WO2022250142A1 - 血液採取容器、血漿の分離方法、細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法 - Google Patents

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blood collection
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plasma
aqueous solution
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邦哉 駒井
嵩也 内山
まりか 神田
智雅 井上
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積水メディカル株式会社
徳山積水工業株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a blood collection container.
  • the present invention also relates to a method for separating plasma, a method for separating extracellular free nucleic acid, and a method for separating extracellular vesicles using the blood collection container.
  • Blood collection containers such as blood collection tubes are widely used in clinical examinations to collect blood. After collecting blood in a blood collection container containing a plasma separation material, the blood can be separated into plasma and blood cells by centrifuging the blood collection container. At this time, the plasma is positioned above the plasma separation material, and the blood cells are positioned below.
  • the blood collection container containing the plasma separation material include a blood collection container containing a composition for plasma separation containing a resin, an inorganic powder, etc. (for example, Patent Document 1), and a blood container containing a jig for plasma separation.
  • a collection container for example, Patent Document 2 is known.
  • Patent Document 3 describes a device for separating extracellular DNA in blood.
  • the separated plasma may contain a relatively large amount of leukocytes. If the plasma contains a relatively large number of leukocytes, the leukocytes will be destroyed over time during storage of the sample, and components such as proteins and nucleic acids in the leukocytes will leak into the plasma, resulting in negative test results. may affect
  • test results vary greatly depending on the nucleic acid leaked from the leukocytes.
  • a blood collection container main body, a plasma separation material accommodated in the blood collection container main body, and an aqueous solution contained in the blood collection container main body are contained in the aqueous solution.
  • a blood collection container is provided, wherein the solute comprises an anticoagulant, and the total concentration of the solute in the aqueous solution is 100 mM or more and 450 mM or less, or 1200 mM or more.
  • the total concentration of the solute in the aqueous solution is 250 mM or more and 390 mM or less, or 1200 mM or more and 6500 mM or less.
  • the solute contained in the aqueous solution contains a second solute other than an anticoagulant, and the second solute contains inorganic salts or sugars.
  • the second solute contains an inorganic salt
  • the inorganic salt contains a sodium salt or a potassium salt.
  • the second solute contains saccharides, and the saccharides contain glucose, sucrose, or trehalose.
  • the anticoagulant is EDTA, a metal salt of EDTA, heparin, a metal salt of heparin, or sodium citrate.
  • the blood collection container is a blood collection container from which a predetermined amount of blood is collected, and an amount of physiological fluid equivalent to the predetermined amount of blood collected in the blood collection container.
  • the osmotic pressure of the mixed liquid is 330 mOsm/L or more and 380 mOsm/L or less. or 440 mOsm/L or more and 1300 mOsm/L or less.
  • the plasma separation material has a specific gravity of 1.030 or more and 1.120 or less at 25°C.
  • the plasma separation material is a composition for plasma separation.
  • the plasma separation composition contains an organic component having fluidity at 25° C. and an inorganic fine powder, the organic component contains a resin, and the The inorganic fine powder includes finely divided silica.
  • the finely divided silica contains hydrophilic silica.
  • the hydrophilic silica content is 0.01% by weight or more and 2.50% by weight or less in 100% by weight of the plasma separation composition.
  • the finely divided silica contains hydrophilic silica and hydrophobic silica.
  • the plasma separation composition has a specific gravity of 1.050 or more at 25° C., and the inorganic fine powder has a higher specific gravity than the fine powder silica. Contains fine powder.
  • the resin includes petroleum resin, cyclopentadiene resin, polyester resin, or (meth)acrylic resin.
  • the blood collection container is used to separate extracellular free nucleic acids or extracellular vesicles in blood.
  • a plasma separation method comprising the steps of: collecting blood in the blood collection container described above; and centrifuging the blood collection container containing the blood. .
  • a blood collection container comprises a blood collection container main body, a plasma separation material contained within the blood collection container main body, and an aqueous solution contained within the blood collection container main body.
  • the solute contained in the aqueous solution contains an anticoagulant, and the total concentration of the solute in the aqueous solution is 100 mM or more and 450 mM or less, or 1200 mM or more. Since the blood collection container according to the present invention has the above configuration, it is possible to suppress contamination of plasma with leukocytes and components of leukocytes.
  • FIG. 1 is a front cross-sectional view schematically showing a blood collection container according to one embodiment of the present invention.
  • a blood collection container comprises a blood collection container main body, a plasma separation material contained within the blood collection container main body, and an aqueous solution contained within the blood collection container main body.
  • the solute contained in the aqueous solution contains an anticoagulant, and the total concentration of the solute in the aqueous solution is 100 mM or more and 450 mM or less, or 1200 mM or more.
  • the blood collection container according to the present invention has the above configuration, it is possible to suppress contamination of plasma with leukocytes and components of leukocytes.
  • the blood collection container according to the present invention has the above configuration, contamination of blood plasma with red blood cells can be suppressed.
  • the separated plasma may contain a relatively large amount of leukocytes. If the plasma contains a relatively large number of leukocytes, components of the leukocytes may leak into the plasma and affect tests using plasma. With conventional blood collection containers, it is difficult to sufficiently suppress contamination of plasma with leukocytes and contamination of components in leukocytes. Although a blood collection container containing a cell stabilizer that stabilizes blood cells is sometimes used in order to suppress the effect on the test results, the cell stabilizer is expensive, and the type and concentration of the agent are limited. Some may be harmful to humans and the environment.
  • the blood collection container according to the present invention contamination of leukocytes into plasma and contamination of components in leukocytes can be effectively suppressed.
  • the blood and the aqueous solution are mixed and the osmotic pressure of the blood increases. Therefore, the water content in white blood cells and the water content in red blood cells move out of the blood cells, and the specific gravities of white blood cells and red blood cells increase.
  • the white blood cells and red blood cells with increased specific gravity move better downward than the plasma separation material having a specific specific gravity. As a result, contamination of plasma with white blood cells and red blood cells can be suppressed.
  • the concentration of the solute is within an appropriate range, so the stress on the blood cells is suppressed, and the leakage of the contents from the blood cells mixed in the plasma is suppressed. can be effectively suppressed.
  • (meth)acryl means one or both of “acryl” and “methacryl”.
  • the blood collection container includes a plasma separation material housed within the blood collection container main body.
  • a conventionally known plasma separation material can be used as the plasma separation material.
  • the plasma separation material include plasma separation compositions and plasma separation jigs.
  • the plasma separation material is preferably the plasma separation composition, because the plasma separation material can be easily produced.
  • the specific gravity of the plasma separation material at 25°C may be 1.030 or more, 1.040 or more, 1.050 or more, or 1.060 or more. well, it may exceed 1.060, or it may be 1.070 or more.
  • the specific gravity of the plasma separation material at 25°C may be 1.120 or less, 1.100 or less, 1.080 or less, or less than 1.070. well, it may be less than 1.060, it may be less than 1.050, it may be less than 1.040.
  • the storage location of the plasma separation material is not particularly limited as long as it is within the blood collection container main body.
  • the plasma separation material may be arranged on the bottom of the blood collection container main body, may be arranged on the inner wall surface of the blood collection container main body, or may be arranged on the side wall surface of the blood collection container main body. may be
  • the plasma separation composition is a composition that migrates between the plasma layer and the blood cell layer during centrifugation to form a partition wall. Moreover, the composition for plasma separation is used for the purpose of preventing component migration between the plasma layer and the blood cell layer after centrifugation.
  • the plasma separation composition preferably has thixotropic properties.
  • the plasma separation composition may be housed in the bottom portion of the blood collection container main body, or may be arranged on the side wall surface of the blood collection container main body. From the viewpoint of exhibiting the effects of the present invention more effectively, the plasma separation composition is preferably contained in the bottom portion of the blood collection container main body.
  • a conventionally known composition for plasma separation can be used as the composition for plasma separation.
  • the composition for plasma separation preferably contains an organic component having fluidity at 25°C and an inorganic fine powder.
  • Each of the organic component having fluidity at 25° C. and the inorganic fine powder may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • the viscosity of the organic component at 25°C is preferably 30 Pa ⁇ s or more, more preferably 50 Pa ⁇ s or more, preferably 200 Pa ⁇ s or less, more preferably 100 Pa ⁇ s or less.
  • the viscosity is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the fluidity of the composition for plasma separation is enhanced, and the strength of partition walls can be enhanced.
  • the viscosity of the above organic component at 25°C is measured using an E-type viscometer (for example, "TVE-35" manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd.) under the conditions of 25°C and a shear rate of 1.0 sec -1 . .
  • the organic component preferably contains the resin, and more preferably contains the resin and the organic compound.
  • the organic component is a mixture of the resin and the organic compound, it is sufficient that the mixture (the organic component) has fluidity, and the resin or the organic compound has fluidity. It doesn't have to be.
  • the resin may be, for example, a solid resin at 25°C.
  • Each of the above resin and the above organic compound may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • Examples of the above resins include petroleum resins, cyclopentadiene resins, polyester resins, polyurethane resins, (meth)acrylic resins, silicone resins, ⁇ -olefin-fumarate ester copolymers, sebacic acid and 2,2-dimethyl-1. ,3-propanediol and 1,2-propanediol copolymers, polyether polyurethane resins, and polyether polyester resins. Only one kind of the resin may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • the resin preferably contains petroleum resin, cyclopentadiene resin, polyester resin, or (meth)acrylic resin.
