WO2023096313A1 - 플라보논 유도체 화합물 및 이의 섬유증을 치료 또는 완화하기 위한 의약 용도 - Google Patents

플라보논 유도체 화합물 및 이의 섬유증을 치료 또는 완화하기 위한 의약 용도 Download PDF

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WO2023096313A1
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서행란
이수연
송연화
최인희
이도헌
김광민
왕승현
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    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/22—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4
    • C07D311/26—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3
    • C07D311/28—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3 with aromatic rings attached in position 2 only
    • C07D311/32—2,3-Dihydro derivatives, e.g. flavanones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
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    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present disclosure relates to compounds for the treatment or alleviation of fibrosis.
  • the present disclosure also relates to the pharmaceutical use of the flavonone derivative compound according to the present disclosure for the treatment or alleviation of fibrosis. That is, the present disclosure relates to methods for the treatment of fibrosis or relief of symptoms of fibrosis.
  • Fibrosis can affect various organs such as the heart, liver, lungs, skeletal muscle, kidneys, blood vessels, and more.
  • fibrosis can be classified into skeletal muscle tissue (dystrophic muscle disease), heart and vascular tissue (myocardial infarction), liver tissue (non-alcoholic fatty liver disease/cirrhosis), lung tissue (idiopathic pulmonary fibrosis), and kidney tissue (chronic kidney disease). /renal fibrosis).
  • renal fibrosis can occur due to various mechanisms including excess matrix synthesis, contraction, and the like.
  • Soma Meran et al. describe the mechanisms associated with fibroblasts and myofibroblasts in renal fibrosis, and the presence of myofibroblasts is recognized as a predictor of fibrotic progression in both experimental models and human renal disease ("Fibroblasts and myofibroblasts in renal disease). fibrosis" Int J Exp Pathol. 2011 Jun; 92(3): 158-167.).
  • Myofibroblasts are characterized by the expression of ⁇ -SMA (Smooth muscle actin), and fibronectin is also characterized by an increase. It is known that ED-A fibronectin, TGF- ⁇ 1, and mechanical tension are involved in the formation of these myofibroblasts, but a clear mechanism has not yet been identified.
  • Liver fibrosis refers to the excessive accumulation of extracellular matrix proteins, including collagen, that occurs in most chronic liver diseases (eg chronic viral hepatitis, alcoholic liver disease, primary biliary sclerosis).
  • Representative cells involved in liver fibrosis include hepatic stellate cells (HSC), Kupffer cells, and endothelial cells.
  • Hepatic stellate cells are the main producer of extracellular matrix, and when activated, they change to a myofibroblast-like phenotype, increase cell proliferation, and increase the production of various extracellular matrix including collagen type I and III. , increased expression of ⁇ -SMA (Smooth muscle actin), and increased cell contractility.
  • fibrotic cytokines such as TGF- ⁇ 1, angiotensin II, and leptin are activated, but a clear treatment mechanism has not yet been identified.
  • Tissue fibrosis defined as excessive accumulation of extracellular matrix (ECM)
  • ECM extracellular matrix
  • the problem to be solved by the present disclosure is to provide a compound effective for the treatment or alleviation of fibrosis or a pharmaceutical composition containing such a compound as an active ingredient. That is, the problem to be solved by the present disclosure is to find a component effective for the treatment or alleviation of fibrosis and to provide a medicinal use thereof.
  • one aspect of the present invention provides a compound of Formula 1 below, or a pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof.
  • X is NO 2 , OR 1 , NR 1 R 2 , or SR 1 , and R 1 and R 2 are each independently hydrogen, alkyl or aryl having 1 to 6 carbon atoms.
  • X is OH
  • the bonding mode of the phenyl group to which X is linked in Formula 1 of the present invention may be Z-form, E-form, or a mixture thereof, preferably Z-form.
  • a biological measurement method capable of recognizing phenotypes such as size and density of liver fibrotic spheroids was developed and applied to an anti-fibrotic drug development platform. That is, by measuring changes in the size and density of liver tissue spheroids, candidate compounds showing an anti-fibrotic improvement effect higher than that of obeticholic acid, a positive control, among 300 kinds of natural derivatives were found.
  • the effects of the candidate compounds were evaluated in various ways to finally find the compounds of the present invention, and the effects were confirmed in various ways to complete the present invention.
  • the compounds according to the present invention may be used as pharmaceutically acceptable salts.
  • salts of compounds according to Formula 1 may be preferred over the respective free bases or free acids, since, for example, such salts impart greater stability or solubility to the molecule and thereby This is because it thus facilitates formulation into dosage forms.
  • the compound according to Formula 1 may act as a compound having an acidic functional group.
  • the pharmaceutically acceptable salt of Formula 1 is a basic salt.
  • Pharmaceutically acceptable basic salts include ammonium salts; alkali metal salts such as, for example, sodium and potassium salts; alkaline earth metal salts such as, for example, calcium and magnesium salts; and for example isopropylamine, diethylamine, ethanolamine, trimethylamine, dicyclohexyl amine and N-methyl-D-glucamine (N- methyl-D-glucamine), including salts with organic basic bases, including salts of primary, secondary and tertiary amines.
  • compounds according to Formula 1 may function as compounds with basic functional groups.
  • the pharmaceutically acceptable salt of Formula 1 is an acid addition salt.
  • Pharmaceutically acceptable acid addition salts are formed from acids which form non-toxic salts. For example, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, bisulphate, nitrate, phosphate, hydrogen phosphate ( hydrogen phosphate, acetate, maleate, malate, fumarate, malonate, lactate, tartrate, citrate , formate, gluconate, succinate, pyruvate, oxalate, oxaloacetate, trifluoroacetate, saccharate ), benzoate, methanesulphonate, ethanesulphonate, benzenesulphonate, p-toluenesulphonate, methanesulphonic, ethanesulphonic ), p-toluenesulphonic, and isethionat
  • pharmaceutically acceptable salt refers to a salt that retains the desired biological activity of a subject compound and exhibits minimal undesirable toxic effects.
  • pharmaceutically acceptable salts can be prepared in situ during the final isolation and purification of the compound, or separately by reacting the purified compound in its free acid or free base form with a suitable base or acid separately.
  • the term “pharmaceutically acceptable” means generally considered safe for such use, officially approved for such use by a national or state regulatory agency, or approved by the U.S. Pharmacopoeia or veterinary , more particularly suitable for use in pharmaceutical preparations listed in other pharmacopeias generally recognized for use in humans.
  • prodrugs of compounds of Formula 1 that is, if a compound (prodrug) is separated from the body to produce the compound of the present invention or its salt, such compound is also included in the scope of the present invention.
  • prodrug refers to a substance that is hydrolyzed, oxidized, and other substances under biological conditions (ex vivo or in vivo) to provide an active compound, particularly a compound of Formula 1 of the present invention. means a compound of the present invention capable of reacting.
  • prodrugs are biohydrolyzable amides, biohydrolyzable esters, biohydrolyzable carbamates, biohydrolyzable carbonates, biohydrolyzable ureides ( ureide), and compounds that are biohydrolyzed to yield compounds of the present invention, including biohydrolyzable moieties such as biohydrolyzable phosphate analogues, but are not limited to these specific embodiments.
  • the prodrug is a compound represented by Formula 2 or 3 below.
  • R is an alkyl or aryl having 1 to 6 carbon atoms.
  • R is methyl, ethyl, or phenyl.
  • R 1 and R 2 are each independently an alkyl having 1 to 6 carbon atoms or an alkoxy having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 1 and R 2 are methyl/methyl; methyl/ethyl; or methyl/methoxy.
  • alkyl refers to a saturated straight-chain or branched non-cyclic hydrocarbon having 1 to 10 carbon atoms (unless the number of carbon atoms is specifically limited). "Lower alkyl” means a straight chain or branched alkyl having 1 to 4 carbon atoms.
  • saturated straight-chain alkyls are -methyl, -ethyl, -n-propyl, -n-butyl, -n-pentyl, -n-hexyl, -n-heptyl, -n-octyl, -n-nonyl and -n- decyl, while saturated branched alkyl is -isopropyl, -sec-butyl, -isobutyl, -tert-butyl, isopentyl, 2-methylhexyl, 3-methylbutyl, 2-methylpentyl, 3- Methylpentyl, 4-methylpentyl, 2-methylhexyl, 3-methylhexyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 4-methylpentyl, 2-methylhexyl, 3-methylhexyl, 4-methylpentyl, 2-methylhexyl, 3-methylhexyl, 4-methylhexyl, 5-
  • C 1-6 when described as “C 1-6 ”, “C1-6”, or “C1-C6”, it means that the number of carbon atoms is 1 to 6.
  • C1-C6 alkyl means an alkyl having 1 to 6 carbon atoms.
  • alkoxy means -OCH 3 , -OCH 2 CH 3 , -O(CH 2 ) 2 CH 3 , -O(CH 2 ) 3 CH 3 , -O(CH 2 ) 4 CH 3 , -O-(alkyl), including -O(CH 2 ) 5 CH 3 , and the like, wherein alkyl is as defined above.
  • lower alkoxy means -O-(lower alkyl), wherein lower alkyl is as defined above.
  • aryl refers to a carbocyclic aromatic group containing from 3 to 10 ring atoms. Representative examples include phenyl, tolyl, xylyl, naphthyl, tetrahydronaphthyl, anthracenyl, fluorenyl, indenyl, azulenyl, and the like. Including, but not limited to. Carbocyclic aromatic groups may be optionally substituted.
  • halogen refers to fluorine (F), chlorine (Cl), bromine (Br), or iodine (I).
