WO2023068332A1 - 腎臓病の原因障害を診断するためのデータを収集する方法および組成物 - Google Patents

腎臓病の原因障害を診断するためのデータを収集する方法および組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2023068332A1
WO2023068332A1 PCT/JP2022/039116 JP2022039116W WO2023068332A1 WO 2023068332 A1 WO2023068332 A1 WO 2023068332A1 JP 2022039116 W JP2022039116 W JP 2022039116W WO 2023068332 A1 WO2023068332 A1 WO 2023068332A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
urine
activity
measuring
diagnosing
glutamyltranspeptidase
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/039116
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
知朗 高田
健太郎 山田
拓治 井山
Original Assignee
国立大学法人鳥取大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人鳥取大学 filed Critical 国立大学法人鳥取大学
Publication of WO2023068332A1 publication Critical patent/WO2023068332A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/493—Physical analysis of biological material of liquid biological material urine

Definitions

  • the present disclosure relates to the field of kidney disease diagnosis and treatment.
  • CKD chronic kidney disease
  • DKD diabetic kidney disease
  • CKD diabetic kidney disease
  • the broad concept of DKD also includes classic diabetic nephropathy (DN), which is mainly due to diabetes-induced nephropathy.
  • DN diabetic nephropathy
  • Non-Patent Document 1 Renal biopsy involves the collection of renal tissue by performing a puncture, requires hospitalization, carries the risk of bleeding, and usually takes 1-2 weeks for a histological diagnosis, making the overall burden excessive. be.
  • An object of the embodiments of the present disclosure is to provide a method for noninvasively collecting data useful for differentiating CKD with different etiologies.
  • ⁇ -Glutamyl transpeptidase activity and XP dipeptidyl peptidase activity in urine specimens from patients with chronic kidney disease differ significantly according to the causative disorder of the kidney disease It was found to show levels.
  • Various enzymes are secreted in urine, but there has been little utilization of urine for disease-specific tests leading to diagnosis.
  • Embodiments of the present disclosure make effective use of urine specimens and contribute to non-invasive diagnosis.
  • the present disclosure includes the following embodiments.
  • [1] (a) measuring XP dipeptidyl peptidase activity or DPP-4 protein level in a urine specimen from the subject; and (b) either or both of measuring ⁇ -glutamyltranspeptidase activity or ⁇ -glutamyltranspeptidase protein levels, wherein P is proline and X is any amino acid; Methods of collecting data for diagnosing causative disorders of kidney disease.
  • An XP dipeptidyl reporter compound represented by the following formula (I), wherein the glutamic acid residue peptide-bonded to the proline residue may be replaced with any other amino acid residue is brought into contact with a urine specimen, and the activity of (a) is measured by measuring the intensity of fluorescence emitted.
  • [3] ⁇ -glutamyl reporter compound represented by the following formula (II) is brought into contact with a urine sample, and the activity of (b) is measured by measuring the intensity of the emitted fluorescence.
  • a compound represented by the following formula (I), wherein the glutamic acid residue peptide-bonded to the proline residue may be replaced with any other amino acid residue
  • a composition for diagnosing causative disorders of kidney disease in a urine specimen comprising: [6] The composition of [5], comprising the compound and urine.
  • a compound represented by the following formula (II) A composition for diagnosing causative disorders of kidney disease in a urine specimen, comprising: [8] The composition of [7], comprising the compound and urine.
  • the present disclosure provides methods of non-invasively collecting data useful for diagnosing, determining, or differentiating causative disorders of kidney disease, particularly chronic kidney disease (CKD), in a subject.
  • This method either (a) measuring XP dipeptidyl peptidase activity or DPP-4 protein level, and (b) measuring ⁇ -glutamyltranspeptidase activity or ⁇ -glutamyltranspeptidase protein level in a urine specimen from the subject, or Including both.
  • CKD chronic kidney disease
  • subject in the present disclosure means an individual who has or is suspected of having kidney disease, and can also be translated as “patient”.
  • the individual is a mammal, preferably a primate, more preferably a human.
  • Subjects with diabetes or suspected diabetes are particularly preferred subjects for the methods of the present embodiment.
  • the clinical manifestations of renal disease are based on patient-specific medical conditions, such as typical renal damage due to diabetes, involvement of arteriosclerosis and/or dyslipidemia, and renal damage not directly related to diabetes. referred to herein as a "disorder" may be present.
  • diagnosis the causative disorder is meant determining for an individual patient the category of disorder that is thus most likely causing the clinical symptoms of kidney disease.
  • data is information about a patient that can be objectively detected or quantified, such as the presence or amount of biomarker molecules, the presence or amount of enzymatic activity, or the presence or amount of specific structures on diagnostic images. means information. If the data can be collected non-invasively, punctures, surgeries, etc. become unnecessary.
  • a ⁇ -glutamyl transpeptidase is an enzyme capable of hydrolyzing a ⁇ -glutamyl peptide to cleave off a ⁇ -glutamyl group, as known to those skilled in the art.
  • Methods for detecting, measuring, or quantifying the activity of ⁇ -glutamyltranspeptidase are known to those skilled in the art, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the presence of ⁇ -glutamyltranspeptidase activity in a test sample can be determined, for example, by adding an (optionally labeled) ⁇ -glutamyl peptide substrate to the test sample and by changing the molecular weight of the substrate or by cleaving the ⁇ -glutamyl group or to another substrate.
  • a fluorescent probe in which a ⁇ -glutamyl group is peptide-bonded (amide bond) can also be used as a reporter substrate. Fluorescent probes that are particularly suitable for this embodiment will be described later.
  • reporter in this disclosure means a compound, composition, or substrate capable of producing a detectable signal or substance in response to the presence of a specific enzymatic activity.
  • a dipeptidyl peptidase is an exopeptidase enzyme that can cleave two amino acid residues at the N-terminus of a peptide, that is, the peptide bond (amide bond) at the base of the dipeptide.
  • the peptide bond amide bond
  • proline which forms a cyclic structure, cannot be cleaved by most dipeptidyl peptidases.
  • XP dipeptidyl peptidase is a special dipeptidyl peptidase that can use the XP dipeptide with proline at the base as a substrate.
  • XP dipeptidyl peptidase The most typical XP dipeptidyl peptidase is DPP-4 (Dipeptidyl Peptidase-4).
  • Methods for detecting, measuring, or quantifying the activity of XP dipeptidyl peptidase are known to those skilled in the art, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • detection, measurement or quantification by adding an (optionally labeled) XP dipeptidyl substrate to the test sample and detecting changes in the molecular weight of the substrate or cleavage of the XP dipeptide, as for ⁇ -glutamyltranspeptidase above. can be A fluorescent probe in which XP dipeptide is peptide-bonded (amide bond) can also be used as a reporter substrate. Fluorescent probes that are particularly suitable for this embodiment will be described later.
  • XP is a naturally occurring amino acid such as glutamic acid (E), lysine (K), tyrosine (Y), leucine (L), proline (P), which are known to those skilled in the art to be residues of polypeptides and substrates for peptidases; It can be, but is not limited to, ⁇ -amino acids. It is particularly preferred to use reporter substrates in which X is glutamic acid (E).
  • compounds of formula (I) below are used as reporter substrates for XP dipeptidyl peptidase.
  • X in XP is glutamic acid (E), but this glutamic acid residue peptide-bonded to the proline residue may be replaced with any other amino acid residue. good.
  • Compounds of formula (I) and compounds having other amino acid residues in place of the glutamic acid residue of formula (I) are collectively referred to as XP dipeptidyl reporter compounds.
