5.77g,47.26mmol)，室温搅拌15分钟，再加入化合物9-6(8g,23.63mmol)，室温搅拌反应过夜，TLC监测反应。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝20:1)碘显色显示原料已反应完全，有一新的主点产生，停止反应。用乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液萃取，分液，收集有机相，干燥，旋干，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝20:1)得到黄色油状液体化合物12-7(9.27g)。
在100mL的单口瓶中加入化合物12-7(9.27g,18.29mmol)，溶于二氧六环(14.0mL)，加入浓盐酸(19mL)，室温搅拌2小时。TLC监测反应。
TLC(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)碘显色显示原料大部分反应完，小部分原料剩余，有一新的主点产生，停止反应。用乙酸乙酯和水萃取，分液，收集有机相，干燥，旋干，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝100:1-5:1)得到黄色油状液体化合物12-8(5.53g)。
在250mL的单口瓶中加入化合物12-8(3.61g,14.09mmol)，溶于四氢呋喃(50.0mL)，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.05g,21.13mmol)，室温搅拌0.5小时，加入4-二甲氨基吡啶(3.44g，28.17mmol)，室温搅拌15分钟，再加入化合物12-5(5.53g，14.09mmol)，室温搅拌反应过夜，TLC监测反应。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝20:1)碘显色显示原料已反应完全，有一新的主点产生，停止反应。用饱和氯化铵溶液和乙酸乙酯萃取，分液，收集有机相，干燥，减压浓缩，通过柱层析(石油醚：乙酸乙 酯＝20:1)得到黄色油状液体化合物12-9(6.64g)。
在250mL的单口瓶中加入化合物12-9(6.64g,10.76mmol),溶于甲醇(50.0mL)，再加入钯-碳(0.9g)，用氢气置换5次，在氢气下，室温搅拌反应过夜。TLC监测反应。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)碘显色显示原料已反应完，有一新的主点产生，停止反应。用硅胶粉抽滤滤掉钯-碳,再用滤头滤掉反应液残留下来的钯-碳,减压浓缩得到无色油状液体化合物12-10(5.16g)。
在250mL的封管中加入化合物12-10(5.16g,9.54mmol)，溶于四氢呋喃(40.0mL)，再加入氯甲酸对硝基苯酯(2.88g,14.31mmol)，室温搅拌5分钟，搅拌至清，室温加入三乙胺(1.93g，19.08mmol)，室温搅拌5分钟，盖好盖子，反应70℃搅拌过夜，TLC监测反应。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)碘显色显示原料已反应完全，有一新的主点产生，有紫外，停止反应。依次加入水溶液，乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液洗涤，用乙酸乙酯萃取2遍，收集有机相，硫酸钠干燥，减压浓缩，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(先用纯石油醚柱层析，再用40:1的石油醚和乙酸乙酯进行柱层析)得到黄色液体化合物12-11(3.04g)。
在50mL的单口瓶中加入化合物12-11(3.04g，4.31mmol)，再加入3-(二乙胺基)丙基-1-醇(5.65g，43.06mmol)，室温搅拌过夜，TLC和LCMS监测反应。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10:1)碘显色显示原料已反应完全，有一新的主点产生，停止反应。LCMS有检测到目标分子量，加入饱和氯化铵溶液洗涤，用乙酸乙酯萃取3遍，收集有机相，硫酸钠干燥，减压浓缩，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(二氯甲烷:甲醇＝70:1)得到黄色液体1.7克，再经进一步纯化得到黄色油状液体化合物12(632mg)。化合物12分子量698.08，LC-MS(m/z)[M+H]＝698Rt＝5.76min。
化合物12的核磁数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.20(t,J＝6.6Hz,2H),4.18–4.09(m,6H),2.54(q,J＝7.1Hz,6H),2.36–2.26(m,3H),1.97(p,J＝5.9Hz,1H),1.84(m,2H),1.80–1.68(m,4H),1.67–1.52(m,4H),1.50–1.38(m,2H),1.35–1.21(m,34H),1.04(t,J＝7.1Hz,6H),0.90(m,9H).C41H79NO7 Exact Mass:697.59,found[M+H]+:698.60.
10.化合物13
化合物13的制备步骤如下：
在100mL的单口瓶中加入化合物13-1(8.66g，14.31mmol)，溶于二氧六环(10.0mL)，加入浓盐酸(18mL)，室温搅拌2h。TLC监测反应。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)碘显色显示原料大部分反应完，有一新的主点产生，停止反应。用乙酸乙酯和水萃取，分液，收集有机相，干燥，旋干，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝100:1-5:1)得到黄色油状液体化合物13-2(4.98g)。
在250mL的单口瓶中加入化合物13-2(2.44g,12.18mmol)，溶于四氢呋喃(50.0mL)，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.92g,15.22mmol)，室温搅拌0.5小时，加入4-二甲氨基吡啶(2.48g,20.29mmol)，室温搅拌15分钟，再加入化合物13-3(4.98g,10.147mmol)，室温搅拌反应过夜，TLC监测反应。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝20:1)碘显色显示原料已反应完全，有一新的主点产生，停止反应。用饱和氯化铵溶液和乙酸乙酯萃取，分液，收集有机相，干燥，减压浓缩，通过柱层析(先用纯石油醚柱层析，再用20:1的石油醚和乙酸乙酯进行柱层析)得到黄色油状液体化合物13-4(6.18g)。
在500mL的单口瓶中加入化合物13-4(6.18g，9.18mmol)，溶于甲醇(60.0mL)，再加入钯-碳(0.90g)，用氢气置换5次，在氢气的下，室温搅拌反应过夜。TLC监测反应。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)碘显色显示原料已反应完，有一新的主点产生，停止反应。用硅胶粉抽滤滤掉钯-碳,再用滤头滤掉反应液残留下来的钯-碳,减压浓缩得到无色油状液体化合物13-5(4.97g)。
在250mL的封管中加入化合物13-5(4.97g，8.53mmol)，溶于四氢呋喃(40.0mL)，再加入氯甲酸对硝基苯酯(2.58g，12.79mmol)，室温搅拌5分钟，搅拌至清，室温加入三乙胺(2.370mL，17.05mmol)，室温搅拌5分钟，盖好盖子，反应70℃搅拌过夜，TLC监测反应。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)碘显色显示原料已反应完全，有一新的主点产生，有紫外，停止反应。依次加入水溶液，乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液洗涤，用乙酸乙酯萃取2遍，收集有机相，硫酸钠干燥，减压浓缩，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(先用纯石油醚柱层析，再用40:1的石油醚和乙酸乙酯进行柱层析)得到黄色液体化合物13-6(4.08g)
在50mL的单口瓶中加入化合物13-6(4.08g，5.45mmol)，再加入3-二乙胺基丙醇(7.16g，54.54mmol)，室温搅拌过夜，TLC和LCMS监测反应。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10:1)碘显色显示原料已反应完全，有一新的主点产生，停止反应。LCMS有检测到目标分子量，加入饱和氯化铵溶液洗涤，用乙酸乙酯萃取3遍，收集有机相，硫酸钠干燥，减压浓缩，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(二氯甲烷至二氯甲烷：甲醇＝70:1)得到黄色液体2.1克，再经制备得到黄色油状液体化合物13(716mg)。化合物13的分子量740.16，LC-MS(m/z)[M+H]＝740Rt＝5.91min。
化合物13的核磁数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.20(t,J＝6.5Hz,2H),4.18–4.09(m,6H),2.61(q,J＝7.1Hz,6H),2.36–2.21(m,2H),2.02–1.84(m,3H),1.83–1.67(m,4H),1.67–1.54(m,4H),1.52–1.37(m,4H),1.26(s,36H),1.08(t,J＝7.2Hz,6H),0.89(m,12H).C44H85NO7 Exact Mass:739.63,found[M+H]+:740.31.