  • the term "compound of the present disclosure” or “compound according to an aspect of the present invention” refers to a compound according to Formula 1 and pharmaceutically acceptable salts thereof, and prodrugs thereof, unless otherwise specified. It means inclusive.
  • compound of Formula 1(s) is also meant to include compounds of Formula 1 as well as clathrates, hydrates, solvates, or polymorphs (polymorphs) thereof.
  • polymorph refers to a solid crystal form of a compound of the present invention or a complex thereof. Different polymorphs of the same compound exhibit different physical, chemical and/or spectral properties. Differences in terms of physical properties include, but are not limited to, stability (e.g. heat or light stability), compressibility and density (important for formulation and product manufacturing), and dissolution rate (which may affect bioavailability). It doesn't. Differences in stability may be due to chemical reactivity changes (e.g. differential oxidation such as faster discoloration when composed of one polymorph than when composed of another polymorph) or mechanical properties (e.g.
  • kinetically Tablet fragments stored as the preferred polymorph may be thermodynamically converted to a more stable polymorph) or both (tablets of one polymorph are more susceptible to degradation at high humidity).
  • Other physical properties of polymorphs can affect their processing. For example, one polymorph may be more likely to form solvates, or may be more difficult to filter or wash, than another polymorph, eg, due to its shape or particle size distribution.
  • solvent compound refers to a compound of the present invention comprising a stoichiometric or non-stoichiometric amount of a solvent bound by non-covalent intermolecular forces.
  • Preferred solvents are volatile, non-toxic, and can be administered in very small amounts to humans.
  • hydrate refers to a compound of the present invention that contains a stoichiometric or non-stoichiometric amount of water bound by non-covalent intermolecular forces.
  • clathrate refers to a compound of the present invention in the form of a crystal lattice containing spaces (eg, channels) in which guest molecules (eg, solvent or water) are confined.
  • n is 1. More preferably, the compound represented by Formula 1 of the present disclosure is 3-(3-hydroxybenzylidene)-2-phenylchroman-4-one or 3-(3-nitrobenzylidene)-2-phenylchroman-4-one, or a pharmaceutical thereof thereof. It is an acceptable salt or prodrug. Even more preferably, the compound represented by Formula 1 of the present disclosure is 3-(3-hydroxybenzylidene)-2-phenylchroman-4-one.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating, improving or preventing fibrosis, comprising the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention is also a therapeutically or prophylactically effective amount of the compound of Formula 1, or a pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof, administered to a subject in need of treatment, improvement or prevention of fibrosis. It provides a method for treating, improving or preventing fibrosis, including doing. That is, the present disclosure provides a pharmaceutical use of the compound of Formula 1, or a pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof, for the treatment, improvement, or prevention of fibrosis.
  • prevention includes prevention of recurrence, expansion or development of fibrosis in a patient (subject).
  • treatment includes eradication, elimination, or control of fibrosis, and minimizing or delaying the spread of fibrosis.
  • fibrosis is cardiac, liver, lung, skeletal muscle, kidney, or vascular fibrosis.
  • the fibrosis is liver or pulmonary fibrosis.
  • the fibrosis is pulmonary fibrosis.
  • the fibrosis is pulmonary fibrosis induced by radiation exposure.
  • the pulmonary fibrosis is idiopathic pulmonary fibrosis.
  • the compound of Formula 1, or a pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof according to the present disclosure is generally administered in a therapeutically or prophylactically effective amount.
  • the compound(s) of the present invention can be administered by any suitable route, in the form of a pharmaceutical composition suitable for such route, and in a dosage effective for the intended treatment.
  • An effective dosage is generally from about 0.01 to about 50 mg/kg of body weight/day, preferably from about 0.05 to about 20 mg/kg/day, in single or divided administration. Dosage levels below the lower end of this range may be suitable depending on the age, species, and disease or condition being treated. In other cases, still larger doses can be used without detrimental side effects. Larger doses may be divided into several smaller doses for administration throughout the day. Methods for determining the appropriate dosage are well known in the art.
  • the present disclosure also provides a composition, preferably a pharmaceutical composition, comprising a compound of the present disclosure (a compound of Formula 1 above, or a pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof) and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the active ingredient described herein can be administered as follows.
  • the active ingredient according to the present invention may be administered intranasally, and nasal administration may be particularly preferable for the pharmaceutical use of the present disclosure.
  • nasal administration is a concept including conventional inhalant administration.
  • intranasal administration is meant delivery of a composition into the nose and nasal cavities through one or both of the nose or nasal passages, and includes delivery by a spray mechanism or droplet mechanism or delivery by aerosolization of an active ingredient.
  • Administration of the composition by inhalation may be through the nose or mouth via delivery by a nebulizer or droplet mechanism.
  • compositions of the present invention may be formulated by methods well known to those skilled in the art, for example, with representative solubilizing, diluting, or dispersing substances such as saline, preservatives such as benzyl alcohol. , absorption enhancers and the like, but is not limited thereto.
  • a liquid pharmaceutical composition may be prepared by the same method as an oral administration composition described later.
  • Such nasal administration may be performed using an intranasal delivery device well known in the art to which the present invention pertains, and propellants such as fluorocarbon and hydrofluoroalkane may be used in such a device.
  • propellants such as fluorocarbon and hydrofluoroalkane may be used in such a device.
  • the compound of the present invention can be administered orally, and oral is a concept including swallowing.
  • Oral administration allows the compounds of the present invention to enter the gastrointestinal tract or be directly absorbed from the mouth into the bloodstream, eg, by buccal or sublingual administration.
  • compositions suitable for oral administration may be in solid, liquid, gel, or powder form, and may have formulations such as tablets, lozenges, capsules, granules, powders, and the like. .
  • compositions for oral administration may optionally be enteric coated and exhibit delayed or sustained release through the enteric coating. That is, the composition for oral administration according to the present invention may be a formulation having an immediate or modified release pattern.
  • Liquid formulations may include solutions, syrups and suspensions, and such liquid compositions may be contained in soft or hard capsules.
  • Such formulations may include a pharmaceutically acceptable carrier such as water, ethanol, polyethylene glycol, cellulose, or oil.
  • the formulation may also contain one or more emulsifying and/or suspending agents.
  • the amount of active ingredient drug may be present from about 0.05% to about 95% by weight, more typically from about 2% to about 50% by weight of the total weight of the tablet.
  • Tablets may also contain a disintegrant comprising from about 0.5% to about 35% by weight, more usually from about 2% to about 25% by weight of the dosage form.
  • disintegrants include, but are not limited to, lactose, starch, sodium starch glycolate, crospovidone, croscarmellose sodium, maltodextrin, or mixtures thereof.
  • Suitable glidants included for making into tablets may be present in amounts from about 0.1% to about 5% by weight, and include talc, silicon dioxide, stearic acid, calcium, zinc or magnesium stearate, sodium stearyl fumarate, and the like. It can be used as a lubricant, but the present invention is not limited to these types of additives.
  • Gelatin polyethylene glycol, sugar, gum, starch, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, etc. may be used as a binder for preparing tablets.
  • Mannitol, xylitol, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, starch, microcrystalline cellulose, etc. may be used as suitable diluents for preparing tablets, but the present invention is not limited to these types of additives. .
  • the solubilizing agent that may be included in the tablet may be used in an amount of about 0.1% to about 3% by weight based on the total weight of the tablet, for example, polysorbate, sodium lauryl sulfate, sodium dodecyl sulfate, propylene carbonate, Diethylene glycol monoethyl ether, dimethylisosorbide, polyoxyethylene glycolated natural or hydrogenated castor oil, HCOR TM (Nikkol), oleyl ester, Gelucire TM , caprylic/caprylic mono/ Diglyceride, sorbitan fatty acid ester, Solutol HS TM and the like can be used in the pharmaceutical composition according to the present invention, but the present invention is not limited to the specific types of these solubilizing agents.
  • Compounds of the present invention may be administered directly into the bloodstream, muscle, or intestine.
  • Suitable methods for parenteral administration include intravenous, intramuscular, subcutaneous intraarterial, intraperitoneal, intrathecal, intracranial injection, and the like.
  • Suitable devices for parenteral administration include injectors (including needle and needleless syringes) and infusion methods.
  • compositions for parenteral administration may be formulations with an immediate or modified release pattern, and the modified release pattern may be a delayed or sustained release pattern.
  • parenteral formulations are liquid compositions, and these liquid compositions are aqueous solutions containing the active ingredient, salt, buffer, tonicity agent and the like according to the present invention.
  • Parenteral formulations may also be prepared in dried form (eg lyophilized) or as sterile non-aqueous solutions. These formulations may be used with a suitable vehicle such as sterile water. Solubility-enhancing agents may also be used in the preparation of parenteral solutions.
  • Compounds according to the present disclosure are useful for the treatment, amelioration or prevention of fibrosis. That is, the present disclosure provides a pharmaceutical use for treating, ameliorating or preventing fibrosis of a compound according to the present disclosure. Another aspect of the present disclosure provides a method for treating or alleviating fibrosis comprising administering to a subject (preferably a human) in need thereof a therapeutically or prophylactically effective amount of a compound according to the present disclosure.
  • Figure 2 is a result of evaluating the effect on the expression of liver fibrosis-related proteins.
  • Figure 3 is the result of evaluating the antioxidant capacity.
  • Figure 6 is a result of evaluating the effect on fibrosis-related genes whose expression increased by TGF- ⁇ 1 treatment.
  • hepatocytes Huh7
  • hepatic stellate cells LX2
  • vascular endothelial cells HAVEC
  • fibroblasts WI38
  • the multicellular liver spheroid model of Experimental Example 1 was lysed and protein was quantified, followed by Western blot analysis. Protein electrophoresis was performed on 6-12% SDS-PAGE gels depending on protein size. Afterwards, the result was transferred to NC membrane, and then blocked with 5% skim milk for 1 hour.