  • XP dipeptidyl peptidase activity is measured by contacting a urine specimen with the XP dipeptidyl reporter compound and measuring the intensity of emitted fluorescence.
  • the compounds of formula (I) and compounds having other amino acid residues in place of the glutamic acid residue of formula (I) were developed by the research group of Urano et al. et al., Scientific Reports, 6:26399). Although these compounds themselves emit little fluorescence under physiological conditions, the activity of XP dipeptidyl peptidase cleaves the base peptide bond (that is, the amide bond CONH) of the XP dipeptide shown on the left side of the structural formula. , the liberated rhodamine derivative (hydroxymethylrhodamine green: HMRG) emits fluorescence. Fluorescence intensity correlates with the amount of XP dipeptidyl peptidase activity. This rhodamine derivative has an absorption maximum near 500 nm and a fluorescence maximum near 524 nm. Compounds of formula (I) are referred to by the name EP-HMRG.
  • a compound represented by formula (II) below is used as a reporter substrate for ⁇ -glutamyltranspeptidase.
  • ⁇ -glutamyl transpeptidase activity is determined by contacting a urine specimen with a ⁇ -glutamyl reporter compound represented by formula (II) and measuring the intensity of emitted fluorescence. Measurements are taken.
  • the compound of formula (II) was developed by the research group of Urano et al. and was shown to be able to detect cancer cells in tissues (Urano et al., Sci. Transl. Med. 2011, 3, 110ra119 ). Although the compound of formula (II) itself emits little fluorescence under physiological conditions, the activity of ⁇ -glutamyltranspeptidase cleaves the amide (CONH) bond of the ⁇ -glutamyl group shown on the left side of the structural formula. Then, the liberated rhodamine derivative (hydroxymethylrhodamine green) emits fluorescence. Fluorescence intensity correlates with the amount of ⁇ -glutamyltranspeptidase activity. This rhodamine derivative has an absorption maximum near 500 nm and a fluorescence maximum near 524 nm. The compound of formula (II) is referred to by the name gGlu-HMRG.
  • EP-HMRG or XP-HMRG
  • gGlu-HMRG are compounds that produce the same fluorescent molecule by their corresponding enzymatic activities
  • measurement of XP dipeptidyl peptidase activity and ⁇ -glutamyl transpeptidase activity using these is It is self-evident that it is preferable to perform the measurement in separate measuring solutions rather than in the physically same measuring solution.
  • the use of these fluorescent reporter compounds is preferred as they can provide very rapid measurements of enzymatic activity.
  • the protein level of the enzyme corresponding to that activity can be measured and used as a biomarker. Therefore, DPP-4 protein levels may be measured instead of XP dipeptidyl peptidase activity in urine specimens. Alternatively, protein levels of ⁇ -glutamyltranspeptidase may be measured in urine specimens instead of ⁇ -glutamyltranspeptidase activity.
  • protein level means protein abundance. Methods for measuring the levels of these proteins are known to those skilled in the art or can be designed by those skilled in the art based on their common knowledge. It is also possible to purchase antibodies or kits (eg, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits) that can be used to measure the levels of these proteins.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • urinary XP dipeptidyl peptidase activity and DPP-4 protein levels in subjects with diabetic nephropathy were significantly higher than those of subjects without DN (including the same subjects above when without DN). It has been found that it can be higher than Thus, for example, a urinary XP dipeptidyl peptidase activity or DPP-4 protein level that is higher than a baseline value can be indicative that a subject has DN.
  • a urinary XP dipeptidyl peptidase activity or DPP-4 protein level below baseline can be an indication that the subject does not have DN.
  • a urinary XP dipeptidyl peptidase activity or DPP-4 protein level higher than the reference value indicates that the subject does not have diabetic kidney disease (DKD) other than DN and/or chronic glomerulonephritis. It can be an indicator of DN rather than CKD that is not directly related to diabetes (complication of diabetes) such as CKD. DKD other than DN can typically be nephrosclerosis.
  • urinary ⁇ -glutamyltranspeptidase activity and ⁇ -glutamyltranspeptidase protein levels in subjects with DKD but not DN were higher than those with DN (including the same subjects above when they had DN). It was found that it could be. Also, urinary ⁇ -glutamyltranspeptidase activity and ⁇ -glutamyltranspeptidase protein levels in subjects with non-DN DKD were significantly higher than those of subjects with CKD not directly associated with diabetes, such as chronic glomerulonephritis (complicated diabetes).
  • a urinary ⁇ -glutamyltranspeptidase activity or ⁇ -glutamyltranspeptidase protein level that is higher than baseline can be indicative that a subject has DKD that is not DN.
  • Urinary ⁇ -glutamyltranspeptidase activity or ⁇ -glutamyltranspeptidase protein levels below baseline can be indicative that a subject does not have DKD other than DN.
  • a urinary ⁇ -glutamyltranspeptidase activity or ⁇ -glutamyltranspeptidase protein level higher than the reference value may indicate that the subject has a disease other than DN and/or diabetes such as chronic glomerulonephritis directly. It can be an indicator of DKD other than DN as opposed to unrelated (diabetic comorbid) CKD.
  • the activity or protein level measurements of the two enzymes in urine can also be used in combination.
  • a urinary XP dipeptidyl peptidase activity or DPP-4 protein level higher than the reference value and a urinary ⁇ -glutamyltranspeptidase activity or ⁇ -glutamyltranspeptidase protein level lower than the reference value indicates that the subject has DN. It can be an indicator of what you have.
  • the disclosed method can differentiate between any two or three of, for example, diabetic nephropathy, glomerulonephritis, and nephrosclerosis.
  • Typical treatments for patients diagnosed with DN are hypoglycemic agents such as alpha-glucosidase inhibitors, sulfonylureas, thiazolidinediones, insulin, DPP-4 inhibitors, glucagon-like peptide-1 agonists or sodium glucose cotransporter-2 inhibitors. drugs or antihypertensive drugs such as angiotensin-converting enzyme inhibitors and angiotensin receptor blockers.
  • the typical treatment for patients diagnosed with nephrosclerosis, a DKD other than DN is blood pressure control with calcium channel blockers.
  • Typical treatments for patients diagnosed with CKD not directly related to diabetes, such as chronic glomerulonephritis, are steroids or immunosuppressants. Embodiments of treatment methods are also contemplated in which these treatments are administered to a subject in response to diagnosis in combination with data collection and diagnosis from urine specimens according to the present disclosure.
  • urine concentrations can vary to some extent from day to day or at different times of the day, diluting urine samples to specific concentrations to measure enzyme activity or protein levels simplifies the interpretation of measurements. can facilitate diagnosis.
  • the creatinine concentration should be uniform among urine specimens, for example from 0.2 to 1.2 ⁇ g/ ⁇ L, or from 0.5 to 0.5 ⁇ g/ ⁇ L.
  • Urine specimens are preferably diluted to values within the range of 1.0 ⁇ g/ ⁇ L. The same is true when measuring protein levels. Creatinine is an organic acid-related compound endogenous in urine. Urine specimens can be diluted with water or aqueous solutions.
  • Urine samples may be diluted based on creatinine concentration prior to measurement of enzyme activity or protein levels, or in undiluted (or diluted based on criteria other than creatinine concentration) urine samples. Enzyme activity or protein level measurements may be taken and the measurements divided by the creatinine concentration. Stated another way, the measured value of enzyme activity or protein level in a urine sample is preferably normalized as a value per weight of creatinine in the same urine sample.
  • the enzyme activity or protein level may be measured after diluting the urine so that the specific gravities of the urine specimens are uniform between specimens.
  • enzyme activity or protein levels may be measured in undiluted (or diluted on a basis other than specific gravity) urine and the measured value divided by the specific gravity value.
