WO2023033151A1 - 変形性関節症の進行抑制剤及び進行抑制キット - Google Patents

変形性関節症の進行抑制剤及び進行抑制キット Download PDF

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WO2023033151A1
WO2023033151A1 PCT/JP2022/033150 JP2022033150W WO2023033151A1 WO 2023033151 A1 WO2023033151 A1 WO 2023033151A1 JP 2022033150 W JP2022033150 W JP 2022033150W WO 2023033151 A1 WO2023033151 A1 WO 2023033151A1
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WO
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inhibitor
group
progression
hyaluronic acid
osteoarthritis
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PCT/JP2022/033150
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English (en)
French (fr)
Inventor
康晴 中島
幸穂 赤▲崎▼
卓也 居石
政和 遠矢
正成 桑原
泰輔 内田
知明 筒井
秀俊 津嶋
Original Assignee
国立大学法人九州大学
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment

Definitions

  • the present invention relates to an agent for suppressing progression of osteoarthritis and a kit for suppressing progression of osteoarthritis.
  • Osteoarthritis is a disease in which cartilage degenerates and wears out.
  • knee osteoarthritis (hereinafter sometimes abbreviated as “knee OA”) affects the quality of life of the elderly. It is a typical disease that lowers (QOL) and threatens healthy life expectancy.
  • QOL lowers
  • ROAD Research on Osteoarthritis against Disability
  • Non-Patent Document 1 Current drug therapy for OA is mainly symptomatic therapy to relieve pain, and hyaluronic acid injections and steroid injections are commonly used clinically (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • G protein-coupled receptor kinase 5 (GRK5) is specifically highly expressed in OA cartilage to exacerbate cartilage degeneration due to catabolism by the NF- ⁇ B pathway, and that GRK5 inhibitors It has been revealed that intra-articular administration of 3. can be a disease-modifying OA therapeutic agent that can structurally suppress cartilage degeneration in OA (see, for example, Non-Patent Document 2 and Patent Document 1).
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides an osteoarthritis progression inhibitor and a progression inhibition kit that can inhibit progression of OA and have improved efficacy.
  • IL6 interleukin 6
  • MMP13 matrix metalloproteinase 13
  • ADAMTS4 disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4
  • the present invention includes the following aspects.
  • An agent for suppressing progression of osteoarthritis comprising a G protein-coupled receptor kinase 5 inhibitor and hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as active ingredients.
  • a kit for suppressing progression of osteoarthritis comprising:
  • the OA progress inhibitor and progress suppression kit of the above aspects can suppress the progress of OA and have improved effectiveness.
  • FIG. 1 is a graph showing the relative expression level of each gene involved in OA pathogenesis in human OA chondrocytes in Example 1.
  • FIG. FIG. 2 shows an administration schedule for OA model mice in Example 2.
  • FIG. 10 shows safranin O-fast green stained images of knee joint tissue sections of each group in Example 2.
  • FIG. Scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • 4 is a graph quantifying the severity of OA in each group in Example 2.
  • FIG. FIG. 10 shows an administration schedule for OA model mice in Example 3.
  • FIG. 10 is a safranin O-fast green stained image of a knee joint tissue section of a group in which amlexanox and hyaluronic acid were administered every 10 days for 8 weeks in Example 3.
  • FIG. Scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • 2 is a graph quantifying the severity of OA in each group in Example 3.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of measuring the pain threshold for pressure stimulation to joints in each group in Example 3.
  • the OA progression inhibitor of the present embodiment contains a GRK5 inhibitor and hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as active ingredients.
  • containing as active ingredients means containing therapeutically effective amounts of a GRK5 inhibitor and hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the inventors mixed the GRK5 inhibitor amlexanox with hyaluronic acid and let it act on human chondrocytes, resulting in IL6, an inflammatory cytokine, and MMP13, a proteolytic enzyme.
  • An effect of synergistically suppressing gene expression of ADAMTS4 was found.
  • a synergistic effect of structurally suppressing cartilage degeneration in OA was found by intra-articular administration of a mixture of amlexanox and hyaluronic acid to an animal model. It is presumed that this is because simultaneous administration of amlexanox and hyaluronic acid can slow the absorption of amlexanox from within the joint after intra-articular administration.
  • OA Ostoarthritis
  • the preventive or therapeutic agent for OA of the present embodiment is particularly preferably used for knee osteoarthritis.
  • OA is also divided into primary arthritis and secondary arthritis depending on the cause. Primary arthropathy is thought to be OA caused by factors such as obesity and aging, although the cause is not specified. Most knee osteoarthritis is primary arthritis.
  • secondary arthritis is OA that develops due to illness, injury, or the like.
  • causes include rheumatoid arthritis, gout, bone fractures, damage to ligaments and menisci, congenital abnormalities in joint structure, and the like.
  • Most hip osteoarthritis is secondary arthritis.
  • the preventive or therapeutic agent for OA of the present embodiment is particularly preferably used for primary arthritis.
  • GRK5 inhibitors include those that inhibit phosphorylation of I ⁇ B ⁇ by GRK5.
  • Specific examples of GRK5 inhibitors include low-molecular-weight compounds, GRK5 expression inhibitors, and GRK5-specific binding substances.
  • Low-molecular-weight compounds that are GRK5 inhibitors include, for example, compounds represented by the following general formula (I) (hereinafter sometimes referred to as "compound (I)").
  • Compound (I) is an example of GRK5 inhibitors, and GRK5 inhibitors are not limited thereto.
  • R 11 is a hydrogen atom, an alkyl group, a phenyl group, an amino group, a carboxy group, or a hydroxyl group.
  • Compound (I) is a 1-azaxanthone-3-carboxylic acid derivative. Compound (I) is described in detail below.
  • the benzene ring represented by ring A may be substituted.
  • substituents on ring A include halogen atoms, nitro groups, amino groups, mono- or dialkylamino groups, alkyl groups, alkoxy groups, carboxy groups, and hydroxyl groups.
  • substituents on ring A include halogen atoms, nitro groups, amino groups, mono- or dialkylamino groups, alkyl groups, alkoxy groups, carboxy groups, and hydroxyl groups.
  • substituents on ring A include halogen atoms, nitro groups, amino groups, mono- or dialkylamino groups, alkyl groups, alkoxy groups, carboxy groups, and hydroxyl groups.
  • the alkyl group may be chain-shaped or cyclic.
  • the chain alkyl group may be linear or branched.
  • the chain alkyl group preferably has 1 to 6 carbon atoms, and specific examples include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, A hexyl group and the like can be mentioned. Among them, a lower alkyl group having 1 or more and 3 or less carbon atoms is preferable from a practical point of view.
  • Cyclic alkyl groups include, for example, a cyclopentyl group and a cyclohexyl group.
  • Halogen atoms include, for example, chlorine, bromine, iodine, and fluorine atoms.
  • alkoxy groups include alkoxy groups in which the alkyl group portion is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, such as methoxy, ethoxy, propoxy, and butoxy.
  • Ring A may have one or more of these substituents, but preferably has one substituent. When having more than one substituent, the substituents may be the same or different. These substituents may be substituted at any position on ring A, but substitution at the 7-position of ring A is preferred.
  • R11 is a hydrogen atom, an alkyl group, a phenyl group, an amino group, a carboxy group or a hydroxyl group.
  • the alkyl group a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferable, and specific examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an n-hexyl group, and the like. be done.
  • R 11 is preferably an amino group.
  • preferred compounds (I) include compounds represented by the following general formula (I-1) (hereinafter sometimes abbreviated as "compound (I-1)").
  • Compound (I-1) is an example of preferred compound (I), and preferred compound (I) is not limited thereto.
  • R 111 is the same as R 11 above.
  • R 112 is a halogen atom, a nitro group, an amino group, a mono- or dialkylamino group, an alkyl group, an alkoxy group, a carboxy group, or hydroxyl group.
  • R111 is the same as R 11 above. Among them, R 111 is preferably an amino group.
  • R 112 is a halogen atom, nitro group, amino group, mono- or dialkylamino group, alkyl group, alkoxy group, carboxy group or hydroxyl group.
  • Examples of the halogen atom, mono- or dialkylamino group, alkyl group and alkoxy group include the same as those exemplified as the substituents of ring A above.
  • R 112 is preferably an alkyl group, more preferably a chain alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and still more preferably an isopropyl group.
