WO2023172099A1 - 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023172099A1
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protein
palmitoylation
vector
fusion protein
activatable
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PCT/KR2023/003292
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연준희
서병창
김별이
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재단법인 대구경북과학기술원
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Definitions

  • the present invention relates to chemogenetically activatable palmitoylation regulatory proteins and uses thereof.
  • Palmitoylation belongs to lipidation among the post-translational modifications of proteins and is a phenomenon in which palmitate, a lipid consisting of 16 carbon chains, is attached to a specific cysteine amino acid in a protein.
  • palmitoylation is the only one that is reversible, and it allows proteins to shuttle between the plasma membrane and the endomembrane. Palmitoylated proteins are transported to the cell membrane, where they perform specific functions. Conversely, when depalmitoylation occurs, the protein detaches from the cell membrane, moves to the inner cell membrane, and loses its function in the cell membrane.
  • the amphiphilic-mediated depalmitoylation technology artificially synthesizes a compound that has both a water-friendly hydrophilic group and a water-unfriendly hydrophobic group, and then treats it with cells. Then, the amphiphilic molecules penetrate the cell membrane and form the target protein. This is a technology that induces depalmitoylation of the target protein by directly binding to and dissociating the palmitoylate group of the target protein.
  • amphiphilic induced depalmitoylation technology requires the synthesis of an artificial amphipathic molecular compound, but the synthesis process is very difficult and expensive, and the amphipathic molecular compound is treated directly in cells in vitro (in vitro). It could only be used under in vitro conditions.
  • amphipathic molecular compounds affect not only target cells but also normal cells, and once treated with amphipathic molecular compounds, there is a high possibility that they will continue to remain in the cell membrane and cause side effects, and as an irreversible reaction, repeated experiments are required. There was this impossible problem (Rudd, AK, et al., Amphiphile-Mediated Depalmitoylation of Proteins in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 50, 17374-17378).
  • One aspect includes a first chemogenetic protein; and a depalmitoylation protein; to provide a fusion protein for regulating palmitoylation that is chemically and genetically activatable.
  • Another aspect is to provide a polynucleotide encoding the chemogenetically activatable fusion protein for regulating palmitoylation.
  • Another aspect is providing a vector containing the polynucleotide.
  • Another aspect is to provide a method of controlling palmitoylation by a chemogenetically activatable fusion protein.
  • First chemogenetic protein And a depalmitoylation protein; a chemically genetically activatable fusion protein for regulating palmitoylation, including a fusion protein.
  • the first chemical genetic protein is FKBP (FK506 binding protein), FRB (FKBP ⁇ Rapamycin binding domain), CNA (Calcineurin A), CyP-Fas, GyrB (gyrase type II), GAI (gibberellin) ), GID (gibberellin insensitive dwarf 1), ABI (abscisic acid insensitive 1), PYR (pyrabactin resistance), PYL (PYR1-like), SNAP-tag (synaptosomal-associated protein-tag), Halo-tag, eDHFR (Dihydrofolate) reductase), Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra large), and Fab (AZ1), a chemogenetically activatable fusion protein for regulating palmitoylation.
  • FKBP FK506 binding protein
  • FRB FKBP ⁇ Rapamycin binding domain
  • CNA Calcineurin A
  • CyP-Fas CyP-Fas
  • the depalmitoylated protein is APT1 (Acyl protein thioesterase 1), APT2 (Acyl protein thioesterase 2), PPT1 (palmitoyl-protein thioesterase 1), PPT2 (palmitoyl-protein thioesterase 2), ABHD10 ( ⁇ / ⁇ hydrolase domain-containing protein 10), ABHD17A ( ⁇ / ⁇ hydrolase domain-containing protein 17A), ABHD17B ( ⁇ / ⁇ hydrolase domain-containing protein 17B), and ABHD17C ( ⁇ / ⁇ hydrolase domain-containing protein 17C).
  • a fusion protein for regulating palmitoylation that is chemically and genetically activatable, selected from the group consisting of:
  • the chemical genetic compound is one or more selected from the group consisting of Rapamycin, FK506, FKCsA, FK1012, Coumermycin, Gibberellin, Abscisic acid, Mandipropamid, HaXS, TMP-Htaq, and ABT-737.
  • Activatable fusion protein for regulating palmitoylation is one or more selected from the group consisting of Rapamycin, FK506, FKCsA, FK1012, Coumermycin, Gibberellin, Abscisic acid, Mandipropamid, HaXS, TMP-Htaq, and ABT-737.
  • the vector is a lentivirus plasmid, an adeno-associated virus plasmid, an adenovirus plasmid, or a ⁇ -retrovirus plasmid.
  • fluorescent protein vectors such as green fluorescent protein (GFP vector), yellow fluorescent protein (YFP vector), red fluorescent protein (RFP vector), and orange fluorescent protein vector (orange). Consisting of a fluorescent protein (OFP vector), a cyan fluorescent protein (CFP vector), a blue fluorescent protein (BFP vector), and a far-red fluorescent protein (fRFP vector).
  • GFP vector green fluorescent protein
  • YFP vector yellow fluorescent protein
  • RFP vector red fluorescent protein
  • OFP vector orange fluorescent protein vector
  • OFP vector cyan fluorescent protein
  • BFP vector blue fluorescent protein
  • fRFP vector far-red fluorescent protein
  • a method for controlling palmitoylation by a chemically activatable fusion protein comprising: treating the cell in which the vector is expressed with a chemical genetic compound.
  • the chemically genetically activatable palmitoylation regulatory fusion protein of the present invention can irreversibly regulate the palmitoylation of a target protein present in the cell membrane through compound treatment.
  • the chemically genetically activatable palmitoylation regulatory fusion protein of the present invention is harmless to cells and organisms through compound treatment and can exhibit excellent diagnostic, preventive and therapeutic effects on diseases related to palmitoylation.
  • Figure 1 is a diagram showing the cloning process of GFP-ABHD17A. This diagram shows that the FKBP gene and ABHD17A gene are amplified by PCR using the appropriate primers and then inserted into the multiple cloning site frame of the pEGFP-C1 vector to produce the GFP-FKBP -ABHD17A construct.
  • Figure 2 is a diagram showing a palmitoylation regulatory fusion protein applied to chemical genetics.
  • Figure 2(A) is a diagram showing the mechanism of action of GFP-FKBP-ABHD17A + LDR.
  • Figure 2(B) is a confocal microscope image of changes before and after rapamycin treatment (Control) in HEK293T cells expressing GFP-FKBP-ABHD17A and N-Ras protein labeled with LDR and fluorescent protein.
  • Figure 3 is a diagram showing the essentials of a palmitoylation regulatory fusion protein applied to chemical genetics.
  • Figures 3(A) and 3(D) show changes in HEK293T cells expressing GFP-FKBP-ABHD17A and N-Ras protein labeled with LDR and fluorescent protein before and after DMSO treatment (Control) using a confocal microscope. It is one degree.