  • Examples of the cyclopentadiene-based resin include polymers of cyclopentadiene-based monomers, copolymers of cyclopentadiene-based monomers and aromatic monomers, and dicyclopentadiene resins.
  • the cyclopentadiene-based resin may be hydrogenated.
  • the polymer of the cyclopentadiene monomer and the copolymer of the cyclopentadiene monomer and the aromatic monomer may be oligomers.
  • cyclopentadiene-based monomers examples include cyclopentadiene, dicyclopentadiene, and alkyl-substituted derivatives of cyclopentadiene.
  • Styrene, methylstyrene, indene, methylindene and the like are mentioned as the aromatic monomers.
  • polyester resins include polyalkylene terephthalate resins and polyalkylene naphthalate resins.
  • polyalkylene terephthalate resin examples include polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate and poly-1,4-cyclohexanedimethylene terephthalate.
  • polyurethane resin examples include a reaction product of a polyol compound and an isocyanate compound.
  • the (meth)acrylic resin includes a resin obtained by polymerizing at least one (meth)acrylic acid ester monomer, and at least one (meth)acrylic acid ester monomer and at least one and a resin obtained by polymerizing a monomer other than the (meth)acrylic acid ester monomer.
  • Examples of the (meth)acrylic acid ester monomers include (meth)acrylic acid alkyl esters having an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, (meth)acrylic acid polyalkylene glycol esters, (meth)acrylic acid esters, acid alkoxyalkyl ester, (meth)acrylic acid hydroxyalkyl ester, (meth)acrylic acid glycidyl ester, (meth)acrylic acid dialkylaminoalkyl ester, (meth)acrylic acid benzyl ester, (meth)acrylic acid phenoxyalkyl ester, ( meth)acrylic acid cyclohexyl ester, (meth)acrylic acid isobornyl ester, and (meth)acrylic acid alkoxysilylalkyl ester, and the like. Only one kind of the (meth)acrylic acid ester monomer may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • Examples of the above organic compounds include benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivatives.
  • the organic compound is preferably a benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivative. Therefore, the organic component is preferably a mixture of the resin and the benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivative.
  • benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivatives examples include phthalates, trimellitates, pyromellitic esters, and the like. Only one kind of the benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivative may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • trimellitate examples include tri-n-octyl trimellitate, triisooctyl trimellitate, and triisodecyl trimellitate.
  • Examples of the pyromellitic acid ester include tetraisooctyl pyromellitic acid.
  • trimellitate esters include “Monocizer W700” and “Monocizer W-750” manufactured by DIC, and “Sansocizer TOTM” and “Sansocizer TITM” manufactured by Shin Nippon Rika.
  • the benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivative is preferably a phthalate, a trimellitate, or a pyromellitate, more preferably a trimellitate.
  • the content of the organic component in 100% by weight of the composition for plasma separation is preferably 80% by weight or more, more preferably 85% by weight or more, still more preferably 90% by weight or more, and preferably 97% by weight or less. .
  • Inorganic fine powder examples include fine powder silica, titanium oxide powder, calcium carbonate powder, zinc oxide powder, alumina powder, glass fine powder, talc powder, kaolin powder, bentonite powder, titania powder, and zirconium powder.
  • the inorganic fine powder preferably contains fine powder silica.
  • the inorganic fine powder includes finely powdered silica and an inorganic fine powder other than finely powdered silica (second inorganic fine powder). and more preferably.
  • the specific gravity of the plasma separation composition at 25° C. is 1.050 or higher
  • the inorganic fine powder may not contain the second inorganic fine powder.
  • the specific gravity of the composition for plasma separation at 25° C. is less than 1.050
  • the inorganic fine powder may contain the second inorganic fine powder.
  • Each of the inorganic fine powder, the fine silica powder, and the second inorganic fine powder may be used alone or in combination of two or more.
  • the finely divided silica includes natural silica and synthetic silica.
  • Synthetic silica includes hydrophilic silica and hydrophobic silica.
  • Hydrophilic silica has the effect of imparting thixotropy to the composition for plasma separation and adjusting the specific gravity, for example, by hydrogen bonding between hydroxyl groups on the particle surfaces.
  • hydrophobic silica has a smaller effect of imparting thixotropy than hydrophilic silica.
  • the finely divided silica preferably contains hydrophilic silica, and includes hydrophilic silica and hydrophobic silica. is more preferable.
  • the finely divided silica preferably contains at least hydrophilic silica.
  • the second inorganic fine powder is preferably an inorganic fine powder having a higher specific gravity than finely divided silica, and is an inorganic fine powder having a specific gravity of 3 or more, such as zinc oxide powder, titanium oxide powder, and alumina powder. is more preferred.
  • the specific gravity of the second inorganic fine powder is preferably 3 or more, more preferably 3.5 or more, and even more preferably 4 or more. The higher the specific gravity of the second inorganic fine powder, the better. When the specific gravity is equal to or higher than the lower limit, the specific gravity of the composition for plasma separation can be effectively increased.
  • the average particle size of the inorganic fine powder, the fine silica powder, and the second inorganic fine powder is not particularly limited.
  • the average particle size of the inorganic fine powder, the fine silica powder, and the second inorganic fine powder may be 1 nm or more, 10 nm or more, 500 nm or less, or 100 nm or less. There may be.
  • the average particle diameters of the inorganic fine powder, the fine silica powder, and the second inorganic fine powder are the average diameters measured on a volume basis, and are the values of the median diameter (D50) at 50%.
  • the volume average particle size (D50) can be measured by a laser diffraction/scattering method, an image analysis method, a Coulter method, a centrifugal sedimentation method, or the like.
  • the volume average particle size (D50) is preferably obtained by measurement by a laser diffraction/scattering method or an image analysis method.
  • the specific surface area of the finely divided silica is not particularly limited.
  • the specific surface area of the finely divided silica may be 20 m 2 /g or more, 100 m 2 /g or more, 500 m 2 /g or less, or 300 m 2 /g or less. good too.
  • the specific surface area of the finely divided silica is measured by the BET method.
  • the content of the hydrophilic silica in 100% by weight of the composition for plasma separation is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.10% by weight or more, and still more preferably 0.30% by weight or more. is 2.50% by weight or less, more preferably 2.00% by weight or less.
  • the content of the hydrophilic silica is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, both the specific gravity and thixotropy of the composition for plasma separation can be maintained within a more suitable range.
  • the content of the finely divided silica in 100% by weight of the composition for plasma separation is preferably 0.1% by weight or more, more preferably 0.5% by weight or more, preferably 10% by weight or less, and more preferably 7% by weight. % by weight or less.
  • content of the finely divided silica is above the lower limit and below the upper limit, both the specific gravity and thixotropy of the composition for plasma separation can be maintained within a more suitable range.
  • the content of the second inorganic fine powder is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.1% by weight or more, and preferably 10% by weight or less. Preferably, it is 7% by weight or less.
  • the content of the second inorganic fine powder is not less than the lower limit and not more than the upper limit, the specific gravity of the plasma separation composition can be effectively increased.
  • the content of the inorganic fine powder in 100% by weight of the composition for plasma separation is preferably 0.1% by weight or more, more preferably 0.5% by weight or more, preferably 10% by weight or less, and more preferably 7% by weight. % by weight or less.
  • the specific gravity of the plasma separation composition can be effectively increased.
  • composition for plasma separation may contain other ingredients than those mentioned above as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • other components include organic gelling agents, thermoplastic elastomers, polyalkylene glycols, silicone oils, co-solvents, antioxidants, colorants and water.
  • organic gelling agents include organic gelling agents, thermoplastic elastomers, polyalkylene glycols, silicone oils, co-solvents, antioxidants, colorants and water.
  • the specific gravity of the plasma separation composition at 25°C is preferably 1.030 or more, more preferably 1.040 or more, and preferably 1.120 or less.
  • the specific gravity of the composition for plasma separation at 25°C is not less than the above lower limit and not more than the above upper limit, the effect of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the specific gravity of the composition for plasma separation at 25°C may be 1.050 or more, 1.060 or more, 1.060 or more, or 1.070 or more. may be The specific gravity of the plasma separation composition at 25°C may be 1.100 or less, 1.080 or less, less than 1.070, or less than 1.060. may be less than 1.050, or less than 1.040.
  • the specific gravity of the composition for plasma separation at 25° C. was obtained by dropping one drop of the composition for plasma separation sequentially into saline at 25° C. whose specific gravity was adjusted stepwise at intervals of 0.002, and floating and sinking in the saline. measured by
  • the viscosity of the plasma separation composition at 25°C is preferably 100 Pa ⁇ s or more, more preferably 150 Pa ⁇ s or more, preferably 500 Pa ⁇ s or less, more preferably 400 Pa ⁇ s or less. When the viscosity is at least the lower limit and at most the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the viscosity of the composition for plasma separation at 25° C. was measured using an E-type viscometer (eg, “TVE-35” manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd.) under conditions of 25° C. and a shear rate of 1.0 sec ⁇ 1 . measured.