11.化合物15
化合物15的制备方法如下：
在冰水浴下条件，于100mL叉有温度计的烧瓶瓶中，加入原料六氢吡啶(1.32g、15.6mmol)、无水碳酸钾(0.47g、3.4mmol)；混合均匀后，将原料15-1(2g、10.4mmol)缓慢滴入反应体系中，于0℃下反应2小时后，将反应液的温度缓慢升至室温，继续反应36小时。反应结束后，将所得混合物抽滤，滤饼用乙醚(30mL)洗涤3次后，滤液合并，旋干。所的混合物溶解在乙腈(20mL)中，于冰水浴下，将丙烯酸乙酯(1.56g，15.6mmol)滴入反应体系中，滴完后升至室温，回流过夜。将醋酸水溶液(0.8g冰醋酸溶于5mL水)加入体系，而后继续加热回流2小时。将反应体系降至室温，水相用固体氯化钠调至饱和，使用乙醚(20mL)萃取3次，有机相干燥旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物15-2。
在冰水浴下条件，于100mL叉有温度计的烧瓶瓶中，分别加入原料15-2(2g，6.8mol)，以及甲醇(50mL，用于溶解原料15-2)，混合均匀后，向体系中缓慢均匀地加入硼氢化钠固体(310mg，8.2mmol)，反应液缓慢升至室温，反应4小时后，TLC监控，直至反应完全。向反应液中缓慢加入水(10mL)进行淬灭，而后加入乙酸乙酯(50mL)进行稀释，然后再进行萃取分液，将有机相用饱和氯化钠溶液(25mL)洗涤1次后，进行干燥、旋干，所得粗产物不用进一步纯化，直接用于下一步。
室温条件下，将上一步中得到的粗产品和咪唑(926mg，13.6mmol)溶解在二氯甲烷(20mL)中，向体系中分批加入叔丁基二甲基氯硅烷(1.54g，10.2mmol)。加完后反应过夜，TLC监控，直至反应完全。向反应体系中加入水(20mL)，萃取分液，水相使用二氯甲烷(40mL)萃取一次，有机相合并后用饱和碳酸氢钠溶液(30mL)洗涤1次、饱和氯化钠溶液(30mL)洗涤1次，有机相干燥旋干。所得混合物使用硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物15-4。
在冰水浴下条件，于100mL的三口瓶中，加入原料15-4(1g，2.4mmol)与无水四氢呋喃(30mL)，然后分批小心的加入四氢铝锂固体(102mg，2.64mmol)，加入完毕后，然后将反应液的温度缓慢升至室温，反应2小时后，TLC监控，原料反应完全。然后，向反应液中加入乙酸乙酯(20mL)稀释，然后缓慢加入水(2mL)、15％NaOH水溶液(2mL)与水(5mL)进行淬灭，抽滤，滤饼用乙酸乙酯(30mL)洗涤3次后，有机相合并后进行干燥、旋干，加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物15-5。
在室温条件下，于250mL的单口瓶中，加入原料15-5(1.0g，2.7mmol)、十一酸(610mg，3.3mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(630mg，3.3mmol)、4-二甲氨基吡啶(402mg、3.3mmol)和二氯甲烷(20mL)， 进行反应；反应过夜后，TLC监控，直到原料反应完全。然后向反应液中加入乙酸乙酯(50mL)与水(50mL)进行萃取分液，将有机相用饱和氯化钠(30mL)洗涤1次，干燥、旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物15-6。
在室温条件下，于50mL的单口瓶中，加入原料15-6(1.0g，1.8mmol)、甲醇(20mL)、以及有水钯碳(5％钯含量，100mg，10％wt)，先用氮气置换3次后，然后充氢气球，氢气置换3次后，反应过夜，TLC监控，直到原料反应完全。然后，用硅藻土进行抽滤，以除去钯碳，将滤液旋干，得到粗产物不经过进一步纯化，直接用于后续反应。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料15-7(1.0g，2.7mmol)、2-辛基癸酸(767mg，3.3mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(518mg，3.3mmol)、4-二甲氨基吡啶(329mg，3.3mmol)和二氯甲烷(50mL)，进行反应。反应过夜后，TLC监控，直到原料反应完全。然后向反应中加入乙酸乙酯(50mL)与水(50mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化钠(30mL)洗涤1次，干燥、旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物15-8。
在室温条件下，于50mL的单口烧瓶中，加入原料15-8(1.0g，1.4mmol)、以及四氢呋喃(20mL，用于溶解原料15-8)；混合均匀后，再向其中滴加入四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1mol/L，2.1mL)，滴加完毕后，于室温继续反应2小时后，TLC监控，直至原料反应完全。向反应体系中缓慢加入水(50mL)，减压除掉大部分有机相，加入乙酸乙酯(50mL)。萃取分液，将有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤1次、干燥、旋干，使用硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物15-9。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料15-9(1.0g，1.67mmol)、吡啶(253mg，3.2mmol)、4-二甲氨基吡啶(39mg，0.32mmol)、以及乙腈(20mL)，充分溶解，然后向其中缓慢加入对硝基苯基氯甲酸酯(482mg，2.4mmol)，反应2h后，TLC监控，直至产生一个新的荧光点。然后向反应体系中再加入3-二甲氨基-1-丙醇(628mg，4.8mmol)，反应过夜。LCMS监控反应完成。向反应液中加入乙酸乙酯(50mL)与水(50mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化钠(30mL)洗涤1次、干燥后旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析得到最终产物化合物15。
化合物15的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.19(t,J＝6.4Hz,2H),4.11–4.00(m,6H),2.64(s,5H),2.35–2.24(m,3H),1.92(s,2H),1.75–1.51(m,10H),1.41(m,J＝15.1,7.1,3.7Hz,6H),1.34–1.17(m,38H),1.10(t,J＝7.2Hz,6H),0.87(m,J＝6.9,1.4Hz,9H).C45H87NO7Exact Mass:753.65,found[M+H]+:754.72.