  • Preferred compounds (I-1) include, for example, those in which R 111 is an amino group and R 112 is an alkyl group. More preferable compounds (I-1) include, for example, those in which R 111 is an amino group and R 112 is a chain alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • preferred compounds (I-1) include compounds represented by the following formula (I-1-1) (hereinafter sometimes referred to as "compound (I-1-1)"), and the like. be done.
  • Compound (I-1-1) is an example of preferred compound (I-1), and preferred compound (I-1) is not limited thereto.
  • Compound (I-1-1) is 2-amino-7-isopropyl-5-oxo-5H-[1]benzopyrano[2,3-b]-pyridine-3-carboxylic acid and has the generic name Amlexanox ).
  • Amlexanox shows a strong inhibitory effect on the histamine release reaction from IgE-related mast cells, and has an inhibitory effect on leukotriene synthesis from macrophages (SRS-A production inhibitory effect) and an antagonistic effect on leukotriene (SRS-A antagonistic effect). action), it is known to have strong anti-allergic and anti-inflammatory effects (Reference 1: Japanese Patent Laid-Open No. 111096/1988).
  • amlexanox is clinically used as an antiallergic agent in the form of nose drops, eye drops and tablets under the trade name "Solfa (registered trademark)” or the trade name "Elix (registered trademark)”.
  • Solfa registered trademark
  • Elix trade name
  • amlexanox selectively inhibits GRK5 (Reference 2: “Homan KT et al., “Identification and Characterization of Amlexanox as a GProtein-Coupled Receptor Kinase 5 Inhibitor.”, Molecules, Vol. 19, p16937-16949, 2014.”). Since amlexanox has been clinically used so far, it is considered to be highly safe, and is suitably used as a GRK5 inhibitor in the preventive or therapeutic agent for OA of the present embodiment.
  • the salt of compound (I) includes salts of inorganic acids and salts of organic acids, which are suitable for separating or crystallizing compound (I).
  • Specific examples of salts of compound (I) include organic amine salts, alkali metal salts, ammonium salts; pharmaceutically acceptable salts and the like.
  • Pharmaceutically acceptable salts of compound (I) include, for example, hydrochloride, bromate, sulfate, hydrogen sulfate, dihydrogen phosphate, methanesulfonate, methylsulfate, maleate, fumarate, 2-naphthalenesulfonate, benzenesulfonate, glycolate, gluconate, citrate, isethionate, para-toluenesulfonate and the like.
  • Compound (I) can be produced, for example, using the method shown below. That is, compound (I) can be obtained by reacting a compound represented by the following general formula (Ia) (hereinafter sometimes referred to as "compound (Ia)”) with an active methylene compound and hydrolyzing the compound. (See reference 2 above).
  • ring A may be substituted.
  • Active methylene compounds used in the reaction include, for example, methyl acetoacetate, ethyl acetoacetate, methyl cyanate, methyl cyanate, cyanoacetamide, malononitrile, ethyl oxaloacetate, diethyl malonate, dimethyl malonate, benzoyl Ethyl acetate, methyl-3-oxo-n-caproate and the like can be mentioned.
  • the amount of these active methylene compounds to be used is generally about 1 mol or more and 10 mol or less per 1 mol of compound (Ia).
  • the above reaction is generally desirably carried out in the presence of a base, and examples of the base used include organic amines.
  • organic amines include primary amines, secondary amines, tertiary amines, and heterocyclic bases.
  • Primary amines include, for example, n-butylamine, benzylamine, aniline and the like.
  • Secondary amines include, for example, diethylamine, dipropylamine, dibutylamine, piperidine, pyrrolidine, morpholine and the like.
  • Examples of tertiary amines include 1,8-diazabicyclo[5,4,0]-7-undecene and triethylamine.
  • Heterocyclic bases include, for example, imidazole, 2-methylimidazole and the like.
  • the amount of the base to be used is generally catalytic amount or more and 5 mol or less per 1 mol of compound (Ia).
  • the above reaction is generally preferably carried out in an organic solvent, and examples of solvents used include alcohols, aromatic hydrocarbons, dimethylformamide, and the like.
  • solvents used include alcohols, aromatic hydrocarbons, dimethylformamide, and the like.
  • alcohols include methanol, ethanol, propanol, butanol and the like.
  • aromatic hydrocarbons include benzene and toluene.
  • reaction temperature and reaction time there are no particular restrictions on other reaction conditions such as the reaction temperature and reaction time, but the reaction is generally carried out for about 1 hour to 24 hours at room temperature (about 25°C) or higher and below the temperature near the boiling point of the solvent used. be.
  • Compound (I) is obtained by hydrolyzing the compound obtained as described above.
  • a conventional acidic hydrolysis method is used.
  • sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, or the like is excessively used, and the acid alone or together with an organic solvent is usually heated at a temperature of 50° C. or higher and 150° C. or lower.
  • Organic solvents used for hydrolysis include, for example, organic acids and alcohols. Examples of organic acids include formic acid and acetic acid. Examples of alcohols include methanol, ethanol, propanol and the like.
  • the reaction time varies depending on the type of compound (I) of interest, but is usually about 1 hour or more and several days or less.
  • Compound (I) can also be produced, for example, by using the method shown below. That is, compound (I) can be obtained by reacting compound (Ia) with acetylene carboxylic acids and hydrolyzing the reaction product.
  • Acetylenecarboxylic acids used in the reaction include, for example, acetylenedicarboxylic acid dimethyl ester, acetylenedicarboxylic acid diethyl ester, and ethyl propiolate.
  • acetylenedicarboxylic acid dimethyl ester acetylenedicarboxylic acid diethyl ester
  • ethyl propiolate the intermediate aminoacrylate derivative can be isolated, but the ring closure reaction can be carried out without isolation.
  • the amount of these acetylene carboxylic acids to be used is generally about 1 mol or more and 10 mol or less per 1 mol of compound (Ia).
  • Organic amines are mentioned as a base used.
  • examples of organic amines include secondary amines, tertiary amines, heterocyclic bases and the like.
  • Secondary amines include, for example, piperidine, pyrrolidine, morpholine, diethylamine, dipropylamine, dibutylamine and the like.
  • Tertiary amines include, for example, triethylamine, tripropylamine, tributylamine and the like.
  • Heterocyclic bases include, for example, pyridine, quinoline, imidazole, 2-methylimidazole and the like. The amount of these bases to be used is usually from about catalytic amount to about 10 mol or less per 1 mol of compound (Ia).
  • the above reaction is generally preferably carried out in an organic solvent, and examples of solvents used include alcohols, aromatic hydrocarbons, dimethylformamide, and the like.
  • solvents used include alcohols, aromatic hydrocarbons, dimethylformamide, and the like.
  • alcohols include methanol, ethanol, propanol, butanol and the like.
  • aromatic hydrocarbons include benzene, toluene, and xylene.
  • reaction temperature reaction temperature, reaction time, etc.
  • reaction time reaction time, etc.
  • reaction is carried out for about 1 hour to 24 hours at room temperature or above the temperature near the boiling point of the solvent used.
  • Compound (I) is obtained by hydrolyzing the compound obtained as described above.
  • the conditions described above can be used.
  • compound (I) in which R 11 is a carboxy group is heated in the absence of a solvent at a temperature slightly higher than the temperature at which the decarboxylation reaction occurs, whereby compound (I) in which R 11 is a hydrogen atom is obtained. can get.
  • the organic amine salt of the compound (I) can be obtained by reacting the compound (I) with an organic amine, an alkali metal hydroxide, ammonia, or the like in a suitable solvent by a known method such as mixing and heating. , alkali metal or ammonium salts can be obtained.
  • GRK5 expression inhibitors include, for example, siRNA, shRNA, miRNA, ribozymes, antisense nucleic acids, low-molecular-weight compounds and the like.
  • siRNA, shRNA, miRNA, ribozymes By administering these GRK5 expression inhibitors, the expression level of GRK5 can be reduced, and NF- ⁇ B signaling can be suppressed.
  • NF- ⁇ B signaling As a result, the expression of inflammatory cytokines and substrate enzymes is suppressed, and progression of OA can be suppressed. That is, administration of these GRK5 expression inhibitors can prevent or treat OA.
  • siRNA small interfering RNA
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • siRNA is prepared by synthesizing sense strand and antisense strand oligonucleotides with an automatic DNA/RNA synthesizer, and denaturing them in an appropriate annealing buffer at 90° C. or higher and 95° C. or lower for about 1 minute. C. to 70.degree. C. for about 1 hour to 8 hours.