  • Primary antibodies primary antibodies used: Collagen 1 ⁇ , phosphor-SMAD3, ⁇ -SMA, ⁇ -actin
  • Primary antibodies primary antibodies used: Collagen 1 ⁇ , phosphor-SMAD3, ⁇ -SMA, ⁇ -actin
  • the secondary antibody, Goat anti-Rabbit IgG or Goat anti-Mouse IgG was treated at room temperature for 1 hour, followed by ECL reaction. Afterwards, protein expression was comparatively analyzed with Chemiluminescence detection equipment. The results are shown in FIG. 2 .
  • compound 1 reduced the expression of the extracellular matrix-related protein collagen I and the fibrosis-related signaling proteins ⁇ -SMA and p-SMAD3 in the spheroid model.
  • compound 2 at low concentrations, the effect of inhibiting the reduction of collagen I and p-SMAD3 expression was weak. In conclusion, it was confirmed that compound 1 exhibits an improved antifibrotic effect compared to compound 2.
  • antioxidants may have the effect of inhibiting hepatic fibrosis by protecting hepatocytes from apoptosis and inhibiting the activation of hepatic stellate cells.
  • Vitamin E a well-known antioxidant, has been reported to be effective in preventing the progression to hepatic fibrosis by inhibiting the inflammatory response in the liver and the activation of hepatic stellate cells in vitro and in animal experiments. .
  • Hepatic stellate cells LX2 were treated with 200uM Hydrogen Peroxide (H 2 O 2 ) for 30 minutes and then treated with 0, 0.1, 0.5, and 1 ⁇ M of the test substance for 24 hours. Thereafter, ROS was stained, and the degree of ROS accumulation was confirmed by image analysis using Operetta CLS and Harmony Software.
  • hepatic stellate cells In 3D co-culture conditions, hepatic stellate cells have the greatest influence on the firmness of spheroids among various stromal cells present in the liver disease microenvironment. In addition, extracellular matrix-related proteins are also highly expressed according to the activity of hepatic stellate cells. Transformation of hepatic stellate cells into fibroblasts is induced by treatment with TGF- ⁇ , and fibrosis in liver tissue is induced. Therefore, the fibrosis inhibitory effect of the test substance was evaluated by inhibiting the activity of TGF- ⁇ -treated hepatic stellate cells.
  • hepatic stellate cells (3,000 cells/well) or vascular endothelial cells (2,000 cells/well) were seeded in a 384-well plate and incubated. The next day, 20 ng/ml TGF- ⁇ 1 or 20 ng/ml TGF- ⁇ 1 + 1.25 ⁇ M of the test substance was treated for 48 hours. After fixing the cells with 4% PFA, they were incubated for 16 hours with primary antibodies, ⁇ -SMA and Phalloidin (F-actin). The next day, the secondary antibody was reacted for 1 hour. After washing with PBS, Hoechst 33342 was reacted for 15 minutes to stain cell nuclei. Washed 3 times with PBS. Then, the intensities of ⁇ -SMA and F-actin were analyzed using Operetta CLS equipment and Harmony software.
  • FIG. 4 results are shown in FIG. 4 (result of inhibition of activity of hepatic stellate cells) and FIG. 5 (result of inhibition of EndMT activity of vascular endothelial cells), respectively.
  • Compound 1 of the present invention reprogrammed hepatic stellate cells in a concentration-dependent manner. Also, as shown in FIG. 5 , Compound 1 of the present invention inhibited EndMT activity of vascular endothelial cells by TGF- ⁇ treatment.
  • the mechanism showing the anti-fibrotic efficacy of the compound of the present invention was analyzed. Fibrosis was induced in LX2 and HUVEC cells constituting hepatic fibrotic spheroids with 20ng/ml TGF- ⁇ 1, and then treated with 1 ⁇ M of the drug for 48 hours to harvest the cells. After RNA was extracted, RNAseq analysis was performed. Based on this, genes commonly expressed in both cells were classified.
  • LX2 and HUVEC cells activated by TGF- ⁇ 1 treatment were treated with Compound 1 of the present invention, and RNA seq analysis was performed. The results are shown in FIG. 6 .
  • the left side is the LX2 cell test result
  • the right side is the HUVEC cell test result.
  • FIG. 7 The results of verifying the antifibrotic efficacy of Compound 1 in the MCD diet mouse NASH model are shown in FIG. 7 .
  • P*, P**, P***, and P**** showed significant differences at ⁇ 0.05, ⁇ 0.01, ⁇ 0.001, and ⁇ 0.0001 levels compared to the MCD diet group treated with physiological saline, respectively. means there is
  • compound 1 showed inhibition of hepatotoxicity and reduction of steatosis at the level of obeticholic acid treatment, which is a positive control group (ALT, AST, steatosis rate). It was confirmed that the inflammation level and the ⁇ -SMA positive area were further reduced than the positive control group.
  • bleomycin was orally administered for 2 weeks. Thereafter, 30 mg/kg Nintedanib or 30 mg/kg Compound 1 as a positive control was orally administered along with bleomycin for 2 weeks. After the experiment was completed, an autopsy was conducted to determine the degree of pulmonary fibrosis by tissue staining, Ashcroft score, and collagen deposition. The results are shown in FIG. 8 .
  • HUVEC cells were seeded in a 384-well plate at 2,000 cells/well and irradiated with 10 Gy.
  • the Pre-treat group was treated with Compound 1 1 hour before irradiation
  • the Post-treat group was treated with Compound 1 3 hours after irradiation.
  • 2-fold serial dilution from 10 ⁇ M was performed up to 0.039 ⁇ M. Comparative analysis was performed with the 0.5% DMSO treated group and the radiation untreated group. After treatment with Compound 1 for 48 hours, cells were fixed with 4% PFA for 30 minutes. After reacting with Phalloidin (F-actin) for 2 hours, Hoechst 33342 was reacted for 15 minutes. After washing with PBS, images were acquired using Operetta CLS equipment.
  • HUVEC cells were seeded in a 100 mm dish at 1 ⁇ 10 6 cells/dish, and irradiation and test material treatment were performed. When the test substance was treated before and after irradiation, the concentration was set to 0, 1, and 2 ⁇ M. Cells were lysed after 48 hours. Western blot analysis was performed by protein quantification. Primary antibodies were diluted with N-cadherin, Vimentin, ⁇ -SMA, Snail, and ⁇ -actin at a ratio of 1:1000 to 1:2000 and incubated at 4°C for 16 hours. The next day, the secondary antibody Goat anti-Rabbit IgG or Goat anti-Mouse IgG was treated at room temperature for 1 hour. After that, ECL reaction was performed and protein expression was comparatively analyzed with Chemiluminescence detection equipment.
  • 90Gy radiation was irradiated to establish a lung fibrosis mouse model. After that, 30 mg/kg Nintedanib or 30 mg/kg Compound 1 was orally administered for 2 weeks. After the experiment was completed, autopsy was performed and H&E and Trichrome staining was performed. The degree of pulmonary fibrosis was analyzed by measuring the Ashcroft score and Trichrome positive area. The results are shown in FIG. 10 .
  • the degree of fibrosis and collagen accumulation decreased when the positive control group Nintendanib or Compound 1 was administered compared to the vehicle irradiated group.
  • Compound 1 of the present invention was significantly more effective than the positive control group.

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Abstract

본 개시는 섬유증의 치료 또는 완화에 유용한 플라바논 유도체 화합물 및 이의 의약 용도에 관한 것이다.

Description

플라보논 유도체 화합물 및 이의 섬유증을 치료 또는 완화하기 위한 의약 용도
본 개시는 섬유증의 치료 또는 완화를 위한 화합물에 관한 것이다. 본 개시는 또한 본 개시에 따른 플라보논 유도체 화합물의 섬유증 치료 또는 완화용 의약 용도에 관한 것이다. 즉, 본 개시는 섬유증의 치료 또는 섬유증 증상의 완화를 위한 방법에 관한 것이다.
조직 손상에 대한 세포 외 매트릭스 성분의 축적은 조직 복구에 필수적인 생리학적 과정이다. 불행히도, 손상(injury)을 악화시키는 만성 손상은 섬유아세포(fibroblast) 및 근섬유아세포(myofibroblast)에 의한 세포 외 매트릭스 성분의 과잉 생산을 유발하여, 섬유질 결합 조직의 과도한 축적을 야기하고, 경우에 따라 이는 섬유증으로 알려진 병리학적 상태에 이르게 된다.
섬유증은 심장, 간, 폐, 골격근, 신장, 혈관 등과 같은 다양한 기관에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 섬유증은 골격근 조직 (이영양성 근육 질환), 심장 및 혈관 조직 (심근 경색), 간 조직 (비알콜성 지방간 질환/간경변), 폐 조직 (특발성 폐 섬유증) 및 신장 조직 (만성 신장 질환/신장 섬유증)에서 나타날 수 있다.
구체적으로, 신장 섬유증은 과잉 기질 합성(excess matrix synthesis), 수축 등을 포함하는 다양한 기전으로 인해 발생할 수 있다. Soma Meran 등은 신장 섬유증에 있어 섬유아세포와 근섬유아세포 관련 기전에 대해 설명하고 있으며, 근섬유아세포의 존재는 실험 모델과 인간의 신장 질환 모두에서 섬유화 진행의 예측 인자로 인식된다("Fibroblasts and myofibroblasts in renal fibrosis" Int J Exp Pathol. 2011 Jun; 92(3): 158-167.). 근섬유아세포는 α-SMA(Smooth muscle actin)의 발현으로 특징지워지며, fibronectin 또한 증가함이 특징이다. 이러한 근섬유아세포의 형성에는 ED-A fibronectin, TGF-β1, 기계적 장력 등이 관여한다고 알려져 있으나 아직 명확한 기전은 밝혀지지 않았다.