12.化合物16
化合物16的制备工艺如下：
在冰水浴下条件下，于250mL叉有温度计的烧瓶中，小心分批将氢化钠(1.5g，37.6mmol，w/w60％)加入N,N-二甲基甲酰胺(50mL)溶液中，混合均匀后，再向体系缓慢滴入原料16-1(2g，12.5mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(20mL)。反应30分钟，待没有气泡冒出后，将4-苄氧基碘代丁烷(8g，27.6mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(40mL)溶液，缓慢滴加入体系，继续反应两个小时，TLC监控，直至原料反应完全。如果没有反应完全，可以将体系的温度缓慢升至50℃，TLC监控，直至原料反应完全。在冰水浴条件下，向体系小心加入氯化铵饱和溶液(10mL)进行淬灭，而后加入(200mL)水稀释。使用乙酸乙酯(200mL)进行萃取分液，将有机相用饱和氯化钠溶液(100mL)洗涤1次、干燥、旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物16-2。
反应步骤1：
在室温条件下，于100mL的烧瓶中，分别加入原料16-22(2g，4.3mmol)、 氢氧化钾(1.15g，20.6mmol)、水(10mL)、四氢呋喃(20mL)；混合均匀后，升温至70℃反应10小时，TLC监控，直至原料反应完全。将反应温度降至室温，使用1mol/L盐酸溶液将pH值调至约等于6。体系在减压下除掉有机相，加水稀释至50mL。使用乙酸乙酯(50mL)进行萃取分液，将有机相干燥、旋干，所得粗产物不经进一步纯化，直接用于下一步合成。
反应步骤2：
在室温条件下，于100mL的烧瓶中，分别加入上一步粗产物，以及水/吡啶的混合溶剂(v/v＝6/1，50mL)，混合均匀后，升温至回流，继续反应48小时后，冷却，TLC监控，直至原料反应完全；在真空下除掉溶剂，用水(30mL)稀释，使用1mol/L盐酸溶液将pH值调至约等于6。使用乙酸乙酯(50mL)萃取分液，将有机相干燥旋干，使用硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物16-4。
在冰水浴下条件下，于250mL的三口瓶中，加入原料16-4(1g，2.4mmol)与无水四氢呋喃(30mL)，然后分批小心的加入四氢铝锂固体(102mg，2.64mmol)，加入完毕后，反应液缓慢升至室温，反应2小时后，TLC监控，原料反应完全。向反应液中加入乙酸乙酯(20mL)进行稀释，而后依次缓慢加入水(2mL)、15％的NaOH水溶液(2mL)与水(5mL)进行淬灭，抽滤，滤饼用乙酸乙酯(30mL)洗涤3次后，将有机相合并，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物16-5。
在室温条件下，于50mL的单口瓶中，加入原料16-5(1.0g，2.7mmol)和咪唑(367mg，5.4mmol)，在二氯甲烷(20mL)中溶解完全。然后，再向体系中分批加入叔丁基二甲基氯硅烷(611mg，4.0mmol)。加完后反应过夜，TLC监控，直至反应完全。向反应体系中加入水(20mL)，萃取分液，水相使用二氯甲烷(40mL)萃取一次，有机相合并后用饱和碳酸氢钠溶液(20mL)洗涤1次，饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤1次，将有机相干燥旋干后，使用硅胶进行拌样，通过柱层析得到终产品16-6。
在室温条件下，于50mL的单口瓶中，加入原料16-6(1.0g，1.8mmol)，甲醇(20mL)，以及有水钯碳(5％钯含量，100mg，10％wt)，先氮气置换3次后，然后充氢气球，氢气置换3次后，反应过夜，TLC监控，直到原料反应完全。用硅藻土进行抽滤，以除去钯碳，将滤液旋干，得到粗产物不经过进一步纯化，直接用于后续反应。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料16-7(1.0g，3.3mmol)、十一酸(614mg，3.3mmol)、4-二甲氨基吡啶(476mg，3.9mmol)和二氯甲烷(40mL)，混合全溶后，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(757mg，3.9mmol)分批加入体系，反应过夜后，TLC监控，直到原料反应 完全。然后加入乙酸乙酯(100mL)与水(100mL)进行萃取分液，有机相在用饱和氯化钠(50mL)洗涤1次，干燥旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物16-8。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料16-8(1.0g，2.1mmol)、2-辛基癸酸(722mg、2.5mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(480mg、2.5mmol)、4-二甲氨基吡啶(305mg、2.5mmol)和二氯甲烷(50mL)进行反应。反应过夜后，TLC监控，直到原料反应完全，然后加入乙酸乙酯(100mL)与水(100mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化钠(50mL)洗涤1次，干燥、旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物16-9。
在室温条件下，于50mL的单口烧瓶中，加入原料16-9(1.0g，1.4mmol)、四氢呋喃(20mL)，混合均匀后，再向其中滴加入四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1mol/L，2.1mL)，滴加完毕后，于室温继续反应2小时，TLC监控，直至原料反应完全。向体系中缓慢加入水(50mL)，减压除掉大部分有机溶剂，再向体系中加入乙酸乙酯(50mL)进行萃取分液，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤1次，干燥、旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物16-10。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料16-10(1.0g，1.6mmol)、吡啶(253mg，3.2mmol)、4-二甲氨基吡啶(39mg，0.32mmol)、乙腈(20mL)。然后向其中缓慢加入对硝基苯基氯甲酸酯(482mg，2.4mmol)，反应2h后，TLC监控，直至产生一个新的荧光点。然后再向反应体系中加入3-二甲氨基-1-丙醇(628mg，4.8mmol)，反应过夜。LCMS监控反应完成，然后向体系中加入乙酸乙酯(50mL)与水(50mL)进行萃取分液，有机相用饱和氯化钠(30mL)洗涤1次，干燥、旋干，使用硅胶进行拌样，通过柱层析得到最终产物化合物16。
化合物16的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.20(t,J＝6.5Hz,2H),4.06(m,6H),2.59(q,J＝6.7Hz,6H),2.38–2.24(m,3H),1.88(p,J＝6.7Hz,2H),1.62(m,9H),1.49–1.35(m,10H),1.34–1.21(m,38H),1.06(t,J＝7.1Hz,6H),0.94–0.82(m,9H).C47H91NO7 Exact Mass:781.68,found[M+H]+:782.72.