  • E-type viscometer eg, “TVE-35” manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd.
  • the jig for plasma separation is a jig that moves between the plasma layer and the blood cell layer during centrifugation to form a partition wall. Moreover, the jig for plasma separation is used for the purpose of preventing component transfer between the plasma layer and the blood cell layer.
  • a conventionally known plasma separation jig can be used as the plasma separation jig.
  • Examples of the plasma separation jig include a mechanical separator (plasma separation jig) described in WO2010/132783A1 and the like.
  • Examples of materials for the plasma separation jig include elastomers.
  • the blood collection container includes an aqueous solution contained within the blood collection container body.
  • the aqueous solution contains an anticoagulant and water.
  • the solute contained in the aqueous solution includes an anticoagulant.
  • the aqueous solution preferably contains a second solute other than the anticoagulant. Therefore, the aqueous solution preferably contains an anticoagulant (first solute), a second solute, and water.
  • the solute contained in the aqueous solution preferably contains an anticoagulant (first solute) and a second solute.
  • the total concentration of the solute in the aqueous solution is 100 mM or more and 450 mM or less, or 1200 mM or more. That is, the total concentration of the solutes in the aqueous solution is 100 mmol/L or more and 450 mmol/L or less, or 1200 mmol/L or more.
  • the total concentration of solutes is the concentration of anticoagulants if the aqueous solution contains only anticoagulants as solutes.
  • the total concentration of the solute is the sum of the concentration of the anticoagulant and the concentration of the second solute when the aqueous solution contains an anticoagulant and a second solute as solutes.
  • the concentration of the anticoagulant is the concentration of the anticoagulant in the aqueous solution when the aqueous solution contains only one type of anticoagulant, and when the aqueous solution contains two or more types of anticoagulant, is the total concentration of anticoagulant in the aqueous solution.
  • the concentration of the second solute is the concentration of the second solute in the aqueous solution when the aqueous solution contains only one second solute, and the aqueous solution contains two or more second solutes. If so, it is the sum of the concentrations of the second solutes in the aqueous solution.
  • the aqueous solution contains three types of solutes, an anticoagulant (X), a second solute (Y), and a second solute (Z), and their concentrations (mM) are A, B, C, the total concentration of solutes in the aqueous solution is (A+B+C) mM.
  • the total concentration of the solute in the aqueous solution is preferably the total concentration of components other than water contained in the aqueous solution.
  • the total concentration of the solutes in the aqueous solution may be 100 mM or more and 450 mM or less, or may be 1200 mM or more.
  • the total concentration of the solutes in the aqueous solution is 100 mM or more and 450 mM or less
  • the total concentration of the solutes in the aqueous solution is preferably 250 mM or more, more preferably 300 mM or more, preferably 390 mM or less, and more preferably 380 mM or less.
  • the total concentration of the solutes is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the total concentration of the solutes in the aqueous solution is 1200 mM or higher
  • the total concentration of the solutes in the aqueous solution is preferably 1500 mM or higher, more preferably 2000 mM or higher, preferably 7000 mM or lower, and more preferably 6500 mM or lower.
  • the total concentration of the solutes is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the aqueous solution contains an anticoagulant.
  • Conventionally known anticoagulants can be used as the anticoagulant. Only one kind of the anticoagulant may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • anticoagulant examples include heparin, heparin metal salts, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), EDTA metal salts and citric acid.
  • the anticoagulant is preferably EDTA, a metal salt of EDTA, heparin, a metal salt of heparin, or sodium citrate.
  • the concentration of the anticoagulant in the aqueous solution is preferably 2 mM or more, more preferably 5 mM or more, still more preferably 10 mM or more, preferably 2000 mM or less, more preferably 1000 mM or less, even more preferably 500 mM or less, still more preferably 250 mM. Below, even more preferably 100 mM or less, particularly preferably 50 mM or less.
  • concentration of the anticoagulant is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, good anticoagulant performance can be exhibited.
  • the second solute is a solute other than the anticoagulant contained in the aqueous solution.
  • the osmotic pressure of the blood collected in the blood collection container can be effectively increased without excessively increasing the content of the anticoagulant. Only one kind of the second solute may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • the second solute is not particularly limited as long as it is a component other than an anticoagulant.
  • examples of the second solute include inorganic salts, sugars, sugar alcohols, propylene glycol and polyethylene glycol (PEG).
  • inorganic salts examples include sodium salts such as sodium chloride and sodium hydrogen phosphate, and potassium salts such as potassium chloride and potassium hydrogen carbonate.
  • Examples of the above saccharides include monosaccharides, disaccharides and polysaccharides.
  • Examples of the monosaccharides include glucose, dihydroxyacetone, fructose and galactose.
  • Examples of the disaccharides include sucrose, trehalose, maltose and lactulose.
  • Examples of the polysaccharides include dextran, hydroxyethyl starch, methylcellulose, polysucrose, and the like.
  • sugar alcohols examples include D-mannitol and D-sorbitol.
  • the second solute preferably contains inorganic salts or sugars. In this case, the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the inorganic salt preferably contains sodium salt or potassium salt, and more preferably contains sodium chloride or potassium chloride. In this case, the effects of the present invention can be exhibited even more effectively.
  • the saccharide preferably contains glucose, sucrose, or trehalose. In this case, the effects of the present invention can be exhibited even more effectively.
  • the concentration of the inorganic salt in the aqueous solution is preferably 100 mM or more, more preferably 200 mM or more, still more preferably 300 mM or more, and preferably 450 mM or less. It is more preferably 420 mM or less, still more preferably 400 mM or less.
  • concentration of the inorganic salt is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited even more effectively.
  • the concentration of the inorganic salt in the aqueous solution is preferably 400 mM or higher, more preferably 500 mM or higher, still more preferably 1000 mM or higher, and preferably 5000 mM or lower, and more preferably. is 2000 mM or less, more preferably 1500 mM or less.
  • concentration of the inorganic salt is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited even more effectively.
  • the concentration of the inorganic salt is the concentration of the inorganic salt in the aqueous solution when the aqueous solution contains only one type of inorganic salt, and the concentration of the inorganic salt in the aqueous solution when the aqueous solution contains two or more types of inorganic salts. It is the total concentration of salt.
  • the concentration of the saccharides in the aqueous solution is preferably 100 mM or more, more preferably 200 mM or more, still more preferably 300 mM or more, preferably 450 mM or less. It is preferably 420 mM or less, more preferably 400 mM or less.
  • concentration of the saccharides is above the lower limit and below the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited even more effectively.
  • the concentration of the saccharides in the aqueous solution is preferably 400 mM or higher, more preferably 500 mM or higher, still more preferably 1000 mM or higher, preferably 5000 mM or lower, and more preferably It is 3000 mM or less, more preferably 2500 mM or less.
  • concentration of the saccharides is above the lower limit and below the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited even more effectively.
  • the concentration of the saccharides is the concentration of the saccharides in the aqueous solution when the aqueous solution contains only one type of saccharides, and the total concentration of the saccharides in the aqueous solution when the aqueous solution contains two or more types of saccharides. is.
  • the concentration of the second solute in the aqueous solution is preferably 80 mM or more, more preferably 100 mM or more, still more preferably 300 mM or more, preferably 450 mM. 420 mM or less, more preferably 400 mM or less.
  • concentration of the second solute is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited even more effectively.
  • the concentration of the second solute in the aqueous solution is preferably 400 mM or higher, more preferably 1000 mM or higher, still more preferably 2000 mM or higher, and preferably 7000 mM or lower. It is more preferably 6500 mM or less, still more preferably 6000 mM or less.
  • concentration of the second solute is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited even more effectively.
  • the amount of the aqueous solution contained in the blood collection container main body is appropriately changed depending on the size of the blood collection container main body, the amount of blood to be collected, and the like.
  • the amount of the aqueous solution contained in the blood collection container body is preferably 0.1 mL or more, more preferably 0.5 mL or more, still more preferably 0.7 mL or more, preferably 5 mL or less, more preferably 3 mL or less, More preferably, it is 2.5 mL or less.
  • the amount of the aqueous solution is equal to or more than the lower limit and equal to or less than the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited more effectively without excessive dilution of blood.
  • the shape of the blood collection container main body is not particularly limited.
  • the blood collection container main body is preferably a bottomed tubular container.
  • the material of the blood collection container body is not particularly limited.
  • Materials for the blood collection container body include thermoplastic resins such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyethylene terephthalate, polymethyl methacrylate, and polyacrylonitrile; thermosetting resins such as unsaturated polyester resins, epoxy resins, and epoxy-acrylate resins; Modified natural resins such as cellulose acetate, cellulose propionate, ethyl cellulose and ethyl chitin; silicate glasses such as soda lime glass, phosphosilicate glass and borosilicate glass; and glasses such as quartz glass. Only one kind of material may be used for the blood collection container main body, or two or more kinds may be used in combination.
  • the blood collection container preferably has a stopper.
  • a conventionally known plug can be used as the plug. It is preferable that the stopper is made of a material and has a shape that can be attached to the opening of the blood collection container main body in an airtight and liquid-tight manner.