  • Figures 3(B) and 3(E) show changes before and after rapamycin treatment (Control) in HEK293T cells expressing GFP-FKBP-ABHD17A and fluorescent protein-tagged N-Ras protein without LDR using a confocal microscope. It is one degree.
  • Figures 3(C) and 3(F) show HEK293T cells expressing GFP-FKBP-ABHD17A(S190A) with a mutated catalytic domain and N-Ras protein labeled with LDR and fluorescent protein before rapamycin treatment (Control). This is a diagram showing the changes afterward using a confocal microscope.
  • Figure 4 is a diagram showing the dynamics of palmitoylation-regulated fusion protein applied to chemical genetics.
  • Figure 4(A) shows changes in HEK293T cells expressing GFP-FKBP-ABHD17A and N-Ras protein labeled with LDR and fluorescent protein before and after treatment with ramapamycin (Control), photographed under a confocal microscope every 10 minutes. It is one degree.
  • Figure 4(B) is a graph analyzing the image shown in Figure 4(A), showing the change in mCherry and GFP fluorescence intensity over time by analyzing the cytoplasm/cell membrane ratio.
  • Figure 5 is a diagram showing that palmitoylation regulatory fusion protein applied to chemical genetics inhibits the growth and proliferation of skin cancer fibrosarcoma HT1080 cell line with N-Ras (Q61K) mutation.
  • Figure 5(A) is a photo taken using an optical microscope on days 1 and 7 when pure HT1080 cells that were not transfected were treated with DMSO, 2-BP, and rapamycin, respectively.
  • Figure 5(B) is a photo taken with an optical microscope of cells on days 1 and 7 when HT1080 cells expressing LDR and GFP-FKBP-ABHD17A were treated with DMSO, 2-BP, and rapamycin, respectively.
  • Figure 5(C) is a diagram showing the cell growth curve calculated by counting the number of cells at the same time every day for 7 days in Figure 5(A)
  • Figure 5(D) is a diagram showing the cell growth curve calculated at the same time every day for 7 days in Figure 5(B). This diagram shows the cell growth curve calculated by counting the number of cells over time.
  • the present inventors have developed a chemically genetically activatable palmitoylation regulatory fusion protein, and when the fusion protein is chemically activated through compound treatment, the palmitoylation of the target protein present in the cell membrane can be irreversibly controlled. It was confirmed that it has excellent diagnostic, preventive and therapeutic effects on diseases related to palmitoylation.
  • the present invention provides a fusion protein for regulating palmitoylation that is chemically and genetically activatable.
  • Chemogenetics is a technique used in research in various biological fields. It modifies a specific protein using genetic methods to react to small molecule chemicals that do not react originally. This means that it is made so that it can be adjusted.
  • the fusion protein can be activated by treating cells with low-molecular-weight chemicals to form bonds between chemical genetic proteins.
  • the term 'palmitoylation' belongs to lipidation among protein post-translational modifications, and palmitate, a 16-carbon lipid, is used to bind a specific cysteine of a protein. This refers to the phenomenon of attachment to amino acids. Among numerous lipidations, palmitoylation is the only one that is reversible, and it allows proteins to shuttle between the plasma membrane and the endomembrane. Palmitoylated proteins are transported to the cell membrane, where they can perform specific functions.
  • 'Depalmitoylation' refers to the phenomenon of palmitate being dropped from a palmitoylated protein. When a protein is depalmitoylated, it breaks away from the cell membrane, moves to the inner cell membrane, and may lose its function in the cell membrane.
  • palmitoylation of the target protein present in the cell membrane can be controlled by treating it with a chemical genetic compound as a low-molecular-weight chemical substance, so it is harmless to cells and individuals and is an excellent diagnosis for diseases related to palmitoylation. , can have preventive and therapeutic effects.
  • the palmitoylation-related disease may be one or more diseases selected from the group consisting of solid cancer, Alzheimer's disease, sepsis, diabetes, Covid-19, and Ras disease.
  • the palmitoylation-related disease is caused by oncogenes (e.g., Ras protein and EGFR protein), cancer suppressor genes (e.g., SCRIB, melanocortin 1 receptor), and immune checkpoint inhibitor genes (e.g., PD-L1 , CTLA4 receptor, STING), etc., may occur as their intracellular location changes depending on whether they are palmitoylated or not.
  • oncogenes e.g., Ras protein and EGFR protein
  • cancer suppressor genes e.g., SCRIB, melanocortin 1 receptor
  • immune checkpoint inhibitor genes e.g., PD-L1 , CTLA4 receptor, STING
  • the solid cancer may be caused by mutation or palmitoylation of Ras, the target protein.
  • the palmitoylation-related disease may be Alzheimer's disease, and the Alzheimer's disease may be caused by abnormal depalmitoylation of the APP (Amyloid precursor protein) protein.
  • APP Amyloid precursor protein
  • the palmitoylation-related disease may be sepsis, and may be caused by abnormal palmitoylation of inflammatory mediator protein or MYD88 in white blood cells.
  • the fusion protein includes a first chemogenetic protein; It may be a chemically genetically activatable fusion protein for regulating palmitoylation, including a depalmitoylation protein.
  • the chemical genetic protein may refer to a protein that forms a complex when processing low-molecular-weight chemicals.
  • the first chemical genetic protein is FKBP (FK506 binding protein), FRB (FKBP ⁇ Rapamycin binding domain), CNA (Calcineurin A), CyP-Fas, GyrB (gyrase type II), GAI ( gibberellin), GID (gibberellin insensitive dwarf 1), ABI (abscisic acid insensitive 1), PYR (pyrabactin resistance), PYL (PYR1-like), SNAP-tag (synaptosomal-associated protein-tag), Halo-tag, eDHFR ( Dihydrofolate reductase), Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra large), and Fab (AZ1).
  • the first chemical genetic protein may be one selected from the group consisting of FKBP (FK506 binding protein) and FRB (FKBP ⁇ Rapamycin binding domain).
  • the depalmitoylated protein is APT1 (Acyl protein thioesterase 1), APT2 (Acyl protein thioesterase 2), PPT1 (palmitoyl-protein thioesterase 1), PPT2 (palmitoyl-protein thioesterase 2), and ABHD10.
  • APT1 Acyl protein thioesterase 1
  • APT2 Acyl protein thioesterase 2
  • PPT1 palmitoyl-protein thioesterase 1
  • PPT2 palmitoyl-protein thioesterase 2
  • ABHD10 ⁇ / ⁇ hydrolase domain-containing protein 10
  • ABHD17A ⁇ / ⁇ hydrolase domain-containing protein 17A
  • ABHD17B ⁇ / ⁇ hydrolase domain-containing protein 17B
  • ABHD17C ⁇ / ⁇ hydrolase domain-containing protein 17C It may be one selected from the group consisting of.
  • the depalmitoylated protein is ABHD17A ( ⁇ / ⁇ hydrolase domain-containing protein 17A), ABHD17B ( ⁇ / ⁇ hydrolase domain-containing protein 17B), and ABHD17C ( ⁇ / ⁇ hydrolase domain-containing protein 17C). It may be one selected from the group consisting of.