13.化合物18
化合物18的制备方法如下：
在室温条件下，于500mL的单口瓶中，加入原料18-1(5.0g，28mmol)、咪唑(3.8g，56mmol)及二氯甲烷(200mL)中，然后向体系中分批加入叔丁基二甲基氯硅烷(6.3g，42mmol)；加完后反应过夜，TLC监控，直至反应完全。然后，向体系中加入水(200mL)，萃取分液，水相使用二氯甲烷(50mL)萃取一次，将有机相合并后用饱和碳酸氢钠溶液(50mL)洗涤1次、饱和氯化钠溶液(100mL)洗涤1次后，进行干燥、旋干然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物18-2。
在冰水浴下条件，于250mL的三口瓶中，加入原料18-2(2g，6.8mmol)与无水四氢呋喃(50mL)，然后分批小心的加入四氢铝锂固体(568mg，15.0mmol)，加入完毕后，然后反应液缓慢升至室温，反应2小时后，TLC监控，原料反应完全。向体系中加入乙酸乙酯(40mL)进行稀释，然后缓慢加入水(4mL)、15％NaOH水溶液(4mL)与水(10mL)进行淬灭，抽滤，滤饼用乙酸乙酯(10mL)洗涤3次后，将有机相合并、旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物18-3。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料18-3(1.0g，4.3mmol)、十二酸(855mg，4.3mmol)、4-二甲氨基吡啶(634mg，5.2mmol)和二氯甲烷(20mL)，混匀后分批加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(991mg，5.2mmol)反应过夜后，TLC监控，直到原料反应完全。然后，向体 系中加入乙酸乙酯(50mL)与水(50mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化钠(20mL)洗涤1次，干燥旋干后，使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到终产品18-4。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料18-4(1.0g，2.4mmol)、2-辛基癸酸(682mg，2.4mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(538mg，2.8mmol)、4-二甲氨基吡啶(342mg，2.8mmol)和二氯甲烷(20mL)，反应过夜后，TLC监控，直到原料反应完全。然后，向反应体系中加入乙酸乙酯(50mL)与水(50mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化钠(20mL)洗涤1次后，进行干燥、旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物18-5。
在室温条件下，于100mL的单口烧瓶中，加入原料18-5(1.0g，1.46mmol)、以及四氢呋喃(20mL)，混合均匀后，向其中滴加入四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1mol/L，2.2mL)，滴加完毕后，于室温继续反应2小时后，TLC监控，直至原料反应完全。然后，向体系中缓慢加入水(50mL)，以减压除掉大部分有机相，加入乙酸乙酯(50mL)，进行萃取分液，将有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤1次后，进行干燥旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物18-6。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料18-6(1.0g，1.8mmol)、吡啶(277mg，3.5mmol)、4-二甲氨基吡啶(43mg，0.35mmol)、乙腈(20mL)，充分溶解，然后再缓慢加入对硝基苯基氯甲酸酯(543mg，2.7mmol)进行反应，反应2h后，TLC监控，直至产生一个新的荧光点。然后再向其中加入3-二甲氨基-1-丙醇(707mg，5.4mmol)，反应过夜。LCMS监控反应完成。然后向体系中加入乙酸乙酯(50mL)与水(50mL)进行萃取分液，将有机相用饱和氯化钠洗涤2-3次后进行干燥、旋干然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到最终产物化合物18。
14.化合物19
化合物19的制备方法如下：
在冰水浴下条件，于1000mL叉有温度计的烧瓶瓶中，分别加入原料19-1(10g，49.4mmol)、甲酸铵(25g，396.8mmol),硼氢化钠(3.45g，54.4mmol)，以及(250mL)溶解，混合均匀后，将反应液的温度缓慢升至室温，反应15小时后，TLC监控，直至原料反应完全。然后，向体系中小心加入水(100mL) 淬灭反应，减压除去有机溶剂。使用3mol/L的盐酸将体系pH调值约等于3，使用乙酸乙酯(100mL)萃取水相两次。水相使用碳酸钾固体小心将pH调至约等于10；然后使用乙酸乙酯(100mL)萃取两次，将有机相合并，干燥、旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物19-2。
第一步：
在冰水浴下条件，于250mL的三口瓶中，加入原料19-2(2g，9.9mmol)与无水四氢呋喃(50mL)，然后再向其中分批小心的加入四氢铝锂固体(828mg，21.8mmol)，加入完毕后，然后反应液的温度缓慢升至室温，反应2小时后，TLC监控，原料反应完全。然后，向体系中加入乙酸乙酯(20mL)稀释，然后依次缓慢加入水(2mL)、15％NaOH水溶液(2mL)与水(5mL)进行淬灭，然后进行抽滤，将滤饼用乙酸乙酯(50mL)洗涤3次后，有机相合并后进行干燥、旋干，得到的粗产品直接用于下一步。
第二步：
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，将上一步所得粗产物溶于二氯甲烷(50mL)中，向其中加入N,N-二异丙基乙胺(2.5g，19.8mmol)，Boc酸酐(3.2g，14.9mmol)，TLC监控，直到原料反应完全。然后，向体系中加入水(100mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化钠(30mL)洗涤2次后进行干燥、旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物19-3。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料19-3(1.0g，4.5mmol)、 十二酸(900mg，4.5mmol)、4-二甲氨基吡啶(671mg，5.5mmol)和二氯甲烷(20mL)，混匀后向其中分批加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.05g，5.5mmol)。反应过夜，TLC监控，直到原料反应完全。