  • a measurement of enzyme activity or protein level in a urine specimen may be normalized as a value per specific gravity of the urine specimen. It was confirmed that urinary creatinine and urine specific gravity show a strong correlation. Methods of measuring the specific gravity of urine are well known to those skilled in the art, one example being the refractive index-based method.
  • the urinary creatinine concentration needs to be measured in a relatively well-equipped laboratory, but the urine specific gravity can be easily measured in a short period of time, for example, at a simple examination site or at a pharmacy.
  • urine concentration adjustment based on creatinine concentration or specific gravity may be omitted in one embodiment, since variations in urine concentration usually remain within a few percent at most.
  • the urine sample in the method of the present embodiment may be a urine sample that has undergone freezing, for example, a urine sample that has undergone cryopreservation.
  • any one of the above fluorescent reporter compounds when used, its concentration when added to a urine sample for measurement is preferably 0.5 to 20 ⁇ M, more preferably 1 to 10 ⁇ M, and 2 to 20 ⁇ M. More preferably 7 ⁇ M.
  • concentration of any of the above fluorescent reporter compounds added to the urine specimen can be, for example, 5 ⁇ M.
  • the enzymatic reaction can be performed, for example, between 0°C (on ice) and 37°C. Reaction at room temperature, eg 25° C., is also preferred.
  • the reaction time for detecting, measuring or quantifying the enzyme activity can be appropriately set by the practitioner according to the design of each test, and can be, for example, 0.5 to 30 minutes, and typically 1 minute provides sufficient data. is obtained.
  • embodiments are also contemplated in which the fluorescence intensity of a fluorescent reporter is continuously monitored at multiple time points rather than at a specific time point or in real time to quantify enzymatic activity by the rate of increase in fluorescence intensity.
  • the present disclosure is represented by the above formula (I) or wherein the glutamic acid residue peptide-bonded to the proline residue in formula (I) is replaced with any other amino acid residue (XP dipeptidyl reporter compound) for diagnosing a causative disorder of kidney disease in a urine sample.
  • XP dipeptidyl reporter compounds are provided for use in diagnosing causative disorders of kidney disease in urine specimens.
  • the composition comprises urine in addition to the XP dipeptidyl reporter compound.
  • the present disclosure provides a composition for diagnosing a causative disorder of kidney disease using a urine specimen, which contains a compound represented by formula (II) above ( ⁇ -glutamyl reporter compound).
  • ⁇ -glutamyl reporter compounds are provided for use in diagnosing causative disorders of kidney disease in urine specimens.
  • the composition comprises urine in addition to the ⁇ -glutamyl reporter compound. It should be understood that these compositions can be tools for carrying out embodiments of the methods described above. Accordingly, descriptions of various structural-functional features (eg, compound concentration and creatinine concentration) provided for the method embodiments also apply to this composition embodiment.
  • Fluorescent Reagents A ⁇ -glutamyl reporter compound (gGlu-HMRG; trade name ProteoGREENTM-gGlu) of formula (II) described herein was purchased from Goryo Kayaku Co., Ltd. After thawing on ice, 29.7 ⁇ L of dimethylsulfoxide (DMSO) was added to 1 vial to make a 1 mM stock and stored at -20°C. When using, first thaw the 1 mM stock on ice, then dilute it 100-fold with phosphate buffered saline (PBS) to prepare a reaction solution (10 ⁇ M), and add it to the same volume of urine sample. , was used in reactions at a final concentration of 5 ⁇ M.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • EP dipeptidyl reporter compound having the structure of formula (I) described herein was also purchased from Goryo Kayaku Co., Ltd. A 1 mM stock was similarly prepared and stored at -20°C. When used, it was adjusted to a final concentration of 5 ⁇ M by the same procedure as above and used for reaction with urine samples.
  • Urine Specimen Urine specimens were collected from the subjects upon waking up early in the morning and immediately stored at -80°C after collection. In a preliminary experiment, it was found that preadjustment of urine concentration based on urinary creatinine could simplify and facilitate the fluorescence assay. was homogenized. Specifically, a cryopreserved urine specimen was thawed on ice and then diluted with PBS so that the creatinine concentration was 2 ⁇ g/ ⁇ L. As described above, the reaction was performed by mixing with the same volume of the fluorescent reagent solution, so that the final concentration of creatinine in the reaction solution was 1 ⁇ g/ ⁇ L.
  • Fluorescence measurement system A detection apparatus was designed in which a fluorescence unit (BioTools) was attached to a stereoscopic microscope (BioTools). A 450 nm bandpass filter was inserted in the light source, and a ⁇ 520 nm sharp cut filter was inserted in the objective lens. During the reaction, the diluted urine sample was added to a 200 ⁇ L tube, then the fluorescent reagent solution was added, reacted at room temperature for 1 minute, and then green fluorescence was detected and imaged with the detection device. ImageJ software was used to quantify the fluorescence intensity of the images. Specifically, after converting the image to 8-bit, a region of interest (ROI) was set in an area that does not include the edge of the tube and the liquid surface, and the density within the ROI was measured.
  • ROI region of interest
  • FIG. 1 shows the measurement results of urinary XP dipeptidyl peptidase activity and ⁇ -glutamyl transpeptidase activity using EP-HMRG (left) and gGlu-HMRG (right), respectively. Enzyme activity was measured based on Fluorescent intensity.
  • DN, GN, and NS are, respectively, classical diabetic nephropathy, chronic glomerulonephritis, a classic “diabetic chronic kidney disease” whose etiology is not directly related to diabetes, and Represents a group of patients with a definitive diagnosis of nephrosclerosis, a typical "diabetic kidney disease other than diabetic nephropathy".
  • XP dipeptidyl peptidase activity measured by EP-HMRG was significantly higher in the DN patient group.
  • ⁇ -Glutamyl transpeptidase activity measured by gGlu-HMRG was confirmed to be significantly higher in diabetic nephropathy (NS) patient groups other than diabetic nephropathy. Both urinary enzyme activities were low in a group of patients with diabetes-complicated chronic kidney disease (GN) who had factors not directly related to diabetes.
  • GN diabetes-complicated chronic kidney disease
  • biomarkers according to embodiments of the present invention is that, in addition to simplicity, cut-off values or target stringency of tests can be arbitrarily set. In other words, for example, when focusing on reducing GN oversight, it is possible to increase the sensitivity of GN diagnosis by setting a strict cutoff value (for example, only cases with particularly strong marker fluorescence are judged to be DN). can.
  • Figure 2 is an example of differentiating the causes of kidney disease by measuring the enzyme protein level instead of the enzyme activity, separately from the study in Figure 1.
  • protein levels of DPP-4 believed to be the major XP dipeptidyl peptidase, were measured in patient urine specimens by ELISA.
  • DN represents patients with classic diabetic nephropathy as described above (7).
  • Non-DN included 5 GN patients and 6 NS patients. Similar to the enzyme activity level by fluorescent reporter, the enzyme protein level was significantly higher in the DN group, and the DN group could be distinguished from the non-DN group.
  • the urine sample concentration was adjusted based on the urinary creatinine concentration in order to increase the accuracy of the comparison between samples, but as a simpler alternative, the urine sample concentration can be adjusted based on the urine specific gravity.
  • R 2 0.7482
  • the difference in the mean detection level between the two groups was smaller than when normalized for creatinine concentration, but the statistically significant difference was maintained, being higher in the DN group (not shown).
  • the method according to the present disclosure can be sufficiently implemented even in situations limited to simple examinations, such as regular health checkups.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