  • siRNAs, shRNAs, miRNAs, ribozymes and antisense nucleic acids may contain various chemical modifications in order to improve their stability and activity.
  • phosphate residues may be substituted with chemically modified phosphate residues such as phosphorothioates (PS), methylphosphonates, phosphorodithionates, etc., to prevent degradation by hydrolases such as nucleases.
  • PS phosphorothioates
  • methylphosphonates methylphosphonates
  • phosphorodithionates etc.
  • at least a part thereof may be composed of a nucleic acid analogue such as a peptide nucleic acid (PNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • GRK5-specific binding substances include those that specifically bind to GRK5 and inhibit the function of GRK5, such as antibodies, antibody fragments, and aptamers.
  • Antibodies can be produced, for example, by immunizing an animal such as a mouse with GRK5 protein or a fragment thereof as an antigen. Alternatively, it can be generated, for example, by screening a phage library.
  • Antibody fragments include Fv, Fab, scFv and the like.
  • said antibody is a monoclonal antibody. Alternatively, it may be a commercially available antibody.
  • An aptamer is a substance that has specific binding ability to a target substance.
  • Aptamers include nucleic acid aptamers, peptide aptamers, and the like.
  • Nucleic acid aptamers having specific binding ability to the target peptide can be selected by, for example, systematic evolution of ligand by exponential enrichment (SELEX) method.
  • Peptide aptamers having specific binding ability to the target peptide can be selected by, for example, the two-hybrid method using yeast.
  • Hyaluronic acid is basically a disaccharide or more containing at least one disaccharide unit in which the 1-position of ⁇ -D-glucuronic acid and the 3-position of ⁇ -DN-acetylglucosamine are bonded. And if it is basically composed of ⁇ -D-glucuronic acid and ⁇ -DN-acetylglucosamine, those elements are bound to one or more disaccharide units bound Also, derivatives thereof, such as those having a hydrolyzable protective group such as an acyl group, may be used.
  • the saccharide may be an unsaturated saccharide, and examples of unsaturated saccharides include non-reducing terminal saccharides, which are usually unsaturated between the 4 and 5-position carbons of glucuronic acid.
  • hyaluronic acid specifically, those extracted from natural products such as animals, those obtained by culturing microorganisms, those synthesized chemically or enzymatically, etc. can be used.
  • natural products such as animals, those obtained by culturing microorganisms, those synthesized chemically or enzymatically, etc.
  • it can be obtained from biological tissues such as rooster's comb, cyst, skin, synovial fluid and the like by known extraction and purification methods. It can also be produced by a fermentation method using bacteria belonging to the genus Streptococcus.
  • Hyaluronic acid also includes hyaluronan oligosaccharides, from low-molecular-weight hyaluronic acids such as disaccharides and derivatives thereof consisting of one disaccharide unit to high-molecular-weight hyaluronic acids with a weight-average molecular weight of about 4,000,000. can be done.
  • Hyaluronic acid having a weight-average molecular weight of about 380 to 4000,000 is preferred, and hyaluronic acid having a weight-average molecular weight of about 2 to 20 sugars is more preferred because of its excellent tissue permeability.
  • Hyaluronic acid with a low molecular weight can be obtained by a known method such as an enzymatic decomposition method, an alkaline decomposition method, a heat treatment method, an ultrasonic treatment method, or a chemical or enzymatic method. It can be produced by a method of synthetically synthesizing.
  • enzymatic decomposition methods include hyaluronidase (hyaluronidase (derived from testis), hyaluronidase (derived from Streptomyces), hyaluronidase SD, etc.), chondroitinase AC, chondroitinase ACII, chondroitinase ACIII, chondroitinase ABC, etc. and a method of producing hyaluronan oligosaccharides by allowing an enzyme that decomposes hyaluronic acid to act on hyaluronan.
  • a base such as sodium hydroxide of about 1N is added to a solution of hyaluronic acid, heated for several hours to reduce the molecular weight, and then neutralized by adding an acid such as hydrochloric acid. and a method for obtaining low-molecular-weight hyaluronic acid.
  • Hyaluronic acid includes salt forms, and pharmaceutically acceptable salts thereof can be used according to pharmaceutical needs.
  • examples include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts, amine salts such as tri(n-butyl)amine salts, triethylamine salts, pyridine salts and amino acid salts. be done.
  • hyaluronic acid that is clinically used includes, for example, Artzdispo (purified sodium hyaluronate, weight average molecular weight of 500,000 to 1,200,000), Suvenyl (purified sodium hyaluronate, weight average molecular weight of 1,500,000 to 3,900,000 ) and the like.
  • the above-mentioned GRK5 inhibitor and the above-mentioned hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be in the form of a mixture thereof, or the above-mentioned GRK5 inhibitor and the above-mentioned hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Pharmaceutically acceptable salts may be in the form of kits, which are separately sealed in containers and reconstituted before use. That is, in one embodiment, the present invention provides an osteoarthritis progression suppression kit comprising a GRK5 inhibitor and hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • ⁇ Pharmaceutical composition The agent for suppressing progression of OA of the present embodiment can be combined with a pharmaceutically acceptable carrier to prepare a pharmaceutical composition for suppressing progression of OA.
  • the progression of OA can be suppressed, and the efficacy is improved as compared with administration of a GRK5 inhibitor alone.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment may be in a dosage form for oral use or may be in a dosage form for parenteral use, but a dosage form for parenteral use is preferred.
  • Dosage forms for oral use include, for example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like.
  • Dosage forms for parenteral use include, for example, injections, ointments, patches and the like.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, and gum arabic
  • excipients such as starch and crystalline cellulose
  • swelling agents such as alginic acid
  • solvents for injections such as water, ethanol, and glycerin
  • Adhesives such as rubber-based adhesives and silicone-based adhesives are included.
  • the pharmaceutical composition may contain additives.
  • Additives include lubricants such as calcium stearate and magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin, and maltitol; flavoring agents such as peppermint and red oil; stabilizers such as benzyl alcohol and phenol; buffers such as salts and sodium acetate; solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol; antioxidants; preservatives and the like.
  • lubricants such as calcium stearate and magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin, and maltitol
  • flavoring agents such as peppermint and red oil
  • stabilizers such as benzyl alcohol and phenol
  • buffers such as salts and sodium acetate
  • solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol
  • antioxidants preservatives and the like.
  • the pharmaceutical composition is formulated by appropriately combining the OA progression inhibitor, the pharmaceutically acceptable carrier and additive, and mixing them in a unit dosage form generally accepted for pharmaceutical practice. be able to.
  • the pharmaceutical composition may be used in combination with at least one selected from the group consisting of therapeutic agents having anti-inflammatory effects other than the above-mentioned OA progression inhibitors and therapeutic agents for other diseases.
  • the OA progress inhibitor and the other drug may be prepared in the same formulation or in separate formulations.
  • each formulation may be administered via the same administration route or via separate administration routes.
  • each formulation may be administered simultaneously, sequentially, or separately with a certain time or period of time between them.
  • the OA progression inhibitor and other drug may be provided as a kit containing them.
  • Subjects to be administered include, but are not limited to, humans, monkeys, dogs, cows, horses, sheep, pigs, rabbits, mice, rats, guinea pigs, hamsters, and cells thereof. Among them, mammals or mammalian cells are preferred, and humans or human cells are particularly preferred.
  • the route of administration is preferably a parenteral route such as subcutaneous administration, transdermal administration, intramuscular administration, or intra-articular administration, and intra-articular administration is particularly preferred.
  • the dosage of the OA progression inhibitor varies depending on the types of the GRK5 inhibitor and hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, the symptoms of the subject of administration, the site of administration, the method of administration, and the like.
  • a person skilled in the art can appropriately select an appropriate dosage. , usually about 0.001 mg to 10 mg, preferably about 0.01 mg to 5 mg, more preferably about 0.02 mg to 2 mg.
  • Hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof is generally about 0.08 mg or more and about 800 mg or less, and about 0.8 mg or more and about 400 mg or less per day for an adult (with a body weight of 60 kg). is preferred, and about 1.6 mg or more and 100 mg or less is more preferred.
  • one syringe (2.5 mL) (containing about 25 mg of purified sodium hyaluronate) is administered, so hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof It can be administered in the range of 25 mg or more or 25 mg or less per administration.