  • the fusion protein may be located in the cytoplasm upon intracellular transfection.
  • the fusion protein may bind to the cell membrane during intracellular transfection.
  • the first chemical genetic protein of the fusion protein may bind to the second chemical genetic protein present in the cell membrane.
  • the first chemogenetic protein; and a second chemical genetic protein; the binding may be induced by a chemical genetic compound. In one embodiment, the first chemogenetic protein; and a second chemical genetic protein; the binding may occur irreversibly depending on treatment with the chemical genetic compound.
  • chemogenetic compound refers to a first chemogenetic protein that is not inherently reactive; and a second chemical genetic protein; refers to a compound that allows the two chemical genetic proteins to bind.
  • the functions of the chemical genetic proteins can be regulated by binding to them by chemical genetic compounds.
  • the chemogenetic compound includes a first chemogenetic protein; and a second chemical genetic protein; and may form a complex.
  • the chemical genetic compound may be one or more selected from the group consisting of Rapamycin, FK506, FKCsA, FK1012, Coumermycin, Gibberellin, Abscisic acid, Mandipropamid, HaXS, TMP-Htaq, and ABT-737.
  • the fusion protein may have impurities removed by, for example, centrifugation or ultrafiltration, and the resulting product may be purified using, for example, affinity chromatography. Additional other purification techniques may be used, such as anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxylapatite chromatography, etc.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the chemically genetically activatable fusion protein for regulating palmitoylation.
  • the polynucleotide encoding the fusion protein is used interchangeably with “nucleotide”, “nucleotide sequence”, “nucleic acid”, and “oligonucleotide”. It may include polymeric forms of nucleotides of any length, deoxyribonucleotides or ribonucleotides, or analogs thereof. Polynucleotides can have any three-dimensional structure and can perform any function, known or unknown. The polynucleotide is meant to comprehensively include DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are basic structural units, include not only natural nucleotides but also analogues with modified sugar or base sites. The sequence of the polynucleotide may be modified. The modifications include additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • the present invention provides a vector containing a polynucleotide encoding the fusion protein for regulating palmitoylation.
  • the vector component may generally include one or more selected from the group consisting of a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. Additionally, in the vector, the polynucleotide is operably linked to the promoter.
  • operably linked refers to a functional linkage between an expression control sequence (e.g., a promoter, a signal sequence, or an array of transcriptional regulator binding sites) and another polynucleotide, whereby the control sequence It regulates the transcription and/or translation of the other polynucleotide sequences.
  • an expression control sequence e.g., a promoter, a signal sequence, or an array of transcriptional regulator binding sites
  • a strong promoter capable of advancing transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells e.g., metallothionein promoter, ⁇ -actin promoter, human heroglobin promoter, and human muscle creatine promoter
  • mammalian cell genomes Promoters derived from animal viruses (e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV , the promoter of Moloney virus, the promoter of Epstein-Barr virus (EBV), and the promoter of Roux Sarcoma virus (RSV) can be used, and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
  • adenovirus late promoter vaccinia virus 7.5K promoter
  • SV40 promoter cytomegalovirus (CMV) promoter
  • tk promoter of HSV e
  • the vector is a lentivirus plasmid, an adeno-associated virus plasmid, an adenovirus plasmid, and a ⁇ -retrovirus plasmid.
  • fluorescent protein vectors such as green fluorescent protein (GFP vector), yellow fluorescent protein (YFP vector), red fluorescent protein (RFP vector), and orange fluorescent protein vector ( orange fluorescent protein, OFP vector), cyan fluorescent protein, CFP vector, blue fluorescent protein, BFP vector, and far-red fluorescent protein, fRFP vector. It may be one or more selected from the group consisting of
  • the vectors can be delivered in vivo or into cells through electroporation, lipofection, viral vectors, nanoparticles, as well as PTD (Protein translocation domain) fusion protein methods, respectively.
  • PTD Protein translocation domain
  • the present invention provides cells transformed with the above-mentioned vectors.
  • the cells may be prokaryotic, yeast or higher eukaryotic cells, specifically strains of the genus Bacillus such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (Pseudomonas) (e.g. Pseudomonas putida), Proteus mirabilis and Staphylococcus (e.g. Staphylocus carnosus) and It may be the same prokaryotic host cell.
  • the cells can be cultured in various media. Any commercially available medium can be used as a culture medium without limitation. All other necessary supplements known to those skilled in the art may also be included in suitable concentrations. Culture conditions, such as temperature, pH, etc., are already used with host cells selected for expression and will be clear to those skilled in the art.
  • the present invention includes the steps of injecting a vector containing a polynucleotide encoding the fusion protein for regulating palmitoylation into an individual and expressing the vector;
  • a method for controlling palmitoylation by a chemically activatable fusion protein including the step of treating cells in which the vector is expressed with a chemical genetic compound.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating palmitoylation-related diseases, comprising the chemically genetically activatable fusion protein for regulating palmitoylation.
  • prevention used in the present invention refers to all actions that suppress or delay the onset of palmitoylation-related diseases by the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which the symptoms of a palmitoylation-related disease are improved or beneficially changed by the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally (e.g., intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, intranasally, inhaled, or applied topically) according to the desired method, and the dosage depends on the patient's condition. It varies depending on body weight, disease severity, drug type, administration route and time, but may be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat or diagnose a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or diagnosis, and the effective dose level is determined by the type of disease, severity, and drug of the patient. It can be determined based on factors including activity, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the patient's age, gender, condition, body weight, absorption, inactivation rate and excretion rate of the active ingredient in the body, type of disease, and drug used in combination.
  • it can be administered every day or every other day, or divided into 1 to 3 times a day.
  • the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the optogenetically activatable fusion protein for regulating palmitoylation is added to the pharmaceutical composition in an amount of 0.1 ⁇ g to 3.0 ⁇ g, 0.1 ⁇ g to 2.5 ⁇ g, 0.1 ⁇ g to 2.0 ⁇ g, and 0.15 ⁇ g to 2.0 ⁇ g. , 0.2 ⁇ g to 2.0 ⁇ g, 0.25 ⁇ g to 2.0 ⁇ g, 0.25 ⁇ g to 1.5 ⁇ g, or 0.25 ⁇ g to 1.0 ⁇ g.
  • the compound When the compound is administered as a composition, it may be formulated with a suitable amount of a pharmaceutically acceptable vehicle or carrier to provide an appropriate dosage form.
  • composition may further include a carrier, excipient, and diluent used in the preparation of the pharmaceutical composition.
  • the carrier is commonly used and includes, but is not limited to, saline solution, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline solution, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, etc., and may be added with antioxidants as needed. , and other common additives such as buffer solutions may be further included.
  • excipients such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc., pills, capsules, granules, or tablets.
  • excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, Examples include, but are not limited to, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, or mineral oil.
  • the formulations can be preferably formulated according to each ingredient using the method disclosed in Remington's literature.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in formulation, but may be formulated as an injection formulation, an injection formulation, a spray formulation, an inhalation formulation, or an external application to the skin.