異なる病因を有する慢性腎臓病を鑑別するために有用となるデータを非侵襲的に収集する方法を提供する。被験者の尿検体における（ａ）ＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性またはＤＰＰ－４タンパク質レベルを測定すること、および（ｂ）γ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性またはγ-グルタミルトランスペプチダーゼタンパク質レベルを測定することのいずれかまたは両方を含み、ここでＰはプロリンでありＸは任意のアミノ酸である、腎臓病の原因障害を診断するためのデータを収集する方法が提供される。

Description

腎臓病の原因障害を診断するためのデータを収集する方法および組成物
　本開示は腎臓病の診断および治療の分野に関する。
　慢性腎臓病（chronic kidney disease: CKD）の患者は増加しており、日本ではすでに1300万人を超えている。それに伴って透析患者も増えている。CKDは、（１）尿異常、画像診断、血液、病理で腎障害の存在が明らかであること、および（２）糸球体濾過量（GFR）が60 mL/min/1.73m2未満に低下していること、のいずれかまたは両方が３カ月以上持続することと定義されている（エビデンスに基づくCKD診療ガイドライン2018、日本腎臓学会編）。
　慢性腎臓病を適切に診断し、治療し、透析が必要になる状態を予防することが求められている。日本透析医学会の全国統計調査では、透析に至る原因について、糖尿病に起因する腎不全が最多であることが示されている。このような背景から、糖尿病性腎臓病（diabetic kidney disease: DKD）の概念が提唱され、日本腎臓学会の上記ガイドラインでもDKDの管理の重要性が強調された。該ガイドラインに記述されているように、DKDは、糖尿病の病態が関与するCKD全般を包括した概念であり、加齢や高血圧を背景とした動脈硬化や脂質異常症の関与が推定される、顕性アルブミン尿を伴わない糖尿病患者におけるGFRの低下のような非典型的な糖尿病関連腎疾患をも含む。DKDの広い概念のなかに、糖尿病による腎障害を主体とする古典的な糖尿病性腎症（diabetic nephropathy: DN）も含まれる。一方、糖尿病患者ではあっても慢性糸球体腎炎（特にIgA腎症）などの糖尿病と直接関連しない腎疾患を合併した場合は、糖尿病合併CKD（CKD with diabetes）に分類される。
　例えばDKDと糖尿病合併CKDとでは、治療方針が大きく異なるため、それらの鑑別診断は極めて重要であるが、臨床像が類似していることが少なくなく、診断には侵襲的な検査である腎生検での組織学的診断を要し得る（非特許文献１）。腎生検には、穿刺を行って腎組織を採取することが関わり、入院を要し、出血のリスクもあり、組織学的診断にも通常１～２週間が掛かり、全体として負担が過大である。
Int J Mol Sci 2021, 22(11), 5425.
　本開示の実施形態は、異なる病因を有するCKDを鑑別するために有用となるデータを非侵襲的に収集する方法を提供することを課題とする。
　慢性腎臓病患者に由来する尿検体におけるγ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性およびＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性、ならびにそれらの活性に対応する酵素のタンパク質量が、その腎臓病の原因障害の違いに応じて有意に異なるレベルを示すことが見出された。尿中には様々な酵素が分泌されるが、診断につながる疾患特異的な検査のための尿利用は今までほとんど存在していなかった。本開示の実施形態は、尿検体を有効利用し、非侵襲的な診断に資するものである。本開示は以下の実施形態を含む。
［１］
　被験者の尿検体における
　（ａ）ＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性またはＤＰＰ－４タンパク質レベルを測定すること、
および
　（ｂ）γ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性またはγ-グルタミルトランスペプチダーゼタンパク質レベルを測定すること
のいずれかまたは両方を含み、ここでＰはプロリンでありＸは任意のアミノ酸である、
　腎臓病の原因障害を診断するためのデータを収集する方法。
［２］
　下記式（Ｉ）で表され、ここで、プロリン残基にペプチド結合しているグルタミン酸残基は他の任意のアミノ酸残基に置き換えられていてもよい、ＸＰジペプチジルレポーター化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 を尿検体と接触させ、発せられる蛍光の強度を測定することによって前記（ａ）の活性の測定が行われる、［１］に記載の方法。
［３］
　下記式（ＩＩ）で表されるγ-グルタミルレポーター化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 を尿検体と接触させ、発せられる蛍光の強度を測定することによって前記（ｂ）の活性の測定が行われる、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
　前記Ｘがグルタミン酸（Ｅ）である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
　下記式（Ｉ）で表され、ここで、プロリン残基にペプチド結合しているグルタミン酸残基は他の任意のアミノ酸残基に置き換えられていてもよい、化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 を含む、尿検体で腎臓病の原因障害を診断するための組成物。
［６］
　前記化合物と尿とを含む、［５］に記載の組成物。
［７］
　下記式（ＩＩ）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 を含む、尿検体で腎臓病の原因障害を診断するための組成物。
［８］
　前記化合物と尿とを含む、［７］に記載の組成物。
EP-HMRG（左）およびgGlu-HMRG（右）をそれぞれ用いた、尿中のXPジペプチジルペプチダーゼ活性およびγ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性の測定結果を示す。 古典的な糖尿病性腎症を有するＤＮ糖尿病患者群と、それ以外の慢性腎臓病を有する非ＤＮ糖尿病患者群の尿検体においてＤＰＰ－４タンパク質レベルを測定して比較した結果を示す。
　一態様において本開示は、被験者における腎臓病、特に慢性腎臓病（CKD）の原因障害を診断、判定、または鑑別するために有用となるデータを、非侵襲的に収集する方法を提供する。この方法は、
　被験者の尿検体における
　（ａ）ＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性またはＤＰＰ－４タンパク質レベルを測定すること、および
　（ｂ）γ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性またはγ-グルタミルトランスペプチダーゼタンパク質レベルを測定すること
のいずれかまたは両方を含む。
　本開示における「被験者」という用語は、腎臓病を有するまたは腎臓病が疑われる個体を意味し、「患者」と換言することもできる。個体は哺乳類であり、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである。糖尿病を有するかまたは糖尿病が疑われる被験者が、本実施形態の方法の被験者として特に好ましい。
　腎臓病の臨床的症状の背景には、糖尿病による典型的な腎障害、動脈硬化および／または脂質異常症の関与、ならびに糖尿病と直接関連しない腎障害のような、患者ごとに異なる医学的状態（本明細書で「障害」と呼ぶ）が存在し得る。「原因障害を診断する」とは、このように腎臓病の臨床的症状を引き起こしている蓋然性が高い障害の類別を個々の患者について判定することを意味する。診断の文脈においてデータとは、バイオマーカー分子の有無もしくは量、酵素活性の有無もしくは量、または診断画像上の特定構造の有無もしくは量のように、客観的に検出または定量化できる、患者についての情報を意味する。データを非侵襲的に収集できる場合、穿刺、手術等は不要になる。