  • the OA progress inhibitor may be administered in a single dose or in multiple doses. In the case of multiple administration, for example, every 2 hours or more and 12 hours or less, every day, or once every 2 days, 5 days, 1 week, 1.5 weeks, several weeks, 1 month or several months etc. can be administered.
  • one syringe 25 mg of purified sodium hyaluronate once
  • administration is performed at intervals of 2 weeks or more and 4 weeks or less.
  • the present invention provides a method for preventing and treating OA, comprising administering an effective amount of a GRK5 inhibitor and hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a patient or patient in need of treatment.
  • a method or method of inhibiting progression is provided.
  • GRK5 inhibitors and hyaluronic acid or pharmaceutically acceptable salts thereof include those similar to those described above.
  • OA the same thing as the above-mentioned thing is mentioned.
  • the present invention provides a GRK5 inhibitor and hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preventing, treating, or suppressing progression of OA.
  • GRK5 inhibitors and hyaluronic acid or pharmaceutically acceptable salts thereof include those similar to those described above.
  • OA the same thing as the above-mentioned thing is mentioned.
  • the present invention provides use of a GRK5 inhibitor and hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof for producing an OA progression inhibitor.
  • GRK5 inhibitors and hyaluronic acid or pharmaceutically acceptable salts thereof include those similar to those described above.
  • OA the same thing as the above-mentioned thing is mentioned.
  • mice C57BL/6J mice (hereinafter sometimes referred to as “wild-type mice”) were purchased from Charles River Japan.
  • GRK5 knockout (KO) mice GRK5 ⁇ / ⁇ mice were obtained from Dr. Kurose (Kyushu University Faculty of Pharmaceutical Sciences). There were no significant differences in growth plate and cartilage thickness, body weight, appearance, etc. between wild-type mice and GRK5KO mice, and there was no difference in development. Immature chondrocytes were harvested from 5-day-old mouse knees.
  • Example 1 (Synergistic inhibitory effect on IL6, MMP13 and ADAMTS4 expression in human chondrocytes by co-administration of amlexanox and hyaluronic acid) Amlexanox (concentration in medium: 100 ⁇ M) and hyaluronic acid (concentration in medium: 1 mg/mL, weight average molecular weight: 500,000 to 1,490,000) were added to human OA chondrocytes and incubated for 48 hours.
  • hyaluronic acid alone did not significantly reduce the expression of IL6, MMP13 and ADAMTS4 (control ratio: 96.6%, 90.13%, 76.84%).
  • Administration of amlexanox alone significantly reduced the expression of all IL6, MMP13 and ADAMTS4 (control ratio: 32.99%, 43.83%, 42.04%).
  • Co-administration of amlexanox and hyaluronic acid increased IL6, MMP13 and ADAMTS4 by 10.58%, 26.25%, 18.95% compared to control and 32.07%, 59.89%, 45.08% compared to amlexanox alone.
  • Significant suppression of expression was observed, indicating a synergistic effect.
  • Example 2 (Synergistic inhibitory effect on progression of cartilage degeneration in osteoarthritis by intra-articular simultaneous administration of amlexanox and hyaluronic acid 1)
  • OA was induced by dissecting the ligament that anchors the medial meniscus to the tibia of 12-week-old male mice (wild-type and GRK5KO mice) to create instability in the knee joint (DMM model).
  • DMM group mice were also prepared by sham surgery using the same method without ligament dissection (hereinafter sometimes referred to as "sham-operated group”).
  • the group administered physiological saline (10 ⁇ L) every 5 days for 8 weeks, the group administered hyaluronic acid solution (10 mg/mL, 10 ⁇ L), the group administered amlexanox solution (100 ⁇ M, 10 ⁇ L ), and a group (10 ⁇ L) administered with a mixed solution of amlexanox (100 ⁇ M) and hyaluronic acid (10 mg/mL) (see FIG. 2A). Sections of knee joint tissue in each group at 8 weeks after OA-induced surgery were stained with Safranin O. The results are shown in FIG. 2B (stained image).
  • amlexanox is a low-molecular-weight compound with a molecular weight of 300 and a half-life in the joint of several hours. It was considered that co-administration of amlexanox and hyaluronic acid resulted in sustained efficacy, and that amlexanox alone was more effective in the mouse model.
  • Example 3 (Synergistic inhibitory effect on progression of cartilage degeneration in osteoarthritis by intra-articular simultaneous administration of amlexanox and hyaluronic acid 2)
  • OA-induced mice were administered a mixed solution of amlexanox (100 ⁇ M) and hyaluronic acid (10 mg/mL) every 10 days for 8 weeks (see FIG. 3A).
  • Sections of knee joint tissue in each group at 8 weeks after OA-induced surgery were stained with Safranin O. The results are shown in FIG. 3B (stained image).
  • FIG. 3C also shows the results of the four groups investigated in Example 2.
  • the co-administration of the GRK5 inhibitors amlexanox and hyaluronic acid has a synergistic effect on suppressing the progression of OA, and it can be a disease-modifying therapeutic agent for OA that has the effect of suppressing the progression of cartilage degeneration, which does not yet exist. Since hyaluronic acid alone does not have an OA progression inhibitory effect, the above results can be said to be a novel effect of hyaluronic acid that can enhance the effect of a GRK5 inhibitor (Amlexanox).
  • the progression of OA can be suppressed, and the efficacy is improved compared to administration of a GRK5 inhibitor alone.

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Abstract

変形性関節症の進行抑制剤は、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ５阻害剤と、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩と、を有効成分として含有する。前記Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ５阻害剤がアンレキサノクスであってもよい。前記変形性関節症の進行抑制剤は、関節内注射により投与されてもよい。変形性関節症の進行抑制キットは、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ５阻害剤と、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩と、を備える。

Description

変形性関節症の進行抑制剤及び進行抑制キット
　本発明は、変形性関節症の進行抑制剤及び進行抑制キットに関する。
　本願は、２０２１年９月６日に、日本に出願された特願２０２１－１４４７０２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　変形性関節症（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＯＡ）は、軟骨が変性及び摩耗する病気であり、中でも、変形性膝関節症（以下、「膝ＯＡ」と略記する場合がある）は、高齢者の生活の質（ＱＯＬ）を低下させ、健康寿命を脅かす代表的な疾患である。２０１０年時点で、日本国内における膝ＯＡの有症状患者数は８００万人と推定されている（ＲＯＡＤ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）プロジェクト調べ）。
　現在のＯＡに対する薬物療法は、疼痛を和らげる対症療法が主体であり、ヒアルロン酸注射やステロイド注射が臨床で一般的に行われている（例えば、非特許文献１参照）。
　発明者らは、これまでにＧタンパク質共役型受容体キナーゼ５（ＧＲＫ５）が、ＯＡ軟骨に特異的に高発現してＮＦ－κＢ経路による異化反応による軟骨変性を増悪させること、さらにＧＲＫ５阻害剤の関節内投与は、ＯＡにおける軟骨変性を構造的に抑制できる疾患修飾ＯＡ治療薬となりうることを明らかにしている（例えば、非特許文献２及び特許文献１等参照）。
　ヒアルロン酸注射は、抗炎症効果があるとの報告もされているが、根本的な治療法ではない。ステロイド注射は、炎症抑制効果に非常に優れるが、副作用の観点から使用可能な患者が限られ、頻回使用することができない。
　また、特許文献１や非特許文献２に記載のＧＲＫ５阻害剤を用いた治療法において、注射による患者への負担を減らすために、使用頻度を低減し、有効性を向上させる面で改良の余地がある。
日本国特開２０２０－１２１９５７号公報
川口　浩著、「変形性関節症治療の国内外のガイドライン」、日本関節病学会誌、３５巻、１号、第１～９頁、２０１６年。 Sueishi T et al., "GRK5 Inhibition Attenuates Cartilage Degradation via Decreased NF-κB Signaling.", Arthritis and Rheumatology, Vol. 72, No. 4, pp. 620-631, 2020.
