CN112730850B - 一种肾纤维化生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肾纤维化生物标志物及其应用，所述肾纤维化生物标志物中包括RelB，或者包括RelB和HE4，可以监控患者纤维化的进展情况，并且该技术无论是单独检测还是与一些已报道的血清纤维化指标联合检测诊断都具有良好的敏感性和特异性，可以准确诊断早期肾纤维化的情况。

Description

一种肾纤维化生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物标志物技术领域，特别是涉及一种肾纤维化生物标志物及其应用。

背景技术

慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)影响全世界约10％成年人口的健康，是全球化的重大公共卫生问题。CKD的主要临床表现是肾脏功能的逐渐衰退，由于缺乏有效的早期诊断方法，大多数CKD患者确诊时仅剩1/3的肾脏可以正常工作；再加上缺乏有效阻止CKD发展的治疗药物，终末期肾病的患者只能靠透析或肾脏移植维持生命，给社会医疗带来巨大的经济负担。目前临床上广泛使用血清肌酐(serum creatinine，SCr)和肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)评估肾功能，并对CKD进行分级评定。但是，SCr和eGFR在CKD早期的变化不明显，且易受到其他疾病的影响，在CKD诊断，尤其是早期CKD诊断中存在固有缺陷。因此，开发易获取且有效的生物标志物用以辅助早期CKD的诊断具有十分重要的临床意义。

肾纤维化是大部分进行性肾脏疾病常见的病理特征，也是CKD临床诊断的重要指症。目前经皮肾脏穿刺活检术是测量肾脏纤维化的金标准，但是这种侵入性检查可能导致出血、感染等一系列并发症，更严重可导致患者休克甚至死亡，这使得穿刺活检不能随时随地并且反复重复进行。因此，开发有效易行的肾纤维化诊断方法亦对辅助早期CKD的诊断具有重要意义。

近二十年来，高通量组学技术极大地加速了生物标志物的研究。针对肾纤维化的新型生物标志物类型十分广泛，包括蛋白组学生物标志物、肾小管损伤标志物、与炎症和纤维化通路激活相关的蛋白、转录组学生物标志物、代谢组学生物标志物等。尿液作为肾脏疾病诊断的最佳检测对象是生物标志物研究最多的对象，相比而言，血液中有关CKD等肾脏疾病生物标志物的研究则很少。

血清肌酐以及肾小球滤过率等作为指标检测时，难以保证诊断的有效性及准确性，对CKD早期患者的检测灵敏度不足。

肾穿刺活检具有以下缺点：1、获取的组织较少：每次肾穿刺活检只能取少量肾组织，以防止其穿刺过多导致出血、感染等并发症；2、如果肾脏病变呈现局灶性或者分布不均，有可能因为出现偏差而导致医生误诊；3、术后可能留下创伤，容易加重血尿，严重者可以引发大出血导致死亡；4、肾穿刺可以明确肾病的病理类型，对于医生进行临床研究有一定帮助，但对于患者的临床治疗指导意义不大；5、禁忌症较多，很多患者不宜采用肾穿刺，例如孤立肾、腹水比较多的情况以及凝血功能有异常的患者往往是严禁行穿刺术的，另外肾感染积脓、肾盂肾炎、肾结核以及肾肿瘤等情况也是肾穿刺活检术的相对禁忌症。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种肾纤维化生物标志物及其应用。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

一种肾纤维化生物标志物，所述生物标志物包括RelB。

一种肾纤维化生物标志物，所述生物标志物包括RelB和HE4，RelB和HE4联合因子作为生物标志物。

在上述技术方案中，所述生物标志物指示肾纤维化程度。

在上述技术方案中，所述生物标志物指示慢性肾病的Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期。

检测RelB的试剂在制备肾纤维化诊断工具或在制备慢性肾病的分期诊断工具中的应用。

检测RelB和HE4的试剂在制备肾纤维化诊断工具或在制备慢性肾病的分期诊断工具中的应用。

在上述技术方案中，所述诊断工具为试剂盒、芯片或试纸。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.利用本肾纤维化生物标志物时，具有微创、可以在短时间内反复操作等特点，可以克服肾穿刺活检对患者创伤大、不能短期内反复穿刺等缺点，可以监控慢性肾病纤维化和疾病的进展情况，并且无论是利用RelB单独检测还是与一些已报道的血清纤维化指标联合检测诊断都具有良好的敏感性和特异性，可以准确诊断早期肾纤维化的情况。