　γ-グルタミルトランスペプチダーゼとは、当業者に知られているように、γ-グルタミルペプチドを加水分解してγ-グルタミル基を切り離すことができる酵素である。γ-グルタミルトランスペプチダーゼの活性を検出、測定または定量化する方法は当業者に知られており、当業者が適宜選択することができる。試験試料中のγ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性の存在は、例えば、試験試料に（任意で標識された）γ-グルタミルペプチド基質を加えて、基質の分子量変化またはγ-グルタミル基の切断もしくは別基質への転移を検出することにより検出、測定あるいは定量化することができる。γ-グルタミル基がペプチド結合（アミド結合）した蛍光プローブをレポーター基質として利用することも可能である。本実施形態において特に好適な蛍光プローブについては後述する。
　本開示における「レポーター」という用語は、特定の酵素活性の存在に応答して検出可能な信号または物質を生ずることができる化合物、組成物、または基質を意味する。
　ジペプチジルペプチダーゼとは、ペプチドのＮ末端にある二つのアミノ酸残基すなわちジペプチドの付け根のペプチド結合（アミド結合）を切断することができるエキソペプチダーゼ酵素である。ジペプチドの付け根側に位置し得る天然アミノ酸残基のうち、環状構造をなすプロリンについては、ほとんどのジペプチジルペプチダーゼは切断することができない。ＸＰジペプチジルペプチダーゼは、付け根側にプロリンを有するＸＰジペプチドを基質とすることができる特別なジペプチジルペプチダーゼである。最も典型的なＸＰジペプチジルペプチダーゼがＤＰＰ－４（Dipeptidyl Peptidase-4）である。ＸＰジペプチジルペプチダーゼの活性を検出、測定または定量化する方法は当業者に知られており、当業者が適宜選択することができる。例えば、上記γ-グルタミルトランスペプチダーゼの場合と同様に、試験試料に（任意で標識された）ＸＰジペプチジル基質を加えて、基質の分子量変化またはＸＰジペプチドの切断を検出することにより検出、測定あるいは定量化することができる。ＸＰジペプチドがペプチド結合（アミド結合）した蛍光プローブをレポーター基質として利用することも可能である。本実施形態において特に好適な蛍光プローブについては後述する。
　ジペプチドの文脈でのＸＰという記載において、Ｐはプロリンを表しＸは任意のアミノ酸を表す。Ｘは、ポリペプチドの残基となりペプチダーゼの基質となり得ることが当業者に知られるグルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）等の天然アミノ酸あるいはα－アミノ酸であり得るがこれらに限定されない。Ｘがグルタミン酸（Ｅ）であるレポーター基質を使用することが特に好ましい。
　一実施形態において、下記式（Ｉ）で表される化合物がＸＰジペプチジルペプチダーゼのレポーター基質として使用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　ここで、上記式（Ｉ）ではＸＰのうちＸがグルタミン酸（Ｅ）となっているが、プロリン残基にペプチド結合しているこのグルタミン酸残基は他の任意のアミノ酸残基に置き換えられてもよい。式（Ｉ）で表される化合物、および、式（Ｉ）のグルタミン酸残基の代わりに他のアミノ酸残基を有する化合物を合わせて、ＸＰジペプチジルレポーター化合物と総称する。
　すなわち、一実施形態の方法では、尿検体と上記ＸＰジペプチジルレポーター化合物を接触させ、発せられる蛍光の強度を測定することによって、（ａ）ＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性の測定が行われる。
　式（Ｉ）の化合物および式（Ｉ）のグルタミン酸残基の代わりに他のアミノ酸残基を有する化合物は、がん細胞を検出するプローブとして浦野らの研究グループによって開発されたものである（Onoyama et al., Scientific Reports, 6:26399）。これらの化合物自体は生理的条件下においてほとんど蛍光を発しないが、ＸＰジペプチジルペプチダーゼの活性により、構造式の左側に示されるＸＰジペプチドの付け根のペプチド結合（すなわちアミド結合CONH）が切断されると、遊離されるローダミン誘導体（ヒドロキシメチルローダミングリーン：HMRG）が蛍光を発する。蛍光強度は、ＸＰジペプチジルペプチダーゼの活性の量と相関する。このローダミン誘導体は500 nm付近に最大吸収を有し524 nm付近に最大蛍光を有する。式（Ｉ）の化合物はEP-HMRGという名称で呼ばれる。
　一実施形態において、下記式（ＩＩ）で表される化合物がγ-グルタミルトランスペプチダーゼのレポーター基質として使用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　すなわち、一実施形態の方法では、尿検体と式（ＩＩ）で表されるγ-グルタミルレポーター化合物を接触させ、発せられる蛍光の強度を測定することによって、（ｂ）γ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性の測定が行われる。
　式（ＩＩ）の化合物は、浦野らの研究グループによって開発され、組織中のがん細胞を検出できることが示されたものである（Urano et al., Sci. Transl. Med. 2011, 3, 110ra119）。式（ＩＩ）の化合物自体は生理的条件下においてほとんど蛍光を発しないが、γ-グルタミルトランスペプチダーゼの活性により、構造式の左側に示されるγ-グルタミル基のアミド（CONH）結合が切断されると、遊離されるローダミン誘導体（ヒドロキシメチルローダミングリーン）が蛍光を発する。蛍光強度は、γ-グルタミルトランスペプチダーゼの活性の量と相関する。このローダミン誘導体は500 nm付近に最大吸収を有し524 nm付近に最大蛍光を有する。式（ＩＩ）の化合物はgGlu-HMRGという名称で呼ばれる。
　EP-HMRG（あるいはXP-HMRG）とgGlu-HMRGは、それぞれ対応する酵素活性によって同じ蛍光分子を生じる化合物であるから、これらを用いたＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性およびγ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性の測定は、物理的に同一の測定液中ではなく別々の測定液中で行うことが好ましいことは自明である。これらの蛍光レポーター化合物の使用は、酵素活性の測定値をきわめて迅速に提供できるため好ましい。
　本開示の実施形態では、酵素活性の代わりに、その活性に対応する酵素のタンパク質レベルを測定してバイオマーカーとして利用することもできる。従って、尿検体においてＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性の代わりにＤＰＰ－４タンパク質レベルを測定してもよい。また、尿検体においてγ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性の代わりにγ-グルタミルトランスペプチダーゼのタンパク質レベルを測定してもよい。本開示において、「タンパク質レベル」とは、タンパク質の存在量を意味する。これらのタンパク質のレベルを測定する方法は当業者に知られているか、または当業者が通常の知識に基づいて設計することができる。これらのタンパク質のレベルを測定するために使用できる抗体またはキット（例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）キット）を購入することも可能である。
　例えば、糖尿病性腎症（DN）を有する被験者の尿中のＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性およびＤＰＰ－４タンパク質レベルは、DNを有さない被験者（DNを有さない時の上記同じ被験者を含む）のものよりも高くなり得ることが見出された。従って、例えば、基準値よりも高い尿中ＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性またはＤＰＰ－４タンパク質レベルは、被験者がDNを有していることの指標となり得る。基準値以下の尿中ＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性またはＤＰＰ－４タンパク質レベルは、被験者がDNを有していないことの指標となり得る。また例えば、基準値よりも高い尿中ＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性またはＤＰＰ－４タンパク質レベルは、その被験者が有する疾患が、DN以外の糖尿病性腎臓病（DKD）ではなく、および／または慢性糸球体腎炎のような糖尿病と直接関連しない（糖尿病合併）CKDではなく、DNであることの指標となり得る。DN以外のDKDは典型的に腎硬化症であり得る。