然后，向体系中加入乙酸乙酯(50mL)与水(50mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化钠(20mL)洗涤1次后，进行干燥、旋干然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到终产品19-4。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料19-4(1.0g，2.5mmol)、2-辛基癸酸(710mg，2.5mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(574mg，3.0mmol)、4-二甲氨基吡啶(366mg，3.0mmol)和二氯甲烷(20mL)。反应过夜后，TLC监控，直到原料反应完全。然后，向体系中加入乙酸乙酯(50mL)与水(50mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化钠(20mL)洗涤1次后，进行干燥旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物19-5。
在室温条件，于50mL的烧瓶中，分别加入原料19-5(500mg，0.75mmol)、二氯甲烷(10mL)和三氟乙酸(2mL)，混合溶解，于室温下反应2小时后，TLC监控，直至原料反应完全。反应完成后，对体系进行减压处理，以除去有机溶剂，得到粗产物不进行进一步纯化，直接用于下一步。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料19-6(500mg，0.77mmol)、吡啶(182mg，2.3mmol)、4-二甲氨基吡啶(19mg，0.15mmol)以乙腈(10mL)溶解。然后，向其中缓慢加入对硝基苯基氯甲酸酯(232mg，1.2mmol)，反应2h后，TLC监控，直至产生一个新的荧光点。然后，向体系中再加入3-二甲氨基-1-丙醇(302mg，2.31mmol)，反应过夜。LCMS监控反应完成，然后向体系中加入乙酸乙酯(30mL)与水(30mL)进行萃取分液，将有机相用饱和氯化钠洗涤2-3次后进行干燥、旋干，使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到最终产物化合物19。
15.化合物20(a＝1)
化合物20的制备方法如下：
在氮气保护下，于100mL的三口烧瓶中，分别加入乙腈(1.6mL，31.6mmol)、六甲基磷酰三胺(11mL)、以及无水四氢呋喃(23mL)；混合均匀后，将降温至-78℃。在低温保护下，再向三口烧瓶中缓慢滴入LDA溶液(15.2mL，2.0mol/L，四氢呋喃/正己烷)，滴加完毕后搅拌30分钟。然 后，向体系中再滴加入20-1(6.86g，26.2mmol)的四氢呋喃(25mL)溶液，反应在低温下继续进行两个小时。然后，再向体系中滴加第二批LDA溶液(15.2mL，2.0mol/L，四氢呋喃/正己烷)，滴加完毕后搅拌30分钟。然后，载向体系中滴加入第二批20-1(6.86g，26.2mmol)的四氢呋喃(25mL)溶液，反应在低温下继续进行两个小时。TLC监控，直至原料反应完全。低温下，使用饱和氯化铵溶液(5mL)进行淬灭反应，将体系的温度升至室温，减压旋出有机相，加水50mL稀释体系，使用乙酸乙酯(100mL)萃取体系，将有机相用饱和氯化钠溶液(50mL)洗涤1次后进行干燥、旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物20-2。
在冰水浴下条件，氮气保护中，于250mL叉有温度计的烧瓶中，分别加入四氢铝锂(737mg，19.4mmol)以及无水四氢呋喃(50mL)溶解，混合均匀后，向体系中滴加入原料20-2(2g，6.5mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液。反应液缓慢升至室温，于70℃下反应16小时，TLC监控，直至原料反应完全。然后降温至0℃，小心加入水(1mL)、10％的氢氧化钠溶液(2mL)和水(1mL)进行淬灭反应。混合物经抽滤，滤出的粘稠状固体使用乙酸乙酯(50mL)洗涤3次。将有机相合并，干燥、旋干，所得粗产品不进行进一步纯化，直接在下一步中使用。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，将上一步所得粗产物溶于二氯甲烷(50mL)中，然后向其中加入N,N-二异丙基乙胺(1.7g，13mmol)、Boc酸酐(2.1g，9.8mmol)进行反应，TLC监控，直到原料反应完全。然后，向其中加入水(100mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化钠(40mL) 洗涤2次后进行干燥、旋干，使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物20-4。
在室温条件下，于50mL的单口瓶中，加入原料20-4(1.0g，2.4mmol)、甲醇(20mL)、以及有水钯碳(5％钯含量、100mg、10％wt)，先氮气置换3次后，然后充氢气球，氢气置换3次后，反应过夜，TLC监控，直到原料反应完全。然后，用硅藻土进行抽滤，以除去钯碳，将滤液旋干，得到粗产物不经过进一步纯化，直接用于后续反应。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料20-5(1.0g，4.3mmol)、十二酸(860mg，4.3mmol)、4-二甲氨基吡啶(634mg，5.2mmol)和二氯甲烷(20mL)，混匀后，分批加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(991mg，5.2mmol)进行反应；反应过夜后，TLC监控，直到原料反应完全。然后，向体系中加入乙酸乙酯(50mL)与水(50mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤2次后，进行干燥、旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物20-6。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料20-6(1.0g，2.4mmol)、2-辛基癸酸(682mg，2.4mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(555mg、2.9mmol)、4-二甲氨基吡啶(354mg、2.9mmol)和二氯甲烷 (20mL)，反应过夜后，TLC监控，直到原料反应完全。然后，向体系中加入乙酸乙酯(50mL)与水(50mL)进行萃取分液，将有机相用饱和氯化钠(20mL)洗涤2次后进行干燥、旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物20-7。