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ＯＡの進行を抑制でき、有効性が向上した変形性関節症の進行抑制剤及び進行抑制キットを提供する。
　発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒアルロン酸とＧＲＫ５阻害剤とを同時に投与することにより、ＧＲＫ５阻害剤の単独投与よりも、ＯＡ病態形成に関わる代表的な炎症系サイトカインであるインターロイキン６（ＩＬ６）、及び基質分解酵素であるＭａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　１３（ＭＭＰ１３）、及びａ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｍｏｔｉｆｓ　４（ＡＤＡＭＴＳ４）のｍＲＮＡの発現を有意に抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１）　Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ５阻害剤と、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩と、を有効成分として含有する、変形性関節症の進行抑制剤。
（２）　前記Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ５阻害剤がアンレキサノクスである、（１）に記載の変形性関節症の進行抑制剤。
（３）　関節内注射により投与される、（１）又は（２）に記載の変形性関節症の進行抑制剤。
（４）　Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ５阻害剤と、
　ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩と、
を備える、変形性関節症の進行抑制キット。
　上記態様のＯＡの進行抑制剤及び進行抑制キットは、ＯＡの進行を抑制でき、有効性が向上している。
実施例１におけるヒトＯＡ軟骨細胞でのＯＡの病態形成に関わる各遺伝子の相対発現量を示すグラフである。 実施例２におけるＯＡモデルマウスへの投与スケジュールを示す図である。 実施例２における各群の膝関節組織切片のサフラニンＯ－ファストグリーン染色像である。スケールバーは１００μｍを示す。 実施例２における各群のＯＡの重症度を定量化したグラフである。 実施例３におけるＯＡモデルマウスへの投与スケジュールを示す図である。 実施例３における１０日おきに８週間アンレキサノクス及びヒアルロン酸を投与した群の膝関節組織切片のサフラニンＯ－ファストグリーン染色像である。スケールバーは１００μｍを示す。 実施例３における各群のＯＡの重症度を定量化したグラフである。 実施例３における各群の関節への圧刺激に対する痛みの閾値を測定した結果を示すグラフである。
≪ＯＡの進行抑制剤≫
　本実施形態のＯＡの進行抑制剤は、ＧＲＫ５阻害剤と、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩と、を有効成分として含有する。
　なお、本明細書において、「有効成分として含有する」とは、治療的に有効量のＧＲＫ５阻害剤及びヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩をそれぞれ含有することを意味する。
　発明者らは、後述する実施例に示すように、ＧＲＫ５阻害剤であるアンレキサノクスとヒアルロン酸を混合してヒト軟骨細胞に作用させることによって、炎症性サイトカインであるＩＬ６や蛋白分解酵素であるＭＭＰ１３及びＡＤＡＭＴＳ４の遺伝子発現を相乗的に抑制する効果を見出した。さらに、アンレキサノクスとヒアルロン酸を混合して動物モデルに関節内投与することによって、ＯＡにおける軟骨変性を構造的に抑制する相乗効果を見出した。これは、アンレキサノクスとヒアルロン酸とを同時に投与することにより、関節内投与後のアンレキサノクスの関節内からの吸収を緩徐にすることができるためであると推察される。
　なお、ＯＡ（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；変形性関節症）は、全身のあらゆる関節に起こり得る。特にＯＡの発症によりＱＯＬの低下に繋がり、健康寿命を脅かす可能性が高い部位は、体を支える役割を担い、体重の負荷が大きい関節であり、具体的には、膝関節、股関節、脊椎等が挙げられ、それぞれ、変形性膝関節症（膝ＯＡ）、変形性股関節症、変形性脊椎症と呼ばれる。中でも、本実施形態のＯＡの予防又は治療剤は、変形性膝関節症に対して特に好適に用いられる。
　また、ＯＡは、その原因によって、一次性関節症と二次性関節症とに分けられる。一次性関節症は、原因は特定されていないが、肥満や加齢等の要因により発病したＯＡであると考えられている。変形性膝関節症の多くは、一次性関節症である。一方、二次性関節症は、病気やケガ等が原因で発症するＯＡである。発症原因として具体的には、例えば、関節リウマチ、痛風、骨折、靭帯や半月板の損傷、先天性の関節構造の異常等が挙げられる。変形性股関節症の多くは、二次性関節症である。中でも、本実施形態のＯＡの予防又は治療剤は、一次性関節症に対して特に好適に用いられる。
＜ＧＲＫ５阻害剤＞
　ＧＲＫ５阻害剤としては、ＧＲＫ５によるＩκＢαのリン酸化を阻害するものが挙げられる。ＧＲＫ５阻害剤として具体的には、例えば、低分子化合物、ＧＲＫ５発現阻害剤、ＧＲＫ５特異的結合物質等が挙げられる。
［低分子化合物］
　ＧＲＫ５阻害剤である低分子化合物としては、例えば、下記一般式（Ｉ）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ）」と称する場合がある）等が挙げられる。化合物（Ｉ）は、ＧＲＫ５阻害剤の一例であり、ＧＲＫ５阻害剤はこれに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（一般式（Ｉ）中、環Ａは置換されていてもよい。Ｒ１１は、水素原子、アルキル基、フェニル基、アミノ基、カルボキシ基又は水酸基である。）
（化合物（Ｉ））
　化合物（Ｉ）は、１－アザキサントン－３－カルボン酸誘導体である。化合物（Ｉ）について、以下に詳細を説明する。
・環Ａ
　環Ａで示されるベンゼン環は置換されていてもよい。環Ａの置換基としては、例えば、ハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基、アルキル基、アルコキシ基、カルボキシ基、水酸基等が挙げられる。また、置換基としては、環Ａにおける６、７、８又は９位に存在する置換基のうち、隣接する２つの、炭素原子からなる置換基同士がベンゼン環を形成するブタジエニレン基（－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－）であってもよい。
　前記アルキル基としては、鎖状であってもよく、環状であってもよい。鎖状アルキル基としては、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。鎖状アルキル基は、炭素数１以上６以下のものが好ましく、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。中でも、実用上から、炭素数１以上３以下の低級アルキル基が好ましい。環状アルキル基としては、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
　ハロゲン原子としては、例えば、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、フッ素原子等が挙げられる。
　モノ又はジアルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基等の炭素数１以上３以下程度の低級アルキル基に置換されたアミノ基が挙げられる。
　アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基等のアルキル基の部分が炭素数１以上４以下のアルキル基であるアルコキシ基が挙げられる。
　環Ａは、これらの置換基を１つ又は２つ以上有していてもよいが、中でも、１つ有することが好ましい。２つ以上の置換基を有する場合、置換基は同一であってもよく、異なっていてもよい。また、これらの置換基は環Ａの任意の位置に置換していてよいが、中でも、環Ａの７位に置換していることが好ましい。
・Ｒ１１
　Ｒ１１は、水素原子、アルキル基、フェニル基、アミノ基、カルボキシ基又は水酸基である。前記アルキル基としては、炭素数１以上６以下の直鎖状のアルキル基が好ましく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ヘキシル基等が挙げられる。
　中でも、Ｒ１１としては、アミノ基が好ましい。
　好ましい化合物（Ｉ）として具体的には、例えば、下記一般式（Ｉ－１）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ－１）」と略記する場合がある）等が挙げられる。なお、化合物（Ｉ－１）は、好ましい化合物（Ｉ）の一例であり、好ましい化合物（Ｉ）はこれに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（一般式（Ｉ－１）中、Ｒ１１１は、上記Ｒ１１と同じである。Ｒ１１２は、ハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、モノ若しくはジアルキルアミノ基、アルキル基、アルコキシ基、カルボキシ基又は水酸基である。）
・Ｒ１１１
　Ｒ１１１は、上記Ｒ１１と同じである。中でも、Ｒ１１１としては、アミノ基が好ましい。
・Ｒ１１２
　Ｒ１１２は、ハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、モノ若しくはジアルキルアミノ基、アルキル基、アルコキシ基、カルボキシ基又は水酸基である。ハロゲン原子、モノ若しくはジアルキルアミノ基、アルキル基及びアルコキシ基としては、上記環Ａの置換基として例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、Ｒ１１２としては、アルキル基が好ましく、炭素数１以上３以下の鎖状アルキル基がより好ましく、イソプロピル基がさらに好ましい。