간 섬유증은 대부분의 만성 간 질환(예를 들어, 만성 바이러스간염, 알코올 간질환, 원발성 담도성 경화증)에서 발생하는 콜라겐을 포함한 세포 외 기질 단백질의 과도한 축적을 말한다. 간 섬유화에 관여하는 대표적인 세포는 간성상세포 (Hepatic stellate cell: HSC), 쿠퍼 세포 (Kupffer cell), 내피 세포 (Endothelial cell) 등이다. 간성상세포는 세포외 기질을 생산하는 주 생산원으로 활성화되면 근섬유아세포 유사형태 (myofibroblast-like phenotype)로 바뀌면서 세포증식의 증가, 교원질 (collagen type I and III)을 포함한 각종 세포외 기질의 생성 증가, α-SMA(Smooth muscle actin)의 발현 증가, 세포 수축성의 증가 등이 있게 된다. 이와 관련된 기전으로 TGF-β1, 안지오텐신 II 및 렙틴과 같은 섬유성 사이토카인 등이 활성화되는 것으로 알려져 있으나 아직 명확한 치료 기전은 밝혀져 있지 않다.
세포외 기질(extracellular matrix: ECM)의 과다한 축적으로 정의되는 조직 섬유화는 다양한 원인에 의한 폐 질환에서도 관찰되는 공통적인 병리소견이다. α-α-SMA의 신생합성(de novo synthesis)은 폐 섬유아세포(lung fibroblast)를 근 섬유아세포 표현형으로 변화시키고 근섬유아세포의 표현은 폐 섬유화가 진행되는 부위에서 상향조절되고 지속적으로 표현되기 때문에 폐 섬유화의 발생과 진행에 주 역할을 할 것으로 추정되고 있다. 한편, 항암치료 또는 산업현장에서 방사선 노출에 의한 폐조직의 손상 및 섬유화 사례는 매우 빈번하다. 이렇게 진행된 페섬유화는 비가역적이며 회복이 불가능하다.
다만, 아직까지 명확한 기전이 밝혀져 있지 않으므로 섬유증 치료 효과는 섬유증 관련 단백질 1~2개의 발현 조절만으로는 단정하기 어려우며 다양한 측면의 in vitro 및 in vivo 효력 평가가 필요하다.
따라서 본 개시가 해결하고자 하는 과제는 섬유증의 치료 또는 완화에 효과적인 화합물 또는 이러한 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다. 즉, 본 개시가 해결하고자 하는 과제는 섬유증의 치료 또는 완화에 효과적인 성분을 찾아내어 이의 의약 용도를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 프로드럭(prodrug)를 제공한다.
Figure PCTKR2022018535-appb-img-000001
상기 화학식 1에서, X는 NO2, OR1, NR1R2, 또는 SR1이며, R1 및 R2은 서로 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 6의 알킬 또는 아릴이다.
본 발명의 바람직한 일 측면에서 상기 X는 OH이다.
본 발명의 상기 화학식 1에서 X가 연결된 페닐기의 결합 양식은 Z체, E체, 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 Z체이다.
본 발명자들이 속한 연구그룹에서는 간조직 구상체가 견고할수록 세포외기질 관련 단백질의 발현이 증가되어 있음이 밝혔다 ("Identification of hepatic fibrosis inhibitors through morphometry analysis of a hepatic multicellular spheroids model" Sci Rep. 2021 May 25;11(1):10931). 또, 간세포와 기질세포간의 상호작용은 세포외기질 (Extracellular molecular) 관련 단백질의 발현 및 기질세포의 형질전환을 유도함을 증명되었다 ("Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma" J Exp Clin Cancer Res. 2018 May 25;37(1):109).
이에 간 섬유화 구상체의 크기 및 치밀성 등의 표현형을 인식할 수 있는 생물학적 측정법 개발하여 항섬유화 약물개발 플랫폼에 적용하였다. 즉, 간조직 구상체의 크기 및 치밀성의 변화 측정하여 300여 종의 천연물 유도체 중 양성 대조군인 오베티콜릭산(Obeticholic acid) 이상의 항섬유화 개선 효과를 보이는 후보 화합물들을 찾아내었다. 또한 후보 화합물들의 효과를 다양한 방법으로 평가하여 최종적으로 본 발명 화합물들을 찾아내고, 그 효과를 다양한 방법으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 태양에 있어, 본 발명에 따른 화합물들은 약학적으로 허용 가능한 염으로 이용될 수 있다. 실제로, 본 발명의 일 태양에서, 화학식 1에 따른 화합물의 염은 각각의 유리 염기 또는 유리 산보다 바람직할 수 있는데, 이는, 예를 들면, 그러한 염이 분자에 보다 큰 안정성 또는 용해도를 부여하고 그에 따라서 투여 형태로의 제형을 촉진하기 때문이다.
특정 태양에서, 상기 화학식 1에 따른 화합물은 산성 작용기를 가진 화합물로 작용할 수 있다. 본 발명의 일 태양에 있어, 화학식 1의 약학적으로 허용 가능한 염은 염기성 염이다. 약학적으로 허용가능한 염기성 염은 암모늄 염; 예를 들어 나트륨 및 칼륨 염 같은 알칼리 금속 염; 예를 들어 칼슘 및 마그네슘 염 같은 알칼리 토금속 염; 및 예를 들어 이소프로필아민(isopropylamine), 디에틸아민(diethylamine), 에탄올아민(ethanolamine), 트리메틸아민(trimethylamine), 디사이클로헥실 아민(dicyclohexyl amine) 및 N-메틸-D-글루카민(N-methyl-D-glucamine) 같은 일차, 이차 및 삼차 아민의 염을 포괄하는, 유기 염기성 염기와의 염을 포함한다.
특정 태양에서, 화학식 1에 따른 화합물은 염기성 작용기를 가진 화합물로 작용할 수 있다. 본 발명의 일 태양에 있어, 화학식 1의 약학적으로 허용 가능한 염은 산 부가 염이다. 약학적으로 허용가능한 산 부가 염은 무독성 염을 형성하는 산으로부터 형성된다. 예를 들어, 하이드로클로라이드(hydrochloride), 하이드로브로마이드(hydrobromide), 하이드로아이오다이드(hydroiodide), 설페이트(sulphate), 바이설페이트(bisulphate), 니트레이트(nitrate), 포스페이트(phosphate), 하이드로겐 포스페이트(hydrogen phosphate), 아세테이트(acetate), 말리에이트(maleate), 말레이트(malate), 퓨마레이트(fumarate), 말로네이트(malonate), 락테이트(lactate), 타르트레이트(tartrate), 시트레이트(citrate), 포르메이트(formate), 글루코네이트(gluconate), 석시네이트(succinate), 피루베이트(pyruvate), 옥살레이트(oxalate), 옥살로아세테이트(oxaloacetate), 트리플루오로아세테이트(trifluoroacetate), 사카레이트(saccharate), 벤조에이트(benzoate), 메탄설포네이트(methanesulphonate), 에탄설포네이트(ethanesulphonate), 벤젠설포네이트(benzenesulphonate), p-톨루엔설포네이트(toluenesulphonate), 메탄설포닉(methanesulphonic), 에탄설포닉(ethanesulphonic), p-톨루엔설포닉(toluenesulphonic), 및 이세티오네이트(isethionate) 염이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 대상 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 원하지 않는 독성 영향을 최소한으로 보이는 염을 지칭한다. 이들 약학적으로 허용 가능한 염은 화합물의 최종 단리 및 정제 중에 in situ에서 제조되거나, 또는 이의 유리 산 또는 유리 염기 형태의 정제된 화합물을 적합한 염기 또는 산과 별개로 반응시켜 제각기 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 일반적으로 그러한 용도로 안전하다고 간주되거나, 그러한 용도로 국가 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 공식적으로 승인되거나, 또는 미국 약전 (U. S. Pharmacopoeia) 또는 동물, 보다 특별히 인간에서의 사용을 위한 것으로 일반적으로 인정되는 기타 약전에 나열된 약학 제제에서의 사용에 적합한 것을 의미한다.
본 발명의 다른 측면은 또한 화학식 1 화합물의 프로드럭을 제공한다. 즉, 만약 어떠한 화합물(프로드럭(prodrug))이 체내에서 분리되어 본 발명의 화합물 또는 이의 염을 생성하게 된다면, 그러한 화합물 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에서 사용되고 다르게 지적되지 않는다면, 용어 "프로드럭(prodrug)"은 활성 화합물, 특히 본 발명의 화학식 1 화합물을 공급하기 위해 가수분해되고, 산화되고, 생물학 조건(생체 외 또는 생체 내)하에 다른 반응을 할 수 있는 본 발명의 화합물을 의미한다. 프로드럭의 예들은, 생가수분해될수 있는(biohydrolyzable) 아미드, 생가수분해될수 있는 에스테르, 생가수분해될수 있는 카르바메이트(carbamate), 생가수분해될수 있는 탄산염, 생가수분해될수 있는 우레이드(ureide), 그리고 생가수분해될수 있는 인산염 유사체들 같은 생가수분해될수 있는 부분을 포함하는, 생가수분해되어 본 발명의 화합물을 생성하는 화합물들을 포함하나, 이러한 구체적 태양에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 일 태양에 있어, 프로드럭은 하기 화학식 2 또는 3의 화합물이다.