在室温条件下，于50mL的烧瓶中，分别加入原料20-7(500mg，0.73mmol)、二氯甲烷(10mL)及三氟乙酸(2mL)，混合均匀后，于室温下反应2小时后，TLC监控，直至原料反应完全。然后，对体系进行减压以除去有机溶剂，得到粗产物不经进一步纯化，直接用于下一步。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料20-8(1.0g，1.5mmol)、吡啶(356mg，4.5mmol)、4-二甲氨基吡啶(37mg，0.3mmol)、乙腈(20mL)，充分溶解后，再向其中缓慢加入对硝基苯基氯甲酸酯(462mg，2.3mmol)，反应2h后，TLC监控，直至产生一个新的荧光点。然后，再向体系中在加入3-二甲氨基-1-丙醇(590mg，4.5mmol)，反应过夜。LCMS监控反应完成，然后向体系中，加入乙酸乙酯(60mL)与水(60mL)进行萃取分液，将有机相用饱和氯化钠(30mL)洗涤1次后进行干燥旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到最终产物化合物20。
16.化合物23
化合物23的制备方案如下：
在室温条件下，于1000mL的单口烧瓶中，加入原料23-1(10.0g，62.08mmol)、以及氢氧化钠水溶液(300mL，1mol/L)，混合均匀后，于1小时内，向其中缓慢滴加Boc酸酐(22.1g，101mmol)的四氢呋喃(200mL)溶液。滴加完毕后，于室温继续反应2小时后，TLC监控，直至原料反应完全。向反应混合物中小心滴入0.2mol/L的磷酸溶液至pH约等于4，减压旋出有机溶剂，然后使用二氯甲烷(300mL)萃取一次，将有机相用饱和氯化钠水溶液(200mL)洗涤后进行干燥、旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物23-2。
在室温条件下，于250mL的单口瓶中，加入原料23-2(5.0g，19.mmol)、十一醇(8.2g，47.9mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(9.2g，47.9mmol)、4-二甲氨基吡啶(468mg，3.84mmol)和二氯甲烷(100mL)， 进行反应，反应过夜后，TLC监控，直到原料反应完全。然后小心地向反应体系中加入乙酸(5mL)与甲醇(10mL)进行淬灭反应，再加入水(100mL)进行稀释体系，然后减压旋出有机相，使用乙酸乙酯(100mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化钠溶液(50mL)洗涤1次后进行干燥旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物23-3。
在室温条件下，于250mL的烧瓶中，分别加入原料23-3(5g，8.8mmol)、以及乙醇(100mL)，混合均匀后，将氢氧化钠的水溶液(351mg，8.8mmol，溶于水30mL)缓慢滴入体系。滴完后于室温继续反应4小时后，TLC监控。向体系中缓慢滴入1mol/L的盐酸至体系pH约等于5。减压移除有机相，加入水(100mL)稀释体系，使用乙酸乙酯(100mL)萃取分液；将有机相用饱和氯化钠溶液(50mL)洗涤1次后进行干燥旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物23-4。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料23-4(2.0g，4.8mmol)、9-十七醇(1.5g，5.8mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.4g、7.2mmol)、4-二甲氨基吡啶(878mg、7.2mmol)和二氯甲烷(50mL)，进行反应，反应过夜后，TLC监控，直到原料反应完全。然后向体系中加入乙酸乙酯(100mL)与水(100mL)进行萃取分液，将有机相在用饱和氯化钠(30mL)洗涤1次后进行干燥旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到产物23-5。
在室温条件下，于50mL的烧瓶中，分别加入原料23-5(1.0g，1.5mmol)、二氯甲烷(20mL)和三氟乙酸(4mL)，混合均匀后，于室温下反应2小时后，TLC监控，直至原料反应完全；然后，减压除去有机溶剂，得到粗产物不经进一步纯化，直接用于下一步。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料23-6(500mg，0.88mmol)、吡啶(209mg，2.64mmol)、4-二甲氨基吡啶(21mg，0.18mmol)、乙腈(10mL)溶解；然后向其中缓慢加入对硝基苯基氯甲酸酯(265mg，1.32mmol)，反应2h后，TLC监控，直至产生一个新的荧光点。然后再向体系中加入3-二甲氨基-1-丙醇(346mg，2.64mmol)，反应过夜。LCMS监控反应完成，然后向体系中加入乙酸乙酯(30mL)与水(30mL)进行萃取分液，将有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤1次后进行干燥旋干，然后使用硅胶进行拌样，通过柱层析(流动相+梯度)得到最终产物化合物23。
下面以化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物9、化合物12、化合物13、化合物15、化合物16说明本发明的阳离子脂质化合物应用在mRNA递送系统LNP中的技术效果。
实施例1
脂质纳米颗粒制剂的制备及检测。
1.制备步骤：
将本发明的上述化合物1分别与DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000以50： 10：38.5：1.5的摩尔比溶于无水乙醇，制备乙醇脂质溶液。
将萤光素酶(luciferase，Luc)或白细胞介素2(IL2)mRNA用50mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝4)稀释得到mRNA水溶液。
通过微流控装置以1：3的体积比混合乙醇脂质溶液和mRNA水溶液制备脂质纳米颗粒，并静置透析18h除去乙醇和完成PBS换液。最后，脂质纳米颗粒溶液通过0.22μm无菌过滤器过滤及超滤浓缩，最终得到包封萤光素酶或白细胞介素2mRNA的化合物1脂质纳米颗粒制剂。
另外，制备MC3脂质纳米颗粒制剂作为对照。
此外，将化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物9、化合物12、化合物13、化合物15、化合物16制备成脂质纳米颗粒制剂，具体制备步骤同化合物1的制备步骤一致。
2.检测步骤
利用LitesizerTM500(Anton Paar，Austrian)测定脂质纳米颗粒粒径、多分散指数(PDI)和电位(Zeta)。其中，粒径及电位均在0.1％PBS中测定。通过RiboGreen检测方法获得脂质纳米颗粒制剂包封率。测试结果如表1所示：
表1
从表1可以看出：本发明的化合物1作为离子脂质可形成脂质纳米颗粒，并且其基本物理化学性质与对照MC3几乎无差异。
实施例2
脂质纳米颗粒制剂细胞转染。
制备实施例1中包封Luc mRNA的化合物1脂质纳米颗粒制剂。同时， 制备MC3脂质纳米颗粒制剂作为对照。
将上述两种制剂用培养基稀释至320ng/mL并加入Hek293细胞。转染24h后，去除培养基并用PBS冲洗。随后加入细胞裂解液并孵育10min。裂解完成后加入萤光素酶底物，用带化学发光模块的多功能酶标仪检测发光信号。测试结果参见图1所示。