　一方、DNではないDKDを有する被験者の尿中のγ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性およびγ-グルタミルトランスペプチダーゼタンパク質レベルは、DNを有する被験者（DNを有する時の上記同じ被験者を含む）のものよりも高くなり得ることが見出された。また、DNではないDKDを有する被験者の尿中のγ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性およびγ-グルタミルトランスペプチダーゼタンパク質レベルは、慢性糸球体腎炎のような糖尿病と直接関連しない（糖尿病合併）CKDを有する被験者のものよりも高くなり得ることが見出された。従って、例えば、基準値よりも高い尿中γ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性またはγ-グルタミルトランスペプチダーゼタンパク質レベルは、被験者がDNではないDKDを有していることの指標となり得る。基準値以下の尿中γ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性またはγ-グルタミルトランスペプチダーゼタンパク質レベルは、被験者がDN以外のDKDは有していないことの指標となり得る。また例えば、基準値よりも高い尿中γ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性またはγ-グルタミルトランスペプチダーゼタンパク質レベルは、その被験者が有する疾患が、DNではなく、および／または慢性糸球体腎炎のような糖尿病と直接関連しない（糖尿病合併）CKDではなく、DN以外のDKDであることの指標となり得る。
　尿中の２つの酵素の活性またはタンパク質レベルの測定値は組み合わされても利用され得る。例えば、尿中ＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性またはＤＰＰ－４タンパク質レベルが基準値より高く、かつ尿中γ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性またはγ-グルタミルトランスペプチダーゼタンパク質レベルが基準値より低いことは、被験者がDNを有していることの指標となり得る。尿中ＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性またはＤＰＰ－４タンパク質レベルが基準値より低く、かつ尿中γ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性またはγ-グルタミルトランスペプチダーゼタンパク質レベルが基準値より高いことは、被験者がDNではないDKDを有していることの指標となり得る。尿中ＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性またはＤＰＰ－４タンパク質レベルが基準値より低く、かつ尿中γ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性またはγ-グルタミルトランスペプチダーゼタンパク質レベルが基準値より低いことは、被験者が慢性糸球体腎炎のような糖尿病と直接関連しない（糖尿病合併）CKDを有していることの指標となり得る。このようにして、本開示に係る方法は例えば糖尿病性腎症、糸球体腎炎、および腎硬化症のうちのいずれか２つまたは３つの間で鑑別を行うことができる。
　DNと診断された患者に対する典型的な治療はαグルコシダーゼ阻害薬、スルフォニル尿素、チアゾリジン誘導体、インスリン、DPP-4阻害薬、glucagon like peptide-1作動薬もしくはsodium glucose cotransporter-2阻害薬などの血糖降下薬またはアンギオテンシン変換酵素阻害薬やアンギオテンシン受容体拮抗薬などの降圧薬である。DN以外のDKDである腎硬化症と診断された患者に対する典型的な治療はカルシウム拮抗薬による血圧コントロールである。慢性糸球体腎炎のような、糖尿病と直接関連しないCKDと診断された患者に対する典型的な治療はステロイド薬または免疫抑制薬である。本開示による尿検体からのデータ収集および診断と組み合わせて、診断結果に応じてこれらの治療を被験者に施す、治療方法の実施形態も企図される。
　尿中ＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性またはＤＰＰ－４タンパク質レベル、および尿中γ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性またはγ-グルタミルトランスペプチダーゼタンパク質レベルのそれぞれの基準値は、測定値と比べられて多寡についての参照点となるものであり、事前に決定された基準値であり得る。基準値は、確定診断がなされた患者群から得られた測定値を参考にしながら当業者が適宜決定することができ、具体的な数値は状況に応じて変化し得ることが理解されるべきである。実施者は、例えば、測定装置を含めどのような測定システムを使用するか、尿検体をどれだけ希釈するか、診断検査の目的が予備的スクリーニングであるかあるいは治療方針決定であるか、等の条件に応じて、個々のアプリケーションにおける適切な基準値を選択することができる。
　尿の濃度は日によってあるいは一日のうちの異なる時刻においてある程度は変動し得るため、尿検体を特定の濃度に希釈して酵素活性またはタンパク質レベルの測定を行うと、測定値の解釈を単純化でき診断を促進することができる。この目的のために、例えば上記いずれかの蛍光レポーター化合物を用いた酵素活性測定では、クレアチニン濃度が尿検体間で均一となるように、例えば０．２～１．２μｇ／μＬあるいは０．５～１．０μｇ／μＬの範囲内の値となるように、尿検体が希釈されることが好ましい。タンパク質レベルを測定する場合も同様である。クレアチニンは尿に内在する有機酸関連化合物である。尿検体は水または水溶液で希釈することができる。酵素活性を阻害しない水溶液は当業者によく知られており、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）はその一例である。クレアチニン濃度に基づいて尿検体を希釈してから酵素活性またはタンパク質レベルの測定を行ってもよいし、あるいは、希釈していない（もしくはクレアチニン濃度とは別の基準に基づいて希釈した）尿検体において酵素活性またはタンパク質レベルの測定を行って、測定値をクレアチニン濃度で割ってもよい。別の言い方をすると、尿検体中の酵素活性またはタンパク質レベルの測定値は、同じ尿検体中のクレアチニン重量あたりの値として正規化（normalization）されることが好ましい。
　あるいは、尿検体の比重が検体間で均一となるように尿を希釈してから酵素活性またはタンパク質レベルの測定を行ってもよい。あるいは、希釈していない（もしくは比重とは別の基準に基づいて希釈した）尿において酵素活性またはタンパク質レベルの測定を行って、測定値を比重値で割ってもよい。別の言い方をすると、尿検体中の酵素活性またはタンパク質レベルの測定値は、その尿検体の比重あたりの値として正規化してもよい。尿中クレアチニンと尿比重は強い相関関係を示すことが確認された。尿の比重を測定する方法は当業者によく知られており、屈折率に基づく測定法はその一例である。尿中クレアチニン濃度については比較的設備の整った検査室での測定が必要であるが、尿比重は、例えば簡易な検診の場や薬局などでも、短時間かつ簡便に測定できる。しかしながら、尿濃度の変動は通常は最大でも数パーセント以内に留まるため、一実施形態ではクレアチニン濃度または比重に基づく尿濃度調整は省略されてもよい。
　尿検体を凍結した後に解凍しても、酵素活性は実質的に影響されないことが確認された。従って、本実施形態の方法における尿検体は、凍結を経た尿検体、例えば凍結保存を経た尿検体であってもよい。
　上記いずれかの蛍光レポーター化合物を用いる場合、測定のために尿検体に加えられた際のその濃度は、０．５～２０μＭであることが好ましく、１～１０μＭであることがより好ましく、２～７μＭであることがさらに好ましい。尿検体に加えられた上記いずれかの蛍光レポーター化合物の濃度は例えば５μＭであり得る。