Figure PCTKR2022018535-appb-img-000002
상기 화학식 2에서, R은 탄소수 1 내지 6의 알킬 또는 아릴임.
상기 화학식 2에 있어, 바람직하게, R은 메틸, 에틸, 또는 페닐이다.
Figure PCTKR2022018535-appb-img-000003
상기 화학식 3에서, R1 및 R2는 서로 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 알킬 또는 탄소수 1 내지 6의 알콕시이다.
상기 화학식 3에 있어, 바람직하게, R1 및 R2 (R1/R2)는 메틸/메틸; 메틸/에틸; 또는 메틸/메톡시이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "알킬"은 (탄소수가 특별히 한정되지 않은 경우) 탄소수 1 내지 10을 가진 포화된 직쇄상 또는 분지상의 비-고리(cyclic) 탄화수소를 의미한다. "저급 알킬"은 탄소수가 1 내지 4인 직쇄상 또는 분지상 알킬을 의미한다. 대표적인 포화 직쇄상 알킬은 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -n-헥실, -n-헵틸, -n-옥틸, -n-노닐 과 -n-데실을 포함하고, 반면에 포화 분지상 알킬은 -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸, 이소펜틸, 2-메틸헥실, 3-메틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 4-메틸헥실, 5- 메틸헥실, 2,3-디메틸부틸, 2,3-디메틸펜틸, 2,4-디메틸펜틸, 2,3-디메틸헥실, 2,4-디메틸헥실, 2,5-디메틸헥실, 2,2-디메틸펜틸, 2,2-디메틸헥실, 3,3-디메틸펜틸, 3,3-디메틸헥실, 4,4-디메틸헥실, 2-에틸펜틸, 3-에틸펜틸, 2-데틸헥실, 3-에틸헥실, 4-에틸헥실, 2-메틸-2-에틸펜틸, 2-메틸-3-에틸펜틸, 2-메틸-4-에틸펜틸, 2-메틸-2-에틸헥실, 2-메틸-3-에틸헥실, 2-메틸-4-에틸헥실, 2,2-디에틸펜틸, 3,3-디에틸헥실, 2,2-디에틸헥실, 및 3,3-디에틸헥실을 포함한다.
본 명세서에서 “C1-6”, "C1-6", 또는 "C1-C6"과 같이 기재될 경우 이는 탄소수가 1 내지 6개임을 의미한다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 탄소수가 1 내지 6인 알킬을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "알콕시"는 -OCH3, -OCH2CH3, -O(CH2)2CH3, -O(CH2)3CH3, -O(CH2)4CH3, -O(CH2)5CH3, 및 이와 유사한 것을 포함하는 -O-(알킬)을 의미하며, 여기에서 알킬은 위에서 정의된 것과 같다. 본 명세서에서 사용된 용어 "저급알콕시"는 -O-(저급알킬)을 의미하며, 여기에서 저급 알킬은 위에서 정의된 것과 같다.
본 명세서에서 사용된 용어 "아릴"은 3 내지 10의 고리 원자를 함유하는 탄소고리 방향족 그룹을 의미한다. 대표적인 예는 페닐, 톨일(tolyl), 자이릴(xylyl), 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 안트라세닐(anthracenyl), 플루오레닐(fluorenyl), 인데닐(indenyl), 아주레닐(azulenyl) 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 탄소고리 방향족 그룹은 선택적으로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치환된"(substituted)은 치환되는 부분(예를 들어, 아릴)의 수소 원자가 치환기로 대체되는 것을 의미한다. 치환체와 관련하여 별도의 기재가 없는 한, 본 발명의 치환체로는 할로겐, 하이드록실, (저급)알킬, 할로알킬, 모노- 또는 디-알킬아미노, 아릴, 헤테로사이클, -NO2, -NRaRb, -NRaC(=O)Rb, -NRaC(=O)NRaRb, -NRaC(=O)ORb, -NRaSO2Rb, -ORa, -CN, -C(=O)Ra, -C(=O)ORa, -C(=O)NRaRb, -OC(=O)Ra, -OC(=O)ORa, -OC(=O)NRaRb, -NRaSO2Rb, -PO3Ra, -PO(ORa)(ORb), -SO2Ra, -S(O)Ra, -SO(NRa)Rb (예를 들어, sulfoximine), -S(NRa)Rb (예를 들어, sulfilimine) 및 -SRa가 이용될 수 있으며, 여기에서 Ra와 Rb는 같거나 다르고 서로 독립적으로 하이드로겐, 할로겐, 아미노, 알킬, 알콕시알킬, 또는 할로알킬이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "할로겐"은 플루오린 (F), 염소 (Cl), 브로민 (Br), 또는 요오드 (I)를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "본 개시의 화합물" 또는 "본 발명의 태양(양태)에 따른 화합물"은 특별히 언급되지 않는 한 화학식 1에 따른 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 프로드럭을 포괄하는 의미이다.
본 명세서에서 사용된 용어인 "화학식 1(의) 화합물"은 또한 화학식 1의 화합물뿐만 아니라, 이들의 클라드레이트(clathrates), 수화물, 용매화물, 또는 다형체(결정다형)를 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 사용될 경우, 용어 "결정다형(polymorph)"은 본 발명의 화합물의 고체 결정 형태 또는 그것의 복합체를 의미한다. 같은 화합물의 다른 결정다형은 다른 물리적, 화학적 그리고/또는 스펙트럼적 특성을 보인다. 물리적 특성 측면의 차이점으로는 안정성(예를 들어, 열 또는 빛 안정성), 압축성과 밀도(제제화 및 생산물 제조에 중요함), 그리고 용해율(생물학적 이용률에 영향을 줄 수 있음)을 포함하나, 이에 한정되지 아니한다. 안정성에서 차이는 화학반응성 변화들(예를 들어, 또 다른 다형으로 구성되었을 때보다 하나의 다형으로 구성되었을 때 더 빠르게 변색이 되는 것 같은 차별적 산화) 또는 기계적인 특징들(예를 들어 동역학적으로 선호된 다형체로서 저장된 정제 파편들이 열역학 적으로 더 안정된 다형으로 변환) 또는 둘 다(하나의 다형의 정제는 높은 습도에서 더 분해에 예민)를 야기한다. 결정다형의 다른 물리적 성질들은 그들의 가공에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 한 결정다형은 또 다른 결정다형에 비하여, 예를 들어, 그것의 형태 또는 입자의 크기 분포에 기인하여 용매화합물을 형성할 가능성이 많을 수 있거나, 여과 또는 세척이 더 어려울 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "용매 화합물"은 비공유 분자간의 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적인 양의 용매를 포함하는 본 발명의 화합물을 의미한다. 바람직한 용매들은 휘발성이고, 비독성이며, 인간에게 극소량 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "수화물(hydrate)"은 비공유 분자간의 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적인 양의 물을 포함하는 본 발명의 화합물을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "클라드레이트(clathrate)"은 게스트 분자(예를 들어, 용매 또는 물)를 가두어 놓은 공간(예를 들어, 채널(channel))을 포함한 결정 격자의 형태의 본 발명의 화합물을 의미한다.
바람직하게, 본 개시의 화학식 1의 화합물에 있어 n은 1이다. 더욱 바람직하게, 본 개시의 화학식 1의 화합물은 3-(3-hydroxybenzylidene)-2-phenylchroman-4-one 또는 3-(3-nitrobenzylidene)-2-phenylchroman-4-one, 또는 이의 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 프로드럭(prodrug)이다. 더욱 더 바람직하게, 본 개시의 화학식 1의 화합물은 3-(3-hydroxybenzylidene)-2-phenylchroman-4-one이다.
본 발명의 다른 측면은 상기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 프로드럭(prodrug)을 유효성분으로 포함하는, 섬유증의 치료, 개선 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 또한 상기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 프로드럭(prodrug)의 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양을 섬유증의 치료, 개선 또는 예방이 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 섬유증의 치료, 개선 또는 예방 방법을 제공한다. 즉, 본 개시는 상기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 프로드럭의 섬유증 치료, 개선 또는 예방의 의약 용도를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 "예방(prevention)"은 환자(개체)에 있어 섬유화의 재발의 방지, 확장 또는 발병의 예방을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "치료"는 섬유화의 근절, 제거, 또는 통제를 포함하고, 섬유화의 확장을 최소화하거나 지연시키는 것이다.
본 개시에 있어, 섬유증은 심장, 간, 폐, 골격근, 신장, 또는 혈관 섬유증이다. 본 발명의 바람직한 일 태양에 있어, 섬유증은 간 또는 폐 섬유증이다. 본 발명의 다른 태양에 있어, 섬유증은 폐 섬유증이다. 본 발명의 또 다른 태양에 있어 섬유증은 방사선 피폭에 의해 유발된 폐 섬유증이다. 본 개시의 다른 양태에 있어, 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증(Idiopathic pulmonary fibrosis)이다.
본 개시에 따른 상기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 프로드럭은 일반적으로 치료적으로 또는 예방학적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 발명의 화합물(들)은 임의의 적합한 경로에 의하여 이러한 경로에 적당한 약학 조성물의 형태, 그리고 의도된 치료를 위하여 효과적인 투여량으로 투여될 수 있다. 효과적인 투여량은 단일 또는 분할 투여로 일반적으로 약 0.01 내지 약 50 mg/체중kg/일이고, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 20 mg/kg/일이다. 나이, 종, 및 치료될 질병 또는 상태(condition)에 따라 이 범위의 하한 미만의 투여량 수준이 적합할 수 있다. 다른 경우에는, 여전히 더 큰 투여량이 해로운 부작용없이 사용될 수 있다. 더 큰 투여량은 하루 동안 투여를 위하여, 여러 작은 투여량으로 분할될 수 있다. 적절한 투여량을 결정하기 위한 방법들이 본 발명이 속한 분야에 잘 알려져 있다.