  • the plug is preferably configured so that a blood collection needle can be pierced therethrough.
  • the plug examples include a plug having a shape that fits into the opening of the blood collection container main body, a sheet-like sealing plug, and the like.
  • the plug body may be a plug body including a plug body such as a rubber plug and a cap member made of plastic or the like. In this case, it is possible to reduce the risk of blood coming into contact with the human body when the plug is pulled out from the opening of the blood collection container main body after blood collection.
  • the plug body examples include synthetic resin, elastomer, rubber, and metal foil.
  • the rubber examples include butyl rubber and halogenated butyl rubber. Aluminum foil etc. are mentioned as said metal foil.
  • the material of the stopper is preferably butyl rubber.
  • the stopper (or the stopper body) is preferably a butyl rubber stopper.
  • the blood collection container is a blood collection container from which a predetermined amount of blood is collected.
  • the predetermined amount of blood is appropriately changed depending on the size and internal pressure of the blood collection container.
  • the predetermined amount of the blood may be 1 mL or more, 2 mL or more, 4 mL or more, 12 mL or less, 11 mL or less, or 10 mL or less. may be
  • a physiological saline solution in an amount equal to a predetermined amount of blood to be collected in the blood collection container is collected in the blood collection container to obtain a mixed solution in which the physiological saline solution and the aqueous solution are mixed.
  • a mixed solution in which the physiological saline solution and the aqueous solution are mixed For example, in a blood collection container from which 5 mL of blood is collected, 5 mL of physiological saline is collected into the blood collection container and mixed by inversion or the like to mix the physiological saline and the aqueous solution. get the liquid
  • the osmotic pressure of the mixture of the physiological saline and the aqueous solution is preferably 330 mOsm/L or more and 380 mOsm/L or less, or 440 mOsm/L or more.
  • the specific gravity of white blood cells and red blood cells can be effectively increased, and contamination of blood plasma with white blood cells and red blood cells can be more effectively suppressed. can.
  • excessive stress on blood cells can be suppressed, and contamination of components in blood cells can be suppressed more effectively.
  • the osmotic pressure of the mixed liquid is preferably 340 mOsm/L or more, more preferably 350 mOsm/L or more, and preferably 375 mOsm/L or less. More preferably, it is 370 mOsm/L or less.
  • the osmotic pressure of the mixed solution is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the specific gravity of leukocytes and erythrocytes can be effectively increased when blood is collected in a blood collection container, and leukocytes can be added to plasma.
  • the osmotic pressure of the mixed solution is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, excessive stress on blood cells can be suppressed, and contamination of components in blood cells can be suppressed more effectively.
  • the osmotic pressure of the mixed solution is preferably 450 mOsm/L or higher, more preferably 500 mOsm/L or higher, preferably 1300 mOsm/L or lower, and more preferably 1000 mOsm/L. /L or less.
  • the osmotic pressure of the mixed solution is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the specific gravity of leukocytes and erythrocytes can be effectively increased when blood is collected in a blood collection container, and leukocytes can be added to plasma. and red blood cell contamination can be suppressed more effectively.
  • the osmotic pressure of the mixed solution is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, excessive stress on blood cells can be suppressed, and contamination of components in blood cells can be suppressed more effectively. .
  • the osmotic pressure of the above mixed solution is measured by the freezing point depression method using an osmometer (for example, "OM-6060” manufactured by ARKRAY).
  • 3 mL or more of blood is preferably collected from 1 mL of the aqueous solution contained therein, more preferably 4 mL or more, preferably 11 mL or less, and 7 mL or less is collected. more preferably.
  • the effects of the present invention can be exhibited more effectively without excessive dilution of blood.
  • the blood collection container is preferably a blood collection tube.
  • the blood collection container main body is preferably a blood collection tube main body.
  • the blood collection container is preferably used for separating plasma from blood.
  • the blood collection container is preferably used for isolating extracellular free nucleic acids or extracellular vesicles in blood. preferably.
  • the blood collection container can be manufactured as follows.
  • An aqueous solution is obtained by dissolving the anticoagulant and the second solute in water.
  • the resulting aqueous solution is added into the body of the blood collection container.
  • the plasma separation material is accommodated in the blood collection container main body.
  • FIG. 1 is a front cross-sectional view schematically showing a blood collection container according to one embodiment of the present invention.
  • the blood collection container main body 2 has an opening at one end and a closed bottom at the other end.
  • the plasma separation composition 3 is housed in the bottom of the blood collection container body 2 .
  • the stopper 5 is inserted into the opening of the blood collection container main body 2 .
  • the aqueous solution 4 is placed on the surface of the plasma separation composition 3, and more specifically, placed on the upper surface (one end side surface) of the plasma separation composition 3.
  • the aqueous solution 4 is placed on the surface of the plasma separation composition 3 when the blood collection container 1 is in an upright state.
  • the anticoagulant and the second solute are contained in the blood collection container main body 2 in a state of being dissolved in water.
  • the composition for plasma separation is arranged on the side wall surface of the blood collection container main body, and the aqueous solution is applied to the blood collection container when the blood collection container is placed in an upright state. It may be arranged at the bottom of the container body. Moreover, the jig for plasma separation may be used instead of the composition for plasma separation.
  • the internal pressure of the blood collection container is not particularly limited.
  • the blood collection container can also be used as a vacuum blood collection tube whose inside is evacuated and then sealed with the stopper. In the case of a vacuum blood collection tube, a fixed amount of blood can be collected easily regardless of the skill of the blood collector.
  • the inside of the blood collection container is sterilized according to ISO or JIS standards.
  • the blood collection container can be used to separate plasma from blood.
  • a plasma separation method according to the present invention comprises the steps of collecting blood in the above-described blood collection container and centrifuging the blood collection container containing the blood.
  • the plasma separation method according to the present invention preferably includes a step of mixing the collected blood and the aqueous solution between the step of collecting the blood and the step of centrifuging.
  • a method for mixing the collected blood and the aqueous solution inversion mixing and the like can be mentioned.
  • the centrifugation conditions in the centrifugation step are not particularly limited as long as the plasma separation material can form partition walls to separate plasma and blood cells.
  • Examples of the centrifugation conditions include conditions for centrifugation at 400 G or more and 4000 G or less for 10 minutes or more and 120 minutes or less.
  • the method for separating extracellular free nucleic acid according to the present invention includes the steps of collecting blood in the above-described blood collection container, and centrifuging the blood collection container containing the blood to separate plasma from the blood. and separating extracellular free nucleic acids from the separated plasma.
  • a method for separating extracellular vesicles according to the present invention includes the steps of collecting blood in the blood collection container described above, and centrifuging the blood collection container containing the blood to separate plasma from the blood. and separating extracellular vesicles from the separated plasma.
  • the collected blood and the aqueous solution are mixed between the step of collecting the blood and the step of centrifuging. It is preferable to include steps.
  • steps As a method for mixing the collected blood and the aqueous solution, inversion mixing and the like can be mentioned.
  • the centrifugation conditions in the centrifugation step are not particularly limited as long as the plasma separation material can form partition walls to separate plasma and blood cells.
  • Examples of the centrifugation conditions include conditions for centrifugation at 400 G or more and 4000 G or less for 10 minutes or more and 120 minutes or less.
  • the extracellular free nucleic acid can be separated from plasma using a conventionally known method.
  • the extracellular free nucleic acid include cell free DNA (cfDNA), cell free RNA (cfRNA), and the like.
  • the method for isolating the extracellularly released nucleic acid from the plasma include a method using a commercially available nucleic acid purification kit.
  • Extracellular free nucleic acids can be easily separated from plasma by using a commercially available nucleic acid purification kit.
  • nucleic acid purification kits include QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (QIAGEN), QIAamp MinElute ccfDNA Kits (QIAGEN) and MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit (Applied biosystems).
  • extracellular vesicles can be separated from plasma using a conventionally known method.
  • the following materials were prepared for the plasma separation composition.
  • (Material of organic component having fluidity at 25°C) (Meth) acrylic resin: 2-Ethylhexyl acrylate and butyl acrylate were subjected to radical polymerization by a solution polymerization method in the presence of an azo polymerization initiator to obtain a (meth)acrylate polymer having fluidity at 25°C.
  • Trimellitate ester (benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivative, "Monocizer W700" manufactured by DIC)
  • Hydrophilic silica fine powder silica, "200CF” manufactured by Nippon Aerosil Co., Ltd.
  • Hydrophobic silica fine powder silica, "R974" manufactured by Nippon Aerosil Co., Ltd.
  • Titanium oxide powder second inorganic fine powder, "A-100” manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.
  • Silicone oil (“SF8410” manufactured by Dow Corning Toray Co., Ltd.)
  • Organic gelling agent (“Gelol D” manufactured by Shin Nippon Rika Co., Ltd.) 1-methyl-2-pyrrolidone (co-solvent)
  • Preparation of plasma separation compositions A and B An organic component, an inorganic fine powder, and other components having flowability at 25° C. were mixed at the mixing ratios shown in Table 1 to prepare compositions A and B for plasma separation.