从图1可以看出：相对于对照(MC3脂质纳米颗粒制剂)，本发明的化合物1脂质纳米颗粒制剂的细胞转染能力增强了十多倍。由此可见，本发明的化合物应用与mRNA递送系统时具有优异的递送效率。
实施例3
化合物1的脂质纳米颗粒制剂体内转染。
将BALB/c小鼠分为四组，每组4只。各组单次静脉(参见图2中的(a)，10μg/只)或肌肉(参见图2中的(b)，5μg/只)注射MC3或化合物1脂质纳米颗粒制剂。6h后腹腔注射萤光素酶底物，等待10min后解剖并取肝、肺、肾、脾器官，利用活体成像仪观察并定量信号。
实验结果参见图2所示。从图2可以看出：相对于对照(MC3脂质纳米颗粒制剂)，本发明化合物1脂质纳米颗粒制剂在脾脏部位的表达明显高于MC3。由此可见，本发明的阳离子脂质化合物的递送器官为脾，说明其具有器官靶向性。
实施例4
实施例1制备的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物9、化合物12、化合物13、化合物15、化合物16的脂质纳米颗粒制剂体内转染。
将BALB/c小鼠分为不同组别，每组3只。各组以2.5μg/只剂量肌肉注射MC3或实施例1制备的脂质纳米颗粒制剂。6h后腹腔注射萤光素酶底物，等待10min后利用活体成像仪观察并定量注射部位信号。随后解剖并 取肝脏、脾脏、淋巴结等器官，并再次定量各器官信号。
实验结果参见图3和图4所示。从图3可以看出，实施例1中各化合物制备的脂质纳米颗粒制剂均在体内表达出一定的蛋白水平，说明其递送效率高。
图4A、图4B、图4C是本发明的化合物制备的脂质纳米颗粒制剂和对照的不同部位的转染效果统计图；其中，图4A为小鼠肌肉注射6小时后肝脏分布定量结果；图4B为小鼠肌肉注射6小时后脾分布定量结果；图4C为小鼠肌肉注射6小时后淋巴结分布定量结果。从图4A、图4B、图4C可以看出：相对于对照(MC3脂质纳米颗粒制剂)，本发明实施例的化合物脂质纳米颗粒制剂在脾脏部位和淋巴结部位的表达明显高于MC3。由此可见，本发明的阳离子脂质化合物的递送器官为脾和/或淋巴结，说明其具有器官靶向性。
实施例5
脂质纳米颗粒制剂体内转染hIL2mRNA用于免疫激活。
将BALB/c小鼠根据体重分为2组，每组4只。各组单次以10μg/只剂量静脉注射MC3或化合物1两种脂质纳米颗粒制剂。给药后3h、6h、24h取血，Elisa检测血浆hIL-2的浓度(参见图5中的(a)图)及IFN-γ的浓度(参见图5中的(b)图)。
从图5可以看出：相对于对照(MC3脂质纳米颗粒制剂)，注射发明化合物1脂质纳米颗粒制剂，虽然小鼠血浆中的hIL-2的浓度低，但是，血浆中IFN-γ含量明显高于对照数倍；因此，由本发明化合物1制备的脂质纳米颗粒制剂表现出优异的免疫激活特性。
综上，本发明开发的阳离子脂质化合物，用于mRNA递送时，具有递送效果高、器官靶向递送、免疫激活特性优异的技术效果。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形 式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (17)

  1. 一种阳离子脂质化合物，其特征在于，所述阳离子脂质化合物的结构如下述式(I)所示：
    其中，在所述式(I)中：X为O或N；n为2-4；m为2-4；a为0或1；R1为包含三级胺的链状结构；R2为直链状脂肪酰基或具有支链的链状脂肪酰基；R3为具有支链的链状脂肪酰基。
  2. 根据权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，所述包含三级胺的链状结构为三级胺的链状结构。
  3. 根据权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，所述R1为如下任一种基团：
  4. 根据权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，所述直链状脂肪酰基为C8-C16的直链状脂肪酰基。
  5. 根据权利要求4所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，所述直链状脂肪酰基为C10-C14的直链状脂肪酰基。
  6. 根据权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，所述直链状脂肪酰基为以下基团中的任一种：
  7. 根据权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，在所述具有支链的链状脂肪酰基中：长链的C原子个数小于等于16，短链的C原子个数小于等于长链的C原子个数。
  8. 根据权利要求7所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，所述具有支链的链状脂肪酰基为以下基团中的任一种：
  9. 根据权利要求1-7任一项所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，所述阳离子脂质化合物为以下化合物中的任一种：




  10. 权利要求9所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物1-化合物5、化合物7的制备化学方程式如下：
    其中，当所制备的化合物为化合物1时，所述化合物N、化合物M选用：
    当所制备的化合物为化合物2时，所述化合物N、化合物M选用：
    当所制备的化合物为化合物3时，所述化合物N、化合物M选用：
    当所制备的化合物为化合物4时，所述化合物N、化合物M选用：
    当所制备的化合物为化合物5时，所述化合物N、化合物M选用：
    当所制备的化合物为化合物7时，所述化合物N、化合物M选用：
    其中，所述化合物1的制备步骤包括：在室温条件下，先向反应容器中加入原料1-10、吡啶、4-二甲氨基吡啶、乙腈；再向其中加入对硝基苯基氯甲酸酯，进行反应，反应设定时间后，TLC点板显示形成一个新的主点；再向反应体系中加入3-二乙氨基-1-丙醇，进行反应；反应结束后进行萃取分液处理；对有机相进行洗涤、干燥、纯化处理，得到无色的油状产品化合物1。
  11. 根据权利要求10所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，原料1-10的制备化学方程式如下：
    其中，原料1-10的制备步骤包括：在室温条件下，向反应容器中加入原料1-9、甲醇，以及有水钯碳；依次用惰性气体、氢气置换多次后，进行反应；反应结束后，进行抽滤处理以除去钯碳；将滤液旋干，得到的无色的油状产品为原料1-10。
  12. 权利要求9所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物9、化合物12、化合物13、化合物15、化合物16、化合物18的制备化学方程式如下：
    其中，制备步骤包括：在室温条件下，向容器中加入原料吡啶、4-二甲氨基吡啶、乙腈；溶解后，向其中加入对硝基苯基氯甲酸酯，进行反应；TLC监控，直至产生一个新的荧光点；然后，向反应体系中加入3-二甲氨基-1-丙醇，进行反应；反应结束后，进行萃取分液处理，并对有机相进行洗涤、干燥、纯化处理，得到所需化合物。
  13. 权利要求9所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物19-化合物20的制备化学方程式如下：