본 개시는 또한 본 개시의 화합물 (상기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 프로드럭) 및 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약학 조성물을 제공한다.
섬유증의 치료, 개선 또는 예방을 위하여, 본 명세서에서 설명된 상기 유효 성분은 다음과 같이 투여될 수 있다.
비강 내 투여(Intranasal administration)
본 발명에 따른 유효 성분은 비강으로 투여될 수 있으며, 특히 본 개시의 의약 용도상 비강 투여가 바람직할 수 있다. 본 발명에 있어, 이러한 비강 투여는 통상적인 흡입제 투여를 포함하는 개념이다.
이러한 “비강 내 투여(intranasal administration)”는 코 또는 비강 중 하나 또는 둘 다를 통한 코 및 비강 내로의 조성물의 전달을 의미하고, 분무 메커니즘 또는 액적 메커니즘에 의한 전달 또는 유효 성분의 에어로졸화를 통한 전달을 포함한다. 흡입제에 의한 조성물의 투여는 분무 또는 액적 메커니즘에 의한 전달을 통해 코 또는 입을 통해 이루어질 수 있다.
비강 또는 흡입 전달을 위하여, 본 발명의 조성물은 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 의해 제형화될 수 있고, 예를 들어, 대표적인 가용화, 희석, 또는 분산 물질, 예컨대, 식염수, 보존제, 예컨대, 벤질알코올, 흡수촉진제 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 액체 제약 조성물은 후술하는 구강 투여 조성물 등과 동일한 방법으로 제조될 수도 있다.
이러한 비강 투여는 본 발명이 속한 분야에서 이미 잘 알려진 비강내 전달 장치를 이용해 수행될 수 있으며, 이러한 장치에서는 플루오로카본, 하이드로플루오로알칸 등의 분사제가 사용될 수도 있다.
구강 투여(Oral administration)
본 발명의 화합물은 구강으로 투여될 수 있으며, 구강은 연하(swallowing)를 포함하는 개념이다. 구강 투여에 의하여 본 발명의 화합물이 위장관(gastrointestinal tract)에 들어가거나, 예를 들어, 구강(buccal) 또는 설하(sublingual) 투여와 같이, 입으로부터 혈류로 직접적으로 흡수될 수 있다.
구강 투여를 위한 적합한 조성물은 고형상, 액상, 겔(gel), 또는 파우더 형상일 수 있으며, 정제(tablet), 로젠지(lozenge), 캡슐(capsule), 과립제, 산제 등의 제형을 가질 수 있다.
구강 투여를 위한 조성물은 선택적으로 장용 코팅(enteric coating)될 수 있으며, 장용 코팅을 통하여 지연된(delayed) 또는 지속된(sustained) 방출을 나타낼 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 구강 투여를 위한 조성물은 즉시 또는 변형된(modified) 방출 패턴을 가진 제형일 수 있다.
액체 제형은 용액, 시럽 및 현탁액을 포함할 수 있으며, 이러한 액상 조성물은 연질 또는 경질 캡슐 내에 함유된 형태일 수 있다. 이러한 제형은 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 셀룰로오스, 또는 오일(oil)을 포함할 수 있다. 상기 제형은 또한 하나 이상의 유화제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다.
정제(tablet) 제형에서, 활성 성분인 약물의 양은 정제 총 중량 대비 약 0.05 중량% 내지 약 95 중량%, 더욱 일반적으로 제형의 약 2 중량% 내지 약 50 중량%로 존재할 수 있다. 또한, 정제는 약 0.5 중량% 내지 약 35 중량%, 더욱 일반적으로 제형의 약 2 중량% 내지 약 25 중량%를 포함하는 붕해제를 함유할 수 있다. 붕해제의 예로는 유당, 전분, 소디움스타치글리콜레이트, 크로스포비돈, 크로스카멜로스소디움(croscarmellose sodium), 말토덱스트린 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
정제로 제조하기 위해 포함되는 적합한 활택제는 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량% 양으로 존재할 수 있고, 탈크(talc), 이산화규소, 스테아린산, 칼슘, 아연 또는 마그네슘 스테아레이트, 소듐 스테아릴 푸마레이트 등이 활택제로 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 첨가제들의 종류에 한정되는 것은 아니다.
정제로 제조하기 위한 결합제(binder)로는 젤라틴, 폴리에틸렌글리콜, 당(sugar), 검(gum), 녹말(starch), 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등이 사용될 수 있으며, 정제로 제조하기 위한 적합한 희석제로는 만니톨, 자일리톨, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 녹말(starch), 미결정셀룰로오스 등이 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 첨가제들의 종류에 한정되는 것은 아니다.
선택적으로 정제에 포함될 수 있는 가용화제는 정제 총 중량 대비 약 0.1 중량% 내지 약 3 중량% 양이 사용될 수 있고, 예를 들어, 폴리소르베이트, 소디움 라우릴설페이트, 소디움 도데실설페이트, 프로필렌 카보네이트, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디메틸이소소르비드, 폴리옥시에틸렌글리콜화된 천연 또는 수소화 피마자유, HCORTM(Nikkol), 올레일에스테르, 젤루시어(GelucireTM), 카프릴릭/카프릴산 모노/디글리세리드, 소르비탄지방산에스테르, 솔루톨HSTM 등이 본 발명에 따른 약학 조성물에 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 가용화제의 구체적 종류에 한정되는 것은 아니다.
비경구 투여(Parenteral Administration)
본 발명의 화합물은 혈류, 근육, 또는 내장 내로 직접 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 방법은 정맥내(intravenous), 근육내(intra-muscular), 피하 동맥내(subcutaneous intraarterial), 복강내(intraperitoneal), 척추강내(intrathecal), 두개내(intracranial) 주사 등을 포함한다. 비경구 투여를 위한 적합한 장치는 (바늘 및 바늘 없는 주사기를 포함하는) 주사기(injector) 및 주입 방법(infusion method)을 포함한다.
비경구 투여를 위한 조성물은 즉시 또는 변형된 방출 패턴을 가진 제형일 수 있으며, 변형된 방출 패턴은 지연된(delayed) 또는 지속된(sustained) 방출 패턴일 수 있다.
대부분의 비경구 제형은 액상 조성물이며, 이러한 액상 조성물은 본 발명에 따른 약효 성분, 염, 완충제, 등장화제 등을 포함하는 수용액이다.
비경구 제형은 또한 건조된 형태(예를 들어, 동결 건조) 또는 멸균 비-수용액으로서 제조될 수 있다. 이들 제형은 멸균수(sterile water)와 같은 적합한 비히클(vehicle)과 함께 사용될 수 있다. 용해도 증강제(solubility-enhancing agents) 또한 비경구 용액의 제조에 사용될 수 있다.
본 개시에 따른 화합물은 섬유증의 치료, 개선 또는 예방에 유용하다. 즉, 본 개시는 본 개시에 따른 화합물의 섬유증 치료, 개선 또는 예방을 위한 의약 용도를 제공한다. 본 개시의 또 다른 측면은 본 개시에 따른 화합물의 치료적 또는 예방적 유효량을 이를 필요로 하는 개체(바람직하게는 인간)에게 투여하는 단계를 포함하는 섬유증을 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다.
도 1은 간조직 구상체를 이용한 in vitro 간섬유화 억제 효능 검증 결과이다.
도 2는 간 섬유화 관련 단백질의 발현에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 3은 항산화능을 평가한 결과이다.
도 4는 간성상세포 (hepatic stellate cells) 활성 억제 평가 결과이다.
도 5는 혈관 내피세포의 EndMT 활성 억제 평가이다.
도 6은 TGF-β1 처리에 의해 발현이 증가한 섬유화 관련 유전자들에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 7은 in vivo 간섬유화 억제 효능 평가 결과이다.
도 8은 in vivo 폐섬유화 억제 효능 평가 결과이다.
도 9는 방사선에 의해 유도된 폐섬유화에 미치는 영향을 평가한 결과이며, 방사선 유도 혈관내피세포의 EndMT 활성 억제 정도를 평가한 결과이다.