  • composition can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions.
  • Solid preparations for oral administration can be tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and the solid preparations include the tectorigenin and its fractions with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, and sucrose. It can be prepared by mixing , lactose, or gelatin. Additionally, in addition to the above excipients, lubricants such as magnesium styrate and talc may be used.
  • Liquid preparations for oral administration may include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • simple diluents such as water and liquid paraffin
  • excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be used.
  • Preparations for parenteral administration can be sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • the non-aqueous solvent or suspension may be propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, or injectable ester such as ethyl oleate.
  • injectable ester such as ethyl oleate.
  • witepsol, macrogol, tween 61, cacao, laurel, and glycerogenatin can be used as a base for the suppository.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving palmitoylation-related diseases, comprising a chemically genetically activatable fusion protein for regulating palmitoylation as an active ingredient.
  • the term “improvement” refers to any action that reduces at least the severity of a parameter related to the condition being treated, such as a symptom.
  • the health functional food composition can be used simultaneously or separately with a drug for treatment before or after the onset of the disease in order to prevent or improve the disease.
  • the active ingredient can be added as is to food or used together with other foods or food ingredients, and can be used appropriately according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention or improvement).
  • the composition of the present invention may be added in an amount of preferably 15% by weight or less, preferably 10% by weight or less, based on the raw materials.
  • the amount may be below the above range.
  • the health functional food composition of the present invention may contain other ingredients as essential ingredients without any particular limitations.
  • it may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, etc.; Disaccharides such as maltose, sucrose, etc.; and polysaccharides, such as common sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents thaumatin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the ratio of the natural carbohydrates can be appropriately determined by the selection of a person skilled in the art.
  • the health functional food composition of the present invention contains various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic and natural flavoring agents, colorants and thickening agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, It may contain alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, etc. These components can be used independently or in combination, and the proportions of these additives can also be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the present invention provides a pharmaceutical preparation for preventing or treating palmitoylation-related diseases, comprising the pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a composition for diagnosing palmitoylation-related diseases, including the chemically genetically activatable fusion protein for regulating palmitoylation.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject a composition for preventing or treating palmitoylation-related diseases comprising the chemically genetically activatable fusion protein for regulating palmitoylation. .
  • “individual” refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, and cows. It means mammal.
  • the present invention provides the use of a chemically genetically activatable fusion protein for regulating palmitoylation for the prevention or treatment of palmitoylation-related diseases.
  • the present invention provides the use of a chemogenetically activatable fusion protein for regulating palmitoylation for producing a drug for treating palmitoylation-related diseases.
  • the present invention provides the use of a composition containing a chemical genetically activatable fusion protein for regulating palmitoylation for producing a drug for the treatment of palmitoylation-related diseases.
  • Example 1 Construction of a gene encoding a chemical genetic fusion protein
  • the chemical genetic proteins FKBP and FRB have the property of forming a triple complex by rapamycin. Applying this, a gene encoding the fusion protein was created using genetic techniques to express a fusion protein that binds to FRB, a chemical genetic protein located on the cell membrane within the cell.
  • GFP-FKBP-ABHD17A which encodes the green fluorescent protein GFP, the chemical genetic protein FKBP, and the depalmitoylation enzyme ABHD17A, was created.
  • the gene produced above was fused to a vector to finally construct a vector containing the gene of GFP-FKBP-ABHD17A.
  • the FKBP gene (GeneBank registration number: NM_054014.4, amino acid residues 1-108 of FKBP prolyl isomerase 1A (FKBP1A)) was amplified by PCR using primers and cloned in frame at the multiple cloning sites HindIII and EcoRI of the pEGFP-C1 vector.
  • ABHD17A (NM_001006983.1, ⁇ / ⁇ hydrolase domain-containing protein 17A) was amplified by PCR using primers and placed in frame at the multiple cloning sites EcoRI and BamHI of the GFP-FKBP vector.
  • the final GFP-FKBP-ABHD17A construct was produced by inserting as shown in Figure 1.
  • rapamycin When the cell in which the fusion protein is expressed is treated with rapamycin, a chemical genetic compound, rapamycin passes through the cell membrane and passes through FKBP protein, which is the first chemical genetic protein among the fusion proteins; and FRB protein, a second chemical genetic protein located in the cell membrane, forming ternary complexes.
  • the rapamycin causes the entire fusion protein to move to the cell membrane where the FRB protein is present, and ABHD17A protein, a palmitoylated protein among the fusion proteins, causes depalmitoylation of N-Ras, the target protein present in the cell membrane. It was confirmed that it was induced and moved to the cytoplasm (see Figure 2(A)).
  • HEK293T cells expressing the fusion protein, LDR, and fluorescent protein-labeled N-Ras protein were photographed before and after rapamycin treatment (Control) using a confocal microscope.
  • palmitoylation of the target protein can be irreversibly controlled by controlling the location and activity of the fusion protein through chemical genetic processing.

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Abstract

본 발명의 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절 융합 단백질은 화합물 처리를 통해 세포막에 존재하는 목표 단백질의 팔미토일화를 비가역적으로 조절할 수 있어, 팔미토일화와 관련된 질환에 대한 우수한 진단, 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.

Description

화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절 단백질 및 이의 용도
본 발명은 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
팔미토일화는 단백질 번역 후 변형(post-translational modification) 중 지질화(lipidation)에 속하며 탄소사슬 16개로 이루어진 지질인 팔미테이트(palmitate)가 단백질의 특정 시스테인(cysteine) 아미노산에 붙는 현상이다. 수많은 lipidation 중 팔미토일화만 유일하게 가역성이 있으며 이를 통해 단백질은 원형질막(plasma membrane)과 세포내막(endomembrane) 사이를 왕복하게 된다. 팔미토일화된 단백질은 세포막으로 수송되며 그곳에서 특정한 기능을 수행한다. 반대로, 탈팔미토일화 되면 단백질은 세포막으로부터 떨어져 나와 세포내막으로 이동하고 세포막에서 수행하던 기능 또한 상실하게 된다.
양친매성 유도 탈팔미토일화(amphiphilic-mediated depalmitoylation) 기술은 물에 친한 친수성기와 물에 친하지 않는 소수성기를 동시에 갖고 있는 화합물을 인위적으로 합성한 다음 세포에 처리하면 양친매성 분자가 세포막을 침투하여 목표 단백질의 팔미테이트(palmitoylate)기에 직접 결합 및 분리시킴으로써 목표단백질의 탈팔미토일화(depalmitoylation)를 유도하는 기술이다.
종래의 양친매성 유도 탈팔미토일화 기술은 인위적인 양친매성 분자 화합물의 합성이 필수적인데, 그 합성 과정이 매우 까다롭고 비용이 많이 들고, 양친매성 분자 화합물을 세포에 직접 처리하는 방법으로 시험관내(in vitro) 조건에서만 사용될 수 있었다. 또한, 양친매성 분자 화합물은 목표 세포뿐만 아니라 주의의 정상세포들에까지 영향을 미치게 되며, 양친매성 분자 화합물을 한번 처리하면 계속해서 세포막에 남아 부작용을 일으킬 가능성이 매우 크고, 비가역적인 반응으로서 반복적인 실험이 불가능한 문제점이 있었다 (Rudd, A. K., et al., Amphiphile-Mediated Depalmitoylation of Proteins in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 50, 17374-17378).