    优选的，所述化合物19-化合物20的制备步骤包括：向反应容器中加入原料吡啶、4-二甲氨基吡啶、乙腈；充分溶解后，向其中加入对硝基苯基氯甲酸酯，进行反应；TLC监控，直至产生一个新的荧光点；然后，向反应体系中加入3-二甲氨基-1-丙醇，反应过夜；反应完成后，进行萃取分液处理，对有机相进行洗涤、干燥、纯化后，得到化合物19-化合物20。
  14. 权利要求9所述的阳离子质脂化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物6的制备化学方程式如下：
    其中，所述化合物6的制备步骤如下：在冰水浴条件下，向反应容器中，加入原料1-10和DMF，混合溶解，冷却至0-5℃，然后再向反应容器中分批加入氢化钠进行反应，反应设定时间后，将原料6-1加入滴到反应体系中，进行反应；反应结束后，依次进行淬灭、萃取分液、干燥、纯化处理后，得到无色的油状化合物6。
  15. 权利要求23所述的阳离子质脂化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物23的制备化学方程式如下：
    优选的，所述化合物23的制备步骤包括：在室温条件下，向反应容器中加入原料23-6、吡啶、4-二甲氨基吡啶、乙腈；充分溶解后，再向其中加入对硝基苯基氯甲酸酯进行反应，TLC监控，直至产生一个新的荧光点；然后，再向反应体系中在加入3-二甲氨基-1-丙醇，反应过夜；反应结束后，进行萃取分液处理，将有机相洗涤、干燥及纯化处理后，得到化合物23。
  16. 权利要求1-9任一项所述的阳离子脂质化合物在制备mRNA递送系统中的应用。
  17. 一种mRNA递送系统，其特征在于，所述mRNA递送系统包括权利要求1-9任一项所述的阳离子脂质化合物。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117466777B (zh) * 2023-12-27 2024-03-19 北京新合睿恩生物医疗科技有限公司 阳离子脂质化合物及其制备方法和应用、以及mRNA递送系统

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101163796A (zh) * 2004-06-07 2008-04-16 普洛体维生物治疗公司 阳离子脂质及应用方法
CN103096875A (zh) * 2010-06-03 2013-05-08 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于递送活性剂的生物可降解脂质
WO2013086354A1 (en) * 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
US20160317458A1 (en) * 2013-12-19 2016-11-03 Luis Brito Lipids and Lipid Compositions for the Delivery of Active Agents
CN110325511A (zh) * 2016-12-21 2019-10-11 阿克丘勒斯治疗公司 用于rna递送的可离子化阳离子脂质
CN112262122A (zh) * 2018-06-08 2021-01-22 富士胶片株式会社 化合物或其盐及脂质颗粒

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2143903C1 (ru) * 1993-02-19 2000-01-10 Ниппон Синяку Ко., Лтд. Фармацевтическая композиция, содержащая сополимер нуклеиновой кислоты
CA2325550A1 (en) * 1998-03-24 1999-09-30 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Remedies for hepatitis
KR102095085B1 (ko) * 2013-11-18 2020-03-31 아크투루스 쎄라퓨틱스, 인크. Rna 전달을 위한 이온화가능한 양이온성 지질
EP3083556B1 (en) * 2013-12-19 2019-12-25 Novartis AG Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
EP3397613A1 (en) * 2015-12-30 2018-11-07 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
CN107281103A (zh) * 2016-04-11 2017-10-24 百奥迈科生物技术有限公司 具有高含量阳性脂质化合物的脂质体制剂及其应用
WO2020118041A1 (en) * 2018-12-05 2020-06-11 Intellia Therapeutics, Inc. Modified amine lipids
EP3959191A1 (en) * 2019-04-25 2022-03-02 Intellia Therapeutics, Inc. Ionizable amine lipids and lipid nanoparticles
JP7241869B2 (ja) * 2019-06-07 2023-03-17 富士フイルム株式会社 脂質組成物
EP4213882A1 (en) * 2020-09-15 2023-07-26 Verve Therapeutics, Inc. Lipid formulations for gene editing
CN112979483B (zh) * 2021-05-14 2021-08-06 苏州艾博生物科技有限公司 一种阳离子脂质化合物、包含其的组合物及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101163796A (zh) * 2004-06-07 2008-04-16 普洛体维生物治疗公司 阳离子脂质及应用方法
CN103096875A (zh) * 2010-06-03 2013-05-08 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于递送活性剂的生物可降解脂质
WO2013086354A1 (en) * 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
US20160317458A1 (en) * 2013-12-19 2016-11-03 Luis Brito Lipids and Lipid Compositions for the Delivery of Active Agents
CN110325511A (zh) * 2016-12-21 2019-10-11 阿克丘勒斯治疗公司 用于rna递送的可离子化阳离子脂质
CN112262122A (zh) * 2018-06-08 2021-01-22 富士胶片株式会社 化合物或其盐及脂质颗粒

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