　好ましい化合物（Ｉ－１）としては、例えば、Ｒ１１１がアミノ基であり、Ｒ１１２がアルキル基であるもの等が挙げられる。
　より好ましい化合物（Ｉ－１）としては、例えば、Ｒ１１１がアミノ基であり、Ｒ１１２が炭素数１以上３以下の鎖状アルキル基であるもの等が挙げられる。
　好ましい化合物（Ｉ－１）として具体的には、例えば、下記式（Ｉ－１－１）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ－１－１）」と称する場合がある）等が挙げられる。なお、化合物（Ｉ－１－１）は、好ましい化合物（Ｉ－１）の一例であり、好ましい化合物（Ｉ－１）はこれに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　化合物（Ｉ－１－１）は、２－アミノ－７－イソプロピル－５－オキソ－５Ｈ－［１］ベンゾピラノ［２，３－ｂ］－ピリジン－３－カルボン酸であり、一般名アンレキサノクス（Ａｍｌｅｘａｎｏｘ）と称される。アンレキサノクス（Ａｍｌｅｘａｎｏｘ）は、ＩｇＥ関与の肥満細胞からのヒスタミン遊離反応に対し強い抑制作用を示し、マクロファージからのロイコトリエン合成に対する抑制作用（ＳＲＳ－Ａ生成抑制作用）及びロイコトリエンに対する拮抗作用（ＳＲＳ－Ａ拮抗作用）を有することにより、強力な抗アレルギー作用、抗炎症作用を有することが知られている（参考文献１：「特開昭５３－１１１０９６号公報」参照）。また、アンレキサノクスは、抗アレルギー剤として商品名「ソルファ（登録商標）」又は商品名「エリックス（登録商標）」にて、点鼻薬、点眼薬や錠剤の形態で、臨床上で使用されている。近年、アンレキサノクスがＧＲＫ５を選択的に阻害することが報告されている（参考文献２：「Homan KT et al., “Identification and Characterization of Amlexanox as a GProtein-Coupled Receptor Kinase 5 Inhibitor.”, Molecules, Vol. 19, p16937-16949, 2014.」参照）。アンレキサノクスは、これまで臨床上で使用されていることから、安全性が高いものと考えられ、本実施形態のＯＡの予防又は治療剤において、ＧＲＫ５阻害剤として好適に用いられる。
　また、化合物（Ｉ）の塩としては、無機酸の塩、有機酸の塩であって、化合物（Ｉ）の分離又は結晶化に適切な塩が挙げられる。化合物（Ｉ）の塩として具体的には、例えば、有機アミン塩、アルカリ金属塩、アンモニウム塩；薬学的に許容しうる塩等が挙げられる。
　化合物（Ｉ）の薬学的に許容しうる塩としては、例えば、塩酸塩、臭素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸二水素塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、イセチオン酸塩、パラ－トルエンスルホン酸塩等が挙げられる。
（化合物（Ｉ）の製造方法）
　化合物（Ｉ）は、例えば、以下に示す方法を用いて製造することができる。
　すなわち、下記一般式（Ｉａ）に示される化合物（以下、「化合物（Ｉａ）」と称する場合がある）に、活性メチレン化合物を反応させ、加水分解することにより化合物（Ｉ）を得ることができる（上記参考文献２、参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（一般式（Ｉａ）中、環Ａは置換されていてもよい。）
　反応に用いられる活性メチレン化合物としては、例えば、アセト酢酸メチル、アセト酢酸エチル、シアン酸メチル、シアン酸メチル、シアノアセトアミド、マロンニトリル、オキサロ酢酸エチルエステル、マロン酸ジエチルエステル、マロン酸ジメチルエステル、ベンゾイル酢酸エチル、メチル－３－オキソ－ｎ－カプロエート等が挙げられる。これらの活性メチレン化合物の使用量は、通常化合物（Ｉａ）１モルに対して、１モル以上１０モル以下程度である。
　上記反応は、一般に塩基の存在下で行われることが望ましく、用いられる塩基としては、有機アミン類が挙げられる。有機アミン類として具体的には、例えば、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、複素環塩基等が挙げられる。第一級アミンとしては、例えば、ｎ－ブチルアミン、ベンジルアミン、アニリン等が挙げられる。第二級アミンとしては、例えば、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、ピペリジン、ピロリジン、モルホリン等が挙げられる。第三級アミンとしては、例えば、１，８－ジアザビシクロ［５，４，０］－７－ウンデセン、トリエチルアミン等が挙げられる。複素環塩基としては、例えば、イミダゾール、２－メチルイミダゾール等が挙げられる。塩基の使用量は、通常化合物（Ｉａ）１モルに対して、触媒量以上５モル以下である。
　上記反応は、一般に有機溶媒中で行われることが好ましく、用いられる溶媒としては、例えば、アルコール類、芳香族炭化水素類、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等が挙げられる。芳香族炭化水素類としては、例えば、ベンゼン、トルエン等が挙げられる。
　反応温度、反応時間等、その他反応条件に特に制限はないが、室温（２５℃程度）以上用いた溶媒の沸点付近の温度以下で、約１時間以上２４時間以下程度反応させるのが一般的である。
　以上のようにして得られる化合物を加水分解することにより、化合物（Ｉ）が得られる。加水分解の条件としては、通常の酸性加水分解法が用いられる。例えば、硫酸、塩酸、リン酸等を過剰に用い、その酸のみで、或いは、有機溶媒と共に、通常、５０℃以上１５０℃以下の温度で加熱することにより行われる。加水分解に用いられる有機溶媒としては、例えば、有機酸類、アルコール類等が挙げられる。有機酸類としては、例えば、ギ酸、酢酸等が挙げられる。アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。反応時間は、目的とする化合物（Ｉ）の種類により異なるが、通常１時間以上数日間以下程度である。
　また、化合物（Ｉ）は、例えば、以下に示す方法を用いても製造することができる。
　すなわち、化合物（Ｉａ）に、アセチレンカルボン酸類を反応させて、加水分解することにより化合物（Ｉ）を得ることができる。
　反応に用いられるアセチレンカルボン酸類としては、例えば、アセチレンジカルボン酸ジメチルエステル、アセチレンジカルボン酸ジエチルエステル、プロピオール酸エチル等が挙げられる。プロピオール酸エチルを用いる場合には、中間に生じるアミノアクリレート誘導体を単離することもできるが、単離せずにそのまま閉環反応を行うことができる。これらのアセチレンカルボン酸類の使用量は、通常化合物（Ｉａ）１モルに対して、１モル以上１０モル以下程度である。
　上記反応は、一般に塩基の存在下で行われることが望ましい。用いられる塩基としては、有機アミン類が挙げられる。有機アミン類としては、例えば、第二級アミン、第三級アミン、複素環塩基等が挙げられる。第二級アミンとしては、例えば、ピペリジン、ピロリジン、モルホリン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン等が挙げられる。第三級アミンとしては、例えば、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン等が挙げられる。複素環塩基としては、例えば、ピリジン、キノリン、イミダゾール、２－メチルイミダゾール等が挙げられる。これら塩基の使用量は、通常化合物（Ｉａ）１モルに対して、触媒量以上１０モル以下程度である。
　上記反応は、一般に有機溶媒中で行われることが好ましく、用いられる溶媒としては、例えば、アルコール類、芳香族炭化水素類、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等が挙げられる。芳香族炭化水素類としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等が挙げられる。
　反応温度、反応時間等、その他反応条件に特に制限はないが、室温以上用いた溶媒の沸点付近の温度以下で、約１時間以上２４時間以下程度反応させるのが一般的である。
　以上のようにして得られる化合物を加水分解することにより、化合物（Ｉ）が得られる。加水分解の条件としては、上記に記載の条件を用いることができる。
　また、Ｒ１１がカルボキシ基である化合物（Ｉ）を、脱炭酸反応を起こす温度よりもやや高めの温度で、無溶媒のまま加熱することにより、Ｒ１１が水素原子である化合物（Ｉ）が得られる。
　また、化合物（Ｉ）と、有機アミン類、アルカリ金属の水酸化物又はアンモニア等とを適宜溶媒中で混合及び加熱する等の公知の方法で反応させることで、化合物（Ｉ）の有機アミン塩、アルカリ金属塩又はアンモニウム塩を得ることができる。
［ＧＲＫ５発現阻害剤］
　ＧＲＫ５発現阻害剤としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、低分子化合物等が挙げられる。これらのＧＲＫ５発現阻害剤を投与することにより、ＧＲＫ５の発現量を低下させて、ＮＦ－κＢシグナルを抑制することができる。その結果、炎症系サイトカインや基質酵素の発現が抑制され、ＯＡの進行を抑制することができる。すなわち、これらのＧＲＫ５発現阻害剤の投与により、ＯＡを予防又は治療することができる。
　ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１塩基対以上２３塩基対以下の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
　ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０℃以上９５℃以下程度で約１分程度変性させた後、３０℃以上７０℃以下程度で約１時間以上８時間以下アニーリングさせることにより調製することができる。
　ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
［ＧＲＫ５特異的結合物質］
　ＧＲＫ５特異的結合物質としては、ＧＲＫ５に特異的に結合してＧＲＫ５の機能を阻害するものが挙げられ、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に、ＧＲＫ５タンパク質又はその断片を抗原として免疫することによって作製することができる。或いは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、市販の抗体であってもよい。
　アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄ　ｂｙ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
＜ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩＞
　ヒアルロン酸（ヒアルロナン）としては、基本的にはβ－Ｄ－グルクロン酸の１位とβ－Ｄ－Ｎ－アセチルグルコサミンの３位とが結合した２ 糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のもので、且つ、β－Ｄ－グルクロン酸とβ－Ｄ－Ｎ－アセチルグルコサミンとから基本的に構成されるものであれば、２糖単位が１個又は複数個結合したものにそれらの要素が結合した糖であってもよく、またこれらの誘導体、例えば、アシル基等の加水分解性保護基を有したもの等であってもよい。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４，５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。
　ヒアルロン酸としては、具体的には動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的若しくは酵素的に合成されたもの等のいずれも使用することができる。例えば鶏冠、さい体、皮膚、関節液等の生体組織から公知の抽出法と精製法によって得ることができる。また、ストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法によっても製造できる。
　ヒアルロン酸にはヒアルロナンオリゴ糖も包含され、上記２糖単位１個からなる２糖及びその誘導体のような低分子量のヒアルロン酸から、重量平均分子量４００万程度の高分子量のヒアルロン酸まで使用することができる。組織における浸透性等の点で優れることから、重量平均分子量３８０以上４０００，０００以下程度のヒアルロン酸が好ましく、２糖以上２０糖以下程度のヒアルロン酸がより好ましい。
　ヒアルロン酸のうち分子量の低いものは、具体的には、酵素分解法、アルカリ分解法、加熱処理法、超音波処理法等の公知の方法によってヒアルロン酸を低分子化する方法、化学的若しくは酵素的に合成する方法等で製造することができる。例えば、酵素分解法としては、ヒアルロン酸分解酵素（ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来）、ヒアルロニダーゼＳＤ等）、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣ等のヒアルロン酸を分解する酵素をヒアルロナンに作用させてヒアルロナンオリゴ糖を生成する方法等が挙げられる。
　また、アルカリ分解法としては、例えばヒアルロン酸の溶液に１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して、低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和して、低分子量のヒアルロン酸を得る方法等が挙げられる。
　ヒアルロン酸は、塩の形態を包含し、製剤上の必要に応じて、その薬学上許容できる塩を用いることができる。例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、トリ（ｎ－ブチル）アミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、アミノ酸塩等のアミン塩等が挙げられる。
　市販品の臨床使用されているヒアルロン酸としては、例えば、アルツディスポ（精製ヒアルロン酸ナトリウム、重量平均分子量５０万以上１２０万以下）、スベニール（精製ヒアルロン酸ナトリウム、重量平均分子量１５０万以上３９０万以下）等が挙げられる。
　上述したＧＲＫ５阻害剤と、上述したヒアルロン酸又その薬学的に許容される塩とは、それらの混合物の形態であってもよく、或いは、上述したＧＲＫ５阻害剤と、上述したヒアルロン酸又その薬学的に許容される塩とが別々に容器に密封されており、用時調整されるキットの形態であってもよい。すなわち、一実施形態において、本発明は、ＧＲＫ５阻害剤と、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩と、を備える、変形性関節症の進行抑制キットを提供する。
＜医薬組成物＞
　本実施形態のＯＡの進行抑制剤は、薬学的に許容可能な担体と組みあわせて、ＯＡの進行抑制用医薬組成物とすることができる。
　本実施形態の医薬組成物によれば、ＯＡの進行を抑制でき、ＧＲＫ５阻害剤の単独投与よりも有効性が向上している。
　本実施形態の医薬組成物は、経口的に使用される剤型であってもよく、非経口的に使用される剤型であってもよいが、非経口的に使用される剤型が好ましい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては例えば注射剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられる。
　薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。
　医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
　医薬組成物は、上記ＯＡの進行抑制剤と、上記薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
　医薬組成物は、上記ＯＡの進行抑制剤以外の抗炎症作用を有する治療薬及び他の疾患の治療薬からなる群より選択される少なくとも１つと組合せて、使用してもよい。上記ＯＡの進行抑制剤と他の薬剤とは、同一の製剤にしてもよいし、別々の製剤にしてもよい。また、各製剤は、同一の投与経路で投与してもよいし、別々の投与経路で投与してもよい。更に、各製剤は、同時に投与してもよいし、逐次的に投与してもよいし、一定の時間乃至期間を空けて別々に投与してもよい。一実施態様において、上記ＯＡの進行抑制剤と他の薬剤とは、これらを包含するキットとしてもよい。
＜投与方法＞
　投与する対象としては、限定されるものではないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、及びそれらの細胞等が挙げられる。中でも、哺乳動物又は哺乳動物細胞が好ましく、ヒト又はヒト細胞が特に好ましい。
　投与経路は、皮下投与、経皮投与、筋肉内投与、関節内投与等の非経口投与経路が好ましく、関節内投与が特に好ましい。
　ＯＡの進行抑制剤の投与量は、ＧＲＫ５阻害剤及びヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩の種類、投与対象の症状、投与部位、投与方法等により変動する。当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能であるが、例えば、局所投与を行う場合は、ＧＲＫ５阻害剤については、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり、通常約０．００１ｍｇ以上１０ｍｇ以下程度であり、約０．０１ｍｇ以上５ｍｇ以下程度が好ましく、約０．０２ｍｇ以上２ｍｇ以下程度がより好ましい。ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩については、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり、通常約０．０８ｍｇ以上８００ｍｇ以下程度であり、約０．８ｍｇ以上４００ｍｇ以下程度が好ましく、約１．６ｍｇ以上１００ｍｇ以下程度がより好ましい。或いは、通常、臨床において、１回あたり、１シリンジ（２．５ｍＬ）（精製ヒアルロン酸ナトリウムとして２５ｍｇ程度を含有する）を投与していることから、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩を１回あたり２５ｍｇ以上又は２５ｍｇ以下の範囲で投与することができる。
　ＯＡの進行抑制剤の投与は、単回投与でもよく、複数回投与であってもよい。複数回投与である場合は、例えば、２時間以上１２時間以下の期間毎、毎日、又は２日、５日、１週間、１．５週間、数週間、１か月若しくは数か月に１回等の頻度で投与することができる。通常、臨床において、ＯＡ治療のために、成人１回１シリンジ（精製ヒアルロン酸ナトリウムとして１回２５ｍｇ）を１週間ごとに連続５回膝関節腔内に投与し、その後、症状の維持を目的とする場合は、２週間隔以上４週間隔以下で投与しているが、本実施形態のＯＡの進行抑制剤は、後述する実施例に示すように、ＧＲＫ５阻害剤及びヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩を組み合わせて使用することで、投与間隔をあけても十分な効果が得られることから、従来よりも投与回数を減らすことも可能である。
≪その他の実施形態≫