  • Preparation of plasma separation composition C The materials of the organic component having fluidity at 25°C shown in Table 1 were blended, heated and melted at 130°C, and mixed to prepare an organic component having fluidity at 25°C. Next, the organic component, the inorganic fine powder, and the other components, which are fluid at 25°C, were mixed at the mixing ratio shown in Table 1 to prepare a composition C for plasma separation.
  • PET bottomed tube polyethylene terephthalate tube with a length of 100 mm and an inner diameter of 14 mm at the opening
  • Example 1 An anticoagulant and a second solute were dissolved in water to obtain an aqueous solution.
  • Table 2 shows the types and concentrations of the ingredients in the resulting aqueous solution.
  • composition C for plasma separation 1.2 g was accommodated in the bottom of the blood collection container main body. Also, 1 mL of the obtained aqueous solution was added onto the surface of the composition C for plasma separation. The inside of the blood collection container was evacuated so that the blood collection volume was 5 mL, and the container was sealed with a butyl rubber stopper. Thus, a blood collection container was produced.
  • Examples 2-7 and Comparative Examples 2-4 The type of composition for plasma separation and the composition of the aqueous solution were changed as shown in Tables 2-4.
  • Example 5 and Comparative Examples 2 and 3 the inside of the blood collection container was evacuated so that the blood collection volume was 10 mL, and the container was sealed with a butyl rubber plug.
  • a blood collection container was produced in the same manner as in Example 1 except for these.
  • composition C for plasma separation was accommodated in the bottom of the blood collection container main body. Also, 60 mg of the obtained mixture was applied to the inner wall surface of the blood collection container main body and dried. The inside of the blood collection container was evacuated so that the blood collection volume was 10 mL, and the container was sealed with a butyl rubber plug. Thus, a blood collection container was produced.
  • Osmotic Pressure of Mixture 5 mL of physiological saline was collected in the blood collection container obtained in Examples 1-4, 6, and 7. In addition, 10 mL of physiological saline was collected in the blood collection container obtained in Example 5. After the physiological saline was collected, the mixture was mixed by inversion to mix the physiological saline and the aqueous solution contained in the blood collection container to obtain a mixed solution. The osmotic pressure of the obtained mixture was measured by the freezing point depression method using an osmometer ("OM-6060" manufactured by ARKRAY).
  • DNA contained in the collected plasma was purified using a cfDNA purification kit ("QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit” manufactured by QIAGEN). The DNA purification operation was performed on the day plasma was collected from the blood collection container.
  • the DNA concentration in the extract after purification was measured using the Qubit dsDNA HS Assay kit (Invitrogen). Then, the cfDNA concentration (the content of cfDNA contained per 1 mL of plasma) was calculated according to the following formula.
  • cfDNA concentration [A] x [B]/[C]
  • the average concentration of cfDNA recovered from plasma on the day of blood collection is defined as "cfDNA concentration (on the day of collection)", and the average concentration of cfDNA collected from plasma after storage for 7 days is defined as “cfDNA concentration (stored for 7 days)”. and In addition, the difference between the cfDNA concentration (stored for 7 days) and the cfDNA concentration (on the day of collection) was defined as "increase in cfDNA concentration”.
  • the average value of the concentration of cfDNA is the average value of the results obtained using the blood of three persons.
  • the recovered amount of cfDNA was determined according to the following criteria. It should be noted that the greater the amount of leukocytes mixed in the plasma and the more unstable the leukocytes in the plasma, the greater the increase in the cfDNA concentration due to the destruction of the leukocytes during storage. Therefore, the smaller the amount of increase in cfDNA concentration, the more suppressed the contamination of leukocytes into plasma and the contamination of components in leukocytes.
  • the concentration of anticoagulant means the concentration of EDTA2K, not the concentration of EDTA2K ⁇ 2H 2 O.

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Abstract

血漿中への白血球及び白血球中の成分の混入を抑えることができる血液採取容器を提供する。　本発明に係る血液採取容器は、血液採取容器本体と、前記血液採取容器本体内に収容された血漿分離材と、前記血液採取容器本体内に収容された水溶液とを備え、前記水溶液に含まれる溶質が、抗凝固剤を含み、前記水溶液における前記溶質の合計濃度が、１００ｍＭ以上４５０ｍＭ以下であるか、又は、１２００ｍＭ以上である。

Description

血液採取容器、血漿の分離方法、細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法
　本発明は、血液採取容器に関する。また、本発明は、上記血液採取容器を用いた血漿の分離方法、細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法に関する。
　臨床検査において、血液を採取するために採血管等の血液採取容器が広く用いられている。血漿分離材が収容された血液採取容器に血液を採取した後、血液採取容器を遠心分離することで、血液を血漿と血球とに分離することができる。このとき、血漿は血漿分離材よりも上側に位置し、血球は下側に位置する。血漿分離材が収容された血液採取容器としては、樹脂及び無機粉末等を含む血漿分離用組成物が収容された血液採取容器（例えば、特許文献１）や、血漿分離用冶具が収容された血液採取容器（例えば、特許文献２）が知られている。
　また、下記の特許文献３には、血液中の細胞外ＤＮＡを分離するためのデバイスが記載されている。