　酵素反応は例えば０℃（氷上）から３７℃の間で行うことができる。室温、例えば２５℃での反応も好ましい。酵素活性を検出、測定あるいは定量化するための反応時間は各試験のデザインに応じて実施者が適宜設定でき、例えば０．５～３０分間であり得、典型的には１分間で十分なデータが得られる。例えば、特定の一時点ではなく複数の時点でまたはリアルタイムで蛍光レポーターの蛍光強度を連続的に観測して、蛍光強度増加の率によって酵素活性を定量化する実施形態も企図される。
　別の態様において本開示は、上記式（Ｉ）で表されるかまたは式（Ｉ）のうちプロリン残基にペプチド結合しているグルタミン酸残基が他の任意のアミノ酸残基に置き換えられたものである化合物（ＸＰジペプチジルレポーター化合物）を含む、尿検体で腎臓病の原因障害を診断するための組成物を提供する。換言すると、尿検体で腎臓病の原因障害を診断することにおける使用のためのＸＰジペプチジルレポーター化合物が提供される。一実施形態において、この組成物は、ＸＰジペプチジルレポーター化合物に加えて尿を含む。別の態様において本開示は、上記式（ＩＩ）で表される化合物（γ-グルタミルレポーター化合物）を含む、尿検体で腎臓病の原因障害を診断するための組成物を提供する。換言すると、尿検体で腎臓病の原因障害を診断することにおける使用のためのγ-グルタミルレポーター化合物が提供される。一実施形態において、この組成物は、γ-グルタミルレポーター化合物に加えて尿を含む。これらの組成物は、上記方法の実施形態を実施するためのツールとなり得るものであることが理解されるべきである。従って、方法の実施形態について提供された様々な構造的・機能的特徴（例えば化合物濃度およびクレアチニン濃度）の説明は、この組成物の実施形態にも適用される。
１．蛍光試薬
　本明細書に記載される式（ＩＩ）の構造のγ-グルタミルレポーター化合物（gGlu-HMRG；商品名ProteoGREEN(商標)-gGlu）を五稜化薬株式会社から購入した。氷上で解凍した後、1バイアルに29.7μLのジメチルスルホキシド（DMSO）を加えて1 mMストックを作成し、-20℃で保存した。使用の際にはまず、1 mMストックを氷上で解凍した後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で100倍希釈した反応液（10μM）を作成し、同体積の尿サンプルへ添加することにより、最終濃度5μMでの反応に使用した。
　本明細書に記載される式（Ｉ）の構造のＥＰジペプチジルレポーター化合物（EP-HMRG）も五稜化薬株式会社から購入した。同様に1 mMストックを作成し、-20℃で保存した。使用の際は上記と同様の手順で最終濃度5μMとなるように調整し尿サンプルとの反応に用いた。
２．尿検体
　早朝起床時の尿検体を被験者から採取し、採取後速やかに-80℃で保存した。予備実験において、尿中クレアチニンを基準とした尿濃度の事前調整が蛍光アッセイを簡略化・促進させ得ることが見出されたため、解析の際には尿中クレアチニンを基準として尿検体を希釈し濃度の均一化を行った。具体的には、凍結保存していた尿検体を氷上で解凍させた後、クレアチニン濃度が2μg/μLとなるようPBSで希釈した。上述したように同体積の蛍光試薬液と混合して反応を行ったため、反応液におけるクレアチニンの最終濃度は1μg/μLとなった。なお、凍結保存を経た検体と室温保存されていた検体とでは実質的に蛍光強度の差はないことを確認した。別の実験では、尿比重屈折計により尿の比重を測定しその比重の違いに応じて各尿検体を希釈して尿濃度の均一化を行った。
３．蛍光測定系
　実体顕微鏡（BioTools社）に蛍光ユニット（BioTools社）を装着させた検出装置を設計した。光源には450 nm域のバンドパスフィルターを挿入し、対物レンズには～520 nmのシャープカットフィルターを挿入した。反応の際は200μL容量のチューブ内に上述の希釈された尿検体を加えた後、蛍光試薬液を添加し、室温で1分間反応させ、その後上記検出装置で緑色の蛍光を検出し撮像した。ImageJソフトウェアを用いて画像の蛍光強度を定量化した。詳細には、画像を8-bitへ変換した後に、チューブの辺縁と液面を含まない領域にregion of interest（ROI）を設定し、ROI内のdensityを測定した。
４．被験者の組織診断
　本実施例で記述される全ての被験者は糖尿病を有し、慢性腎臓病の症状を示していた患者である。被験者は、尿検体を採取した日と同日に腎生検の実施を受けた。得られた生検組織を10%ホルマリン固定した後にPeriodic acid Schiff（PAS）染色し、組織学的な診断を行った。以下では、この腎生検の組織学的診断に基づいて確定診断が得られたDN群9人、GN群76人、NS群17人の被験者についての尿中酵素分析結果を示す。
５．その他
　ELISAはHuman DPP4 ELISA kit（abcam社）を用いて行った。統計学的な分析および有意差決定は、GraphPad Prismを用いてWelch’s t検定あるいはOne-way ANOVA（post-hoc Tukey）で行った。
６．結果
　図１に、EP-HMRG（左）およびgGlu-HMRG（右）をそれぞれ用いた、尿中のXPジペプチジルペプチダーゼ活性およびγ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性の測定結果を示す。酵素活性は蛍光強度（Fluorescent intensity）に基づいて測定された。DN、GN、およびNSはそれぞれ、古典的な糖尿病性腎症（diabetic nephropathy）、病因が糖尿病と直接関連しない典型的な「糖尿病合併慢性腎臓病」である慢性の糸球体腎炎（glomerulonephritis）、および典型的な「糖尿病性腎症以外の糖尿病性腎臓病」である腎硬化症（nephrosclerosis）であると確定診断がなされた患者群を表す。EP-HMRGで測定されるXPジペプチジルペプチダーゼ活性はDN患者群で有意に高くなっていることが確認された。gGlu-HMRGで測定されるγ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性は、糖尿病性腎症以外の糖尿病性腎臓病（NS）患者群で有意に高くなっていることが確認された。糖尿病と直接関連しない要因を有する糖尿病合併慢性腎臓病（GN）の患者群ではどちらの尿中酵素活性も低かった。
　既報によると、糖尿病4561例の解析で、DNの診断における糖尿病網膜症の感度67%、特異度78%であった（Ophthalmic Res 2019;62:68-79）。また、腎生検51例（DN 34例とGN 17例）の解析で、GN診断における顕微鏡的血尿の感度59%、特異度68%であった（Nephrol Dial Transplant 1997;12:2588-91）。現行の臨床検査（組織検査を除く）で、最も重要と考えられ得るのは、GNを見落とさないこと、特にDNとGNを鑑別することである。EP-HMRGでのGN検出感度は83%、特異度は67%であり、既報の検査に劣らない。本発明の実施形態によるバイオマーカーの有利な点は、簡便性に加えて、カットオフ値、あるいは目的とする検査のストリンジェンシーを、任意に設定できる点にある。つまり、例えばGNの見落としを減らすことに主眼を置く場合には、カットオフ値を厳しく設定する（例えばマーカーの蛍光が特に強い症例のみをDNと判定する）ことでGN診断の感度を上げる事ができる。
　図２は、図１の研究とは別途に、そして酵素活性の代わりに酵素タンパク質レベルを測定して、腎臓病の原因障害の鑑別を行った例である。すなわちここでは、ELISAによって、主要なXPジペプチジルペプチダーゼであると考えられるDPP-4のタンパク質レベルを患者の尿検体において測定した。DNは上記の通り古典的な糖尿病性腎症の患者を表す（7人）。Non-DNは5人のGN患者と6人のNS患者を含んだ。蛍光レポーターによる酵素活性レベルと同様に、酵素タンパク質レベルも、DN群で有意に高値となっており、DN群をnon-DN群から区別することができている。
　上記の実験では、検体間の比較の精度を上げるために尿中クレアチニン濃度に基づいて尿検体濃度を調節していたが、より簡便な代替として尿の比重に基づいて尿検体濃度を調節することもできる。予備実験において、尿中クレアチニンと尿比重は強く相関することが見出された（R2=0.7482）。DN群とnon-DN群の尿検体を希釈して尿試験紙法で同じ比重段階になる程度に比重を均一化したうえで、EP-HMRGによりXPジペプチジルペプチダーゼ活性を測定して比較したところ、クレアチニン濃度で標準化した場合と比べて両群間の平均検出レベルの差が小さくなったものの、DN群の方が高いという統計学的有意差は維持された（図示していない）。本開示に係る方法は、例えば定期健康診断など、簡易な検査に限定される場面においても十分に実施可能である。
 