2.为一些孤立肾、凝血异常、肾脓肿以及肾结核病人提供了一种更为安全的替代诊断方式。而且该技术可以在肾纤维化的早期检测到病情的发生，避免肾纤维化进入中晚期，抓住了肾纤维化早期的有利治疗时机，阻止肾脏病的恶化，远离透析。

附图说明

图1中A是是实施例1的流程图，B是实施例1的原理图。

图2中A是Masson三色染色和RelB免疫组化染色的显微照片，B是RelB蛋白的表达与CKD患者的肾纤维化程度的相关性分析，C是血清RelB与肾组织纤维化程度的相关性分析。

图3中A是血清RelB表达量与血肌酐(Scr)的相关性分析，B是血清RelB表达量与肾小球滤过率(eGFR)的相关性分析。

图4是血清RelB蛋白表达与HE4蛋白表达的相关性分析。

图5是利用ROC曲线对血清中RelB和HE4作为检测CKD患者严重程度的准确率进行分析评估。

图6是RelB(A)、HE4(B)或RelB-HE4(C)组合在鉴别CKD病人和正常人之间校准效果。

图7中A是RelB水平与SCr的相关性分析，B是RelB水平与eGFR的相关性分析。

图8是ROC分析检验CKDⅠ&Ⅱ期和CKDⅢ&Ⅳ期病人的鉴别能力。

图9是RelB或RelB-HE4组合在鉴别CKDⅠ&Ⅱ期和CKDⅢ&Ⅳ期病人的效果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

如图1中A和B，所示，

1、静脉抽血到EP管内，然后4℃，3000g离心除去血细胞，取上清血清液转移至新的EP管中；

2、用ELISA试剂盒(FineTest，EH1905)测定：

1)含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)清洗ELISA孔3遍；

2)前两列加入RelB蛋白的标准品，标准品按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和blank稀释浓度，浓度分别稀释为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625(ng/ml)。然后把病人血清样本按顺序加入ELISA剩余孔中，37℃孵育90分钟；

3)孵育完后甩去血清及标准品，PBST继续清洗3遍；

4)每个孔加入100μL生物素标记的抗体工作液，37℃孵育60分钟；

5)甩去生物素标记的抗体工作液，PBST继续清洗3遍；

6)每个孔加入100μL链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物工作液，37℃孵育30分钟；

7)甩去链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物工作液，PBST继续清洗5遍；

8)每个孔加入90μL四甲基联苯胺(TMB)，37℃孵育10分钟；

9)待TMB显色后，每孔加入50μL反应终止液，最后在450nm处酶标仪读取吸光值；

10)通过标准品的吸光值以及浓度计算病人血清中RelB的浓度，单位为pg/mL。

实施例2

2019年至2020年，从深圳市龙华区人民医院一共收集34例CKD患者肾活检标本，这34名患者中有15名CKD病人同时收集到了血样本，首先我们对34例肾活检标本进行Masson三色染色和RelB免疫组化染色。通过Masson三色染色，我们观察到不同肾脏活检标本中反映CKD患者肾纤维化程度的肾胶原沉积的差别。

图2中A为四张具有代表性的Masson三色染色和RelB免疫组化染色的显微照片。在这34例CKD患者肾活检标本中，我们发现RelB蛋白的表达与CKD患者的肾纤维化呈正相关(r＝0.6994，P<0.0001)，如图2中B所示。