ＷＯ２０１０／０５３１８０Ａ１ ＷＯ２０１０／１３２７８３Ａ１ ＷＯ２０２０／１３２７４７Ａ１
　臨床検査では、血漿を用いた検査が行われている。特許文献１，２に記載のような従来の血液採取容器を用いて血液から血漿を分離した場合には、分離された血漿中に白血球が比較的多く混入していることがある。血漿中に白血球が比較的多く混入していると、検体の保管中に経時的に白血球が破壊されるなどして、白血球中のタンパク質及び核酸等の成分が血漿中に漏れ出て、検査結果に影響を及ぼすことがある。
　例えば、血漿中の細胞外遊離核酸（例えばｃｅｌｌ　ｆｒｅｅ　ＤＮＡ）を検出する検査では、白血球から漏れ出た核酸によって、検査結果が大きく変動する。
　特許文献３に記載のデバイスでは、血漿中への白血球の混入をある程度抑えることができるものの、その効果は十分ではないことがある。そのため、特許文献３に記載のデバイスであっても、検体の保管中に経時的に白血球中の核酸等の成分が血漿中に漏れ出て、検査結果に影響を及ぼすことがある。
　本発明の目的は、血漿中への白血球及び白血球中の成分の混入を抑えることができる血液採取容器を提供することである。また、本発明は、上記血液採取容器を用いた血漿の分離方法、細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法を提供することも目的とする。
　本発明の広い局面によれば、血液採取容器本体と、前記血液採取容器本体内に収容された血漿分離材と、前記血液採取容器本体内に収容された水溶液とを備え、前記水溶液に含まれる溶質が、抗凝固剤を含み、前記水溶液における前記溶質の合計濃度が、１００ｍＭ以上４５０ｍＭ以下であるか、又は、１２００ｍＭ以上である、血液採取容器が提供される。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記水溶液における前記溶質の合計濃度が、２５０ｍＭ以上３９０ｍＭ以下であるか、又は、１２００ｍＭ以上６５００ｍＭ以下である。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記水溶液に含まれる前記溶質が、抗凝固剤以外の第２の溶質を含み、前記第２の溶質が、無機塩、又は糖類を含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記第２の溶質が、無機塩を含み、前記無機塩が、ナトリウム塩、又はカリウム塩を含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記第２の溶質が、糖類を含み、前記糖類が、グルコース、スクロース、又はトレハロースを含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記抗凝固剤が、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡの金属塩、ヘパリン、ヘパリンの金属塩又はクエン酸ナトリウムである。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記血液採取容器は、所定量の血液が採取される血液採取容器であり、血液採取容器に採取される血液の所定量と等量の生理食塩水を血液採取容器内に採取して、前記生理食塩水と前記水溶液とが混合された混合液を得たときに、前記混合液の浸透圧が、３３０ｍＯｓｍ／Ｌ以上３８０ｍＯｓｍ／Ｌ以下であるか、又は、４４０ｍＯｓｍ／Ｌ以上１３００ｍＯｓｍ／Ｌ以下である。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記血漿分離材の２５℃での比重が１．０３０以上１．１２０以下である。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記血漿分離材が、血漿分離用組成物である。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記血漿分離用組成物が、２５℃で流動性を有する有機成分と、無機微粉末とを含み、前記有機成分が、樹脂を含み、前記無機微粉末が、微粉末シリカを含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記微粉末シリカが、親水性シリカを含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記血漿分離用組成物１００重量％中、前記親水性シリカの含有量が、０．０１重量％以上２．５０重量％以下である。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記微粉末シリカが、親水性シリカと疎水性シリカとを含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記血漿分離用組成物の２５℃での比重が１．０５０以上であり、前記無機微粉末が、前記微粉末シリカよりも比重が大きい無機微粉末を含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記樹脂が、石油樹脂、シクロペンタジエン系樹脂、ポリエステル樹脂、又は（メタ）アクリル系樹脂を含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記血液採取容器は、血液中の細胞外遊離核酸又は細胞外小胞を分離するために用いられる。
　本発明の広い局面によれば、上述した血液採取容器内に血液を採取する工程と、前記血液が採取された前記血液採取容器を遠心分離する工程とを備える、血漿の分離方法が提供される。
　本発明の広い局面によれば、上述した血液採取容器内に血液を採取する工程と、前記血液が採取された前記血液採取容器を遠心分離して、血液から血漿を分離する工程と、分離された前記血漿から、細胞外遊離核酸を分離する工程とを備える、細胞外遊離核酸の分離方法が提供される。
　本発明の広い局面によれば、上述した血液採取容器内に血液を採取する工程と、前記血液が採取された前記血液採取容器を遠心分離して、血液から血漿を分離する工程と、分離された前記血漿から、細胞外小胞を分離する工程とを備える、細胞外小胞の分離方法が提供される。
　本発明に係る血液採取容器は、血液採取容器本体と、上記血液採取容器本体内に収容された血漿分離材と、上記血液採取容器本体内に収容された水溶液とを備える。本発明に係る血液採取容器では、上記水溶液に含まれる溶質が、抗凝固剤を含み、上記水溶液における上記溶質の合計濃度が、１００ｍＭ以上４５０ｍＭ以下であるか、又は、１２００ｍＭ以上である。本発明に係る血液採取容器では、上記の構成が備えられているので、血漿中への白血球及び白血球中の成分の混入を抑えることができる。
図１は、本発明の一実施形態に係る血液採取容器を模式的に示す正面断面図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明に係る血液採取容器は、血液採取容器本体と、上記血液採取容器本体内に収容された血漿分離材と、上記血液採取容器本体内に収容された水溶液とを備える。本発明に係る血液採取容器では、上記水溶液に含まれる溶質が、抗凝固剤を含み、上記水溶液における上記溶質の合計濃度が、１００ｍＭ以上４５０ｍＭ以下であるか、又は、１２００ｍＭ以上である。
　本発明に係る血液採取容器では、上記の構成が備えられているので、血漿中への白血球及び白血球中の成分の混入を抑えることができる。
　また、本発明に係る血液採取容器では、上記の構成が備えられているので、血漿中への赤血球の混入も抑えることができる。
　従来の血液採取容器を用いて血液から血漿を分離した場合には、分離された血漿中に白血球が比較的多く混入していることがある。血漿中に白血球が比較的多く混入していると、白血球中の成分が血漿中に漏れ出て、血漿を用いた検査に影響を及ぼすことがある。従来の血液採取容器では、血漿中への白血球の混入及び白血球中の成分の混入を十分に抑えることは困難である。なお、検査結果への影響を抑えるために、血球を安定化させる細胞安定化剤が収容された血液採取容器が用いられることがあるものの、細胞安定化剤は高価であり、また、種類及び濃度によっては人体や環境に害を及ぼす恐れがある。
　これに対して、本発明に係る血液採取容器では、血漿中への白血球の混入及び白血球中の成分の混入を効果的に抑えることができる。本発明に係る血液採取容器内に血液を採取すると、血液と上記水溶液とが混合されて、血液の浸透圧が大きくなる。そのため、白血球内の水分及び赤血球内の水分が血球外へ移動し、白血球及び赤血球の比重が大きくなる。比重が大きくなった白血球及び赤血球は、血液採取容器を遠心分離することにより、特定の比重を有する血漿分離材よりも下方に良好に移動する。その結果、血漿中への白血球及び赤血球の混入を抑えることができる。なお、採取後の血液の浸透圧が適切ではない場合、血球細胞にストレスがかかり、遠心分離後も血漿に混入している白血球が破損して白血球中の成分が血漿中へ漏出しやすい。これに対して、本発明に係る血液採取容器では、溶質の濃度が適切な範囲であるため、血球細胞へのストレスが抑えられ、血漿中に混入している血球細胞からの内容物の漏出も効果的に抑えることができる。
　以下、本発明に係る血液採取容器の詳細などを説明する。なお、本明細書において、「（メタ）アクリル」は「アクリル」と「メタクリル」との一方又は双方を意味する。
　（血漿分離材）
　上記血液採取容器は、上記血液採取容器本体内に収容された血漿分離材を備える。上記血漿分離材として、従来公知の血漿分離材を用いることができる。上記血漿分離材としては、血漿分離用組成物、及び血漿分離用冶具等が挙げられる。血漿分離材の作製が容易であることから、上記血漿分離材は、上記血漿分離用組成物であることが好ましい。
　上記血漿分離材の２５℃での比重は、１．０３０以上であってもよく、１．０４０以上であってもよく、１．０５０以上であってもよく、１．０６０以上であってもよく、１．０６０を超えていてもよく、１．０７０以上であってもよい。上記血漿分離材の２５℃での比重は、１．１２０以下であってもよく、１．１００以下であってもよく、１．０８０以下であってもよく、１．０７０未満であってもよく、１．０６０未満であってもよく、１．０５０未満であってもよく、１．０４０未満であってもよい。
　上記血漿分離材の収容箇所は、上記血液採取容器本体内であれば特に限定されない。上記血漿分離材は、上記血液採取容器本体の底部に配置されていてもよく、上記血液採取容器本体の内壁面上に配置されていてもよく、上記血液採取容器本体の側壁面上に配置されていてもよい。
　＜血漿分離用組成物＞
　上記血漿分離用組成物は、遠心分離時に血漿層と血球層との間に移動して隔壁を形成する組成物である。また、上記血漿分離用組成物は、遠心分離後に血漿層と血球層との間の成分移行を防止する目的で用いられる。上記血漿分離用組成物は、チクソトロピー性を有することが好ましい。上記血漿分離用組成物は、上記血液採取容器本体の底部に収容されていてもよく、上記血液採取容器本体の側壁面上に配置されていてもよい。本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点から、上記血漿分離用組成物は、上記血液採取容器本体の底部に収容されていることが好ましい。
　上記血漿分離用組成物として、従来公知の血漿分離用組成物を用いることができる。
　上記血漿分離用組成物は、２５℃で流動性を有する有機成分と、無機微粉末とを含むことが好ましい。上記２５℃で流動性を有する有機成分、及び上記無機微粉末はそれぞれ、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　２５℃で流動性を有する有機成分：
　上記「２５℃で流動性を有する」とは、２５℃での粘度が５００Ｐａ・ｓ以下であることを意味する。
　上記有機成分の２５℃での粘度は、好ましくは３０Ｐａ・ｓ以上、より好ましくは５０Ｐａ・ｓ以上、好ましくは２００Ｐａ・ｓ以下、より好ましくは１００Ｐａ・ｓ以下である。上記粘度が上記下限以上及び上記上限以下であると、血漿分離用組成物の流動性が高められ、隔壁の強度を高めることができる。