최근 화학유전학의 발전으로 신호 경로의 구성 요소를 시-공간적으로 조작할 수 있게 되어, 신호 전달이 어떻게 동적으로 조절되고 있는지 확인할 수 있으며, 화학유전학적인 방법으로 상기 신호 전달을 조절하는 방법에 대한 개발이 이루어지고 있다. 신호 전달 경로의 각 구성은 자극의 다양한 모드로 다르게 반응하는 것으로 알려져 있다. 신호 전달 네트워크의 화학유전학적 연구를 통해 신호 전달 경로의 시공간 조절뿐만 아니라, 세포 및 기관 수준의 결과 외에도 많은 질환에서 볼 수 있는 신호 전달 기능 장애를 입증할 수 있다.
다만, 화학유전학적인 방법을 이용하여 신호 전달 네트워크에서 탈팔미토일화를 조절하는 방법에 대해서는 현재까지 보고된 바가 없다. 이에, 본 발명자들은 팔미토일화 단백질을 살아있는 세포에서 실시간으로 탈팔미토일화 할 수 있는 방법을 개발하고자, 화학유전학 단백질을 이용하여 탈팔미토일화 효소인 ABHD17A의 인위적인 세포막 이동을 통해 타겟 단백질을 탈팔미토일화 할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 제 1 화학유전학 단백질; 및 탈팔미토일화 단백질;을 포함하는, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
다른 양상은 화학유전학적으로 활성화 가능한 융합 단백질에 의한 팔미토일화를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
1. 제 1 화학유전학 단백질; 및 탈팔미토일화 단백질;을 포함하는, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
2. 위 1에 있어서, 상기 제 1 화학유전학 단백질은 FKBP (FK506 binding protein), FRB(FKBP·Rapamycin binding domain), CNA(Calcineurin A), CyP-Fas, GyrB(gyrase type II), GAI(gibberellin), GID(gibberellin insensitive dwarf 1), ABI(abscisic acid insensitive 1), PYR(pyrabactin resistance), PYL(PYR1-like), SNAP-tag(synaptosomal-associated protein-tag), Halo-tag, eDHFR(Dihydrofolate reductase), Bcl-xL(B-cell lymphoma-extra large) 및 Fab(AZ1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
3. 위 1에 있어서, 상기 탈팔미토일화 단백질은 APT1 (Acyl protein thioesterase 1), APT2 (Acyl protein thioesterase 2), PPT1 (palmitoyl-protein thioesterase 1), PPT2 (palmitoyl-protein thioesterase 2), ABHD10(α/β hydrolase domain-containing protein 10), ABHD17A (α/β hydrolase domain-containing protein 17A), ABHD17B (α/β hydrolase domain-containing protein 17B) 및 ABHD17C (α/β hydrolase domain-containing protein 17C)으로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
4. 위 1에 있어서, 상기 융합 단백질은 세포 내 형질 주입시 세포질에 위치하는 것인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
5. 위 1에 있어서, 상기 제 1 화학유전학 단백질;은 세포막에 존재하는 제 2 화학유전학 단백질;과 결합하는 것인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
6. 위 5에 있어서, 상기 제 1 화학유전학 단백질; 및 제 2 화학유전학 단백질;의 결합은 화학유전학 화합물에 의해 유도되는 것인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
7. 위 6에 있어서, 상기 화학유전학 화합물은 제 1 화학유전학 단백질; 및 제 2 화학유전학 단백질;과 결합하여 복합체를 형성하는 것인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
8. 위 6에 있어서, 상기 화학유전학 화합물은 Rapamycin, FK506, FKCsA, FK1012, Coumermycin, Gibberellin, Abscisic acid, Mandipropamid, HaXS, TMP-Htaq 및 ABT-737로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
9. 위 1 내지 8 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
10. 위 9에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
11. 위 10에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스 플라스미드 (Lentivirus plasmid), 아데노-연관 바이러스 플라스미드 (Adeno-associated virus plasmid), 아데노 바이러스 플라스미드 (Adenovirus plasmid), γ -레트로 바이러스 플라스미드 (γ-Retrovirus plasmid), 형광단백질벡터인 녹색형광단백질벡터(green fluorescent protein, GFP vector), 황색형광단백질벡터(yellow fluorescent protein, YFP vector), 적색형광단백질벡터(red fluorescent protein, RFP vector), 주황형광단백질벡터(orange fluorescent protein, OFP vector), 청록색형광단백질벡터(cyan fluorescent protein, CFP vector), 청색형광단백질벡터(Blue fluorescent protein, BFP vector) 및 원적색형광단백질벡터(far-red fluorescent protein, fRFP vector)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 벡터.
12. 위 10의 벡터를 세포에 주입하고 상기 벡터를 발현시키는 단계; 및
상기 벡터가 발현된 세포에 화학유전학 화합물을 처리하는 단계;를 포함하는, 화학유전학적으로 활성화 가능한 융합 단백질에 의한 팔미토일화를 조절하는 방법.
본 발명의 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절 융합 단백질은 화합물 처리를 통해 세포막에 존재하는 목표 단백질의 팔미토일화를 비가역적으로 조절할 수 있다.
본 발명의 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절 융합 단백질은 화합물 처리를 통해 세포 및 개체에 무해하며 팔미토일화와 관련된 질환에 대한 우수한 진단, 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 GFP-ABHD17A의 클로닝 과정을 나타낸 도이다. FKBP 유전자와 ABHD17A 유전자를 각각에 맞는 primer를 이용하여 PCR로 증폭한 후 pEGFP-C1 vector의 다중 클로닝 부위 프레임에 맞도록 삽입하여 GFP-FKBP -ABHD17A 컨스트럭트를 제작함을 나타낸 도이다.
도 2은 화학유전학 응용 팔미토일화 조절 융합 단백질을 나타낸 도이다. 도 2(A)는 GFP-FKBP-ABHD17A + LDR의 작용기작을 나타낸 도이다. 도 2(B)는 GFP-FKBP-ABHD17A와 LDR 및 형광단백질이 표지된 N-Ras 단백질이 발현된 HEK293T 세포에서 라파마이신 처리 전(Control)과 후의 변화를 공초점 현미경으로 촬영한 도이다.
도 3은 화학유전학 응용 팔미토일화 조절 융합 단백질의 필수 사항을 나타낸 도이다. 도 3(A) 및 3(D)는 GFP-FKBP-ABHD17A와 LDR 및 형광단백질이 표지된 N-Ras 단백질이 발현된 HEK293T 세포에서 DMSO가 처리 전(Control)과 후의 변화를 공초점 현미경으로 촬영한 도이다. 도 3(B) 및 3(E)는 LDR없이 GFP-FKBP-ABHD17A와 형광단백질이 표지된 N-Ras 단백질이 발현된 HEK293T 세포에서 라파마이신 처리 전(Control)과 후의 변화를 공초점 현미경으로 촬영한 도이다. 도 3(C) 및 3(F)는 촉매도메인이 돌연변이 된 GFP-FKBP-ABHD17A(S190A)와 LDR 및 형광단백질이 표지된 N-Ras 단백질이 발현된 HEK293T 세포에서 라파마이신 처리 전(Control)과 후의 변화를 공초점 현미경으로 촬영한 도이다.
도 4는 화학유전학 응용 팔미토일화 조절융합 단백질의 동역학을 나타낸 도이다. 도 4(A)는 GFP-FKBP-ABHD17A와 LDR 및 형광단백질이 표지된 N-Ras 단백질이 발현된 HEK293T 세포에서 라마파미이신 처리 전(Control)과 후의 변화를 10분 단위로 공초점 현미경으로 촬영한 도이다. 도 4(B)는 도 4(A)에 나타난 이미지를 분석한 그래프로, 시간에 따른 mCherry와 GFP 형광 intensity의 변화를 세포질/세포막 비율로 분석하여 나타낸 도이다.
도 5는 화학유전학 응용 팔미토일화 조절융합 단백질이 N-Ras(Q61K) 돌연변이가 존재하는 피부암 섬유육종 HT1080 세포주의 성장과 증식을 억제함을 나타낸 도이다. 도 5(A)는 아무것도 형질주입하지 않은 순수한 HT1080 세포에 DMSO, 2-BP, 라파마이신을 각각 처리했을 때, 1일차와 7일 차의 세포광학 현미경으로 촬영한 도이다. 도 5(B)는 LDR과 GFP-FKBP-ABHD17A를 발현시킨 HT1080세포에 DMSO, 2-BP, 라파마이신을 각각 처리했을 때, 1일차와 7일차의 세포 광학현미경으로 촬영한 도이다. 도 5(C)는 도 5(A)의 7일동안 매일 동시간에 세포수를 집계하여 나타낸 세포 성장곡선을 나타낸 도이며, 도 5(D)는 도 5(B)의 7일동안 매일 동시간에 세포수를 집계하여 나타낸 세포 성장곡선을 나타낸 도이다.
본 발명자들은 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절 융합 단백질을 개발하고, 화합물 처리를 통해 상기 융합 단백질을 화학유전학적으로 활성화시키는 경우 세포막에 존재하는 목표 단백질의 팔미토일화를 비가역적으로 조절할 수 있어, 팔미토일화와 관련된 질환에 대한 우수한 진단, 예방 및 치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질을 제공한다.
본 명세서에서 화학유전학 (Chemogenetics)은 다양한 생물학분야의 연구에서 사용되는 기법으로, 특정 단백질(Protein)을 유전학적 방법으로 변형하여 원래는 반응하지 않는 저분자 화학물질(Small molecule chemical)에 대해 반응하여 기능이 조절될 수 있도록 만든 것을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서, 세포에 저분자 화학물질을 처리함으로서 화학유전학 단백질 간의 결합을 형성하게 하여, 융합 단백질을 작용을 활성화할 수 있다.
본 명세서에서 용어 '팔미토일화 (palmitoylation)'는 단백질 번역 후 변형(post-translational modification) 중 지질화(lipidation)에 속하며 탄소 16개로 이루어진 지질인 팔미테이트(palmitate)가 단백질의 특정 시스테인(cysteine) 아미노산에 붙는 현상을 의미한다. 수많은 lipidation 중 팔미토일화만 유일하게 가역성이 있으며 이를 통해 단백질은 원형질막(plasma membrane)과 세포내막(endomembrane) 사이를 왕복하게 된다. 팔미토일화된 단백질은 세포막으로 수송되며 그곳에서 특정한 기능을 수행할 수 있다.
본 명세서에서 용어 '탈팔미토일화 (Depalmitoylation)'는 팔미토일화된 단백질에서 팔미테이트(palmitate)가 떨어지는 현상을 의미한다. 단백질이 탈팔미토일화 되면 세포막으로부터 떨어져 나와 세포내막으로 이동하고 세포막에서 수행하던 기능 또한 상실할 수 있다.
본원 발명의 융합 단백질을 이용하는 경우, 저분자 화학물질로서 화학유전학 화합물을 처리함으로서 세포막에 존재하는 목표 단백질의 팔미토일화를 조절할 수 있어, 세포 및 개체에 무해하며 팔미토일화와 관련된 질환에 대한 우수한 진단, 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 팔미토일화 관련 질환은 고체암, 알츠하이머, 폐혈증, 당뇨병, Covid-19, 및 Ras질환(Rasopathy)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 팔미토일화 관련 질환은 발암유전자(예, Ras 단백질과 EGFR 단백질), 암 억제유전자(예, SCRIB, melanocortin 1 receptor) 및 면역관문억제 유전자(예, PD-L1, CTLA4 receptor, STING) 등의 팔미토일화 여부에 따라서 세포내 위치가 달라지면서 발생할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 고체암은 목표 단백질인 Ras의 돌연변이 또는 팔미토일화에 의해 발생할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 팔미토일화 관련 질환은 알츠하이머일 수 있으며, 상기 알츠하이머는 APP (Amyloid precursor protein) 단백질이 탈팔미토일화가 비정상적으로 일어남으로 인해 발생하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 팔미토일화 관련 질환은 폐혈증일 수 있으며, 백혈구 내의 염증매개 단백질 또는 MYD88의 팔미토일화가 비정상적으로 일어남으로 인해 발생하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 융합 단백질은 제 1 화학유전학 단백질; 및 탈팔미토일화 단백질;을 포함하는, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질일 수 있다.
본 발명에서 상기 화학유전학 단백질은 저분자 화학물질을 처리하는 경우 복합체 (Complex)를 형성하는 단백질을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 제 1 화학유전학 단백질은 FKBP (FK506 binding protein), FRB(FKBP·Rapamycin binding domain), CNA(Calcineurin A), CyP-Fas, GyrB(gyrase type II), GAI(gibberellin), GID(gibberellin insensitive dwarf 1), ABI(abscisic acid insensitive 1), PYR(pyrabactin resistance), PYL(PYR1-like), SNAP-tag(synaptosomal-associated protein-tag), Halo-tag, eDHFR(Dihydrofolate reductase), Bcl-xL(B-cell lymphoma-extra large) 및 Fab(AZ1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제 1 화학유전학 단백질은 FKBP (FK506 binding protein) 및 FRB(FKBP·Rapamycin binding domain)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 탈팔미토일화 단백질은 APT1 (Acyl protein thioesterase 1), APT2 (Acyl protein thioesterase 2), PPT1 (palmitoyl-protein thioesterase 1), PPT2 (palmitoyl-protein thioesterase 2), ABHD10(α/β hydrolase domain-containing protein 10), ABHD17A (α/β hydrolase domain-containing protein 17A), ABHD17B (α/β hydrolase domain-containing protein 17B) 및 ABHD17C (α/β hydrolase domain-containing protein 17C)으로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 탈팔미토일화 단백질은 ABHD17A (α/β hydrolase domain-containing protein 17A), ABHD17B (α/β hydrolase domain-containing protein 17B) 및 ABHD17C (α/β hydrolase domain-containing protein 17C)으로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 융합 단백질은 세포 내 형질 주입시 세포질에 위치할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 융합 단백질은 세포 내 형질 주입시 세포막에 결합하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 융합 단백질 구성 중 제 1 화학유전학 단백질;은 세포막에 존재하는 제 2 화학유전학 단백질;과 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 제 1 화학유전학 단백질; 및 제 2 화학유전학 단백질;의 결합은 화학유전학 화합물에 의해 유도되는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 제 1 화학유전학 단백질; 및 제 2 화학유전학 단백질;의 결합은 화학유전학 화합물의 처리에 따라 비가역적으로 일어날 수 있다.