对其中同时收集到肾组织和血样的15名患者进行分析，通过ELISA测量血清中RelB的表达量，发现血清RelB与肾组织纤维化程度也呈正相关，如图2中C所示。

再进一步加大血清样本量，分析了来自32位CKD患者和60位健康人的92份血清样本，通过ELISA检测了CKD患者和正常人血清中的RelB和HE4(一种已报道的可以检测肾纤维程度的血清指标)，进一步进行了血清RelB表达量与肾功能相关指数之间的相关性分析，发现RelB蛋白表达与血肌酐(Scr)正相关(r＝0.6913，p<0.0001)，而与肾小球滤过率(eGFR)负相关(r＝0.6024，p<0.0001)。如图3中A所示，而且进一步检测分析到血清RelB蛋白表达与HE4蛋白表达呈正相关(r＝0.4939，p<0.0001)，如图3中B所示，与已被报道的诊断纤维化的潜在血清学指标具有很高的相关性，可以进一步证明血清中RelB可以作为肾纤维化的预测指标。

进一步检测分析到血清RelB蛋白表达与HE4蛋白表达呈正相关(r＝0.4939，p<0.0001)，可以进一步证明血清中RelB可以作为肾纤维化的预测指标，如图4所示。

接着，我们使用接受者操作特征曲线(ROC曲线)对血清中RelB和HE4作为检测CKD患者严重程度的准确率进行分析评估。血清RelB的AUC-ROC(ROC曲线下的面积)为0.873，而血清HE4的AUC-ROC为0.849，血清RelB和HE4作为联合因子的AUC-ROC为0.920。ROC曲线分析表明，RelB可能是优于HE4的CKD肾纤维化生物标志物，并且联合血清HE4检测可以提高肾纤维化诊断的准确性。如图5所示，总之，血清RelB可被视为CKD导致的肾纤维化的潜在生物标志物。

CKD肾纤维化的生物标志物表现

Hosmer-Lemeshow试验进一步表明RelB或RelB-HE4组合在鉴别CKD病人和正常人之间具有较好的校准效果。如图6中A、B、C所示。

最后，进一步分析CKD不同分期患者中RelB与SCr、eGFR的相关性。同样的CKD患者血清中RelB水平与SCr呈正相关，与eGFR呈负相关，血清RelB水平也与血清HE4水平呈正相关。如图7中A、B所示。

如图8所示，ROC分析检验CKDⅠ&Ⅱ期和CKDⅢ&Ⅳ期病人的鉴别能力，发现RelB的ROC为0.817，HE4的ROC为0.520，RelB-HE4联合的ROC为0.823。

如图9中A、B、C所示，Hosmer-Lemeshow试验进一步表明RelB或RelB-HE4组合在鉴别CKDⅠ&Ⅱ期和CKDⅢ&Ⅳ期病人具有较好的校准效果。这些结果表明，血清RelB能较好地鉴别CKD患者的不同分期。

综上，血清RelB水平与CKD患者的肾纤维化严重程度呈正相关，可以同时反应纤维化和CKD的进程，所以血清RelB可作为肾纤维化及CKD的潜在生物标志物。

由此可见，检测RelB的试剂和方法可用于制备肾纤维化诊断工具，用于制备慢性肾病的分期诊断工具，所述诊断工具为试剂盒、芯片或试纸。更进一步的，可通过颜色深浅和荧光强弱等为基础的所述诊断工具，进行定性判断和定量检测，确定肾纤维化程度和慢性肾病进展分期。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.检测血清样品中的RelB的蛋白质表达水平的试剂在制备慢性肾病肾纤维化诊断工具或在制备慢性肾病的分期诊断工具中的应用，其特征在于，血清RelB蛋白表达水平与慢性肾病肾组织纤维化程度呈正相关，所述慢性肾病的分期指慢性肾病的Ⅰ期和Ⅱ期的鉴别，或者诊断慢性肾病的Ⅲ期和Ⅳ期的鉴别。

2.检测血清样品中的RelB和HE4的蛋白质表达水平的试剂在制备慢性肾病肾纤维化诊断工具或在制备慢性肾病的分期诊断工具中的应用，其特征在于，血清RelB蛋白表达水平与慢性肾病肾组织纤维化程度呈正相关，所述慢性肾病的分期指慢性肾病的Ⅰ期和Ⅱ期的鉴别，或者诊断慢性肾病的Ⅲ期和Ⅳ期的鉴别。

3.如权利要求1或2中的应用，其特征在于，所述诊断工具为试剂盒、芯片或试纸。

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