Claims (8)

  1. 　被験者の尿検体における
    　（ａ）ＸＰジペプチジルペプチダーゼ活性またはＤＰＰ－４タンパク質レベルを測定すること、および
    　（ｂ）γ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性またはγ-グルタミルトランスペプチダーゼタンパク質レベルを測定すること
    のいずれかまたは両方を含み、ここでＰはプロリンでありＸは任意のアミノ酸である、
    　腎臓病の原因障害を診断するためのデータを収集する方法。
  2. 　下記式（Ｉ）で表され、ここで、プロリン残基にペプチド結合しているグルタミン酸残基は他の任意のアミノ酸残基に置き換えられていてもよい、ＸＰジペプチジルレポーター化合物
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     を尿検体と接触させ、発せられる蛍光の強度を測定することによって前記（ａ）の活性の測定が行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 　下記式（ＩＩ）で表されるγ-グルタミルレポーター化合物
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     を尿検体と接触させ、発せられる蛍光の強度を測定することによって前記（ｂ）の活性の測定が行われる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記Ｘがグルタミン酸（Ｅ）である、請求項１または２に記載の方法。
  5. 　下記式（Ｉ）で表され、ここで、プロリン残基にペプチド結合しているグルタミン酸残基は他の任意のアミノ酸残基に置き換えられていてもよい、化合物
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     を含む、尿検体で腎臓病の原因障害を診断するための組成物。
  6. 　前記化合物と尿とを含む、請求項５に記載の組成物。
  7. 　下記式（ＩＩ）で表される化合物
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     を含む、尿検体で腎臓病の原因障害を診断するための組成物。
  8. 　前記化合物と尿とを含む、請求項７に記載の組成物。
PCT/JP2022/039116 2021-10-21 2022-10-20 腎臓病の原因障害を診断するためのデータを収集する方法および組成物 WO2023068332A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-172209 2021-10-21
JP2021172209 2021-10-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023068332A1 true WO2023068332A1 (ja) 2023-04-27

Family

ID=86058331

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/039116 WO2023068332A1 (ja) 2021-10-21 2022-10-20 腎臓病の原因障害を診断するためのデータを収集する方法および組成物

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023068332A1 (ja)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KYSLOVA IULIIA, KONOPLITSKA ANASTASIA, YABLON OLGA, KABLUKOVA ELENA, GUMINSKAYA GALINA: "SP902 Early markers topical diagnosis of renal damage in children with haematuria syndrome", NEPHROLOGY DIALYSIS TRANSPLANTATION, OXFORD UNIVERSITY PRESS, GB, vol. 30, no. suppl_3, 21 May 2015 (2015-05-21), GB , pages iii674, XP093058991, ISSN: 0931-0509, DOI: 10.1093/ndt/gfv203.40 *
SIWY J, MISCHAK H, KLEIN T, VON EYNATTEN M: "Urinary proteomics may unmask the renal potential of the dipeptidyl peptidase (DPP)-4 inhibitor linagliptin in patients with diabetic kidney disease (DKD)", NEPHROLOGY DIALYSIS TRANSPLANTATION, vol. 33, no. suppl. 1, 18 May 2018 (2018-05-18), pages i35, XP093058990 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bidin et al. Blood and urine biomarkers in chronic kidney disease: An update
JP4516124B2 (ja) 肝線維症の診断方法
CN102762985B (zh) 使用热休克蛋白72作为敏感生物标志物来检测急性肾损伤的诊断方法
WO2010143423A1 (ja) 糖尿病性腎症の検査方法
JP5221333B2 (ja) 意識障害患者における病態の検出方法及び検出用キット
Samoni et al. The relationship between intra-parenchymal renal resistive index variation and renal functional reserve in healthy subjects
JP4814788B2 (ja) 間質性膀胱炎の検査方法
WO2023068332A1 (ja) 腎臓病の原因障害を診断するためのデータを収集する方法および組成物
EP2775303B1 (en) Method for detecting chronic sinusitis
JP7190165B2 (ja) 慢性腎臓病罹患の可能性の判定のための方法
CN113514643B (zh) 剪接相关蛋白130用于特发性肺间质纤维化诊断和疾病严重程度评估
CN112285360A (zh) I-309在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用
JP4871173B2 (ja) 糖尿病性腎症患者の病態把握方法
CN112034189B (zh) 内皮素-1作为用于评价原发性慢性肾脏病患者无症状心血管器官损伤的标志物的应用
RU2814003C1 (ru) Способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии у больных с сахарным диабетом 2-го типа
CN112730850B (zh) 一种肾纤维化生物标志物及其应用
WO2022255348A1 (ja) 可溶型ｃｌｅｃ２を用いた急性脳血管障害のリスク評価方法
Abdelwahab et al. Studying the role of cadherin-11 as a novel biomarker of kidney fibrosis.
Othman Assessment of Cartilage Oligomeric Matrix Protein Biomarker for Laboratory Diagnosis of Hepatocellular Carcinoma
JP4464298B2 (ja) 尿中のｎ２，ｎ２−ジメチルグアノシン濃度測定による心疾患の診断方法
WO2022255349A1 (ja) 可溶型ｃｌｅｃ２を用いた出血性脳卒中のリスク評価法
Devi et al. Evaluate the Levels of Cardiac Troponin I in Saliva and Serum of Acute Myocardial Infarct Patients
Mao et al. Research progress on markers of urine tubular damage in idiopathic membranous nephropathy.
Elsayed et al. Incidence of acute kidney injury in infants with dextrotransposition of the great arteries after arterial switch operation (an observational cohort single-center study)
Harris et al. Clinical Application of Renal Biomarkers

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22883635

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2023554737

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE