WO2023013568A1 - イヌの癌の診断方法 - Google Patents

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WO2023013568A1
WO2023013568A1 PCT/JP2022/029420 JP2022029420W WO2023013568A1 WO 2023013568 A1 WO2023013568 A1 WO 2023013568A1 JP 2022029420 W JP2022029420 W JP 2022029420W WO 2023013568 A1 WO2023013568 A1 WO 2023013568A1
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mir
microrna
specific
gene expression
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孝広 落谷
博 伊藤
玲子 土屋
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株式会社メディカル・アーク
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing canine cancer based on the results of microRNA gene expression analysis.
  • MicroRNAs are small RNAs of about 22 bases contained in body fluids such as blood, saliva, and urine, and control the expression of specific genes. and amounts are known to vary. In humans, microRNAs are used as cancer-specific biomarkers, and cancer diagnostic kits are being developed based on the analysis results of their expression (eg, Patent Document 1).
  • the present invention provides an accurate and rapid method for diagnosing canine cancer based on the results of gene expression analysis using canine microRNA.
  • Each embodiment of the present invention is as follows. [1] Obtaining the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from body fluids of a dog to be diagnosed, obtaining the gene expression levels of specific microRNAs using the results, and using the gene expression levels as diagnostic criteria
  • a method for diagnosing canine cancer comprising a diagnostic step of diagnosing the degree of risk that the dog to be diagnosed is suffering from a specific cancer disease, wherein the specific microRNA is extracted from canine bodily fluids
  • the microRNA is a microRNA that shows a significant difference in gene expression levels between dogs suffering from the specific cancer disease and healthy dogs.
  • a method for diagnosing canine cancer characterized by: [2] Gene expression between a dog suffering from a specific cancer disease and a healthy dog based on the results of gene expression analysis of microRNA extracted from canine body fluids prior to the diagnosis step The method of [1], further comprising the step of extracting microRNAs showing a significant difference in level as specific microRNAs based on a discriminant created using statistical analysis processing. [3] The method of [1] or [2], wherein the specific cancer disease is selected from the group consisting of oral melanoma, urothelial carcinoma, malignant lymphoma, hepatocellular carcinoma and mast cell tumor.
  • the specific cancer disease is five cancer diseases including oral melanoma, urothelial carcinoma, malignant lymphoma, hepatocellular carcinoma and mast cell tumor, wherein the specific microRNA is cfa-let -7c, cfa-miR-103, cfa-miR-10a, cfa-miR-122, cfa-miR-125a, cfa-miR-125b, cfa-miR-126, cfa-miR-130a, cfa-miR-144 , cfa-miR-150, cfa-miR-155, cfa-miR-186, cfa-miR-193a, cfa-miR-197, cfa-miR-199, cfa-miR-19b, cfa-miR-22, cfa - miR-222, cffa
  • the specific cancer disease is oral melanoma
  • the specific microRNA is cfa-miR-10a, cfa-miR-1185, cfa-miR-125a, cfa-miR-126, cfa-miR -144, cfa-miR-146a, cfa-miR-149, cfa-miR-150, cfa-miR-155, cfa-miR-184, cfa-miR-186, cfa-miR-197, cfa-miR-199 , cfa-miR-19b, cfa-miR-24, cfa-miR-30c, cfa-miR-483, cfa-miR-489, cfa-miR-8798, cfa-miR-8816, cfa-miR-
  • the specific cancer disease is urothelial cancer
  • the specific microRNA is cfa-let-7f, cfa-miR-10a, cfa-miR-1249, cfa-miR-125a, cfa- miR-126, cfa-miR-1306, cfa-miR-130a, cfa-miR-133b, cfa-miR-144, cfa-miR-146a, cfa-miR-149, cfa-miR-150, cfa-miR- 155, cfa-miR-1844, cfa-miR-186, cfa-miR-193a, cfa-miR-197, cfa-miR-19b, cfa-miR-2114, cfa-miR-24, cfa-miR-29b,
  • the specific cancer disease is malignant lymphoma
  • the specific microRNA is cfa-miR-1185, cfa-miR-122, cfa-miR-1249, cfa-miR-126, cfa-miR- 1306, cfa-miR-144, cfa-miR-150, cfa-miR-184, cfa-miR-188, cfa-miR-197, cfa-miR-199, cfa-miR-24, cfa-miR-342, cfa-miR-345, cfa-miR-378, cfa-miR-425, cfa-miR-574, cfa-miR-8794, cfa-miR-8797, cfa-miR-8798, cfa-miR-8900,
  • the specific cancer disease is hepatocellular carcinoma
  • the specific microRNA is cfa-let-7g, cfa-miR-10a, cfa-miR-1185, cfa-miR-122, cfa-miR -125b, cfa-miR-150, cfa-miR-155, cfa-miR-197, cfa-miR-199, cfa-miR-206, cfa-miR-22, cfa-miR-378, cfa-miR-383 , cfa-miR-483, cfa-miR-665, cfa-miR-7, cfa-miR-718, cfa-miR-874, cfa-miR-8794, cfa-miR-8798, cfa-miR-8875,
  • the specific cancer disease is mastocytoma
  • the specific microRNA is cfa-miR-10b, cfa-miR-1185, cfa-miR-125b, cfa-miR-126, cfa-miR -149, cfa-miR-150, cfa-miR-155, cfa-miR-197, cfa-miR-199, cfa-miR-222, cfa-miR-24, cfa-miR-26b, cfa-miR-8803 , which is at least one selected from the group consisting of cfa-miR-8872, cfa-miR-8903, cfa-miR-8907 and cfa-miR-92b, according to any one of [1] to [3] the method of.
  • a method for diagnosing canine cancer comprising a diagnostic step of diagnosing the degree of risk that the dog to be diagnosed is suffering from a specific cancer disease, wherein the specific microRNA is extracted from canine bodily fluids Gene expression levels between dogs suffering from the specific cancer disease and dogs suffering from other cancer diseases and healthy dogs based on the results of gene expression analysis of the extracted microRNA A method for diagnosing canine cancer, characterized in that the microRNA has a significant difference in .
  • the specific cancer disease is oral melanoma, and the specific microRNA used in the diagnosis is cfa-miR-1185, cfa-miR-122, cfa-miR-126, cfa-miR- 1271, cfa-miR-1306, cfa-miR-130b, cfa-miR-140, cfa-miR-144, cfa-miR-146a, cfa-miR-150, cfa-miR-155, cfa-miR-192, cfa-miR-197, cfa-miR-222, cfa-miR-29a,
  • the specific cancer disease is urothelial cancer
  • the specific microRNA used in the diagnosis is cfa-let-7b, cfa-miR-107, cfa-miR-10b, cfa-miR- 122, cfa-miR-125b, cfa-miR-1306, cfa-miR-130a, cfa-miR-133b, cfa-miR-144, cfa-miR-146a, cfa-miR-149, cfa-miR-181a, cfa-miR-185, cfa-miR-193a, cfa-miR-197, cfa-miR-19b, cfa-miR-23a, cfa-miR-29c, cfa-miR-345, cfa-miR-361, cfa-
  • the specific cancer disease is malignant lymphoma
  • the specific microRNA used in the diagnosis is cfa-let-7f, cfa-miR-122, cfa-miR-1306, cfa-miR-130a, cfa-miR-140, cfa-miR-144, cfa-miR-146a, cfa-miR-151, cfa-miR-15a, cfa-miR-181a, cfa-miR-1844, cfa-miR-188, cfa-miR-188 miR-192, cfa-miR-193a, cfa-miR-21, cfa-miR-22, cfa-miR-23b, cfa-miR-24, cfa-miR-26a, cfa-miR-26b, cfa-m
  • the specific cancer disease is mastocytoma
  • the specific microRNA used in the diagnosis is cfa-let-7c, cfa-let-7f, cfa-miR-10a, cfa-miR-1306 , cfa-miR-130a, cfa-miR-144, cfa-miR-149, cfa-miR-186, cfa-miR-188, cfa-miR-18a, cfa-miR-191, cfa-miR-221, cfa - miR-223, cfa-miR-301a, cfa-miR-30c, cfa-miR-342, cfa-miR-370, cfa-miR-451, cfa-miR-486-3p, cfa-miR-551b, cfa - miR-574,
  • cfa-let-7c, cfa-miR-103 for diagnosing five canine cancer diseases including oral melanoma, urothelial carcinoma, malignant lymphoma, hepatocellular carcinoma and mast cell tumor , cfa-miR-10a, cfa-miR-122, cfa-miR-125a, cfa-miR-125b, cfa-miR-126, cfa-miR-130a, cfa-miR-144, cfa-miR-150, cfa -miR-155, cfa-miR-186, cfa-miR-193a, cfa-miR-197, cfa-miR-199, cfa-miR-19b, cfa-miR-22, cfa-miR-222, cfa-miR -223,
  • cfa-let-7g cfa-miR-10a, cfa-miR-1185, cfa-miR-122, cfa-miR-125b, cfa-miR-150 for diagnosing canine hepatocellular carcinoma , cfa-miR-155, cfa-miR-197, cfa-miR-199, cfa-miR-206, cfa-miR-22, cfa-miR-378, cfa-miR-383, cfa-miR-483, cfa - miR-665, cfa-miR-7, cfa-miR-718, cfa-miR-874, cfa-miR-8794, cfa-miR-8798, cfa-miR-8875, cfa-miR-8
  • biomarker [24] cfa-miR-10b, cfa-miR-1185, cfa-miR-125b, cfa-miR-126, cfa-miR-149, cfa-miR-150, for diagnosing canine mastocytoma, cfa-miR-155, cfa-miR-197, cfa-miR-199, cfa-miR-222, cfa-miR-24, cfa-miR-26b, cfa-miR-8803, cfa-miR-8872, cfa-miR-8872
  • a biomarker comprising at least one microRNA selected from the group consisting of miR-8903, cfa-miR-8907 and cfa-miR-92b.
  • the present invention provides an accurate and rapid method for diagnosing canine cancer.
  • Figure showing the results of microRNA gene expression analysis Figure showing the results of microRNA gene expression analysis Diagram showing the ROC curve and AUC of the model discriminant Diagram showing the ROC curve and AUC of the model discriminant A diagram showing each discriminant extracted in the implementation of the present invention and its AUC A diagram showing each discriminant extracted in the implementation of the present invention and its AUC A diagram showing each discriminant extracted in the implementation of the present invention and its AUC A diagram showing each discriminant extracted in the implementation of the present invention and its AUC A diagram showing each discriminant extracted in the implementation of the present invention and its AUC A diagram showing each discriminant extracted in the implementation of the present invention and its AUC A diagram showing each discriminant extracted in the implementation of the present invention and its AUC A diagram showing each discriminant extracted in the implementation of the present invention and its AUC A diagram showing each discriminant extracted in the implementation of the present invention and its AUC A diagram showing each discriminant extracted in the implementation of the present invention and its AUC A diagram showing each discriminant extracted in the implementation of the present invention and its AUC A diagram showing each discriminant extracted in
  • microRNA expression analysis A body fluid of a dog is collected as a sample (subject), microRNA is extracted from the collected body fluid, gene expression analysis is performed on the extracted microRNA, and the expression level of the microRNA is detected.
  • body fluids of dogs suffering from cancer including "specific cancer diseases” are prepared.
  • a particular cancer disease may refer to the cancer disease to be diagnosed.
  • bodily fluids examples include serum, saliva, and urine.
  • dog serum is used.
  • the "specific cancer disease” can be selected from the group consisting of oral melanoma, urothelial carcinoma, malignant lymphoma, hepatocellular carcinoma and mast cell carcinoma, which are relatively frequently occurring canine cancers. , but not limited to.
  • microarray analysis for example, microarray analysis or next-generation sequencing technology (NGS) can be used.
  • NGS next-generation sequencing technology
  • Another technique well known in since the gene expression analysis performed here requires a broad analysis of the correlation between each cancer disease and gene expression level, it is possible to comprehensively analyze microRNAs extracted from dog bodily fluids. It is desirable to adopt the method. For this reason, microarray analysis can be preferably used. Since the techniques for gene expression analysis, including microarray analysis, are known, detailed descriptions thereof are omitted here. In addition, the gene expression analysis, including work to sort out the gene expression levels of microRNAs, results in a huge amount of data, so it is desirable that the analysis be performed by a computer.
  • microRNAs that show significant differences in gene expression levels between dogs with cancer, dogs with other cancer diseases, and healthy dogs are extracted.
  • the number of microRNAs to be extracted depends on the extraction method and target, and is generally about 1 to 80, preferably about 4 to 50, although not limited thereto.
  • microRNAs are referred to as "specific microRNAs”.
  • the above-mentioned "specific cancer disease” can be selected from the group consisting of oral melanoma, urothelial carcinoma, malignant lymphoma, hepatocellular carcinoma and mast cell carcinoma, which are relatively frequently occurring canine cancers. It is possible, but not limited to this.
  • LASSO at l east a bsolute shrinkage and election operator
  • LASSO regression analysis is performed based on the results of gene expression analysis of the microRNA, and a model discriminant for predicting canine cancer is constructed.
  • a method of extracting a “specific microRNA” from such a discriminant can be adopted.
  • LASSO regression analysis is known as a regression analysis method that improves the predictive accuracy and interpretability of the generated statistical model, and the method using the LASSO regression analysis is more characteristic in "specific cancer diseases" and / Alternatively, it is particularly suitable for extracting frequently occurring microRNAs as "specific microRNAs" that can be used as biomarkers in subsequent diagnostic steps.
  • heat map images are generated based on the results of the gene expression analysis, and dogs suffering from the "specific cancer disease” and healthy dogs ( In some cases, including dogs suffering from other cancer diseases), microRNAs that show a significant difference, for example, a difference of 2-fold or more, are identified by computer image analysis processing.
  • a method of mechanically selecting and extracting a “specific microRNA” from among such microRNAs can be mentioned.
  • a heat map image is an image that visualizes the expression levels of genes, and shows the level of gene expression levels depending on the types and shades of colors used.
  • a heat map image that allows intuitive recognition of the results of such microRNA expression analysis is generated, and after performing clustering processing, etc., It may be combined with the method using the LASSO regression analysis, or a method of generating a heat map image as a preprocessing of the LASSO regression analysis may be employed.
  • a method of extracting the "specific microRNA” by image analysis processing based on machine learning using AI is also assumed, and this is excluded in the present invention. isn't it.
  • AI-based image analysis processing cases where a significant difference is recognized only by combining multiple microRNAs, or cases where a significant difference is recognized even if it is a small difference, can be extracted with a simple threshold setting. It is expected that it will be possible to extract microRNAs, which are difficult to extract.
  • a computer including the generation of heat map images that require accurate mapping of gene expression levels.
  • a computer may be one in which software separately developed for implementation of the present invention is installed, or commercially available software developed for the gene expression analysis, for example, microarray analysis. It may have been installed.
  • Step 3 Diagnosis using specific microRNA> Obtaining new results of gene expression analysis of microRNAs extracted from the bodily fluid of a dog to be diagnosed, obtaining the gene expression level of the extracted "specific microRNAs" using the results, Using the gene expression level as a diagnostic criterion, the degree of risk of the dog to be diagnosed being afflicted with the "specific cancer disease” is diagnosed.
  • the technique used for expression analysis of microRNA extracted from the bodily fluid of the dog to be diagnosed may be the same as or different from the technique for gene expression analysis in step 1 above, and may employ, for example, microarray analysis. However, it is not limited to this.
  • bodily fluids examples include serum, saliva, urine, etc.
  • dog serum is used.
  • the degree of risk may be a mode in which the diagnosis is alternatively indicated by either “having/not having the cancer", or “having the cancer It may also be a mode in which the diagnosis is indicated in multiple stages, such as "Possibility of being XX%".
  • the degree of risk includes aspects in which a diagnosis such as "the risk of having a particular cancer is higher/lower than the risk of having other cancer diseases" is indicated. can be anything.
  • telomeres that are considered to be particularly relevant to specific cancer diseases are extracted in advance. is sufficient to perform expression analysis on about 4 to 50 kinds of "specific microRNAs”, and there is no need for extensive and exhaustive expression analysis. In short, it becomes possible to efficiently perform gene expression analysis of microRNAs of dogs to be diagnosed, and as a result, the processing burden for the diagnosis is reduced, and rapid and accurate diagnosis of canine cancer becomes possible.
  • microRNAs for use in diagnosing canine cancer
  • the “specific microRNAs” extracted in the practice of the present invention are specifically shown below for each diagnostic purpose/application for which they are expected to be used as biomarkers.
  • RNA As RNA, the following 44 microRNAs were extracted: cfa-let-7c, cfa-miR-103, cfa-miR-10a, cfa-miR-122, cfa-miR-125a, cfa-miR-125b, cfa-miR-126, cfa-miR-130a, cfa- miR-144, cfa-miR-150, cfa-miR-155, cfa-miR-186, cfa-miR-193a, cfa-miR-197, cfa-miR-199, cfa-miR-19b, cfa-miR- 22, cfa-miR-222, cfa-miR-223, cfa-miR-24, cfa-miR-26a, cfa-miR-
  • microRNAs are extracted from dogs suffering from any of five cancer diseases including oral melanoma, urothelial carcinoma, malignant lymphoma, hepatocellular carcinoma and mast cell carcinoma and from healthy dogs, respectively. Based on the results of gene expression analysis of microRNA, statistical analysis processing using LASSO regression analysis was performed to construct a model discriminant for predicting the specific cancer disease, and the five types of cancer diseases characteristic and / or microRNAs included in the top 20 discriminants selected as containing frequent microRNAs. The discriminants and AUCs showing their discriminative ability are shown in FIG.
  • the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from body fluids of dogs to be diagnosed are newly obtained, and at least 1, 2, 3, 4, 5 species, 6 species, 7 species, 8 species, 9 species, 10 species, 11 species, 12 species, 13 species, 14 species, 15 species, 16 species, 17 species, 18 species, 19 species, 20 species, 21 species, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 , 39 species, 40 species, 41 species, 42 species, 43 species, or all 44 species.
  • malignant lymphoma hepatocellular carcinoma and mast cell carcinoma.
  • Said “specific microRNA” specifically includes: Both those with high gene expression levels and those with particularly low gene expression levels can be included.
  • Valid biomarkers for differentiating between dogs suffering from oral melanoma and diagnosing healthy dogs include the 22 microRNAs shown below: cfa-miR-10a, cfa-miR-1185, cfa-miR-125a, cfa-miR-126, cfa-miR-144, cfa-miR-146a, cfa-miR-149, cfa-miR-150, cfa-miR-150 miR-155, cfa-miR-184, cfa-miR-186, cfa-miR-197, cfa-miR-199, cfa-miR-19b, cfa-miR-24, cfa-miR-30c, cfa-miR- 483, cfa-miR-489, c
  • microRNA predicts oral melanoma by statistical analysis processing using LASSO regression analysis based on the results of gene expression analysis of microRNA extracted from dogs suffering from oral melanoma and healthy dogs.
  • microRNAs included in the top 20 discriminants selected as containing microRNAs characteristic and/or frequent in oral melanoma.
  • the discriminants and AUCs showing their discriminative ability are shown in FIG. 4 ("Healthy VS intraoral melanoma").
  • the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from the bodily fluid of a dog to be diagnosed are newly obtained, and at least one, two, three, four, and five microRNAs are obtained.
  • the gene expression levels are determined for all 22 species, and the level of risk of the dog suffering from oral melanoma can be diagnosed based on the gene expression levels.
  • specific microRNA can include both those with particularly high gene expression levels and those with particularly low gene expression levels in oral melanoma compared to healthy dogs.
  • Valid biomarkers for differentiating between dogs with urothelial carcinoma and a diagnosis of healthy dogs include the 41 microRNAs shown below: cfa-let-7f, cfa-miR-10a, cfa-miR-1249, cfa-miR-125a, cfa-miR-126, cfa-miR-1306, cfa-miR-130a, cfa-miR-133b, cfa-miR-133b miR-144, cfa-miR-146a, cfa-miR-149, cfa-miR-150, cfa-miR-155, cfa-miR-1844, cfa-miR-186, cfa-miR-193a, cfa-miR- 197, cfa-miR
  • microRNAs were analyzed by statistical analysis using LASSO regression analysis.
  • Model discriminants for predicting cancer are constructed, and microRNAs included in the top 20 discriminants selected as containing microRNAs characteristic and/or frequent in urothelial cancer.
  • the discriminants and AUCs showing their discriminative ability are shown in FIG. 4 (“healthy vs. urothelial cancer”).
  • the results of genetic analysis of microRNAs extracted from body fluids of dogs to be diagnosed are newly obtained, and at least one, two, three, four, or five types of microRNAs are obtained. , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 species, 23 species, 24 species, 25 species, 26 species, 27 species, 28 species, 29 species, 30 species, 31 species, 32 species, 33 species, 34 species, 35 species, 36 species, 37 species, 38 species,
  • the gene expression levels are determined for all 39, 40, or 41 species, and the level of risk of the dog suffering from urothelial cancer can be diagnosed based on the gene expression levels.
  • the "specific microRNA” can include both those with particularly high gene expression levels and those with particularly low gene expression levels in urothelial cancer compared to healthy dogs.
  • dogs with high gene expression levels for at least one microRNA from the group consisting of cfa-miR-483, cfa-miR-718 and cfa-miR-8908a-3p are selected from dogs whose urothelium is diagnosed with high risk for cancer and/or cfa-miR-125a, cfa-miR-126, cfa-miR-144, cfa-miR-146a, cfa-miR-149, cfa-miR at least from the group consisting of -150, cfa-miR-155, cfa-miR-186, cfa-miR-2114, cfa-miR-24, cfa-miR-29b, cfa-miR-8832 and cfa-miR-8907 It is desirable to diagnose dogs with high gene expression levels for one microRNA as having a
  • Effective biomarkers for differentiating between dogs with malignant lymphoma and healthy dogs include the 24 microRNAs shown below: cfa-miR-1185, cfa-miR-122, cfa-miR-1249, cfa-miR-126, cfa-miR-1306, cfa-miR-144, cfa-miR-150, cfa-miR-184, cfa-miR-184 miR-188, cfa-miR-197, cfa-miR-199, cfa-miR-24, cfa-miR-342, cfa-miR-345, cfa-miR-378, cfa-miR-425, cfa-miR- 574, cfa-miR-8794, cfa-
  • microRNA is based on the results of gene expression analysis of microRNA extracted from dogs suffering from malignant lymphoma and healthy dogs, respectively, by statistical analysis processing using LASSO regression analysis to predict malignant lymphoma. and microRNAs included in the top 20 discriminants selected as containing microRNAs characteristic and/or frequent in malignant lymphoma. The discriminants and AUCs showing their discriminative ability are shown in FIG. 4 (“healthy vs. malignant lymphoma”).
  • the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from the bodily fluid of a dog to be diagnosed are obtained, and at least one, two, three, four, five, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , all 23 or 24 species, and based on the gene expression level, it is possible to diagnose the degree of risk of the dog suffering from malignant lymphoma.
  • the "specific microRNA” can include both those with particularly high gene expression levels and those with particularly low gene expression levels in malignant lymphoma compared to healthy dogs.
  • Effective biomarkers for differentiating between healthy dogs and dogs with hepatocellular carcinoma include the 28 microRNAs shown below: cfa-let-7g, cfa-miR-10a, cfa-miR-1185, cfa-miR-122, cfa-miR-125b, cfa-miR-150, cfa-miR-155, cfa-miR-197, cfa-miR-197 miR-199, cfa-miR-206, cfa-miR-22, cfa-miR-378, cfa-miR-383, cfa-miR-483, cfa-miR-665, cfa-miR-7, cfa-miR- 718, cfa-miR-874, cfa-miR
  • microRNA was obtained by statistical analysis using LASSO regression analysis based on the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from dogs suffering from hepatocellular carcinoma and from healthy dogs.
  • a model discriminant for predicting is constructed, and microRNAs included in the top 20 discriminants selected as containing microRNAs characteristic and/or frequent in hepatocellular carcinoma.
  • the discriminants and AUCs showing their discriminative abilities are shown in FIG. 4 (“healthy vs. hepatocellular carcinoma”).
  • the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from the bodily fluid of a dog to be diagnosed are newly obtained, and at least one, two, three, four, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 or 24 gene expression levels can be determined, and the degree of risk of contracting hepatocellular carcinoma can be diagnosed on the basis of the gene expression level.
  • the "specific microRNA” can include both those with particularly high gene expression levels and those with particularly low gene expression levels in hepatocellular carcinoma compared to healthy dogs.
  • Dogs with high gene expression levels for at least one microRNA from the group consisting of cfa-miR-8798, cfa-miR-8875, cfa-miR-8908a-3p and cfa-miR-92b were selected for hepatocellular carcinoma.
  • Valid biomarkers for differentiating dogs with mastocytoma from diagnosis in healthy dogs include the 17 microRNAs shown below: cfa-miR-10b, cfa-miR-1185, cfa-miR-125b, cfa-miR-126, cfa-miR-149, cfa-miR-150, cfa-miR-155, cfa-miR-197, cfa-miR-197 miR-199, cfa-miR-222, cfa-miR-24, cfa-miR-26b, cfa-miR-8803, cfa-miR-8872, cfa-miR-8903, cfa-miR-8907 and cfa-miR- 92b.
  • the frequency and base sequence of each microRNA are shown below;
  • microRNA predicts mastocytoma by statistical analysis using LASSO regression analysis based on the results of gene expression analysis of microRNA extracted from dogs suffering from mastocytoma and healthy dogs.
  • MicroRNAs included in the top 20 discriminants selected as containing microRNAs characteristic and/or frequent in mastocytoma.
  • the discriminants and AUCs showing their discriminative ability are shown in FIG. 4 (“healthy vs. mastocytoma”).
  • the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from the bodily fluid of a dog to be diagnosed are newly obtained, and at least one, two, three, four, and five microRNAs are obtained.
  • Species, 6 species, 7 species, 8 species, 9 species, 10 species, 11 species, 12 species, 13 species, 14 species, 15 species, 16 species, or all 17 species the gene expression level is obtained, and the gene expression level can be used as a basis for diagnosing the degree of risk of suffering from mastocytoma.
  • the "specific microRNA” can include both those with particularly high gene expression levels and those with particularly low gene expression levels in mast cell tumors compared to healthy dogs.
  • dogs with high gene expression levels for at least one microRNA from the group consisting of cfa-miR-8803, cfa-miR-8903 and cfa-miR-92b are selected for mastocytoma. and/or the group consisting of cfa-miR-126, cfa-miR-150, cfa-miR-155, cfa-miR-199, cfa-miR-8872 and cfa-miR-8907 It would be desirable to diagnose dogs with high gene expression levels for at least one microRNA from .
  • Valid biomarkers for differentiating dogs with oral melanoma from dogs with other cancer diseases and healthy dogs include the 35 microRNAs shown below: cfa-miR-1185, cfa-miR-122, cfa-miR-126, cfa-miR-1271, cfa-miR-1306, cfa-miR-130b, cfa-miR-140, cfa-miR-144, cfa-miR-144 miR-146a, cfa-miR-150, cfa-miR-155, cfa-miR-192, cfa-miR-197, cfa-miR-222, cfa-miR-29a, cfa-miR-29b, cfa-miR- 30b,
  • the microRNA is based on the results of gene expression analysis of microRNA extracted from dogs suffering from oral melanoma, dogs suffering from other cancer diseases, and healthy dogs, respectively, using LASSO regression analysis.
  • a model discriminant for predicting oral melanoma was constructed by statistical analysis and included in the top 20 discriminants selected as containing microRNAs characteristic and/or frequent in oral melanoma micro RNA.
  • the discriminants and AUCs showing their discriminative ability are shown in FIG. 4 (“Intraoral melanoma VS others”).
  • the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from the bodily fluid of a dog to be diagnosed are newly obtained, and at least one, two, three, four, and five microRNAs are obtained.
  • the degree of risk of suffering from oral melanoma can be diagnosed on the basis of the gene expression level.
  • the risk of having oral melanoma is greater than the risk of having other cancer diseases, such as urothelial carcinoma, malignant lymphoma, hepatocellular carcinoma, and mast cell tumor. may also include determination of whether the value is high or low.
  • Effective biomarkers for differentiating dogs with urothelial carcinoma from dogs with other cancer diseases and healthy dogs include the 43 microRNAs shown below. : cfa-let-7b, cfa-miR-107, cfa-miR-10b, cfa-miR-122, cfa-miR-125b, cfa-miR-1306, cfa-miR-130a, cfa-miR-133b, cfa- miR-144, cfa-miR-146a, cfa-miR-149, cfa-miR-181a, cfa-miR-185, cfa-miR-193a, cfa-miR-197, cfa-miR-19b, cfa-miR- 23a, cfa
  • microRNA was obtained by LASSO regression analysis based on the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from dogs suffering from urothelial cancer, dogs suffering from other cancer diseases, and healthy dogs, respectively.
  • the statistical analysis process utilized constructed a model discriminant for predicting urothelial carcinoma and selected the top 20 microRNAs that were characteristic and/or frequent for urothelial carcinoma. MicroRNAs included in the discriminant.
  • the discriminants and AUCs showing their discriminative ability are shown in FIG. 4 (“Urothelial cancer vs. others”).
  • the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from the bodily fluid of a dog to be diagnosed are newly obtained, and at least one, two, three, four, and five microRNAs are obtained.
  • the risk of having urothelial carcinoma is greater than the risk of having other cancer diseases, such as oral melanoma, malignant lymphoma, hepatocellular carcinoma, and mast cell tumor. may also include determination of whether the value is high or low.
  • Diagnosis of canine cancer using the above-mentioned "specific microRNA” as a biomarker makes it possible to distinguish between urothelial cancer and other cancer diseases. It is considered that there is a need.
  • Valid biomarkers for differentiating dogs with malignant lymphoma from dogs with other cancer diseases and healthy dogs include the 42 microRNAs shown below: cfa-let-7f, cfa-miR-122, cfa-miR-1306, cfa-miR-130a, cfa-miR-140, cfa-miR-144, cfa-miR-146a, cfa-miR-151, cfa- miR-15a, cfa-miR-181a, cfa-miR-1844, cfa-miR-188, cfa-miR-192, cfa-miR-193a, cfa-miR-21, cfa-miR-22, cfa-miR- 23b, cfa-miR-24,
  • microRNAs are statistically expressed using LASSO regression analysis based on the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from dogs suffering from malignant lymphoma, dogs suffering from other cancer diseases, and healthy dogs, respectively.
  • LASSO regression analysis based on the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from dogs suffering from malignant lymphoma, dogs suffering from other cancer diseases, and healthy dogs, respectively.
  • a model discriminant for predicting malignant lymphoma is constructed, and the microRNA included in the top 20 discriminants selected as containing microRNAs characteristic and/or frequent in malignant lymphoma. .
  • the discriminants and AUCs showing their discriminative abilities are shown in FIG. 4 (“malignant lymphoma vs. others”).
  • the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from the bodily fluid of a dog to be diagnosed are newly obtained, and at least one, two, three, four, and five microRNAs are obtained.
  • species, 6 species, 7 species, 8 species, 9 species, 10 species, 11 species, 12 species, 13 species, 14 species, 15 species, 16 species, 17 species, 18 species, 19 species, 20 species, 21 species, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 , 39, 40, 41, or 42 species the gene expression level can be obtained, and the degree of risk of contracting malignant lymphoma can be diagnosed based on the gene expression level.
  • the risk of having malignant lymphoma is greater than the risk of having any other cancer disease, such as oral melanoma, urothelial carcinoma, hepatocellular carcinoma, and mast cell tumor. may also include determination of whether the value is high or low.
  • Diagnosis of canine cancer using the above-mentioned "specific microRNA” as a biomarker makes it possible to distinguish between malignant lymphoma and other cancer diseases. is thought to exist.
  • Valid biomarkers for differentiating dogs with hepatocellular carcinoma from dogs with other cancer diseases and healthy dogs include the 40 microRNAs shown below. : cfa-let-7b, cfa-let-7c, cfa-let-7f, cfa-let-7g, cfa-miR-10b, cfa-miR-122, cfa-miR-1249, cfa-miR-132, cfa- miR-134, cfa-miR-146a, cfa-miR-150, cfa-miR-155, cfa-miR-16, cfa-miR-206, cfa-miR-22, cfa-miR-223, cfa-miR- 29a, cfa-miR-30d, cfa-miR
  • the microRNA is based on the results of gene expression analysis of microRNA extracted from dogs suffering from hepatocellular carcinoma, dogs suffering from other cancer diseases, and healthy dogs, respectively, using LASSO regression analysis.
  • a model discriminant for predicting hepatocellular carcinoma was constructed by statistical analysis, and the top 20 discriminants selected as containing microRNAs characteristic and/or frequent in hepatocellular carcinoma microRNAs involved.
  • FIG. 4 (“Hepatocellular carcinoma vs. others”) shows the discriminants and AUCs indicating their discriminative ability.
  • the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from the bodily fluid of a dog to be diagnosed are newly obtained, and at least one, two, three, four, and five microRNAs are obtained.
  • the gene expression level can be determined, and the degree of risk of contracting hepatocellular carcinoma can be diagnosed on the basis of the gene expression level.
  • the risk of having hepatocellular carcinoma is greater than the risk of having any other cancer disease, such as oral melanoma, urothelial carcinoma, malignant lymphoma, and mast cell tumor. may also include determination of whether the value is high or low.
  • Valid biomarkers for differentiating dogs with mast cell tumors from dogs with other cancer diseases and healthy dogs include the 29 microRNAs shown below: cfa-let-7c, cfa-let-7f, cfa-miR-10a, cfa-miR-1306, cfa-miR-130a, cfa-miR-144, cfa-miR-149, cfa-miR-186, cfa- miR-188, cfa-miR-18a, cfa-miR-191, cfa-miR-221, cfa-miR-223, cfa-miR-301a, cfa-miR-30c, cfa-miR-342, cfa-miR- 370, cfa-miR-451, cfa-miR-
  • microRNAs were obtained using LASSO regression analysis based on the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from dogs suffering from mastocytoma, dogs suffering from other cancer diseases, and healthy dogs, respectively. Statistical analysis was performed to construct model discriminants for predicting mast cell tumors, and microRNAs included in the top 20 discriminants selected as containing microRNAs characteristic and/or frequent in mast cell tumors. RNA. The discriminants and AUCs showing their discriminative ability are shown in FIG. 4 (“mast cell tumor vs. others”).
  • the results of gene expression analysis of microRNAs extracted from the bodily fluid of a dog to be diagnosed are newly obtained, and at least one, two, three, four, and five microRNAs are obtained.
  • species, 6 species, 7 species, 8 species, 9 species, 10 species, 11 species, 12 species, 13 species, 14 species, 15 species, 16 species, 17 species, 18 species, 19 species, 20 species, 21 species Determine the gene expression level for all 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 or 29 species, and determine the degree of risk of having mast cell tumor based on the gene expression level can be diagnosed.
  • This diagnosis includes a greater risk of having mastocytoma than other cancer diseases, such as oral melanoma, urothelial carcinoma, malignant lymphoma, and hepatocellular carcinoma. may also include determination of whether the value is high or low.
  • RNA Dye was added to 65 ⁇ L of the filtered gel, vigorously shaken, and centrifuged at 13,000 ⁇ g/10 minutes at room temperature. After setting the chip in a dedicated holder and injecting the gel, the condition solution, fluorescent marker, and ladder marker were sequentially injected according to the product instructions. Finally, it was added to the sample wells of the chip and mixed with a vortex mixer, and the RNA to be measured was measured with an Agilent 2100 bioanalyzer.
  • microarray analysis was performed by the following procedure.
  • (1) Clustering processing Based on 453 known microRNAs registered as canine microRNAs, hierarchical clustering processing of the entire sample is performed, the similarity of each sample is compared, and those with close expression values are arranged nearby. bottom.
  • the heat map image shows the level of microRNA gene expression levels, with lighter shading indicating lower gene expression levels and darker shading indicating higher gene expression levels.
  • the Manhattan distance which emphasizes the number of expressed genes and the difference in expression level, was used.
  • Principal Component Analysis Furthermore, in order to exclude samples with remarkably different expression trends, principal component analysis (PCA) was performed on all 224 samples.
  • PCA principal component analysis
  • Pattern A Specific microRNAs are selected that are capable of discriminating between healthy and specific cancer diseases. Diagnosis using such microRNAs is considered to be necessary for monitoring recurrence after treatment of specific cancers.
  • Pattern B A specific microRNA is selected that can discriminate between healthy and five types of cancer diseases with relatively high incidence. Diagnosis using such microRNA is useful in cancer screening, etc., to comprehensively check whether the patient is suffering from the five types of cancer that occur with relatively high frequency, and is considered to be the most needed. .
  • Pattern C Specific microRNAs are selected that are capable of discriminating between specific cancer diseases and other cancer diseases and healthy conditions. Diagnosis using such microRNAs makes it possible to distinguish specific cancer diseases from healthy as well as other difficult-to-distinguish cancers. Conceivable.
  • the LASSO regression analysis was performed according to the following procedure.
  • Evaluation values such as AUC, sensitivity, specificity, and cutoff value of the model were calculated using the data of the validation group.
  • Calculations based on the model were repeated 20 times, a ROC curve plotted for sensitivity and specificity was created, and the area under the ROC curve "AUC" was calculated.
  • Classification was performed in descending order of "AUC", and the top 20 discriminants were selected.
  • FIG. 2 and 3 show the ROC curve and AUC of the discriminant created in the LASSO regression analysis.
  • FIG. 2 and FIG. 3 each show sensitivity on the vertical axis and specificity on the horizontal axis, and one discriminant is selected for each diagnostic purpose/application and shown as a typical example. The closer the "AUC", which corresponds to the area under the ROC curve, is to "1", the higher the discriminative ability.
  • the discriminant formulas of the groups corresponding to the pattern A and pattern B shown in FIG. 2 most of them reach "AUC" of 1.00 between any groups, indicating extremely high discriminative ability.
  • the method for diagnosing canine cancer of the present invention can be used for early diagnosis and early treatment of canine cancer.

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Abstract

イヌのマイクロＲＮＡを用いた遺伝子発現解析の結果に基づいてコンピュータに診断させるイヌの癌の診断方法を提供する。　診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を取得し、当該結果を用いて、特定のマイクロＲＮＡについての遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを診断基準として、当該診断対象のイヌが特定の癌疾患に罹患しているリスクの程度を診断する、診断工程を含む、イヌの癌の診断方法であって、前記特定のマイクロＲＮＡは、イヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づいて、前記特定の癌疾患に罹患しているイヌと健常なイヌとの間での遺伝子発現レベルにおいて有意な差が認められるマイクロＲＮＡであることを特徴とする。

Description

イヌの癌の診断方法
　本発明は、マイクロＲＮＡの遺伝子発現解析結果に基づく、イヌの癌の診断方法に関する。
　癌の治療は早期発見、早期治療は重要である。しかしながら、従来の検査は腫瘍組織を切り取って病理検査するなどの侵襲的な方法であり、患者への負担が大きく、また、繰り返しの検査が難しいという問題があった。そこで、近年、注目を浴びているのが、血液、唾液、尿などの体液由来の特定のバイオマーカーを解析することにより、癌を検出する手法、すなわち、リキッドバイオプシーである。このような手法は、患者への負担が小さい、繰り返し採取できる、さらには単一臓器に限らず全身をスクニーニングできる、といったメリットがあり、癌の早期診断のみならず、治療後の再発モニタリングにも有用であると考えられている。
　マイクロＲＮＡは、血液、唾液、尿などの体液に含まれる、２２塩基程度の小さなＲＮＡであり、特定の遺伝子の発現を制御しており、癌等の疾患に伴って患者の血液中でその種類や量が変動することが知られている。ヒトにおいては、癌特異的なバイオマーカーとして、マイクロＲＮＡを使用し、その発現の解析結果に基づく、癌の診断キットの開発が進められている（たとえば、特許文献１）。
　しかしながら、イヌを対象として癌を検出するための有効な手法については、いまだ確立されていない。
再表２０１５／１９４６１５号
　本発明は、イヌのマイクロＲＮＡを用いた遺伝子発現解析の結果に基づく、正確かつ迅速なイヌの癌の診断方法を提供するものである。
　本発明の各実施態様は以下のとおりである。
［１］診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を取得し、当該結果を用いて、特定のマイクロＲＮＡについての遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを診断基準として、当該診断対象のイヌが特定の癌疾患に罹患しているリスクの程度を診断する、診断工程を含む、イヌの癌の診断方法であって、前記特定のマイクロＲＮＡは、イヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づいて、前記特定の癌疾患に罹患しているイヌと健常なイヌとの間での遺伝子発現レベルにおいて有意な差が認められるマイクロＲＮＡであることを特徴とする、イヌの癌の診断方法。
［２］前記診断工程の前に、イヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づいて、特定の癌疾患に罹患しているイヌと健常なイヌとの間での遺伝子発現レベルにおいて有意な差が認められるマイクロＲＮＡを、統計解析処理を用いて作成された判別式に基づき、特定のマイクロＲＮＡとして抽出する工程をさらに含む、［１］に記載の方法。
［３］前記特定の癌疾患が口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫からなる群より選択される、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記特定の癌疾患が口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫を含む５種の癌疾患であって、前記特定のマイクロＲＮＡがcfa-let-7c、cfa-miR-103、cfa-miR-10a、cfa-miR-122、cfa-miR-125a、cfa-miR-125b、cfa-miR-126、cfa-miR-130a、cfa-miR-144、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-186、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-19b、cfa-miR-22、cfa-miR-222、cfa-miR-223、cfa-miR-24、cfa-miR-26a、cfa-miR-27b、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-378、cfa-miR-383、cfa-miR-483、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-489、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-718、cfa-miR-874、cfa-miR-8794、cfa-miR-8798、cfa-miR-8843、cfa-miR-8859a、cfa-miR-8860、cfa-miR-8903、cfa-miR-8906、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908dおよびcfa-miR-92bからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］から［３］までのいずれに記載の方法。
［５］前記特定の癌疾患が口腔内メラノーマであって、前記特定のマイクロＲＮＡが、cfa-miR-10a、cfa-miR-1185、cfa-miR-125a、cfa-miR-126、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-184、cfa-miR-186、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-19b、cfa-miR-24、cfa-miR-30c、cfa-miR-483、cfa-miR-489、cfa-miR-8798、cfa-miR-8816、cfa-miR-8875およびcfa-miR-8908a-3pからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］から［３］までのいずれかに記載の方法。
［６］前記特定の癌疾患が尿路上皮がんであって、前記特定のマイクロＲＮＡが、cfa-let-7f、cfa-miR-10a、cfa-miR-1249、cfa-miR-125a、cfa-miR-126、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-133b、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-1844、cfa-miR-186、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-19b、cfa-miR-2114、cfa-miR-24、cfa-miR-29b、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-361、cfa-miR-370、cfa-miR-425、cfa-miR-483、cfa-miR-494、cfa-miR-502、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-665、cfa-miR-718、cfa-miR-8798、cfa-miR-8824、cfa-miR-8832、cfa-miR-8834a、cfa-miR-8843、cfa-miR-8904bおよびcfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3pからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］から［３］までのいずれかに記載の方法。
［７］前記特定の癌疾患が悪性リンパ腫であって、前記特定のマイクロＲＮＡが、cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-1249、cfa-miR-126、cfa-miR-1306、cfa-miR-144、cfa-miR-150、cfa-miR-184、cfa-miR-188、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-24、cfa-miR-342、cfa-miR-345、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-574、cfa-miR-8794、cfa-miR-8797、cfa-miR-8798、cfa-miR-8900、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8907およびcfa-miR-8908dからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］から［３］までのいずれかに記載の方法。
［８］前記特定の癌疾患が肝細胞がんであって、前記特定のマイクロＲＮＡが、cfa-let-7g、cfa-miR-10a、cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-125b、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-206、cfa-miR-22、cfa-miR-378、cfa-miR-383、cfa-miR-483、cfa-miR-665、cfa-miR-7、cfa-miR-718、cfa-miR-874、cfa-miR-8794、cfa-miR-8798、cfa-miR-8875、cfa-miR-8900、cfa-miR-8902、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92bおよびcfa-miR-99aからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］から［３］までのいずれかに記載の方法。
［９］前記特定の癌疾患が肥満細胞腫であって、前記特定のマイクロＲＮＡが、cfa-miR-10b、cfa-miR-1185、cfa-miR-125b、cfa-miR-126、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-222、cfa-miR-24、cfa-miR-26b、cfa-miR-8803、cfa-miR-8872、cfa-miR-8903、cfa-miR-8907およびcfa-miR-92bからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］から［３］までのいずれかに記載の方法。
［１０］診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を取得し、当該結果を用いて、特定のマイクロＲＮＡについての遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを診断基準として、当該診断対象のイヌが特定の癌疾患に罹患しているリスクの程度を診断する、診断工程を含む、イヌの癌の診断方法であって、前記特定のマイクロＲＮＡは、イヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づいて、前記特定の癌疾患に罹患しているイヌと、その他の癌疾患に罹患しているイヌおよび健常なイヌとの間での遺伝子発現レベルにおいて有意な差が認められるマイクロＲＮＡであることを特徴とする、イヌの癌の診断方法。
［１１］前記診断工程の前に、イヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づいて、特定の癌疾患に罹患しているイヌとその他の癌疾患に罹患しているイヌおよび健常なイヌとの間での遺伝子発現レベルにおいて有意な差が認められるマイクロＲＮＡを、統計解析処理を用いて作成された判別式に基づき、特定のマイクロＲＮＡとして抽出する工程をさらに含む、［１０］に記載の方法。
［１２］前記診断工程において、前記診断対象のイヌが前記特定の癌疾患に罹患しているリスクの程度は、その他の癌疾患に罹患しているリスクよりも高いか、あるいは低いことを含む、［１０］に記載の方法。
［１３］前記特定の癌疾患が口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫からなる群より選択される、［１０］から［１２］までのいずれかに記載の方法。
［１４］前記特定の癌疾患が口腔内メラノーマであって、前記診断において使用される特定のマイクロＲＮＡが、cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-126、cfa-miR-1271、cfa-miR-1306、cfa-miR-130b、cfa-miR-140、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-192、cfa-miR-197、cfa-miR-222、cfa-miR-29a、cfa-miR-29b、cfa-miR-30b、cfa-miR-370、cfa-miR-378、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-489、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-8803、cfa-miR-8816、cfa-miR-8824、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8859a、cfa-miR-8875、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908dおよびcfa-miR-92bからなる群より選択された少なくとも１種である、［１０］から［１３］までのいずれかに記載の方法。
［１５］前記特定の癌疾患が尿路上皮がんであり、前記診断において使用される特定のマイクロＲＮＡが、cfa-let-7b、cfa-miR-107、cfa-miR-10b、cfa-miR-122、cfa-miR-125b、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-133b、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-181a、cfa-miR-185、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-19b、cfa-miR-23a、cfa-miR-29c、cfa-miR-345、cfa-miR-361、cfa-miR-370、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-8794、cfa-miR-8803、cfa-miR-8816、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8860、cfa-miR-8873a、cfa-miR-8891、cfa-miR-8903、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92b、cfa-miR-93およびcfa-miR-99aからなる群より選択された少なくとも１種である、［１０］から［１３］までのいずれかに記載の方法。
［１６］前記特定の癌疾患が悪性リンパ腫であり、前記診断において使用される特定のマイクロＲＮＡが、cfa-let-7f、cfa-miR-122、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-140、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-151、cfa-miR-15a、cfa-miR-181a、cfa-miR-1844、cfa-miR-188、cfa-miR-192、cfa-miR-193a、cfa-miR-21、cfa-miR-22、cfa-miR-23b、cfa-miR-24、cfa-miR-26a、cfa-miR-26b、cfa-miR-27b、cfa-miR-301a、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-345、cfa-miR-378、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-551b、cfa-miR-574、cfa-miR-631、cfa-miR-8794、cfa-miR-8803、cfa-miR-8809、cfa-miR-8836、cfa-miR-8843、cfa-miR-8863、cfa-miR-8872、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8906、cfa-miR-8907およびcfa-miR-8908dからなる群より選択された少なくとも１種である、［１０］から［１３］までのいずれかに記載の方法。
［１７］前記特定の癌疾患が肝細胞がんであり、前記診断において使用される特定のマイクロＲＮＡが、cfa-let-7b、cfa-let-7c、cfa-let-7f、cfa-let-7g、cfa-miR-10b、cfa-miR-122、cfa-miR-1249、cfa-miR-132、cfa-miR-134、cfa-miR-146a、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-16、cfa-miR-206、cfa-miR-22、cfa-miR-223、cfa-miR-29a、cfa-miR-30d、cfa-miR-331、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-483、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-574、cfa-miR-8794、cfa-miR-8815、cfa-miR-8824、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8836、cfa-miR-8843、cfa-miR-8860、cfa-miR-8892、cfa-miR-8900、cfa-miR-8903、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92bおよびcfa-miR-99aからなる群より選択された少なくとも１種である、［１０］から［１３］までのいずれかに記載の方法。
［１８］前記特定の癌疾患が肥満細胞腫であり、前記診断において使用される特定のマイクロＲＮＡが、cfa-let-7c、cfa-let-7f、cfa-miR-10a、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-144、cfa-miR-149、cfa-miR-186、cfa-miR-188、cfa-miR-18a、cfa-miR-191、cfa-miR-221、cfa-miR-223、cfa-miR-301a、cfa-miR-30c、cfa-miR-342、cfa-miR-370、cfa-miR-451、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-551b、cfa-miR-574、cfa-miR-631、cfa-miR-8809、cfa-miR-8815、cfa-miR-8816、cfa-miR-8834a、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8903およびcfa-miR-92bからなる群より選択された少なくとも１種である、［１０］から［１３］までのいずれかに記載の方法。
［１９］口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫を含む５種のイヌの癌疾患を診断するための、cfa-let-7c、cfa-miR-103、cfa-miR-10a、cfa-miR-122、cfa-miR-125a、cfa-miR-125b、cfa-miR-126、cfa-miR-130a、cfa-miR-144、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-186、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-19b、cfa-miR-22、cfa-miR-222、cfa-miR-223、cfa-miR-24、cfa-miR-26a、cfa-miR-27b、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-378、cfa-miR-383、cfa-miR-483、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-489、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-718、cfa-miR-874、cfa-miR-8794、cfa-miR-8798、cfa-miR-8843、cfa-miR-8859a、cfa-miR-8860、cfa-miR-8903、cfa-miR-8906、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908dおよびcfa-miR-92bからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
［２０］イヌの口腔内メラノーマを診断するための、cfa-miR-10a、cfa-miR-1185、cfa-miR-125a、cfa-miR-126、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-184、cfa-miR-186、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-19b、cfa-miR-24、cfa-miR-30c、cfa-miR-483、cfa-miR-489、cfa-miR-8798、cfa-miR-8816、cfa-miR-8875およびcfa-miR-8908a-3pからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
［２１］イヌの尿路上皮がんを診断するための、cfa-let-7f、cfa-miR-10a、cfa-miR-1249、cfa-miR-125a、cfa-miR-126、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-133b、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-1844、cfa-miR-186、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-19b、cfa-miR-2114、cfa-miR-24、cfa-miR-29b、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-361、cfa-miR-370、cfa-miR-425、cfa-miR-483、cfa-miR-494、cfa-miR-502、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-665、cfa-miR-718、cfa-miR-8798、cfa-miR-8824、cfa-miR-8832、cfa-miR-8834a、cfa-miR-8843、cfa-miR-8904bおよびcfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3pからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
［２２］イヌの悪性リンパ腫を診断するための、cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-1249、cfa-miR-126、cfa-miR-1306、cfa-miR-144、cfa-miR-150、cfa-miR-184、cfa-miR-188、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-24、cfa-miR-342、cfa-miR-345、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-574、cfa-miR-8794、cfa-miR-8797、cfa-miR-8798、cfa-miR-8900、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8907およびcfa-miR-8908dからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
［２３］イヌの肝細胞がんを診断するための、cfa-let-7g、cfa-miR-10a、cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-125b、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-206、cfa-miR-22、cfa-miR-378、cfa-miR-383、cfa-miR-483、cfa-miR-665、cfa-miR-7、cfa-miR-718、cfa-miR-874、cfa-miR-8794、cfa-miR-8798、cfa-miR-8875、cfa-miR-8900、cfa-miR-8902、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92bおよびcfa-miR-99aからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
［２４］イヌの肥満細胞腫を診断するための、cfa-miR-10b、cfa-miR-1185、cfa-miR-125b、cfa-miR-126、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-222、cfa-miR-24、cfa-miR-26b、cfa-miR-8803、cfa-miR-8872、cfa-miR-8903、cfa-miR-8907およびcfa-miR-92bからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
［２５］イヌの口腔内メラノーマを診断するための、cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-126、cfa-miR-1271、cfa-miR-1306、cfa-miR-130b、cfa-miR-140、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-192、cfa-miR-197、cfa-miR-222、cfa-miR-29a、cfa-miR-29b、cfa-miR-30b、cfa-miR-370、cfa-miR-378、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-489、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-8803、cfa-miR-8816、cfa-miR-8824、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8859a、cfa-miR-8875、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908dおよびcfa-miR-92bからなる群より選択された少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
［２６］イヌの尿路上皮がんを診断するための、cfa-let-7b、cfa-miR-107、cfa-miR-10b、cfa-miR-122、cfa-miR-125b、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-133b、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-181a、cfa-miR-185、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-19b、cfa-miR-23a、cfa-miR-29c、cfa-miR-345、cfa-miR-361、cfa-miR-370、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-8794、cfa-miR-8803、cfa-miR-8816、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8860、cfa-miR-8873a、cfa-miR-8891、cfa-miR-8903、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92b、cfa-miR-93およびcfa-miR-99aからなる群より選択された少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
［２７］イヌの悪性リンパ腫を診断するための、cfa-let-7f、cfa-miR-122、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-140、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-151、cfa-miR-15a、cfa-miR-181a、cfa-miR-1844、cfa-miR-188、cfa-miR-192、cfa-miR-193a、cfa-miR-21、cfa-miR-22、cfa-miR-23b、cfa-miR-24、cfa-miR-26a、cfa-miR-26b、cfa-miR-27b、cfa-miR-301a、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-345、cfa-miR-378、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-551b、cfa-miR-574、cfa-miR-631、cfa-miR-8794、cfa-miR-8803、cfa-miR-8809、cfa-miR-8836、cfa-miR-8843、cfa-miR-8863、cfa-miR-8872、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8906、cfa-miR-8907およびcfa-miR-8908dからなる群より選択された少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
［２８］イヌの肝細胞がんを診断するための、cfa-let-7b、cfa-let-7c、cfa-let-7f、cfa-let-7g、cfa-miR-10b、cfa-miR-122、cfa-miR-1249、cfa-miR-132、cfa-miR-134、cfa-miR-146a、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-16、cfa-miR-206、cfa-miR-22、cfa-miR-223、cfa-miR-29a、cfa-miR-30d、cfa-miR-331、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-483、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-574、cfa-miR-8794、cfa-miR-8815、cfa-miR-8824、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8836、cfa-miR-8843、cfa-miR-8860、cfa-miR-8892、cfa-miR-8900、cfa-miR-8903、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92bおよびcfa-miR-99aからなる群より選択された少なくとも１種マイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
［２９］イヌの肥満細胞腫を診断するための、cfa-let-7c、cfa-let-7f、cfa-miR-10a、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-144、cfa-miR-149、cfa-miR-186、cfa-miR-188、cfa-miR-18a、cfa-miR-191、cfa-miR-221、cfa-miR-223、cfa-miR-301a、cfa-miR-30c、cfa-miR-342、cfa-miR-370、cfa-miR-451、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-551b、cfa-miR-574、cfa-miR-631、cfa-miR-8809、cfa-miR-8815、cfa-miR-8816、cfa-miR-8834a、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8903およびcfa-miR-92bからなる群より選択された少なくとも１種マイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
　本発明により、正確かつ迅速なイヌの癌の診断方法が提供される。
マイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を示す図 マイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を示す図 モデル判別式のＲＯＣ曲線およびＡＵＣを示す図 モデル判別式のＲＯＣ曲線およびＡＵＣを示す図 本発明の実施において抽出された各判別式とそのＡＵＣを示す図 本発明の実施において抽出された各判別式とそのＡＵＣを示す図 本発明の実施において抽出された各判別式とそのＡＵＣを示す図 本発明の実施において抽出された各判別式とそのＡＵＣを示す図 本発明の実施において抽出された各判別式とそのＡＵＣを示す図 本発明の実施において抽出された各判別式とそのＡＵＣを示す図 本発明の実施において抽出された各判別式とそのＡＵＣを示す図 本発明の実施において抽出された各判別式とそのＡＵＣを示す図 本発明の実施において抽出された各判別式とそのＡＵＣを示す図 本発明の実施において抽出された各判別式とそのＡＵＣを示す図 本発明の実施において抽出された各判別式とそのＡＵＣを示す図
［イヌの癌の診断方法に含まれる各工程について］
　ここでは、本発明のイヌの癌の診断方法をいくつかの工程に分けて具体的に説明するが、当該方法に含まれる各工程の順序、分離および統合などの変更は、本発明の目的を逸脱しない限りにおいて可能であるものとする。
　＜ステップ１；マイクロＲＮＡの発現解析＞
　サンプル（被検体）としてイヌの体液を収集し、収集した体液からマイクロＲＮＡを抽出し、抽出したマイクロＲＮＡについての遺伝子発現解析をおこない、マイクロＲＮＡの発現量を検出する。
　前記サンプルとして、健常なイヌの体液のほか、「特定の癌疾患」を含む癌に罹患しているイヌの体液を準備する。本開示の範囲内において、「特定の癌疾患」とは、診断すべき癌疾患を意味するものであってよい。
　前記体液の例として、血清、唾液または尿などが挙げられる。好適には、イヌの血清を用いる。
　前記「特定の癌疾患」として、イヌの癌として比較的発生頻度の高い口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫からなる群により選択することができるが、これに限定されるものでない。
　前記遺伝子発現解析の手法として、たとえば、マイクロアレイ解析または次世代シーケンス技術（ＮＧＳ）などを用いることができるが、イヌの体液から抽出されるマイクロＲＮＡの遺伝子発現を検出可能な限りにおいて、当該技術分野においてよく知られた別の手法を採用してもよい。ただし、ここで行う遺伝子発現解析は、各癌疾患と遺伝子発現量との相互関係を広く解析する必要があることから、イヌの体液から抽出されるマイクロＲＮＡを可能な限り網羅的に解析可能な手法を採用することが望ましい。このことから、好適には、マイクロアレイ解析を用いることができる。なお、マイクロアレイ解析を含め、前記遺伝子発現解析の手法は既知であるため、ここでは詳細な説明を省略する。また、前記遺伝子発現解析は、マイクロＲＮＡの遺伝子発現量を整理する作業も含めて、その解析結果が膨大なデータ量となるため、コンピュータに実行させることが望ましい。
　＜ステップ２；特定のマイクロＲＮＡの抽出＞
　前記マイクロＲＮＡの発現解析の結果に基づき、「特定の癌疾患」に罹患しているイヌと健常なイヌとの間の遺伝子発現レベルにおいて、あるいは特定の実施形態においては、特定の癌疾患に罹患しているイヌと、その他の癌疾患に罹患しているイヌおよび健常なイヌとの間の遺伝子発現レベルにおいて、有意な差がみられるマイクロＲＮＡを抽出する。ここで、抽出されるマイクロＲＮＡの数は、抽出の手法およびその対象に依存し、これに限定されるものではないが一般に１～８０種程度、好適には４～５０種程度である。
　本開示の範囲内において、このようなマイクロＲＮＡを「特定のマイクロＲＮＡ」と呼称する。
　また、前記「特定の癌疾患」として、イヌの癌として比較的発生頻度の高い口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫からなる群により選択することができるが、これに限定されるものでない。
　前記「特定のマイクロＲＮＡ」の抽出方法として、前記マイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づいて統計解析処理をおこない、イヌの癌を予測するためのモデル判別式を構築し、このような判別式から「特定のマイクロＲＮＡ」を抽出する手法を採用することができる。
　前記統計解析処理の具体的な手法として、たとえば、ＬＡＳＳＯ（at least absolute shrinkage and selection operator）回帰分析を挙げることができるが、本発明の目的を達成できる限りにおいて、これに限定されるものではない。
　特定の実施形態において、前記「特定のマイクロＲＮＡ」の抽出方法として、前記マイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づいてＬＡＳＳＯ回帰分析をおこない、イヌの癌を予測するためのモデル判別式を構築し、このような判別式から「特定のマイクロＲＮＡ」を抽出する手法を採用することができる。
　ＬＡＳＳＯ回帰分析は、生成する統計モデルの予測精度と解釈可能性を向上させる回帰分析手法として知られており、前記ＬＡＳＳＯ回帰分析を用いた手法は、「特定の癌疾患」においてより特徴的および／または頻度の高いマイクロＲＮＡを、後の診断工程においてバイオマーカーとして利用可能な「特定のマイクロＲＮＡ」として抽出するのに、特に好適である。
　また、前記「特定のマイクロＲＮＡ」の抽出する他の手法として、前記遺伝子発現解析の結果に基づいてヒートマップ画像を生成し、「特定の癌疾患」に罹患しているイヌと健常なイヌ（場合によっては、その他の癌疾患に罹患しているイヌを含む）との間の遺伝子発現レベルにおいて、顕著な差、たとえば、２倍以上の差が認められるマイクロＲＮＡを、コンピュータによる画像解析処理によって機械的に選定し、このようなマイクロＲＮＡの中から、「特定のマイクロＲＮＡ」を抽出する手法を挙げることができる。ヒートマップ画像とは、遺伝子の発現量を視覚化した画像であり、使用される色彩の種類や濃淡によって遺伝子の発現量の高低を示す。
　したがって、前記「特定のマイクロＲＮＡ」を抽出する他の手法として、このようなマイクロＲＮＡの発現解析の結果を直感的に認識可能なヒートマップ画像を生成し、さらにクラスタリング処理などを施した後に、前記ＬＡＳＳＯ回帰分析を用いた手法と組みあわせるか、あるいは前記ＬＡＳＳＯ回帰分析の前処理的にヒートマップ画像を生成する手法を採用してもよい。
　さらに、前記「特定のマイクロＲＮＡ」を抽出する手法として、ＡＩを用いた機械学習などに基づく画像解析処理によって「特定のマイクロＲＮＡ」の抽出する手法も想定され、本発明においてこれを排除するものではない。このようなＡＩによる画像解析処理によって、複数のマイクロＲＮＡを組み合わせることによってのみ有意な差が認められるケースや、あるいは微差であっても有意な差が認められるケースなど、単純な閾値設定では抽出が難しいマイクロＲＮＡの抽出が可能になることが期待される。
　また、前記「特定のマイクロＲＮＡ」の抽出は、遺伝子の発現量を正確にマッピングすることが必要なヒートマップ画像の生成をおこなう場合も含め、コンピュータに実行させることが望ましい。このようなコンピュータは、本発明の実施のために別途開発されたソフトウェアをインストールしたものであってもよいし、また、前記遺伝子発現解析、たとえば、マイクロアレイ解析のために開発された市販のソフトウェアをインストールしたものであってもよい。
　＜ステップ３：特定のマイクロＲＮＡを用いた診断＞
　診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を新たに取得し、当該結果を用いて、前記抽出された「特定のマイクロＲＮＡ」について、その遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを診断基準として前記診断対象のイヌが、前記「特定の癌疾患」に罹患しているリスクの程度を診断する。
　診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの発現解析に用いられる手法は、前記ステップ１の遺伝子発現解析の手法と同じか、あるいは異なってもよく、たとえば、マイクロアレイ解析を採用することができるが、これに限定されるものではない。
　また、前記体液の例として、血清、唾液または尿などが挙げられるが、好適には、イヌの血清を用いる。
　前記リスクの程度とは、「その癌に罹患している／罹患していない」のいずれかによって択一的に診断が示される態様であってもよいし、また、「その癌に罹患している可能性ＸＸ％」のように、多段階に診断が示される態様であってもよい。特定の実施形態において、前記リスクの程度は、「特定の癌に罹患しているリスクが、その他の癌疾患に罹患しているリスクよりも高い／低い」のような診断が示される態様を含むものであってよい。
　また、本発明によれば、特定の癌疾患との特に関連性が高いとされる「特定のマイクロＲＮＡ」が予め抽出されていることから、診断対象について一般には１～８０種程度、好適には４～５０種程度の数の「特定のマイクロＲＮＡ」について発現解析を行うことで足り、広く網羅的な発現解析の必要がない。要するに、診断対象のイヌのマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析を効率よくおこなうことが可能となる結果、その診断にかかる処理負担が小さくなり、迅速かつ正確なイヌの癌の診断が可能となる。
　したがって、前記診断は、コンピュータに実行されることが望ましいが、その比較的小さい処理負担から、一般家庭で使用されるパーソナルコンピュータやスマートフォン等によって実行することも可能となる。
　［イヌの癌の診断に用いるためのバイオマーカーについて］
　以下、本発明の実施において抽出された「特定のマイクロＲＮＡ」を、そのバイオマーカーとしての利用が想定される診断目的／用途ごとに、具体的に示す。
＜５種の癌疾患の診断に用いるためのマイクロＲＮＡ＞
　口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫を含む５種の癌疾患のいずれかに罹患しているイヌと健常なイヌとを区別するために有効なマイクロＲＮＡとして、以下の４４個のマイクロＲＮＡが抽出された：
cfa-let-7c、cfa-miR-103、cfa-miR-10a、cfa-miR-122、cfa-miR-125a、cfa-miR-125b、cfa-miR-126、cfa-miR-130a、cfa-miR-144、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-186、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-19b、cfa-miR-22、cfa-miR-222、cfa-miR-223、cfa-miR-24、cfa-miR-26a、cfa-miR-27b、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-378、cfa-miR-383、cfa-miR-483、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-489、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-718、cfa-miR-874、cfa-miR-8794、cfa-miR-8798、cfa-miR-8843、cfa-miR-8859a、cfa-miR-8860、cfa-miR-8903、cfa-miR-8906、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908dおよびcfa-miR-92b。
各マイクロＲＮＡの頻度および塩基配列を以下に示す；
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　前記マイクロＲＮＡは、口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫を含む５種の癌疾患のいずれかに罹患しているイヌと健常なイヌからそれぞれ抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づき、ＬＡＳＳＯ回帰分析を利用した統計解析処理により、前記特定の癌疾患を予測するためのモデル判別式を構築し、前記５種の癌疾患に特徴的および／または頻度の高いマイクロＲＮＡを含むものとして選出された上位２０の判別式に含まれるマイクロＲＮＡである。前記判別式とそれらの判別能を示すＡＵＣを図４（「健常ＶＳ全がん（５種）」）に示す。
　したがって、本発明の実施において、診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を新たに取得し、前記マイクロＲＮＡの少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種、２７種、２８種、２９種、３０種、３１種、３２種、３３種、３４種、３５種、３６種、３７種、３８種、３９種、４０種、４１種、４２種、４３種または４４種すべてについてその遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを基準として、前記診断対象のイヌが口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫のいずれかに罹患しているリスクの程度を診断することができる。
　前記「特定のマイクロＲＮＡ」には、口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫を含む５種の癌疾患において、健常のイヌと比較した場合に、特に遺伝子発現レベルの高いものと、特に遺伝子発現レベルの低いものの双方が含まれうる。
　したがって、診断にあたっては、cfa-miR-483、cfa-miR-718、cfa-miR-8794、cfa-miR-8798、cfa-miR-8859a、cfa-miR-8908a-3pおよびcfa-miR-92bからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡについて遺伝子発現レベルの高いイヌを、口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫のいずれかに罹患しているリスクが高いものと診断し、かつ／またはcfa-let-7c、cfa-miR-103、cfa-miR-10a、cfa-miR-125a、cfa-miR-125b、cfa-miR-126、cfa-miR-144、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-186、cfa-miR-199、cfa-miR-19b、cfa-miR-24、cfa-miR-26a、cfa-miR-383、cfa-miR-489、cfa-miR-8907およびcfa-miR-8908dからなる群の少なくとも１種のマイクロＲＮＡについて遺伝子発現レベルの高いイヌを、口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫のいずれかに罹患しているリスクが低いものと診断することが望ましい。
　なお、前記「特定のマイクロＲＮＡ」をバイオマーカーとして用いたイヌの癌の診断は、癌検診などで、比較的発生頻度の高い特定の癌疾患に罹患していないかを包括的に調べるのに役立ち、最もニーズが高いと考えられる。
　＜口腔内メラノーマの診断に用いるためのマイクロＲＮＡ＞
　口腔内メラノーマに罹患しているイヌと健常なイヌの診断とを区別するために有効なバイオマーカーとして、以下に示す２２個のマイクロＲＮＡを挙げることができる：
cfa-miR-10a、cfa-miR-1185、cfa-miR-125a、cfa-miR-126、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-184、cfa-miR-186、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-19b、cfa-miR-24、cfa-miR-30c、cfa-miR-483、cfa-miR-489、cfa-miR-8798、cfa-miR-8816、cfa-miR-8875およびcfa-miR-8908a-3p。
各マイクロＲＮＡの頻度および塩基配列を以下に示す；
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　前記マイクロＲＮＡは、口腔内メラノーマに罹患しているイヌと健常なイヌからそれぞれ抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づき、ＬＡＳＳＯ回帰分析を利用した統計解析処理により、口腔内メラノーマを予測するためのモデル判別式を構築し、口腔内メラノーマに特徴的および／または頻度の高いマイクロＲＮＡを含むものとして選出された上位２０の判別式に含まれるマイクロＲＮＡである。前記判別式とそれらの判別能を示すＡＵＣを図４（「健常ＶＳ口腔内メラノーマ」）に示す。
　したがって、本発明によれば、診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を新たに取得し、前記マイクロＲＮＡの少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種または２２種すべてについてその遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを基準として、前記イヌが口腔内メラノーマに罹患しているリスクの程度を診断することができる。
　前記「特定のマイクロＲＮＡ」には、口腔内メラノーマにおいて、健常のイヌと比較した場合に、特に遺伝子発現レベルの高いものと、特に遺伝子発現レベルの低いものの双方が含まれうる。
　したがって、診断にあたっては、cfa-miR-197、cfa-miR-483、cfa-miR-8798、cfa-miR-8875およびcfa-miR-8908a-3pからなる群からの少なくとも１種のマイクロＲＮＡについて遺伝子発現レベルの高いイヌを、口腔内メラノーマに罹患しているリスクが高いものと診断し、かつ／またはcfa-miR-10a、cfa-miR-125a、cfa-miR-126、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-155、cfa-miR-184、cfa-miR-186、cfa-miR-199、cfa-miR-19b、cfa-miR-24、cfa-miR-30cおよびcfa-miR-489からなる群からの少なくとも１種のマイクロＲＮＡについて遺伝子発現レベルの高いイヌを、口腔内メラノーマに罹患しているリスクが低いものと診断することが望ましい。
　なお、前記「特定のマイクロＲＮＡ」をバイオマーカーとして用いたイヌの癌の診断は、癌検診などのほか、口腔内メラノーマの治療後の再発をモニターするなどのニーズがあると考えられる。
　＜尿路上皮がんの診断に用いるためのマイクロＲＮＡ＞
　尿路上皮がんに罹患しているイヌと健常なイヌの診断とを区別するために有効なバイオマーカーとして、以下に示す４１個のマイクロＲＮＡを挙げることができる：
cfa-let-7f、cfa-miR-10a、cfa-miR-1249、cfa-miR-125a、cfa-miR-126、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-133b、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-1844、cfa-miR-186、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-19b、cfa-miR-2114、cfa-miR-24、cfa-miR-29b、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-361、cfa-miR-370、cfa-miR-425、cfa-miR-483、cfa-miR-494、cfa-miR-502、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-665、cfa-miR-718、cfa-miR-8798、cfa-miR-8824、cfa-miR-8832、cfa-miR-8834a、cfa-miR-8843、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8907およびcfa-miR-8908a-3p。各マイクロＲＮＡの頻度および塩基配列を以下に示す；
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　前記マイクロＲＮＡは、尿路上皮がんに罹患しているイヌと健常なイヌからそれぞれ抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づき、ＬＡＳＳＯ回帰分析を利用した統計解析処理により、尿路上皮がんを予測するためのモデル判別式を構築し、尿路上皮がんに特徴的および／または頻度の高いマイクロＲＮＡを含むものとして選出された上位２０の判別式に含まれるマイクロＲＮＡである。前記判別式とそれらの判別能を示すＡＵＣを図４（「健常ＶＳ尿路上皮がん」）に示す。
　したがって、本発明によれば、診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子解析の結果を新たに取得し、前記マイクロＲＮＡの少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種、２７種、２８種、２９種、３０種、３１種、３２種、３３種、３４種、３５種、３６種、３７種、３８種、３９種、４０種または４１種すべてについてその遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを基準として、前記イヌが、尿路上皮がんに罹患しているリスクの程度を診断することができる。
　前記「特定のマイクロＲＮＡ」には、尿路上皮がんにおいて、健常のイヌと比較して、特に遺伝子発現レベルの高いものと、特に遺伝子発現レベルの低いものの双方が含まれうる。
　したがって、前記診断にあたっては、cfa-miR-483、cfa-miR-718およびcfa-miR-8908a-3pからなる群からの少なくとも１種のマイクロＲＮＡについて遺伝子発現レベルの高いイヌを、尿路上皮がんに罹患しているリスクが高いものと診断し、かつ／またはcfa-miR-125a、cfa-miR-126、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-186、cfa-miR-2114、cfa-miR-24、cfa-miR-29b、cfa-miR-8832およびcfa-miR-8907からなる群からの少なくとも１種のマイクロＲＮＡについて遺伝子発現レベルの高いイヌを、尿路上皮がんに罹患しているリスクが低いものと診断することが望ましい。
　なお、前記「特定のマイクロＲＮＡ」をバイオマーカーとして用いたイヌの癌の診断は、癌検診などのほか、尿路上皮がんの治療後の再発をモニターするなどのニーズがあると考えられる。
　＜悪性リンパ腫の診断に用いるためのマイクロＲＮＡ＞
　悪性リンパ腫に罹患しているイヌと健常なイヌとを区別するために有効なバイオマーカーとして、以下に示す２４個のマイクロＲＮＡを挙げることができる：
cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-1249、cfa-miR-126、cfa-miR-1306、cfa-miR-144、cfa-miR-150、cfa-miR-184、cfa-miR-188、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-24、cfa-miR-342、cfa-miR-345、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-574、cfa-miR-8794、cfa-miR-8797、cfa-miR-8798、cfa-miR-8900、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8907およびcfa-miR-8908d。
各マイクロＲＮＡの頻度および塩基配列を以下に示す；
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　前記マイクロＲＮＡは、悪性リンパ腫に罹患しているイヌと健常なイヌからそれぞれ抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づき、ＬＡＳＳＯ回帰分析を利用した統計解析処理により、悪性リンパ腫を予測するためのモデル判別式を構築し、悪性リンパ腫に特徴的および／または頻度の高いマイクロＲＮＡを含むものとして選出された上位２０の判別式に含まれるマイクロＲＮＡである。前記判別式とそれらの判別能を示すＡＵＣを図４（「健常ＶＳ悪性リンパ腫」）に示す。
　したがって、本発明によれば、診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を取得し、前記マイクロＲＮＡの少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種または２４種すべてについてその遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを基準として、前記イヌが、悪性リンパ腫に罹患しているリスクの程度を診断することができる。
　前記「特定のマイクロＲＮＡ」には、悪性リンパ腫において、健常のイヌと比較して、特に遺伝子発現レベルの高いものと、特に遺伝子発現レベルの低いものの双方が含まれうる。
　したがって、診断にあたっては、cfa-miR-188、cfa-miR-342、cfa-miR-378、cfa-miR-8797、cfa-miR-8798およびcfa-miR-8904bからなる群からの少なくとも１種のマイクロＲＮＡについて遺伝子発現レベルの高いイヌを、悪性リンパ腫に罹患しているリスクが高いものと診断し、かつ／またはcfa-miR-126、cfa-miR-1306、cfa-miR-144、cfa-miR-184、cfa-miR-199、cfa-miR-24、cfa-miR-345、cfa-miR-574、cfa-miR-8900、cfa-miR-8907およびcfa-miR-8908dからなる群からの少なくとも１種のマイクロＲＮＡについて遺伝子発現レベルの高いイヌを、悪性リンパ腫に罹患しているリスクが低いものと診断することが望ましい。
　なお、前記「特定のマイクロＲＮＡ」をバイオマーカーとして用いたイヌの癌の診断は、癌検診などのほか、悪性リンパ腫の治療後の再発をモニターするなどのニーズがあると考えられる。
　＜肝細胞がんの診断に用いるためのマイクロＲＮＡ＞
　肝細胞がんに罹患しているイヌと健常なイヌとを区別するために有効なバイオマーカーとして、以下に示す２８個のマイクロＲＮＡを挙げることができる：
cfa-let-7g、cfa-miR-10a、cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-125b、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-206、cfa-miR-22、cfa-miR-378、cfa-miR-383、cfa-miR-483、cfa-miR-665、cfa-miR-7、cfa-miR-718、cfa-miR-874、cfa-miR-8794、cfa-miR-8798、cfa-miR-8875、cfa-miR-8900、cfa-miR-8902、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92bおよびcfa-miR-99a。
各マイクロＲＮＡの頻度および塩基配列を以下に示す；
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　前記マイクロＲＮＡは、肝細胞がんに罹患しているイヌと健常なイヌからそれぞれ抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づき、ＬＡＳＳＯ回帰分析を利用した統計解析処理により、肝細胞がんを予測するためのモデル判別式を構築し、肝細胞がんに特徴的および／または頻度の高いマイクロＲＮＡを含むものとして選出された上位２０の判別式に含まれるマイクロＲＮＡである。前記判別式とそれらの判別能を示すＡＵＣを図４（「健常ＶＳ肝細胞がん」）に示す。
　したがって、本発明の診断工程において、診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を新たに取得し、前記マイクロＲＮＡの少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種または２４種すべてについてその遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを基準として、肝細胞がんに罹患しているリスクの程度を診断することができる。
　前記「特定のマイクロＲＮＡ」には、肝細胞がんにおいて、健常のイヌと比較して、特に遺伝子発現レベルの高いものと、特に遺伝子発現レベルの低いものの双方が含まれうる。
　したがって、診断にあたっては、たとえば、cfa-miR-122、cfa-miR-206、cfa-miR-378、cfa-miR-483、cfa-miR-665、cfa-miR-718、cfa-miR-8794、cfa-miR-8798、cfa-miR-8875、cfa-miR-8908a-3pおよびcfa-miR-92bからなる群からの少なくとも１種のマイクロＲＮＡについて遺伝子発現レベルの高いイヌを、肝細胞がんに罹患しているリスクが高いものと診断し、かつ／またはcfa-let-7g、cfa-miR-10a、cfa-miR-125b、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-199、cfa-miR-383、cfa-miR-7、cfa-miR-8900、cfa-miR-8902、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908dおよびcfa-miR-99aからなる群からの少なくとも１種のマイクロＲＮＡについて遺伝子発現レベルの高いイヌを、肝細胞がんに罹患しているリスクが低いものと診断することが望ましい。
　なお、前記「特定のマイクロＲＮＡ」をバイオマーカーとして用いたイヌの癌の診断は、癌検診などのほか、肝細胞がんの治療後の再発をモニターするなどのニーズがあると考えられる。
　＜肥満細胞腫の診断に用いるためのマイクロＲＮＡ＞
　肥満細胞腫に罹患しているイヌと健常なイヌの診断とを区別するために有効なバイオマーカーとして、以下に示す１７個のマイクロＲＮＡを挙げることができる：
cfa-miR-10b、cfa-miR-1185、cfa-miR-125b、cfa-miR-126、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-222、cfa-miR-24、cfa-miR-26b、cfa-miR-8803、cfa-miR-8872、cfa-miR-8903、cfa-miR-8907およびcfa-miR-92b。
各マイクロＲＮＡの頻度および塩基配列を以下に示す；
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　前記マイクロＲＮＡは、肥満細胞腫に罹患しているイヌと健常なイヌからそれぞれ抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づき、ＬＡＳＳＯ回帰分析を利用した統計解析処理により、肥満細胞腫を予測するためのモデル判別式を構築し、肥満細胞腫に特徴的および／または頻度の高いマイクロＲＮＡを含むものとして選出された上位２０の判別式に含まれるマイクロＲＮＡである。前記判別式とそれらの判別能を示すＡＵＣを図４（「健常ＶＳ肥満細胞腫」）に示す。
　したがって、本発明によれば、診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を新たに取得し、前記マイクロＲＮＡの少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種または１７種すべてについてその遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを基準として、肥満細胞腫に罹患しているリスクの程度を診断することができる。
　前記「特定のマイクロＲＮＡ」には、肥満細胞腫において、健常のイヌと比較して、特に遺伝子発現レベルの高いものと、特に遺伝子発現レベルの低いものの双方が含まれうる。
　したがって、診断にあたっては、cfa-miR-8803、cfa-miR-8903およびcfa-miR-92bからなる群からの少なくとも１種のマイクロＲＮＡについて遺伝子発現レベルの高いイヌを、肥満細胞腫に罹患しているリスクが高いものと診断し、かつ／またはcfa-miR-126、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-199、cfa-miR-8872およびcfa-miR-8907からなる群からの少なくとも１種のマイクロＲＮＡについて遺伝子発現レベルの高いイヌを、肥満細胞腫に罹患しているリスクが低いものと診断することが望ましい。
　なお、前記「特定のマイクロＲＮＡ」を用いたイヌの癌の診断方法は、癌検診などのほか、肥満細胞腫の治療後の再発をモニターするなどのニーズがあると考えられる。
　＜口腔内メラノーマの診断のためのマイクロＲＮＡ（その他の癌疾患との区別も含む）＞
　口腔内メラノーマに罹患しているイヌと、その他の癌疾患に罹患しているイヌおよび健常イヌとを区別するための有効なバイオマーカーとして、以下に示す３５個のマイクロＲＮＡを挙げることができる：
cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-126、cfa-miR-1271、cfa-miR-1306、cfa-miR-130b、cfa-miR-140、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-192、cfa-miR-197、cfa-miR-222、cfa-miR-29a、cfa-miR-29b、cfa-miR-30b、cfa-miR-370、cfa-miR-378、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-489、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-8803、cfa-miR-8816、cfa-miR-8824、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8859a、cfa-miR-8875、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908dおよびcfa-miR-92b。
各マイクロＲＮＡの頻度および塩基配列を以下に示す；
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　前記マイクロＲＮＡは、口腔内メラノーマに罹患しているイヌと、その他の癌疾患に罹患してるイヌおよび健常なイヌからそれぞれ抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づき、ＬＡＳＳＯ回帰分析を利用した統計解析処理により、口腔内メラノーマを予測するためのモデル判別式を構築し、口腔内メラノーマに特徴的および／または頻度の高いマイクロＲＮＡを含むものとして選出された上位２０の判別式に含まれるマイクロＲＮＡである。前記判別式とそれらの判別能を示すＡＵＣを図４（「口腔内メラノーマＶＳその他」）に示す。
　したがって、本発明によれば、診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を新たに取得し、前記マイクロＲＮＡの少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種、２７種、２８種、２９種、３０種、３１種、３２種、３３種、３４種または３５種すべてについてその遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを基準として、口腔内メラノーマに罹患しているリスクの程度を診断することができる。この診断には、口腔内メラノーマに罹患しているリスクが、その他の癌疾患、たとえば、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫のいずれかに罹患しているリスクよりも高いのか、あるいは低いのか、の判別を含むものであってよい。
　なお、前記「特定のマイクロＲＮＡ」をバイオマーカーとして用いたイヌの診断は、口腔内メラノーマとその他の癌疾患との判別も可能となるため、最も難易度が高いとされるものの一定のニーズがあると考えられる。
　＜尿路上皮がんの診断のためのマイクロＲＮＡ（その他の癌疾患との区別も含む）＞
　尿路上皮がんに罹患しているイヌと、その他の癌疾患に罹患しているイヌおよび健常イヌとを区別するため有効なバイオマーカーとして、以下に示す４３個のマイクロＲＮＡを挙げることができる：
cfa-let-7b、cfa-miR-107、cfa-miR-10b、cfa-miR-122、cfa-miR-125b、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-133b、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-181a、cfa-miR-185、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-19b、cfa-miR-23a、cfa-miR-29c、cfa-miR-345、cfa-miR-361、cfa-miR-370、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-8794、cfa-miR-8803、cfa-miR-8816、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8860、cfa-miR-8873a、cfa-miR-8891、cfa-miR-8903、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92b、cfa-miR-93およびcfa-miR-99a。
各マイクロＲＮＡの頻度および塩基配列を以下に示す；
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　前記マイクロＲＮＡは、尿路上皮がんに罹患しているイヌ、その他の癌疾患に罹患してるイヌおよび健常なイヌからそれぞれ抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づき、ＬＡＳＳＯ回帰分析を利用した統計解析処理により、尿路上皮がんを予測するためのモデル判別式を構築し、尿路上皮がんに特徴的および／または頻度の高いマイクロＲＮＡを含むものとして選出された上位２０の判別式に含まれるマイクロＲＮＡである。前記判別式とそれらの判別能を示すＡＵＣを図４（「尿路上皮がんＶＳその他」）に示す。
　したがって、本発明によれば、診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を新たに取得し、前記マイクロＲＮＡの少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種、２７種、２８種、２９種、３０種、３１種、３２種、３３種、３４種、３５種、３６種、３７種、３８種、３９種、４０種、４１種、４２種または４３種すべてについてその遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを基準として、尿路上皮がんに罹患しているリスクの程度を診断することができる。この診断には、尿路上皮がんに罹患しているリスクが、その他の癌疾患、たとえば、口腔内メラノーマ、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫のいずれかに罹患しているリスクよりも高いのか、あるいは低いのか、の判別を含むものであってよい。
　前記「特定のマイクロＲＮＡ」をバイオマーカーとして用いたイヌの癌の診断は、尿路上皮がんとその他の癌疾患との判別も可能となるため、最も難易度が高いとされるものの一定のニーズがあると考えられる。
　＜悪性リンパ腫の診断のためのマイクロＲＮＡ（その他の癌疾患との区別も含む）＞
　悪性リンパ腫に罹患しているイヌと、その他の癌疾患に罹患しているイヌおよび健常イヌとを区別するための有効なバイオマーカーとして、以下に示す４２個のマイクロＲＮＡを挙げることができる：
cfa-let-7f、cfa-miR-122、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-140、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-151、cfa-miR-15a、cfa-miR-181a、cfa-miR-1844、cfa-miR-188、cfa-miR-192、cfa-miR-193a、cfa-miR-21、cfa-miR-22、cfa-miR-23b、cfa-miR-24、cfa-miR-26a、cfa-miR-26b、cfa-miR-27b、cfa-miR-301a、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-345、cfa-miR-378、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-551b、cfa-miR-574、cfa-miR-631、cfa-miR-8794、cfa-miR-8803、cfa-miR-8809、cfa-miR-8836、cfa-miR-8843、cfa-miR-8863、cfa-miR-8872、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8906、cfa-miR-8907およびcfa-miR-8908d。
各マイクロＲＮＡの頻度および塩基配列を以下に示す；
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　前記マイクロＲＮＡは、悪性リンパ腫に罹患しているイヌ、その他の癌疾患に罹患してるイヌおよび健常なイヌからそれぞれ抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づき、ＬＡＳＳＯ回帰分析を利用した統計解析処理により、悪性リンパ腫を予測するためのモデル判別式を構築し、悪性リンパ腫に特徴的および／または頻度の高いマイクロＲＮＡを含むものとして選出された上位２０の判別式に含まれるマイクロＲＮＡである。前記判別式とそれらの判別能を示すＡＵＣを図４（「悪性リンパ腫ＶＳその他」）に示す。
　したがって、本発明によれば、診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を新たに取得し、前記マイクロＲＮＡの少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種、２７種、２８種、２９種、３０種、３１種、３２種、３３種、３４種、３５種、３６種、３７種、３８種、３９種、４０種、４１種または４２種すべてについてその遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを基準として悪性リンパ腫に罹患しているリスクの程度を診断することができる。この診断には、悪性リンパ腫に罹患しているリスクが、その他の癌疾患、たとえば、口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、肝細胞がんおよび肥満細胞腫のいずれかに罹患しているリスクよりも高いのか、あるいは低いのか、の判別を含むものであってよい。
　なお、前記「特定のマイクロＲＮＡ」をバイオマーカーとして用いたイヌの癌の診断は、悪性リンパ腫とその他の癌疾患との判別も可能となるため、最も難易度が高いとされるものの一定のニーズが存在すると考えられる。
　＜肝細胞がんの診断のためのマイクロＲＮＡ（その他の癌疾患との区別も含む）＞
　肝細胞がんに罹患しているイヌと、その他の癌疾患に罹患しているイヌおよび健常イヌとを区別するための有効なバイオマーカーとして、以下に示す４０個のマイクロＲＮＡを挙げることができる：
cfa-let-7b、cfa-let-7c、cfa-let-7f、cfa-let-7g、cfa-miR-10b、cfa-miR-122、cfa-miR-1249、cfa-miR-132、cfa-miR-134、cfa-miR-146a、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-16、cfa-miR-206、cfa-miR-22、cfa-miR-223、cfa-miR-29a、cfa-miR-30d、cfa-miR-331、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-483、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-574、cfa-miR-8794、cfa-miR-8815、cfa-miR-8824、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8836、cfa-miR-8843、cfa-miR-8860、cfa-miR-8892、cfa-miR-8900、cfa-miR-8903、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92bおよびcfa-miR-99a。
各マイクロＲＮＡの頻度および塩基配列を以下に示す；
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　前記マイクロＲＮＡは、肝細胞がんに罹患しているイヌ、その他の癌疾患に罹患してるイヌおよび健常なイヌからそれぞれ抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づき、ＬＡＳＳＯ回帰分析を利用した統計解析処理により、肝細胞がんを予測するためのモデル判別式を構築し、肝細胞がんに特徴的および／または頻度の高いマイクロＲＮＡを含むものとして選出された上位２０の判別式に含まれるマイクロＲＮＡである。前記判別式とそれらの判別能を示すＡＵＣを図４（「肝細胞がんＶＳその他」）に示す。
　したがって、本発明によれば、診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を新たに取得し、前記マイクロＲＮＡの少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種、２７種、２８種、２９種、３０種、３１種、３２種、３３種、３４種、３５種、３６種、３７種、３８種、３９種または４０種すべてについてその遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを基準として肝細胞がんに罹患しているリスクの程度を診断することができる。この診断には、肝細胞がんに罹患しているリスクが、その他の癌疾患、たとえば、口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫および肥満細胞腫のいずれかに罹患しているリスクよりも高いのか、あるいは低いのか、の判別を含むものであってよい。
　なお、前記「特定のマイクロＲＮＡ」をバイオマーカーとして用いたイヌの癌の診断は、肝細胞がんとその他の癌疾患との判別も可能となるため、最も難易度が高いとされるものの一定のニーズがあると考えられる。
　＜肥満細胞腫の診断のためのマイクロＲＮＡ（その他の癌疾患との区別も含む）＞
　肥満細胞腫に罹患しているイヌと、その他の癌疾患に罹患しているイヌおよび健常イヌとを区別するための有効なバイオマーカーとして、以下に示す２９個のマイクロＲＮＡを挙げることができる：
　cfa-let-7c、cfa-let-7f、cfa-miR-10a、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-144、cfa-miR-149、cfa-miR-186、cfa-miR-188、cfa-miR-18a、cfa-miR-191、cfa-miR-221、cfa-miR-223、cfa-miR-301a、cfa-miR-30c、cfa-miR-342、cfa-miR-370、cfa-miR-451、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-551b、cfa-miR-574、cfa-miR-631、cfa-miR-8809、cfa-miR-8815、cfa-miR-8816、cfa-miR-8834a、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8903およびcfa-miR-92b。
各マイクロＲＮＡの頻度および塩基配列を以下に示す；
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　前記マイクロＲＮＡは、肥満細胞腫に罹患しているイヌ、その他の癌疾患に罹患してるイヌおよび健常なイヌからそれぞれ抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づき、ＬＡＳＳＯ回帰分析を利用した統計解析処理により、肥満細胞腫を予測するためのモデル判別式を構築し、肥満細胞腫に特徴的および／または頻度の高いマイクロＲＮＡを含むものとして選出された上位２０の判別式に含まれるマイクロＲＮＡである。前記判別式とそれらの判別能を示すＡＵＣを図４（「肥満細胞腫ＶＳその他」）に示す。
　したがって、本発明によれば、診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を新たに取得し、前記マイクロＲＮＡの少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種、２７種、２８種または２９種すべてについてその遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを基準として肥満細胞腫に罹患しているリスクの程度を診断することができる。この診断には、肥満細胞腫に罹患しているリスクが、その他の癌疾患、たとえば、口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫および肝細胞がんのいずれかに罹患しているリスクよりも高いのか、あるいは低いのか、の判別を含むものであってよい。
　なお、前記「特定のマイクロＲＮＡ」をバイオマーカーとして用いたイヌの癌の診断は、肥満細胞腫とその他の癌疾患との判別も可能となるため、最も難易度が高いとされるものの一定のニーズがあると考えられる。
　以下、本発明を実施例等によりさらに具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
　１．血清サンプルの調製
　（Ａ）健常なイヌ４０個体、（Ｂ）口腔内メラノーマに罹患しているイヌ４０個体、（Ｃ）尿路上皮がんに罹患しているイヌ４０個体、（Ｄ）悪性リンパ腫に罹患しているイヌ４０個体、（Ｅ）肝細胞がんに罹患しているイヌ３１個体、および（Ｆ）肥満細胞腫に罹患しているイヌ３３個体の計２２４個体から採取した血液を、採血管に入れ、室温で３０分静置して血液を凝固させた。凝固確認後、管壁から血餅をスパーテルなどで剥がし、遠心条件：１，５００×ｇ／３０分、回転半径１２ｃｍ、３，５００ｒｐｍで遠心による血清分離をおこなった。上清の血清を、凍結チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社：ＤＮＡ　ＬｏＢｉｎｄ　Ｔｕｂｅｓ♯００３０　１０８．０５１）に０．５ｍＬずつ分注し、速やかに－８０℃で凍結保存した。
　２．血清からのマイクロＲＮＡの抽出
　以下の手順により、前記血清からマイクロＲＮＡを抽出した：
（１）２．０ｍＬチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社：ＤＮＡ　ＬｏＢｉｎｄ　Ｔｕｂｅｓ＃００３０　１２０．０９４）に２００μｌの血清を入れた。
（２）１ｍＬ（血清の５倍量）のＱＩＡｚｏｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社：ＲＮａｓｅ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ＃５５４６９９４）を加えてボルテックス後、５分静置した。
（３）２００μｌのクロロホルムを加えて１５秒ボルテックスした。
（４）２分静置後、４℃に冷却した遠心機で１２，０００×ｇ／１５分の遠心分離をおこなった。
（５）上清６００μｌを新しい２．０ｍＬチューブに移し、これに９００μＬの１００％エタノールを加え懸濁した。
（６）（５）で混和した溶液５００μＬを、コレクションチューブにセットされたＲＮａｓｅ　Ｍｉｎｉ　スピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ社：ＲＮａｓｅ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ＃５５４６９９４）に入れ、室温に戻した遠心機で、８，０００×ｇ／１５秒でさらに遠心分離をおこなった。
（７）カラム溶出液を取り除いた。
（８）（５）で混和した溶液を、（６）と同様に遠心し、残りの溶液をすべてスピンカラムにかけた。
（９）７００μｌのＲＷＴ溶液をカラムに添加して、８，０００×ｇ／１５秒遠心分離をおこなった。
（１０）５００μｌのＲＰＥ溶液をカラムに添加して、８，０００×ｇ／１５秒遠心分離をおこなった。
（１１）（１０）をもう一度繰り返した。
（１２）スピンカラムを新しいコレクションチューブにセットして、１２，０００×ｇ、２分遠心分離をおこなった。
（１３）スピンカラムを新しい１．５ｍＬチューブにセットして、３０～５０μＬのＲＮａｓｅ　Ｈ２Ｏを加えて１分間静置した。
（１４）スピンカラムを８，０００×ｇ、１５秒遠心分離をおこなって、ＲＮＡを含む溶液を溶出した。
（１５）ＲＮＡを含む溶液（カラム溶出液）を回収して、同じカラムに入れて１分間静置した。
（１６）スピンカラムを８，０００×ｇ、１分遠心分離してＲＮＡを回収した。
　３．回収したＲＮＡの測定
　Ａｇｉｌｅｎｔ　ＲＮＡ　６０００　ｐｉｃｏ　ｋｉｔ（Ａｌｉｇｅｎｔ　Ｔｅｃｈ　＃５０６７－１５１３）を用いて付属のゲルをスピンフィルターで濾過した。付属のラダーマーカーについては予め７０℃、１０分の熱変性処理をおこなった。測定対象のＲＮＡについても同様に７０℃で、２分の熱変性処理をおこなった。前記濾過したゲル６５μＬに対してＲＮＡ　Ｄｙｅを１μＬ加え、激しく振とうさせた後、１３，０００×ｇ／１０分室温で遠心分離をおこなった。チップを専用のホルダーにセットし、ゲルを注入した後、製品説明書にしたがい、コンディション溶液、蛍光マーカー、ラダーマーカーを順に注入した。最後に、チップのサンプル用のウェルに加えてボルテックスミキサで混和し、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００　バイオアナライザーで測定対象のＲＮＡを測定した。
　４．マイクロアレイ解析
　引き続いて、得られたマイクロＲＮＡの発現量を検出するため、以下の手順でマイクロアレイ解析をおこなった。
（１）クラスタリング処理
　イヌのマイクロＲＮＡとして登録されている既知のマイクロＲＮＡ４５３個に基づいてサンプル全体の階層的クラスタリング処理をおこない、各サンプルの類似度を比較し、発現値の近いものを近くに配置した。ヒートマップ画像は、マイクロＲＮＡの遺伝子発現量の高低を示し、濃淡が薄いほど遺伝子発現量が低く、濃淡が濃いほど遺伝子発現量が高いことを示す。なお、前記クラスタリング処理は、発現する遺伝子の多さや発現量の違いが強調されるＭａｎｈａｔｔａｎ距離を採用した。
（２）主成分分析
　さらに、著しく発現傾向の異なるサンプルを除外するために、全２２４サンプルについて主成分分析（ＰＣＡ）をおこなった。サンプル全体のＰＣＡ結果は、第１主成分３０．５％、第２主成分９．４８％、第３主成分５．８８％であった。他のサンプルと距離が離れ過ぎた１５サンプルについて除外し、残りの２０９サンプルを引き続いての解析に用いた。
（３）グループ間の発現量比較
　２０９サンプルにおいて発現が検出されたのは、既知のマイクロＲＮＡ４５３個のうち１２１個であった。したがって、特定の癌疾患に罹患するイヌと健常イヌとのグループ間で、さらには特定の癌疾患に罹患するイヌとその他の癌疾患に罹患するイヌおよび健常イヌとのグループ間で、マイクロアレイ解析により、前記１２１個のマイクロＲＮＡについての発現量の比較をおこなった。特定の癌疾患に罹患するイヌにおいてその発現が上昇しているマイクロＲＮＡと、反対に発現が減少しているマイクロＲＮＡなど、個々のマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果が得られた。当該結果を図１に示す。
　５．モデル判別式の作成
　前記マイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づき、それぞれ判別すべきグループ間でＬＡＳＳＯ回帰分析による解析をおこない、モデル判別式を導き出した。
前記判別式は、診断の目的に応じた、以下の３つのパターンに基づいて作成した。
（１）パターンＡ
　健常と特定の癌疾患との判別が可能な特定のマイクロＲＮＡを選定する。このようなマイクロＲＮＡを利用した診断は、特定の癌の治療後の再発をモニターするなどのニーズがあると考えられる。
（２）パターンＢ
　健常と比較的発生頻度の高い５種の癌疾患との判別が可能な特定のマイクロＲＮＡを選定する。このようなマイクロＲＮＡを利用した診断は、癌検診などで、比較的発生頻度の高い５種の癌疾患に罹患していないかを包括的に調べるのに役立ち、最もニーズの高いものと考えられる。
（３）パターンＣ
　特定の癌疾患と、その他の癌疾患および健常との判別が可能な特定のマイクロＲＮＡを選定する。このようなマイクロＲＮＡを利用した診断は、特定の癌疾患を、健常のみならず判別の難しいその他の癌と区別することを可能とし、最も難易度が高いとされるものの一定のニーズがあると考えられる。
　ＬＡＳＳＯ回帰分析は、具体的には以下の手順によりおこなった。
（１）データセットとして学習群：検証群＝８：２で群間の特徴的なマイクロＲＮＡ発現を表す計算式を組み立てた。
（２）学習群のデータを用いて１０回にわたり交差検定をおこない、モデルを作成した。
（３）検証群のデータを用いて、モデルのＡＵＣ、感度、特異度、カットオフ値などの評価値を算出した。
（４）モデルに基づいた計算を２０回繰り返し、感度および特異度をプロットしたＲＯＣ曲線を作成して、当該ＲＯＣ曲線下の面積「ＡＵＣ」を算出した。
（５）「ＡＵＣ」の高い順から分類し、上位２０の判別式を選別した。
　前記ＬＡＳＳＯ回帰分析において作成された判別式のＲＯＣ曲線とＡＵＣを示す図を、図２および図３に示す。図２および図３はそれぞれ、縦軸を感度、横軸を特異度とし、その診断目的／用途ごとにそれぞれ一の判別式を選出し、典型例として示すものである。ＲＯＣ曲線下の面積に相当する「ＡＵＣ」が「１」に近いほど判別能が高いことを示し、一般には「０．７」以上で判別能あり、と評価される。図２に示す前記パターンＡおよびパターンＢに相当するグループの判別式では、いずれのグループ間でも、その多くが１．００の「ＡＵＣ」に達し、極めて高い判別能を示すことがわかる。
　一方、判別が難しいとされる図３のパターンＣに相当する判別式では、抽出されるマイクロＲＮＡの数が増えるにつれて「ＡＵＣ」の値が若干低くなるものの、依然としてその大部分が０．９を上回る高い「ＡＵＣ」を示し、バイオマーカーとして利用する際に十分な判別能を示すことが明らかとなった。
　これらの結果は、本発明の実施により抽出された特定のマイクロＲＮＡが、「特定の癌疾患」に対して高い判別能を示し、よって、イヌの癌の診断にバイオマーカーとして利用可能であることを示している。
　本発明のイヌの癌の診断方法は、イヌの癌の早期診断および早期治療に利用可能である。

Claims (29)

  1. 　診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を取得し、当該結果を用いて、特定のマイクロＲＮＡについての遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを診断基準として、当該診断対象のイヌが特定の癌疾患に罹患しているリスクの程度を診断する、診断工程を含む、イヌの癌の診断方法であって、前記特定のマイクロＲＮＡは、イヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づいて、前記特定の癌疾患に罹患しているイヌと健常なイヌとの間での遺伝子発現レベルにおいて有意な差が認められるマイクロＲＮＡであることを特徴とする、イヌの癌の診断方法。
  2. 　前記診断工程の前に、イヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づいて、特定の癌疾患に罹患しているイヌと健常なイヌとの間での遺伝子発現レベルにおいて有意な差が認められるマイクロＲＮＡを、統計解析処理を用いて作成された判別式に基づき、特定のマイクロＲＮＡとして抽出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記特定の癌疾患が口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記特定の癌疾患が口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫を含む５種の癌疾患であって、
    前記特定のマイクロＲＮＡがcfa-let-7c、cfa-miR-103、cfa-miR-10a、cfa-miR-122、cfa-miR-125a、cfa-miR-125b、cfa-miR-126、cfa-miR-130a、cfa-miR-144、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-186、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-19b、cfa-miR-22、cfa-miR-222、cfa-miR-223、cfa-miR-24、cfa-miR-26a、cfa-miR-27b、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-378、cfa-miR-383、cfa-miR-483、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-489、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-718、cfa-miR-874、cfa-miR-8794、cfa-miR-8798、cfa-miR-8843、cfa-miR-8859a、cfa-miR-8860、cfa-miR-8903、cfa-miR-8906、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908dおよびcfa-miR-92bからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記特定の癌疾患が口腔内メラノーマであって、
    前記特定のマイクロＲＮＡが、cfa-miR-10a、cfa-miR-1185、cfa-miR-125a、cfa-miR-126、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-184、cfa-miR-186、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-19b、cfa-miR-24、cfa-miR-30c、cfa-miR-483、cfa-miR-489、cfa-miR-8798、cfa-miR-8816、cfa-miR-8875およびcfa-miR-8908a-3pからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記特定の癌疾患が尿路上皮がんであって、
    前記特定のマイクロＲＮＡが、cfa-let-7f、cfa-miR-10a、cfa-miR-1249、cfa-miR-125a、cfa-miR-126、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-133b、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-1844、cfa-miR-186、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-19b、cfa-miR-2114、cfa-miR-24、cfa-miR-29b、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-361、cfa-miR-370、cfa-miR-425、cfa-miR-483、cfa-miR-494、cfa-miR-502、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-665、cfa-miR-718、cfa-miR-8798、cfa-miR-8824、cfa-miR-8832、cfa-miR-8834a、cfa-miR-8843、cfa-miR-8904bおよびcfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3pからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記特定の癌疾患が悪性リンパ腫であって、
    前記特定のマイクロＲＮＡが、cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-1249、cfa-miR-126、cfa-miR-1306、cfa-miR-144、cfa-miR-150、cfa-miR-184、cfa-miR-188、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-24、cfa-miR-342、cfa-miR-345、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-574、cfa-miR-8794、cfa-miR-8797、cfa-miR-8798、cfa-miR-8900、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8907およびcfa-miR-8908dからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記特定の癌疾患が肝細胞がんであって、
    前記特定のマイクロＲＮＡが、cfa-let-7g、cfa-miR-10a、cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-125b、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-206、cfa-miR-22、cfa-miR-378、cfa-miR-383、cfa-miR-483、cfa-miR-665、cfa-miR-7、cfa-miR-718、cfa-miR-874、cfa-miR-8794、cfa-miR-8798、cfa-miR-8875、cfa-miR-8900、cfa-miR-8902、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92bおよびcfa-miR-99aからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記特定の癌疾患が肥満細胞腫であって、
    前記特定のマイクロＲＮＡが、cfa-miR-10b、cfa-miR-1185、cfa-miR-125b、cfa-miR-126、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-222、cfa-miR-24、cfa-miR-26b、cfa-miR-8803、cfa-miR-8872、cfa-miR-8903、cfa-miR-8907およびcfa-miR-92bからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
  10. 　診断対象のイヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果を取得し、当該結果を用いて、特定のマイクロＲＮＡについての遺伝子発現レベルを求め、当該遺伝子発現レベルを診断基準として、当該診断対象のイヌが特定の癌疾患に罹患しているリスクの程度を診断する、診断工程を含む、イヌの癌の診断方法であって、前記特定のマイクロＲＮＡは、イヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づいて、前記特定の癌疾患に罹患しているイヌと、その他の癌疾患に罹患しているイヌおよび健常なイヌとの間での遺伝子発現レベルにおいて有意な差が認められるマイクロＲＮＡであることを特徴とする、イヌの癌の診断方法。
  11. 　前記診断工程の前に、イヌの体液から抽出されたマイクロＲＮＡの遺伝子発現解析の結果に基づいて、特定の癌疾患に罹患しているイヌとその他の癌疾患に罹患しているイヌおよび健常なイヌとの間での遺伝子発現レベルにおいて有意な差が認められるマイクロＲＮＡを、統計解析処理を用いて作成された判別式に基づき、特定のマイクロＲＮＡとして抽出する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記診断工程において、前記診断対象のイヌが前記特定の癌疾患に罹患しているリスクの程度は、その他の癌疾患に罹患しているリスクよりも高いか、あるいは低いことを含む、請求項１０に記載の方法。
  13. 　前記特定の癌疾患が口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫からなる群より選択される、請求項１０から１２までのいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記特定の癌疾患が口腔内メラノーマであって、
    前記診断において使用される特定のマイクロＲＮＡが、cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-126、cfa-miR-1271、cfa-miR-1306、cfa-miR-130b、cfa-miR-140、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-192、cfa-miR-197、cfa-miR-222、cfa-miR-29a、cfa-miR-29b、cfa-miR-30b、cfa-miR-370、cfa-miR-378、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-489、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-8803、cfa-miR-8816、cfa-miR-8824、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8859a、cfa-miR-8875、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908dおよびcfa-miR-92bからなる群より選択された少なくとも１種である、請求項１０から１３までのいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記特定の癌疾患が尿路上皮がんであり、
    前記診断において使用される特定のマイクロＲＮＡが、cfa-let-7b、cfa-miR-107、cfa-miR-10b、cfa-miR-122、cfa-miR-125b、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-133b、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-181a、cfa-miR-185、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-19b、cfa-miR-23a、cfa-miR-29c、cfa-miR-345、cfa-miR-361、cfa-miR-370、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-8794、cfa-miR-8803、cfa-miR-8816、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8860、cfa-miR-8873a、cfa-miR-8891、cfa-miR-8903、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92b、cfa-miR-93およびcfa-miR-99aからなる群より選択された少なくとも１種である、請求項１０から１３までのいずれか１項に記載の方法。
  16. 　前記特定の癌疾患が悪性リンパ腫であり、
    前記診断において使用される特定のマイクロＲＮＡが、cfa-let-7f、cfa-miR-122、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-140、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-151、cfa-miR-15a、cfa-miR-181a、cfa-miR-1844、cfa-miR-188、cfa-miR-192、cfa-miR-193a、cfa-miR-21、cfa-miR-22、cfa-miR-23b、cfa-miR-24、cfa-miR-26a、cfa-miR-26b、cfa-miR-27b、cfa-miR-301a、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-345、cfa-miR-378、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-551b、cfa-miR-574、cfa-miR-631、cfa-miR-8794、cfa-miR-8803、cfa-miR-8809、cfa-miR-8836、cfa-miR-8843、cfa-miR-8863、cfa-miR-8872、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8906、cfa-miR-8907およびcfa-miR-8908dからなる群より選択された少なくとも１種である、請求項１０から１３までのいずれか１項に記載の方法。
  17. 　前記特定の癌疾患が肝細胞がんであり、
    前記診断において使用される特定のマイクロＲＮＡが、cfa-let-7b、cfa-let-7c、cfa-let-7f、cfa-let-7g、cfa-miR-10b、cfa-miR-122、cfa-miR-1249、cfa-miR-132、cfa-miR-134、cfa-miR-146a、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-16、cfa-miR-206、cfa-miR-22、cfa-miR-223、cfa-miR-29a、cfa-miR-30d、cfa-miR-331、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-483、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-574、cfa-miR-8794、cfa-miR-8815、cfa-miR-8824、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8836、cfa-miR-8843、cfa-miR-8860、cfa-miR-8892、cfa-miR-8900、cfa-miR-8903、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92bおよびcfa-miR-99aからなる群より選択された少なくとも１種である、請求項１０から１３までのいずれか１項に記載の方法。
  18. 　前記特定の癌疾患が肥満細胞腫であり、
    前記診断において使用される特定のマイクロＲＮＡが、cfa-let-7c、cfa-let-7f、cfa-miR-10a、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-144、cfa-miR-149、cfa-miR-186、cfa-miR-188、cfa-miR-18a、cfa-miR-191、cfa-miR-221、cfa-miR-223、cfa-miR-301a、cfa-miR-30c、cfa-miR-342、cfa-miR-370、cfa-miR-451、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-551b、cfa-miR-574、cfa-miR-631、cfa-miR-8809、cfa-miR-8815、cfa-miR-8816、cfa-miR-8834a、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8903およびcfa-miR-92bからなる群より選択された少なくとも１種である、請求項１０から１３までのいずれか１項に記載の方法。
  19. 　口腔内メラノーマ、尿路上皮がん、悪性リンパ腫、肝細胞がんおよび肥満細胞腫を含む５種のイヌの癌疾患を診断するための、cfa-let-7c、cfa-miR-103、cfa-miR-10a、cfa-miR-122、cfa-miR-125a、cfa-miR-125b、cfa-miR-126、cfa-miR-130a、cfa-miR-144、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-186、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-19b、cfa-miR-22、cfa-miR-222、cfa-miR-223、cfa-miR-24、cfa-miR-26a、cfa-miR-27b、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-378、cfa-miR-383、cfa-miR-483、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-489、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-718、cfa-miR-874、cfa-miR-8794、cfa-miR-8798、cfa-miR-8843、cfa-miR-8859a、cfa-miR-8860、cfa-miR-8903、cfa-miR-8906、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908dおよびcfa-miR-92bからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
  20. 　イヌの口腔内メラノーマを診断するための、cfa-miR-10a、cfa-miR-1185、cfa-miR-125a、cfa-miR-126、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-184、cfa-miR-186、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-19b、cfa-miR-24、cfa-miR-30c、cfa-miR-483、cfa-miR-489、cfa-miR-8798、cfa-miR-8816、cfa-miR-8875およびcfa-miR-8908a-3pからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
  21. 　イヌの尿路上皮がんを診断するための、cfa-let-7f、cfa-miR-10a、cfa-miR-1249、cfa-miR-125a、cfa-miR-126、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-133b、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-1844、cfa-miR-186、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-19b、cfa-miR-2114、cfa-miR-24、cfa-miR-29b、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-361、cfa-miR-370、cfa-miR-425、cfa-miR-483、cfa-miR-494、cfa-miR-502、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-665、cfa-miR-718、cfa-miR-8798、cfa-miR-8824、cfa-miR-8832、cfa-miR-8834a、cfa-miR-8843、cfa-miR-8904bおよびcfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3pからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
  22. 　イヌの悪性リンパ腫を診断するための、cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-1249、cfa-miR-126、cfa-miR-1306、cfa-miR-144、cfa-miR-150、cfa-miR-184、cfa-miR-188、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-24、cfa-miR-342、cfa-miR-345、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-574、cfa-miR-8794、cfa-miR-8797、cfa-miR-8798、cfa-miR-8900、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8907およびcfa-miR-8908dからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
  23. 　イヌの肝細胞がんを診断するための、cfa-let-7g、cfa-miR-10a、cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-125b、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-206、cfa-miR-22、cfa-miR-378、cfa-miR-383、cfa-miR-483、cfa-miR-665、cfa-miR-7、cfa-miR-718、cfa-miR-874、cfa-miR-8794、cfa-miR-8798、cfa-miR-8875、cfa-miR-8900、cfa-miR-8902、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92bおよびcfa-miR-99aからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
  24. 　イヌの肥満細胞腫を診断するための、cfa-miR-10b、cfa-miR-1185、cfa-miR-125b、cfa-miR-126、cfa-miR-149、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-197、cfa-miR-199、cfa-miR-222、cfa-miR-24、cfa-miR-26b、cfa-miR-8803、cfa-miR-8872、cfa-miR-8903、cfa-miR-8907およびcfa-miR-92bからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
  25. 　イヌの口腔内メラノーマを診断するための、cfa-miR-1185、cfa-miR-122、cfa-miR-126、cfa-miR-1271、cfa-miR-1306、cfa-miR-130b、cfa-miR-140、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-192、cfa-miR-197、cfa-miR-222、cfa-miR-29a、cfa-miR-29b、cfa-miR-30b、cfa-miR-370、cfa-miR-378、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-489、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-8803、cfa-miR-8816、cfa-miR-8824、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8859a、cfa-miR-8875、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908dおよびcfa-miR-92bからなる群より選択された少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
  26. 　イヌの尿路上皮がんを診断するための、cfa-let-7b、cfa-miR-107、cfa-miR-10b、cfa-miR-122、cfa-miR-125b、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-133b、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-149、cfa-miR-181a、cfa-miR-185、cfa-miR-193a、cfa-miR-197、cfa-miR-19b、cfa-miR-23a、cfa-miR-29c、cfa-miR-345、cfa-miR-361、cfa-miR-370、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-551b、cfa-miR-660、cfa-miR-8794、cfa-miR-8803、cfa-miR-8816、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8860、cfa-miR-8873a、cfa-miR-8891、cfa-miR-8903、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8907、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92b、cfa-miR-93およびcfa-miR-99aからなる群より選択された少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
  27. 　イヌの悪性リンパ腫を診断するための、cfa-let-7f、cfa-miR-122、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-140、cfa-miR-144、cfa-miR-146a、cfa-miR-151、cfa-miR-15a、cfa-miR-181a、cfa-miR-1844、cfa-miR-188、cfa-miR-192、cfa-miR-193a、cfa-miR-21、cfa-miR-22、cfa-miR-23b、cfa-miR-24、cfa-miR-26a、cfa-miR-26b、cfa-miR-27b、cfa-miR-301a、cfa-miR-339、cfa-miR-342、cfa-miR-345、cfa-miR-378、cfa-miR-486、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-551b、cfa-miR-574、cfa-miR-631、cfa-miR-8794、cfa-miR-8803、cfa-miR-8809、cfa-miR-8836、cfa-miR-8843、cfa-miR-8863、cfa-miR-8872、cfa-miR-8904b、cfa-miR-8906、cfa-miR-8907およびcfa-miR-8908dからなる群より選択された少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
  28. 　イヌの肝細胞がんを診断するための、cfa-let-7b、cfa-let-7c、cfa-let-7f、cfa-let-7g、cfa-miR-10b、cfa-miR-122、cfa-miR-1249、cfa-miR-132、cfa-miR-134、cfa-miR-146a、cfa-miR-150、cfa-miR-155、cfa-miR-16、cfa-miR-206、cfa-miR-22、cfa-miR-223、cfa-miR-29a、cfa-miR-30d、cfa-miR-331、cfa-miR-378、cfa-miR-425、cfa-miR-483、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-494、cfa-miR-532、cfa-miR-574、cfa-miR-8794、cfa-miR-8815、cfa-miR-8824、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8836、cfa-miR-8843、cfa-miR-8860、cfa-miR-8892、cfa-miR-8900、cfa-miR-8903、cfa-miR-8908a-3p、cfa-miR-8908d、cfa-miR-92bおよびcfa-miR-99aからなる群より選択された少なくとも１種マイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
  29. 　イヌの肥満細胞腫を診断するための、cfa-let-7c、cfa-let-7f、cfa-miR-10a、cfa-miR-1306、cfa-miR-130a、cfa-miR-144、cfa-miR-149、cfa-miR-186、cfa-miR-188、cfa-miR-18a、cfa-miR-191、cfa-miR-221、cfa-miR-223、cfa-miR-301a、cfa-miR-30c、cfa-miR-342、cfa-miR-370、cfa-miR-451、cfa-miR-486-3p、cfa-miR-551b、cfa-miR-574、cfa-miR-631、cfa-miR-8809、cfa-miR-8815、cfa-miR-8816、cfa-miR-8834a、cfa-miR-8834b、cfa-miR-8903およびcfa-miR-92bからなる群より選択された少なくとも１種マイクロＲＮＡを含む、バイオマーカー。
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