본 명세서에서 "화학유전학 화합물"이란 원래는 반응하지 않는 제 1 화학유전학 단백질; 및 제 2 화학유전학 단백질;에 작용하여, 상기 두 화학유전학 단백질이 결합될 수 있도록 하는 화합물을 의미한다. 화학유전학 화합물에 의해 상기 화학유전학 단백질들이 결합함으로서 기능이 조절될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학유전학 화합물은 제 1 화학유전학 단백질; 및 제 2 화학유전학 단백질;과 결합하여 복합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학유전학 화합물은 Rapamycin, FK506, FKCsA, FK1012, Coumermycin, Gibberellin, Abscisic acid, Mandipropamid, HaXS, TMP-Htaq 및 ABT-737로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 융합단백질은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 명세서에서, 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"와 상호교환적으로 사용된다. 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지된 또는 비공지된 임의의 기능을 수행할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 팔미토일화 조절용 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터 성분에는 일반적으로, 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 상기 벡터에서 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
본 명세서에서 용어 "작동적으로 연결"은 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 폴리뉴클레오티드 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 플라스미드 (Lentivirus plasmid), 아데노-연관 바이러스 플라스미드 (Adeno-associated virus plasmid), 아데노 바이러스 플라스미드 (Adenovirus plasmid), γ -레트로 바이러스 플라스미드 (γ-Retrovirus plasmid), 형광단백질벡터인 녹색형광단백질벡터(green fluorescent protein, GFP vector), 황색형광단백질벡터(yellow fluorescent protein, YFP vector), 적색형광단백질벡터(red fluorescent protein, RFP vector), 주황형광단백질벡터(orange fluorescent protein, OFP vector), 청록색형광단백질벡터(cyan fluorescent protein, CFP vector), 청색형광단백질벡터(Blue fluorescent protein, BFP vector) 및 원적색형광단백질벡터(far-red fluorescent protein, fRFP vector)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 벡터는 각각 전기천공법 (electroporation), 리포펙션, 바이러스 벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라, PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등을 통해 생체 내 또는 세포 내로 전달될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 상기 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 구체적으로 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포일 수 있다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
또한, 본 발명은 상기 팔미토일화 조절용 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 개체에 주입하고 상기 벡터를 발현시키는 단계; 및
상기 벡터가 발현된 세포에 화학유전학 화합물을 처리하는 단계;를 포함하는, 화학유전학적으로 활성화 가능한 융합 단백질에 의한 팔미토일화를 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질을 포함하는, 팔미토일화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물에 의해 팔미토일화 관련 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물에 의해 팔미토일화 관련 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내, 비강 내, 흡입 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다. 또한, 그 주기에 있어서 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 광유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질은 상기 약학적 조성물에 0.1 ㎍ 내지 3.0 ㎍, 0.1 ㎍ 내지 2.5㎍, 0.1 ㎍ 내지 2.0㎍, 0.15 ㎍ 내지 2.0㎍, 0.2 ㎍ 내지 2.0㎍, 0.25 ㎍ 내지 2.0㎍, 0.25 ㎍ 내지 1.5㎍ 또는 0.25 ㎍ 내지 1.0㎍으로 포함될 수 있다.
상기 화합물이 조성물로서 투여되는 경우, 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다.
한편, 상기 조성물은 약학적 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 담체는 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다.
또한 부형제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제형, 주입제형, 분무제형, 흡입제형 또는 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 사용될 수 있고, 상기 고형제제는 상기 텍토리게닌과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 또한, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있고, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 팔미토일화 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
이때, 상기 건강기능식품 조성물은 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에서, 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적 (예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들면, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 포함하는, 팔미토일화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질을 포함하는, 팔미토일화 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질을 포함하는 팔미토일화 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 또한, 본 발명은 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질의 팔미토일화 관련 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 팔미토일화 관련 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 팔미토일화 관련 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 화학유전학 융합 단백질을 코딩하는 유전자 제작
화학유전학 단백질 FKBP와 FRB는 라파마이신에 의해 삼중복합체가 되는 특성이 있다. 이를 응용하여 유전학기법으로 세포 내에서 세포막에 위치하는 화학유전학 단백질인 FRB과 결합하는 융합 단백질을 발현시키기 위해, 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제작하였다.
녹색 형광단백질인 GFP, 화학유전학 단백질인 FKBP 및 탈팔미토일화 효소인 ABHD17A를 코딩하는, GFP-FKBP-ABHD17A라는 유전자를 제작하였다.
실시예 2. 화학유전학 융합 단백질의 유전자 형질 도입을 위한 벡터 제작
상기 제작된 유전자를 벡터에 융합해 최종적으로 GFP-FKBP-ABHD17A의 유전자를 포함하는 벡터를 제작하였다.
구체적으로, FKBP 유전자(GeneBank 등록번호: NM_054014.4, FKBP prolyl isomerase 1A(FKBP1A)의 1-108 아미노산 잔기)를 primer를 이용해 PCR로 증폭시켜 pEGFP-C1 벡터의 다중 클로닝 부위 HindIII와 EcoRI에 프레임에 맞도록 삽입하여 GFP-FKBP를 제적한 후 ABHD17A(NM_001006983.1, α/β hydrolase domain-containing protein 17A)를 primer를 이용해 PCR로 증폭시켜 GFP-FKBP 벡터의 다중 클로닝 부위 EcoRI과 BamHI에 프레임에 맞도록 삽입하여 최종 GFP-FKBP-ABHD17A 컨스트럭트를 제작하였다 (도 1 참조).
실험예 1. 세포막에 위치하는 목표 단백질의 팔미토일화를 조절 확인
상기 실시예 2의 벡터를 통해 세포에 GFP-FKBP-ABHD17A 유전자를 형질 주입하면, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절 융합 단백질이 발현된다.