도 10은 방사선에 의해 유도된 폐섬유화에 미치는 영향을 평가한 결과이며, HUVEC 세포의 항섬유화 효능 및 신호전달에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
합성예 1: (Z)-3-(3-hydroxybenzylidene)-2-phenylchroman-4-one (화합물 1)의 합성
Figure PCTKR2022018535-appb-img-000004
출발물질 (E)-1-(2-hydroxyphenyl)-3-(3-(methoxymethoxy)phenyl)prop-2-en-1-one (중국 reliable chem사 구매) 1 mmol에 Benzaldehyde 1.01 mmol과 Pyrrolidine 1.01 mmol을 넣고 EtOH에 용해시켰다. 이후 6시간 동안 환류 교반하였다. 반응 종료 후 용매를 제거하고 초산에테르와 물로 추출한 후 유기층을 별도로 분리하였다. 유기층을 감압증류하여 오일상의 액체를 얻었다. 여기에 메틸렌클로라이드 20ml를 가하고 2N HCl 3 ml를 가한후 상온에서 6시간동안 교반하였다. 반응 종결 후 물을 20 ml 가하고 20분간 교반하였다. 이후 유기층을 분리하고 감앙 농축하였다. 이후 컬럼크로마토그래피를 통하여 목적 화합물을 미색 고체로 75%의 수율로 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz) 5.62 (s, 1H), 6.70(d, 1H, J=2.2Hz), 6.82(dd, 1H, 2.2, 8.6Hz), 6.91 (s, 1H), 7.28-7.90(m, 10H), 8.14 (dd, 1H, J=2.4, 8.8Hz), 9.37 (bs, 1H)
합성예 2: (Z)-3-(3-nitrobenzylidene)-2-phenylchroman-4-one (화합물 2)의 합성
Figure PCTKR2022018535-appb-img-000005
상기 합성예 1에서 E)-1-(2-hydroxyphenyl)-3-(3-(methoxymethoxy)phenyl)prop-2-en-1-one 대신 (E)-1-(2-hydroxyphenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one을 사용한 것을 제외하고는, 합성예 1과 동일한 방법으로 연한 갈색의 화합물 2를 60%의 수율로 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz) 5.66 (s, 1H), 6.82(dd, 1H, 2.2, 8.6Hz), 7.01 (s, 1H), 7.18-7.99 (m, 10H), 8.14 (dd, 2H, J=2.2, 8.8Hz), 8.30(d, 1H, J=2.2Hz)
합성예 3: (Z)-3-(3-aminobenzylidene)-2-phenylchroman-4-one (화합물 3)의 합성
Figure PCTKR2022018535-appb-img-000006
합성예 2의 화합물 100 mg을 MeOH 10ml에 녹인후 Zn powder 210 mg과 초산 1 ml를 넣고 6시간동안 환류하였다. 반응 종료 후 셀라이트로 여과하였다. 그 후 감압증류하여 용매를 제거한 후 컬럼크로마토그래피로 연갈색 고체의 목적 화합물을 55% 수율로 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz) 5.27 (bs, 2H), 5.62 (s, 1H), 6.52 (dd, 1H, 2.2, 8.6Hz), 6.67(d, 1H, J=2.2Hz), 6.91 (s, 1H), 7.28-7.90 (m, 10H), 8.12 (dd, 1H, J=2.0, 8.8Hz)
합성예 4: (Z)-3-(3-methoxybenzylidene)-2-phenylchroman-4-one (화합물 4)의 합성
Figure PCTKR2022018535-appb-img-000007
합성예 1의 화합물 100mg을 디메틸포름아미드 3ml에 녹인후 트리에틸아민 1.1당량과 메틸요오드 1.1당량을 넣었다. 6시간동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후 셀라이트로 여과하고 물과 초산에틸로 추출하였다. 유기층을 감압증류하여 용매를 제거한 후 컬럼크로마토그래피로 연노랑색 고체의 목적 화합물을 75% 수율로 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz) 3.77 (s, 3H), 5.66 (s, 1H), 6.82 (dd, 1H, 2.2, 8.0Hz), 6.91 (s, 1H), 7.04(d, 1H, J=2.2Hz), 7.28-7.90(m, 10H), 8.12 (dd, 1H, J=2.0, 8.8Hz)
합성예 5: (Z)-3-((4-oxo-2-phenylchroman-3-ylidene)methyl)phenyl acetate (화합물 5)의 합성
Figure PCTKR2022018535-appb-img-000008
합성예 1의 화합물 100mg을 디클로로메탄 3ml에 녹인후 초산 0.1당량과 무수초산 1.1당량을 넣고 6시간 동안 한류 교반하였다. 반응 종료 후 셀라이트로 여과하고 물로 유기층을 세척하였다. 유기층을 감압증류하여 용매를 제거한 후 컬럼크로마토그래피로 연노랑색 고체의 목적화합물을 72% 수율로 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz) 2.33 (s, 3H), 5.66 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 7.04 (d, 1H, J=2.2Hz), 7.28-7.90 (m, 11H), 8.12 (dd, 1H, J=2.0, 8.8Hz)
양성 대조군 및 비교예 화합물들
임상 3상 중인 오베티콜릭산(Obeticholic acid)은 간의 섬유증을 완화시켰으므로, 이를 positive control로 사용하였다. 또, 본 발명 화합물들과 구조가 유사한 다음의 화합물들을 비교예 화합물들로 평가하였다. 하기 비교예 화합물들의 경우 별다른 섬유증 개선 효과를 나타내지 않았다.
Figure PCTKR2022018535-appb-img-000009
실험예 1: 간조직 구상체를 이용한 in vitro 간섬유화 억제 효능 검증
간조직 구상체가 견고할수록 세포외기질 관련 단백질의 발현이 증가되어 있음이 밝혀졌다 ("Identification of hepatic fibrosis inhibitors through morphometry analysis of a hepatic multicellular spheroids model" Sci Rep. 2021 May 25;11(1):10931). 이에 상기 논문에 따른 간조직 구상체 모델을 이용하여 간섬유화 억제 효능을 평가하였다. 환자 조직을 활용한 3차원 암조직 공배양은 기존의 2 차원 단순 증식 assay와 비교할 때 실제의 생체 내 환경과 상황을 훨씬 더 잘 대변한다.
구체적으로, 간세포(Huh7), 간성상세포(LX2), 혈관내피세포(HUVEC), 및 섬유아세포(WI38)를 각각 3,300 cells/well, 900 cells/well, 900 cells/well, 900 cells/well로 혼합하여 Low-attach round bottom 384-well plate에 seeding하였다. 이후 3일간 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 시험 물질을 처리하고 48시간 배양한 뒤 Operetta CLS 이미지 장비를 이용하여 구상체의 크기를 측정하였다.
양성 대조군 (Obeticholic acid), 화합물 1, 및 화합물 2의 평가 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타나는 바와 같이, 시험 화합물들의 경우 구상체의 크기가 증가하였음을 확인할 수 있었다. 다만, 화합물 1이 화합물 2보다 그 효과가 우수하였다.
실험예 2: 간 섬유화 관련 단백질의 발현을 통한 간섬유화 억제 효능 검증
실험예 1의 구상체 모델에서 세포외기질 관련 단백질 collagen I 및 섬유화 관련 신호전달 단백질 α-SMA와 p-SMAD3의 발현이 감소되는지 여부로 간섬유화 효과 여부를 평가하였다.
구체적으로, 실험예 1의 다세포성 간 구상체 모델을 lysis하여 단백질 정량 후 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 단백질 크기에 따라 6~12%의 SDS-PAGE 젤에서 단백질 전기영동을 수행하였다. 이후 결과물을 NC membrane으로 transfer하고, 이후 5% skim milk로 1시간 blocking 하였다. 1차 항체 (사용한 1차 항체 : Collagen 1α, phosphor-SMAD3, α-SMA, β-actin)를 1:500~1:2000의 비율로 희석하여 16시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 2차 항체 Goat anti-Rabbit IgG 또는 Goat anti-Mouse IgG를 상온에서 1시간 처리한 후 ECL 반응시켰다. 이후 Chemiluminescence 검출 장비로 단백질 발현을 비교 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 나타난 바처럼, 화합물 1은 구상체 모델에서 세포외기질 관련 단백질 collagen I 및 섬유화 관련 신호전달 단백질 α-SMA와 p-SMAD3의 발현을 감소시켰다. 이에 반해, 화합물 2의 경우 낮은 농도에서는 collagen I 및 p-SMAD3 발현 감소 억제 효과가 미약했다. 결론적으로 화합물 1이 화합물 2에 비해 개선된 항섬유화 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 3: 항산화능 검증
비록 다른 여러 실험으로 추가적인 확인이 필요하기는 하지만, 항산화제는 세포사로부터 간세포를 보호하며 간성상세포의 활성화를 억제하여 간섬유화를 억제하는 효과가 있을 수 있다. 예를 들어, Vitamin E는 널리 알려진 항산화제로서 in vitro 및 동물실험에서 간내 염증반응을 억제하고 간성상세포 (hepatic stellate cell)의 활성화를 억제하여 간섬유화로의 진행을 막는 효과가 있음이 보고되었다.
이에 따라 시험 물질들의 항산화능을 평가하였다. 간성상세포인 LX2에 200uM Hydrogen Peroxide (H2O2)를 30분간 처리 한 후 0, 0.1, 0.5, 1μM의 시험 물질을 24시간 처리하였다. 이후 ROS를 염색하고, Operetta CLS 및 Harmony Software를 통해 이미지 분석하여 ROS의 축적 정도를 확인하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 화합물 1은 기존의 항산화제와 유사하게 간암세포에 축적된 활성 산소 (Reactive oxygen species, ROS)를 효과적으로 제거하였다.
실험예 4: 간성상세포 (hepatic stellate cells) 및 혈관 내피세포의 EndMT 활성 억제 평가
3차원 공배양 조건에서는 간질환 미세환경에 존재하는 여러 가지 기질 세포 중에서 간성상세포가 구상체의 견고함에 가장 큰 영향을 미친다. 또한, 세포외기질 관련 단백질 또한 간성상세포의 활성에 따라 높게 발현한다. 간성상세포는 TGF-β 처리에 의해 섬유아세포로 형질 전환이 유도되고, 간조직내의 섬유화를 유도한다. 따라서, TGF-β 처리된 간성상세포의 활성 억제로 시험 물질의 섬유증 억제 효과를 평가하였다.
한편, Hepatocyte와 혈관세포의 crosstalk은 손상된 간조직 재생과 간섬유화에 중요한 역할을 한다. 특히, 간 sinusoidal vascular network가 중요하며, 최근 간섬유화조직의 재생에 있어서 sinusoidal endothelial cell(LSEC) 에서 분비되는 angiocrin 분비물질은 Hepatocyte의 성장과 재생을 조절하여 간섬유화를 조절한다는 연구결과들이 보고 되고 있다. 폐섬유화 진행초기단계에서 나타나는 혈관 저산소증에 의한 혈관내피 세포의 간엽세포로의 변이(EndMT) 현상 조절은 섬유화 제어를 위한 새로운 치료전략이 될 수 있다. 따라서, TGF-β 처리된 혈관 내피세포의 EndMT 활성 억제로 섬유증 개선 효과를 평가하였다.