　上記有機成分の２５℃での粘度は、Ｅ型粘度計（例えば、東機産業社製「ＴＶＥ－３５」）を用いて、２５℃及びせん断速度１．０秒－１の条件で測定される。
　上記有機成分としては、樹脂、及び樹脂と可塑剤等の有機化合物との混合物等が挙げられる。したがって、上記有機成分は、上記樹脂を含むことが好ましく、上記樹脂と上記有機化合物とを含むことがより好ましい。上記有機成分が、上記樹脂と上記有機化合物との混合物である場合に、該混合物（上記有機成分）として流動性を有していればよく、該樹脂又は該有機化合物が流動性を有していなくてもよい。上記有機成分が、上記樹脂と上記有機化合物との混合物である場合に、該樹脂は、例えば、２５℃で固体の樹脂であってもよい。上記樹脂及び上記有機化合物はそれぞれ１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記樹脂としては、石油樹脂、シクロペンタジエン系樹脂、ポリエステル樹脂、ポリウレタン樹脂、（メタ）アクリル系樹脂、シリコーン樹脂、α－オレフィン－フマル酸エステル共重合体、セバシン酸と２，２－ジメチル－１，３－プロパンジオールと１，２－プロパンジオールとの共重合体、ポリエーテルポリウレタン系樹脂、及びポリエーテルポリエステル系樹脂等が挙げられる。上記樹脂は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記樹脂は、石油樹脂、シクロペンタジエン系樹脂、ポリエステル樹脂、又は（メタ）アクリル系樹脂を含むことが好ましい。
　上記石油樹脂の市販品としては、イーストマンケミカル社製「リガライトＳ５０９０」等が挙げられる。
　上記シクロペンタジエン系樹脂としては、シクロペンタジエン系モノマーの重合体、シクロペンタジエン系モノマーと芳香族系モノマーとの共重合体、及びジシクロペンタジエン樹脂等が挙げられる。上記シクロペンタジエン系樹脂は、水素添加されていてもよい。上記シクロペンタジエン系モノマーの重合体及び上記シクロペンタジエン系モノマーと芳香族系モノマーとの共重合体は、オリゴマーであってもよい。
　上記シクロペンタジエン系モノマーとしては、シクロペンタジエン、ジシクロペンタジエン、及びシクロペンタジエンのアルキル置換誘導体等が挙げられる。
　上記芳香族系モノマーとしては、スチレン、メチルスチレン、インデン、及びメチルインデン等が挙げられる。
　上記ジシクロペンタジエン樹脂の市販品としては、コロン社製「スコレッツＳＵ５００」及び「スコレッツＳＵ９０」等が挙げられる。
　上記ポリエステル樹脂としては、ポリアルキレンテレフタレート樹脂、及びポリアルキレンナフタレート樹脂等が挙げられる。上記ポリアルキレンテレフタレート樹脂としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート及びポリ－１，４－シクロヘキサンジメチレンテレフタレート等が挙げられる。
　上記ポリウレタン樹脂としては、ポリオール化合物とイソシアネート化合物との反応物等が挙げられる。
　上記（メタ）アクリル系樹脂としては、少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステル単量体を重合することにより得られる樹脂、及び少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステル単量体と少なくとも１種の該（メタ）アクリル酸エステル単量体以外の単量体とを重合することにより得られる樹脂が挙げられる。
　上記（メタ）アクリル酸エステル単量体としては、例えば、炭素数が１以上２０以下であるアルキル基を有する（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸ポリアルキレングリコールエステル、（メタ）アクリル酸アルコキシアルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルエステル、（メタ）アクリル酸グリシジルエステル、（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル、（メタ）アクリル酸ベンジルエステル、（メタ）アクリル酸フェノキシアルキルエステル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシルエステル、（メタ）アクリル酸イソボルニルエステル、及び（メタ）アクリル酸アルコキシシリルアルキルエステル等が挙げられる。上記（メタ）アクリル酸エステル単量体は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記有機化合物としては、ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体等が挙げられる。上記有機化合物は、ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体であることが好ましい。したがって、上記有機成分は、上記樹脂と、上記ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体との混合物であることが好ましい。
　上記ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体としては、フタル酸エステル、トリメリット酸エステル、及びピロメリット酸エステル等が挙げられる。上記ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記トリメリット酸エステルとしては、トリメリット酸トリｎ－オクチル、トリメリット酸トリイソオクチル、及びトリメリット酸トリイソデシル等が挙げられる。
　上記ピロメリット酸エステルとしては、ピロメリット酸テトライソオクチル等が挙げられる。
　上記トリメリット酸エステルの市販品としては、ＤＩＣ社製「モノサイザーＷ７００」、及び「モノサイザーＷ－７５０」、新日本理化社製「サンソサイザーＴＯＴＭ」及び「サンソサイザーＴＩＴＭ」等が挙げられる。
　上記ピロメリット酸エステルの市販品としては、ＤＩＣ社製「モノサイザーＷ－７０１０」等が挙げられる。
　上記ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体は、フタル酸エステル、トリメリット酸エステル、又はピロメリット酸エステルであることが好ましく、トリメリット酸エステルであることがより好ましい。
　上記血漿分離用組成物１００重量％中、上記有機成分の含有量は、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは８５重量％以上、更に好ましくは９０重量％以上、好ましくは９７重量％以下である。
　無機微粉末：
　上記無機微粉末としては、微粉末シリカ、酸化チタン粉末、炭酸カルシウム粉末、酸化亜鉛粉末、アルミナ粉末、ガラス微粉末、タルク粉末、カオリン粉末、ベントナイト粉末、チタニア粉末、及びジルコニウム粉末等が挙げられる。
　本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記無機微粉末は、微粉末シリカを含むことが好ましい。２５℃での比重が１．０５０以上である血漿分離用組成物を得る場合には、上記無機微粉末は、微粉末シリカと、微粉末シリカ以外の無機微粉末（第２の無機微粉末）とを含むことがより好ましい。ただし、血漿分離用組成物の２５℃での比重が１．０５０以上である場合であっても、上記無機微粉末は、上記第２の無機微粉末を含んでいなくてもよい。また、血漿分離用組成物の２５℃での比重が１．０５０未満である場合であっても、上記無機微粉末は、上記第２の無機微粉末を含んでいてもよい。上記無機微粉末、上記微粉末シリカ及び上記第２の無機微粉末はそれぞれ、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記微粉末シリカとしては、天然シリカ及び合成シリカが挙げられる。合成シリカとしては、親水性シリカ及び疎水性シリカが挙げられる。親水性シリカは、例えば、粒子表面の水酸基同士が水素結合することにより、血漿分離用組成物にチクソトロピー性を付与すると共に、比重を調整する作用を有する。一方、疎水性シリカは、親水性シリカに比べてチクソトロピー性の付与効果は小さい。
　血漿分離用組成物の比重とチクソトロピー性との双方を共に好適な範囲に維持する観点からは、上記微粉末シリカは、親水性シリカを含むことが好ましく、親水性シリカと疎水性シリカとを含むことがより好ましい。上記微粉末シリカは、親水性シリカを少なくとも含むことが好ましい。
　上記第２の無機微粉末は、微粉末シリカよりも比重が大きい無機微粉末であることが好ましく、酸化亜鉛粉末、酸化チタン粉末、アルミナ粉末等の比重が３以上である無機微粉末であることがより好ましい。
　上記第２の無機微粉末の比重は、好ましくは３以上、より好ましくは３．５以上、更に好ましくは４以上である。上記第２の無機微粉末の比重は大きいほどよい。上記比重が上記下限以上であると、血漿分離用組成物の比重を効果的に大きくすることができる。
　上記無機微粉末、上記微粉末シリカ及び上記第２の無機微粉末の平均粒子径は、特に限定されない。上記無機微粉末、上記微粉末シリカ及び上記第２の無機微粉末の平均粒子径は、１ｎｍ以上であってもよく、１０ｎｍ以上であってもよく、５００ｎｍ以下であってもよく、１００ｎｍ以下であってもよい。
　上記無機微粉末、上記微粉末シリカ及び上記第２の無機微粉末の平均粒子径は、体積基準で測定される平均径であり、５０％となるメディアン径（Ｄ５０）の値である。上記体積平均粒子径（Ｄ５０）は、レーザー回折・散乱法、画像解析法、コールター法、及び遠心沈降法等により測定可能である。上記体積平均粒子径（Ｄ５０）は、レーザー回折・散乱法又は画像解析法による測定により求めることが好ましい。
　上記微粉末シリカの比表面積は、特に限定されない。上記微粉末シリカの比表面積は、２０ｍ２／ｇ以上であってもよく、１００ｍ２／ｇ以上であってもよく、５００ｍ２／ｇ以下であってもよく、３００ｍ２／ｇ以下であってもよい。
　上記微粉末シリカの比表面積は、ＢＥＴ法により測定される。
　上記血漿分離用組成物１００重量％中、上記親水性シリカの含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．１０重量％以上、更に好ましくは０．３０重量％以上、好ましくは２．５０重量％以下、より好ましくは２．００重量％以下である。上記親水性シリカの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、血漿分離用組成物の比重とチクソトロピー性との双方をより一層好適な範囲に維持することができる。
　上記血漿分離用組成物１００重量％中、上記微粉末シリカの含有量は、好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．５重量％以上、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは７重量％以下である。上記微粉末シリカの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、血漿分離用組成物の比重とチクソトロピー性との双方をより一層好適な範囲に維持することができる。
　上記血漿分離用組成物１００重量％中、上記第２の無機微粉末の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．１重量％以上、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは７重量％以下である。上記第２の無機微粉末の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、血漿分離用組成物の比重を効果的に大きくすることができる。