　一実施形態において、本発明は、ＧＲＫ５阻害剤及びヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩の有効量を、治療を必要とする患者又は患畜に投与することを含む、ＯＡの予防方法、治療方法、又は進行抑制方法を提供する。ここで、ＧＲＫ５阻害剤及びヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩としては、上述したものと同様のものが挙げられる。また、ＯＡとしては、上述したものと同様のものが挙げられる。
　一実施形態において、本発明は、ＯＡの予防、治療、又は進行抑制のための、ＧＲＫ５阻害剤及びヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩を提供する。ここで、ＧＲＫ５阻害剤及びヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩としては、上述したものと同様のものが挙げられる。また、ＯＡとしては、上述したものと同様のものが挙げられる。
　一実施形態において、本発明は、ＯＡの進行抑制剤を製造するためのＧＲＫ５阻害剤及びヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。ここで、ＧＲＫ５阻害剤及びヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩としては、上述したものと同様のものが挙げられる。また、ＯＡとしては、上述したものと同様のものが挙げられる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［材料］
１．ヒト軟骨細胞の採取
　人工膝関節置換術後に通常では破棄される切除軟骨片より、ヒト軟骨細胞を単離培養した。すべてのドナーに対して、倫理審査委員会において承認を受けた臨床研究に参加することに同意を得た。すべてのドナーの個人情報に取り扱いには十分に配慮した。ドナーの膝関節は、レントゲンにてＯＡグレード（Ｋｅｌｌｇｒｅｎ－ｌａｗｒｅｎｃｅ）ＩＩＩ～ＩＶであった。
２．マウス
　チャールズリバージャパンからＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（以下、「野生型マウス」と称する場合がある）を購入した。ＧＲＫ５ノックアウト（ＫＯ）マウス（ＧＲＫ５　－／－）は、黒瀬博士（九州大学薬学部）から入手した。野生型マウス及びＧＲＫ５ＫＯマウスにおいて、成長板及び関節表面の軟骨の厚さ、体重、見た目等について大きな差は見られず、発達に差はなかった。未成熟軟骨細胞は、５日齢のマウス膝から採取した。
［実施例１］
（アンレキサノクス及びヒアルロン酸の同時投与によるヒト軟骨細胞のＩＬ６、ＭＭＰ１３及びＡＤＡＭＴＳ４発現に対する相乗的抑制効果）
　ヒトＯＡ軟骨細胞にアンレキサノクス（培地中の濃度：１００μＭ）及びヒアルロン酸（培地中の濃度：１ｍｇ／ｍＬ、重量平均分子量：５０万以上１４９万以下）を添加し、４８時間インキュベートした。対照として、何も投与せず４８時間インキュベートとしたものと、アンレキサノクス（培地中の濃度：１００μＭ）又はヒアルロン酸（培地中の濃度：１ｍｇ／ｍＬ、重量平均分子量：５０万以上１４９万以下）を投与して、４８時間インキュベートとしたものも準備した。
　アンレキサノクス及びヒアルロン酸を添加したヒトＯＡ軟骨細胞をリポポリサッカライド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）（培地中の濃度：１０μｇ／ｍＬ）で刺激し、６時間インキュベートした。その後、上記細胞よりｍＲＮＡを回収した。逆転写後、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　２．０システム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨを内部標準に使用した。使用したプライマーの配列を以下の表１に示す。結果を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図１に示すように、ヒアルロン酸単独投与では、ＩＬ６、ＭＭＰ１３及びＡＤＡＭＴＳ４の発現の有意な低下は認められなかった（コントロール比：９６．６％、９０．１３％、７６．８４％）。アンレキサノクス単独投与によって、ＩＬ６、ＭＭＰ１３及びＡＤＡＭＴＳ４全ての発現が有意に低下した（コントロール比：３２．９９％、４３．８３％、４２．０４％）。アンレキサノクス及びヒアルロン酸の同時投与によって、コントロール比１０．５８％、２６．２５％、１８．９５％、アンレキサノクス単独比３２．０７％、５９．８９％、４５．０８％のＩＬ６、ＭＭＰ１３及びＡＤＡＭＴＳ４の発現の有意な抑制を認め、相乗的な効果であった。
［実施例２］
（アンレキサノクス及びヒアルロン酸の関節内同時投与による変形性関節症の軟骨変性進行に対する相乗的抑制効果１）
　ＯＡは、１２週齢の雄マウス（野生型マウス及びＧＲＫ５ＫＯマウス）の内側半月板を脛骨に繋ぎ止めている靭帯を切離して膝関節に不安定性を与えること（ＤＭＭモデル）によって誘発させた（以下、「ＤＭＭ群」と称する場合がある）。また、対照として、靭帯切離せずに同様の方法を用いて偽手術を行ったマウスも準備した（以下、「偽手術群」と称する場合がある）。次いで、ＯＡ誘発直後から、５日おきに８週間、生理食塩水を投与する群（１０μＬ）、ヒアルロン酸溶液を投与する群（１０ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ）、アンレキサノクス溶液を投与する群（１００μＭ、１０μＬ）、アンレキサノクス（１００μＭ）及びヒアルロン酸（１０ｍｇ／ｍＬ）の混合溶液を投与する群（１０μＬ）の４群に分けた（図２Ａ参照）。ＯＡ誘導手術後８週時点での各群の膝関節組織の切片をサフラニンＯで染色した。結果を図２Ｂ（染色像）に示す。
　また、ＯＡＲＳＩによって推奨されている病理組織学的等級付けに基づいて、染色切片を評価することで、ＯＡの重症度を定量化した。結果を図２Ｃに示す。
　図２Ｂ及び図２Ｃに示すように、ヒアルロン酸単独投与群では、ＯＡＲＳＩスコアの有意な改善はなかった（コントロール群比：９２．５７％）。アンレキサノクス単独投与群では、ＯＡＲＳＩスコアの有意な低下を認めた（コントロール群比：５６．９５％）。アンレキサノクス及びヒアルロン酸の同時投与群では、コントロール群比３２．５８％、アンレキサノクス単独群比５７．２１％の有意なＯＡＲＳＩスコアの低下を認め、相乗的な軟骨変性抑制効果であった。
　アンレキサノクス及びヒアルロン酸を同時投与することにより、関節内投与後のアンレキサノクスの関節内からの吸収を緩徐にすることができたものと推察された。ヒアルロン酸の関節液中半減期は約２０時間であり、投与後約３日間まで関節液中より検出される。アンレキサノクスは分子量３００の低分子化合物であり、関節内の半減期は数時間である。アンレキサノクス及びヒアルロン酸を同時投与によって持続する薬効を得られ、アンレキサノクス単独投与よりもマウスモデルでの効果を得られたと考察された。
［実施例３］
（アンレキサノクス及びヒアルロン酸の関節内同時投与による変形性関節症の軟骨変性進行に対する相乗的抑制効果２）
　実施例２と同様の方法を用いて、ＯＡを誘発したマウスに１０日おきに８週間、アンレキサノクス（１００μＭ）及びヒアルロン酸（１０ｍｇ／ｍＬ）の混合溶液を投与した（図３Ａ参照）。ＯＡ誘導手術後８週時点での各群の膝関節組織の切片をサフラニンＯで染色した。結果を図３Ｂ（染色像）に示す。
　また、ＯＡＲＳＩによって推奨されている病理組織学的等級付けに基づいて、染色切片を評価することで、ＯＡの重症度を定量化した。結果を図３Ｃに示す。図３Ｃでは、実施例２で検討した４群の結果も併せて示した。
　図３Ｂ及び図３Ｃに示すように、アンレキサノクス及びヒアルロン酸の同時投与群では、投与間隔を１０日に延ばしても、アンレキサノクス単独投与群よりも、軟骨変性抑制効果が有意に高かった。
　また、ＯＡを誘発したマウスに、１０日おきに８週間、アンレキサノクス（１００μＭ）及びヒアルロン酸（１０ｍｇ／ｍＬ）の混合溶液を投与した群と、５日おきに８週間、アンレキサノクス溶液を投与した群（１００μＭ、１０μＬ）において、ＯＡ誘導手術後８週時点で、ＳＭＡＬＧＯ小動物用アルゴメータ（Ｂｉｏｓｅｂ社製、型番ＢＩＯ－ＳＭＡＬＧＯ＋）を用いて、関節への圧刺激に対する痛みの閾値を測定した。結果を図３Ｄに示す。
　図３Ｄに示すように、アンレキサノクス及びヒアルロン酸の同時投与群では、アンレキサノクス単独投与群よりも、痛みを軽減できることが明らかになった。
　以上の結果から、ＧＲＫ５阻害剤であるアンレキサノクス及びヒアルロン酸の同時投与によるＯＡ進行抑制効果は相乗的であり、未だ存在しない軟骨変性進行を抑制する効果を有する疾患修飾性ＯＡ治療薬となり得る。ヒアルロン酸単独ではＯＡ進行抑制効果を有しないことから、上記結果はＧＲＫ５阻害剤（アンレキサノクス）の効果を増強できるヒアルロン酸の新規効果といえる。
　本実施形態の変形性関節症の進行抑制剤及び進行抑制キットによれば、ＯＡの進行を抑制でき、ＧＲＫ５阻害剤の単独投与よりも有効性が向上している。

Claims (4)

  1. 　Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ５阻害剤と、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩と、を有効成分として含有する、変形性関節症の進行抑制剤。
  2. 　前記Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ５阻害剤がアンレキサノクスである、請求項１に記載の変形性関節症の進行抑制剤。
  3. 　関節内注射により投与される、請求項１又は２に記載の変形性関節症の進行抑制剤。
  4. 　Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ５阻害剤と、
    　ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩と、
    を備える、変形性関節症の進行抑制キット。
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