구체적으로, 간성상세포 (3,000 cells/well) 또는 혈관내피세포 (2,000 cells/well)를 384-well plate에 seeding 하여 인큐베이션하였다. 다음 날 20 ng/ml TGF-β1 또는 20ng/ml TGF-β1 + 1.25 μM의 시험 물질을 48시간 처리하였다. 4% PFA로 세포를 고정한 후 1차 항체인 α-SMA, Phalloidin (F-actin)으로 16시간 동안 인큐베이션하였다. 다음 날 2차 항체를 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 washing 해준 후 세포 핵 염색을 위해 Hoechst 33342를 15분간 반응시켰다. PBS로 3번 washing 하였다. 그 후 Operetta CLS 장비 및 Harmony software를 이용하여 α-SMA 및 F-actin의 intensity를 분석하였다.
그 결과를 각각 도 4 (간성상세포 (hepatic stellate cells) 활성 억제 평가 결과) 및 도 5 (혈관 내피세포의 EndMT 활성 억제 평가 결과)에 나타내었다.
도 4에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 화합물 1은 간성상세포를 농도 의존적으로 reprogramming시킴을 관찰할 수 있었다. 또한, 도 5에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 화합물 1은 TGF-β 처리에 의한 혈관 내피세포의 EndMT 활성을 억제하였다.
실험예 5: 본 발명 화합물의 섬유화 억제 기전 분석
본 발명 화합물의 항섬유화 효능을 나타내는 기전을 분석하고자 하였다. 간섬유화 구상체를 구성하는 LX2 및 HUVEC 세포에 20ng/ml TGF-β1로 섬유화 유도 후 약물 1 μM을 48시간 처리하여 세포를 harvest하였다. 이후 RNA를 추출하고, RNAseq 분석을 수행하였다. 이를 기반으로 두 세포에서 공통으로 발현되는 유전자를 분류하였다.
TGF-β1 처리에 의해 활성화된 LX2 및 HUVEC 세포에 본 발명 화합물 1을 처리하여 RNA seq 분석을 수행한 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 왼쪽이 LX2 세포 실험 결과이며, 오른쪽이 HUVEC 세포 실험결과이다.
도 6에 나타나는 바와 같이, TGF-β1 처리에 의해 섬유화 관련 유전자들의 발현이 증가하였으며, 화합물 1이 이를 감소시킴을 확인하였다.
실험예 6: in vivo 간섬유화 억제 효능 검증
MCD-diet NASH 모델에서 화합물 1의 간섬유화 억제 효능을 검증하였다. C57/BL6N 7주령 수컷 마우스를 normal diet 또는 MCD diet (25 kcal% fat, Methionine and choline deficient L-amino acid diet)를 7주간 제공하였다. C57/BL6N 마우스에 식이를 통해 NASH를 유도한 후 4주간 약물을 투여하여 효능을 관찰하였다. 마우스 NASH 모델에서 양성대조군으로 Obeticholic acid (경구투여, 30mg/kg)를 사용하였다. 시험물질인 화합물 1은 50mg/kg으로 복강투여하였다. 투여횟수 및 기간은 4주(28일)간 매일 투여하였다. 투여를 마친 후 마우스는 부검하여 간 조직병리 및 혈액생화학적 분석을 수행하였다.
MCD 식이 마우스 NASH 모델에서 화합물 1의 항섬유화 효능 검증 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서, P*, P**, P***, 및 P**** 는 각각 생리식염수 처리한 MCD diet group 대비 <0.05, <0.01, <0.001, 및 <0.0001 수준에서 유의적인 차이가 있음을 의미한다.
도 7에 나타나는 바와 같이, 화합물 1은 양성대조군인 Obeticholic acid 처리 수준의 간독성 억제 및 steatosis 감소를 보였다 (ALT, AST, Steatosis rate). 염증 수치와 α-SMA positive area는 양성대조군보다 더욱 감소시킴을 확인하였다.
실험예 7: in vivo 폐섬유화 억제 효능 검증
Bleomycin으로 유도된 폐섬유화 모델에서 본 발명 화합물 1의 효능을 검증하였다.
폐섬유화 마우스 모델을 구축하기 위하여 bleomycin을 2주간 경구 투여하였다. 이후 bleomycin과 함께 양성 대조군인 30mg/kg Nintedanib 또는 30mg/kg 화합물 1을 2주 간 경구투여하였다. 실험을 마친 후 부검하여 조직염색, Ashcroft score, 및 collagen deposition으로 폐섬유화 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타나는 바와 같이, 섬유화 및 콜라겐 축적 정도를 분석한 결과 Bleomycin만 투여한 vehicle 군에 비하여 양성대조군인 Nintendanib 또는 화합물 1을 동시 투여하였을 때, vehicle에 비하여 유의미하게 감소함을 확인하였다. 또한 본 발명 화합물 1이 양성 대조군인 Nintendanib 보다 더 큰 감소율을 더 보였다.
실험예 8: 방사선 유도 폐섬유화 억제 효능 검증 (방사선 유도 혈관내피세포의 EndMT 활성 억제)
시험 물질 처리에 의한 방사선 유도혈관 내피세포의 EndMT 활성 억제 정도를 평가하였다. 384-well plate에 HUVEC 세포를 2,000 cells/well로 seeding 하여 10Gy 방사선 조사하였다. Pre-treat군은 방사선 조사 1시간 전에, Post-treat군은 방사선 조사 후 3시간 뒤에 본 발명 화합물 1을 처리하였다. 농도 별 약효를 확인하기 위하여 10 μM부터 2-fold serial dilution하여 0.039 μM까지 처리하였다. 0.5% DMSO 처리군 및 방사선 미처리군과 함께 비교분석하였다. 화합물 1을 48시간 처리 한 후, 4% PFA를 이용하여 세포를 30분간 고정하였다. Phalloidin (F-actin) 2시간 반응 후 Hoechst 33342를 15분간 반응시켰다. PBS로 washing하여 Operetta CLS 장비를 이용하여 이미지를 획득하였다.
또한 EMT(상피-간엽전이) 관련 단백질의 신호전달 변화를 확인하였다. 100mm dish에 HUVEC 세포를 1 × 106 cells/dish로 seeding하여 방사선 조사 및 시험 물질 처리를 진행하였다. 방사선 조사 전, 후 시험 물질 처리 시 농도는 0, 1, 2 μM로 하였다. 48시간 뒤 세포를 lysis하였다. 단백질 정량하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였음다. 1차 항체는 N-cadherin, Vimentin, α-SMA, Snail, β-actin으로, 1:1000~1:2000 비율로 희석하여 16시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음 날 2차 항체 Goat anti-Rabbit IgG 또는 Goat anti-Mouse IgG를 상온에서 1시간 처리하였다. 그 후 ECL 반응시켜 Chemiluminescence 검출 장비로 단백질 발현을 비교 분석하였다.
그 결과를 하기 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타나는 바와 같이, 방사선 미조사 처리군에 비하여 방사선 처리시 N-Cadherin, Vimentin, α-SMA, Snail의 단백질 발현이 증가하였다. 이러한 발현은 화합물 1 처리에 의해 감소함을 확인하였다. 방사선 조사 후에 화합물 1 처리 시 섬유화 관련 단백질의 발현이 더욱 두드러지게 감소함을 확인할 수 있었다. 또한 Stress fiber 변화를 통해 항섬유화 효능을 관찰한 결과 1.25 μM 약물처리시 섬유화 억제 효능을 가짐을 확인하였다.
실험예 9: 방사선 유도 폐섬유화 억제 효능 검증 (HUVEC 세포의 항섬유화 효능 및 신호전달 변화)
시험 물질 처리에 의한 방
폐섬유화 마우스 모델 구축을 위해 90Gy 방사선을 조사하였다. 그 후 2주간 30mg/kg Nintedanib 또는 30mg/kg 화합물 1을 경구투여하였다. 실험을 마친 후 부검하여 H&E, Trichrome 염색을 수행하였다. Ashcroft score 및 Trichrome positive area를 측정하여 폐섬유화 정도를 분석하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타나는 바와 같이, 방사선 조사 군인 vehicle에 비하여 양성대조군인 Nintendanib 또는 화합물 1 투여 시 섬유화 및 콜라겐 축적 정도가 감소하였다. 또한 본 발명의 화합물 1은 양성 대조군보다 그 효과가 월등히 뛰어났다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 프로드럭(prodrug).
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022018535-appb-img-000010
    상기 화학식 1에서, X는 NO2, OR1, NR1R2, 또는 SR1이며, R1 및 R2은 서로 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 6의 알킬 또는 아릴임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 X는 OH인, 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 프로드럭(prodrug).
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 3-(3-hydroxybenzylidene)-2-phenylchroman-4-one 또는 3-(3-nitrobenzylidene)-2-phenylchroman-4-one인, 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 프로드럭(prodrug).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 프로드럭(prodrug)을 유효 성분으로 포함하는 섬유증의 치료 또는 완화용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 섬유증은 간 또는 폐 섬유증인, 섬유증의 치료 또는 완화용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폐 섬유증은 방사선 피폭에 의해 유발된 폐 섬유증인, 섬유증의 치료 또는 완화용 약학 조성물.
PCT/KR2022/018535 2021-11-24 2022-11-22 플라보논 유도체 화합물 및 이의 섬유증을 치료 또는 완화하기 위한 의약 용도 WO2023096313A1 (ko)

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