화학유전학 화합물인 라파마이신을 상기 융합 단백질이 발현된 세포에 처리하면, 라파마이신이 세포막을 통과하여 상기 융합 단백질 중 제 1 화학유전학 단백질인 FKBP 단백질; 및 세포막에 위치하는 제 2 화학유전학 단백질인 FRB 단백질;과 삼중복합체(ternary complexes)를 형성하게 된다.
그 결과, 상기 라파마이신에 의해 융합 단백질 전체가 FRB 단백질이 존재하는 세포막으로 이동하게 되고, 융합 단백질 중 팔미토일화 단백질인 ABHD17A 단백질이 세포막에 존재하는 목표 단백질인 N-Ras의 탈팔미토일화를 유도하여 세포질로 이동시킴을 확인하였다 (도 2(A) 참조).
실험예 2. 라파마이신 처리에 따른 단백질의 분포 변화 확인
상기 작용을 확인하기 위해, 상기 융합 단백질, LDR 및 형광단백질이 표지된 N-Ras 단백질이 발현된 HEK293T 세포에서 라파마이신 처리 전(Control)과 후를 공초점 현미경으로 촬영하였다.
그 결과, 라파마이신 처리 전에는 ABHD17A가 세포질 전체에 분포하며 N-Ras는 세포막에 주로 위치하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 라파마이신 처리 후 60분이 지난 시점에는 ABHD17A가 세포막에 주로 분포하며 N-Ras는 세포막 주변의 세포질로 분산된 것을 확인할 수 있었다 (도 2(B) 참조).
이는 화학유전학적 처리에 의해 상기 융합 단백질의 위치 및 활성을 조절하여, 목표 단백질의 팔미토일화를 비가역적으로 조절할 수 있음을 의미한다.
실험예 3. 화학유전학적 팔미토일화 조절 융합 단백질의 동역학
상기 동역학을 확인하기 위해, 상기 융합 단백질, LDR 및 형광단백질이 표지된 N-Ras 단백질이 발현된 HEK293T 세포에서 라파마이신 처리 전(Control)과 후를 10분 단위로 공초점 현미경으로 촬영하였다. 그 결과, 라파마이신 처리 후 약 30분 내에 N-Ras의 탈팔미토일화가 일어나 세포막으로부터 떨어져 나와 세포질로 이동한 것을 확인할 수 있었다 (도 4(B) 참조). 이는 화학 유전학적 처리에 의해 상기 융합 단백질의 위치 및 활성을 조절하여, 목표 단백질의 팔미토일화를 30분내로 완전히 조절할 수 있음을 의미한다.
실험예 4. 팔미토일화 조절 융합 단백질의 N-Ras(Q61K) 돌연변이가 존재하는 피부암 섬유육종 HT1080 세포주의 세포 성장과 증식의 억제 확인
상기 작용을 확인하기 위해, N-Ras(Q61K) 돌연변이가 존재하는 피부암 섬유육종 HT1080 세포주에 아무것도 발현시키지 않은 세포와 상기 융합단백질 및 LDR을 발현시킨 세포에 DMSO, 2-BP, 라파마이신을 각각 처리하여 세포의 성장과 증식정도를 7일간 매일 동시간에 세포수를 집계하고 세포 광학현미경 사진을 촬영하였다. 그 결과, DMSO는 세포에 아무런 영향을 주지 않으나, 팔미토일화 억제제인 2-BP를 처리했을 때는 세포의 성장과 증식이 억제되는 모습을 관찰하였다 (도 5 참조). 흥미롭게도, 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 상기 융합단백질과 LDR이 발현된 세포에 라파마이신을 처리하면 2-BP를 처리했을 때 정도로 세포의 성장과 증식이 크게 감소한 것을 확인하였다 (도 5(B) 및 도 5(D) 참조). 이는 상기 융합단백질에 의해 돌연변이 N-Ras(Q61K)가 세포막으로부터 해리되어 하부신호전달경로가 차단되고 암세포의 성장과 증식이 억제되었다고 판단할 수 있다.

Claims (12)

  1. 제 1 화학유전학 단백질; 및 탈팔미토일화 단백질;을 포함하는, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제 1 화학유전학 단백질은 FKBP (FK506 binding protein), FRB(FKBP·Rapamycin binding domain), CNA(Calcineurin A), CyP-Fas, GyrB(gyrase type II), GAI(gibberellin), GID(gibberellin insensitive dwarf 1), ABI(abscisic acid insensitive 1), PYR(pyrabactin resistance), PYL(PYR1-like), SNAP-tag(synaptosomal-associated protein-tag), Halo-tag, eDHFR(Dihydrofolate reductase), Bcl-xL(B-cell lymphoma-extra large) 및 Fab(AZ1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 탈팔미토일화 단백질은 APT1 (Acyl protein thioesterase 1), APT2 (Acyl protein thioesterase 2), PPT1 (palmitoyl-protein thioesterase 1), PPT2 (palmitoyl-protein thioesterase 2), ABHD10(α/β hydrolase domain-containing protein 10), ABHD17A (α/β hydrolase domain-containing protein 17A), ABHD17B (α/β hydrolase domain-containing protein 17B) 및 ABHD17C (α/β hydrolase domain-containing protein 17C)으로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 융합 단백질은 세포 내 형질 주입시 세포질에 위치하는 것인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 제 1 화학유전학 단백질;은 세포막에 존재하는 제 2 화학유전학 단백질;과 결합하는 것인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 제 1 화학유전학 단백질; 및 제 2 화학유전학 단백질;의 결합은 화학유전학 화합물에 의해 유도되는 것인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 화학유전학 화합물은 제 1 화학유전학 단백질; 및 제 2 화학유전학 단백질;과 결합하여 복합체를 형성하는 것인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 화학유전학 화합물은 Rapamycin, FK506, FKCsA, FK1012, Coumermycin, Gibberllin, Abscisic acid, Mandipropamid, HaXS, TMP-Htaq 및 ABT-737로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 화학유전학적으로 활성화 가능한 팔미토일화 조절용 융합 단백질.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스 플라스미드 (Lentivirus plasmid), 아데노-연관 바이러스 플라스미드 (Adeno-associated virus plasmid), 아데노 바이러스 플라스미드 (Adenovirus plasmid), γ -레트로 바이러스 플라스미드 (γ-Retrovirus plasmid), 형광단백질벡터인 녹색형광단백질벡터(green fluorescent protein, GFP vector), 황색형광단백질벡터(yellow fluorescent protein, YFP vector), 적색형광단백질벡터(red fluorescent protein, RFP vector), 주황형광단백질벡터(orange fluorescent protein, OFP vector), 청록색형광단백질벡터(cyan fluorescent protein, CFP vector), 청색형광단백질벡터(Blue fluorescent protein, BFP vector) 및 원적색형광단백질벡터(far-red fluorescent protein, fRFP vector)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 벡터.
  12. 청구항 10의 벡터를 세포에 주입하고 상기 벡터를 발현시키는 단계; 및
    상기 벡터가 발현된 세포에 화학유전학 화합물을 처리하는 단계;를 포함하는, 화학유전학적으로 활성화 가능한 융합 단백질에 의한 팔미토일화를 조절하는 방법.
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