　上記血漿分離用組成物１００重量％中、上記無機微粉末の含有量は、好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．５重量％以上、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは７重量％以下である。上記無機微粉末の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、血漿分離用組成物の比重を効果的に大きくすることができる。
　他の成分：
　上記血漿分離用組成物は、本発明の効果を損なわない限り、上述した成分以外の他の成分を含んでいてもよい。上記他の成分としては、有機ゲル化剤、熱可塑性エラストマー、ポリアルキレングリコール、シリコーンオイル、補助溶媒、酸化防止剤、着色剤及び水等が挙げられる。上記他の成分はそれぞれ、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記血漿分離用組成物の２５℃での比重は、好ましくは１．０３０以上、より好ましくは１．０４０以上、好ましくは１．１２０以下である。上記血漿分離用組成物の２５℃での比重が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　なお、上記血漿分離用組成物の２５℃での比重は、１．０５０以上であってもよく、１．０６０以上であってもよく、１．０６０を超えていてもよく、１．０７０以上であってもよい。上記血漿分離用組成物の２５℃での比重は、１．１００以下であってもよく、１．０８０以下であってもよく、１．０７０未満であってもよく、１．０６０未満であってもよく、１．０５０未満であってもよく、１．０４０未満であってもよい。
　上記血漿分離用組成物の２５℃での比重は、血漿分離用組成物１滴を、比重を０．００２の間隔で段階的に調整した２５℃の食塩水中に順次滴下し、食塩水中における浮沈により測定される。
　上記血漿分離用組成物の２５℃での粘度は、好ましくは１００Ｐａ・ｓ以上、より好ましくは１５０Ｐａ・ｓ以上、好ましくは５００Ｐａ・ｓ以下、より好ましくは４００Ｐａ・ｓ以下である。上記粘度が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。
　上記血漿分離用組成物の２５℃での粘度は、Ｅ型粘度計（例えば、東機産業社製「ＴＶＥ－３５」）を用いて、２５℃及びせん断速度１．０秒－１の条件で測定される。
　＜血漿分離用冶具＞
　上記血漿分離用冶具は、遠心分離時に血漿層と血球層との間に移動して隔壁を形成する冶具である。また、上記血漿分離用冶具は、血漿層と血球層との間の成分移行を防止する目的で用いられる。
　上記血漿分離用冶具として、従来公知の血漿分離用冶具を用いることができる。上記血漿分離用冶具としては、例えば、ＷＯ２０１０／１３２７８３Ａ１等に記載の機械的セパレータ（血漿分離用冶具）等が挙げられる。
　上記血漿分離用冶具の材料としては、例えば、エラストマー等が挙げられる。
　（水溶液）
　上記血液採取容器は、上記血液採取容器本体内に収容された水溶液を備える。上記水溶液は、抗凝固剤と、水とを含む。上記水溶液に含まれる溶質は、抗凝固剤を含む。上記水溶液は、抗凝固剤以外の第２の溶質を含むことが好ましい。したがって、上記水溶液は、抗凝固剤（第１の溶質）と、第２の溶質と、水とを含むことが好ましい。上記水溶液に含まれる溶質は、抗凝固剤（第１の溶質）と、第２の溶質とを含むことが好ましい。
　本発明の効果を発揮する観点から、上記水溶液における上記溶質の合計濃度は、１００ｍＭ以上４５０ｍＭ以下であるか、又は、１２００ｍＭ以上である。すなわち、上記水溶液における上記溶質の合計濃度は、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以上４５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるか、又は、１２００ｍｍｏｌ／Ｌ以上である。上記溶質の合計濃度は、上記水溶液が溶質として抗凝固剤のみを含む場合には、抗凝固剤の濃度である。上記溶質の合計濃度は、上記水溶液が溶質として抗凝固剤と第２の溶質とを含む場合には、抗凝固剤の濃度と、第２の溶質の濃度との合計である。上記抗凝固剤の濃度は、上記水溶液が抗凝固剤を１種類のみ含む場合には、上記水溶液における該抗凝固剤の濃度であり、上記水溶液が抗凝固剤を２種類以上含む場合には、上記水溶液における抗凝固剤の濃度の合計である。上記第２の溶質の濃度は、上記水溶液が第２の溶質を１種類のみ含む場合には、上記水溶液における該第２の溶質の濃度であり、上記水溶液が第２の溶質を２種類以上含む場合には、上記水溶液における第２の溶質の濃度の合計である。例えば、上記水溶液が、抗凝固剤（Ｘ）、第２の溶質（Ｙ）及び第２の溶質（Ｚ）の３種類の溶質を含み、かつそれらの濃度（ｍＭ）がそれぞれ、Ａ、Ｂ、Ｃである場合に、上記水溶液における溶質の合計濃度は、（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）ｍＭである。
　上記水溶液における上記溶質の合計濃度は、上記水溶液に含まれる水以外の成分の合計濃度であることが好ましい。
　上記水溶液における上記溶質の合計濃度は、１００ｍＭ以上４５０ｍＭ以下であってもよく、１２００ｍＭ以上であってもよい。
　上記水溶液における上記溶質の合計濃度が１００ｍＭ以上４５０ｍＭ以下である場合に、上記水溶液における上記溶質の合計濃度は、好ましくは２５０ｍＭ以上、より好ましくは３００ｍＭ以上、好ましくは３９０ｍＭ以下、より好ましくは３８０ｍＭ以下である。上記溶質の合計濃度が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　上記水溶液における上記溶質の合計濃度が１２００ｍＭ以上である場合に、上記水溶液における上記溶質の合計濃度は、好ましくは１５００ｍＭ以上、より好ましくは２０００ｍＭ以上、好ましくは７０００ｍＭ以下、より好ましくは６５００ｍＭ以下である。上記溶質の合計濃度が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　＜抗凝固剤（第１の溶質）＞
　上記水溶液は、抗凝固剤を含む。上記抗凝固剤として、従来公知の抗凝固剤を用いることができる。上記抗凝固剤は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記抗凝固剤としては、ヘパリン、ヘパリンの金属塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡの金属塩及びクエン酸等が挙げられる。
　抗凝固性能を良好に発揮させる観点から、上記抗凝固剤は、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡの金属塩、ヘパリン、ヘパリンの金属塩又はクエン酸ナトリウムであることが好ましい。
　上記水溶液における上記抗凝固剤の濃度は、好ましくは２ｍＭ以上、より好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは１０ｍＭ以上、好ましくは２０００ｍＭ以下、より好ましくは１０００ｍＭ以下、より一層好ましくは５００ｍＭ以下、更に好ましくは２５０ｍＭ以下、更により一層好ましくは１００ｍＭ以下、特に好ましくは５０ｍＭ以下である。上記抗凝固剤の濃度が上記下限以上及び上記上限以下であると、抗凝固性能を良好に発揮させることができる。
　＜第２の溶質＞
　上記第２の溶質は、上記水溶液に含まれる抗凝固剤以外の溶質である。上記第２の溶質を用いることにより、抗凝固剤の含有量を過度に多くすることなく、血液採取容器内に採取された血液の浸透圧を効果的に大きくすることができる。上記第２の溶質は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記第２の溶質は、抗凝固剤以外の成分であれば特に限定されない。上記第２の溶質としては、例えば、無機塩、糖類、糖アルコール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。
　上記無機塩としては、塩化ナトリウム及びリン酸水素ナトリウム等のナトリウム塩、並びに、塩化カリウム及び炭酸水素カリウム等のカリウム塩等が挙げられる。
　上記糖類としては、単糖類、二糖類及び多糖類等が挙げられる。上記単糖類としては、グルコース、ジヒドロキシアセトン、フルクトース及びガラクトース等が挙げられる。上記二糖類としては、スクロース、トレハロース、マルトース及びラクツロース等が挙げられる。上記多糖類としては、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、メチルセルロース、及びポリスクロース等が挙げられる。
　上記糖アルコールとしては、Ｄ－マンニトール及びＤ－ソルビトール等が挙げられる。
　上記第２の溶質は、無機塩、又は糖類を含むことが好ましい。この場合には、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　上記無機塩は、ナトリウム塩、又はカリウム塩を含むことが好ましく、塩化ナトリウム、又は塩化カリウムを含むことがより好ましい。この場合には、本発明の効果を更により一層効果的に発揮することができる。
　上記糖類は、グルコース、スクロース、又はトレハロースを含むことが好ましい。この場合には、本発明の効果を更により一層効果的に発揮することができる。
　上記水溶液における上記溶質の合計濃度が１００ｍＭ以上４５０ｍＭ以下である場合に、上記水溶液における上記無機塩の濃度は、好ましくは１００ｍＭ以上、より好ましくは２００ｍＭ以上、更に好ましくは３００ｍＭ以上、好ましくは４５０ｍＭ以下、より好ましくは４２０ｍＭ以下、更に好ましくは４００ｍＭ以下である。上記無機塩の濃度が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果を更により一層効果的に発揮することができる。
　上記水溶液における上記溶質の合計濃度が１２００ｍＭ以上である場合に、上記水溶液における上記無機塩の濃度は、好ましくは４００ｍＭ以上、より好ましくは５００ｍＭ以上、更に好ましくは１０００ｍＭ以上、好ましくは５０００ｍＭ以下、より好ましくは２０００ｍＭ以下、更に好ましくは１５００ｍＭ以下である。上記無機塩の濃度が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果を更により一層効果的に発揮することができる。
　上記無機塩の濃度は、上記水溶液が無機塩を１種類のみ含む場合には、上記水溶液における該無機塩の濃度であり、上記水溶液が無機塩を２種類以上含む場合には、上記水溶液における無機塩の濃度の合計である。
　上記水溶液における上記溶質の合計濃度が１００ｍＭ以上４５０ｍＭ以下である場合に、上記水溶液における上記糖類の濃度は、好ましくは１００ｍＭ以上、より好ましくは２００ｍＭ以上、更に好ましくは３００ｍＭ以上、好ましくは４５０ｍＭ以下、より好ましくは４２０ｍＭ以下、更に好ましくは４００ｍＭ以下である。上記糖類の濃度が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果を更により一層効果的に発揮することができる。
　上記水溶液における上記溶質の合計濃度が１２００ｍＭ以上である場合に、上記水溶液における上記糖類の濃度は、好ましくは４００ｍＭ以上、より好ましくは５００ｍＭ以上、更に好ましくは１０００ｍＭ以上、好ましくは５０００ｍＭ以下、より好ましくは３０００ｍＭ以下、更に好ましくは２５００ｍＭ以下である。上記糖類の濃度が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果を更により一層効果的に発揮することができる。
　上記糖類の濃度は、上記水溶液が糖類を１種類のみ含む場合には、上記水溶液における該糖類の濃度であり、上記水溶液が糖類を２種類以上含む場合には、上記水溶液における糖類の濃度の合計である。
　上記水溶液における上記溶質の合計濃度が１００ｍＭ以上４５０ｍＭ以下である場合に、上記水溶液における上記第２の溶質の濃度は、好ましくは８０ｍＭ以上、より好ましくは１００ｍＭ以上、更に好ましくは３００ｍＭ以上、好ましくは４５０ｍＭ以下、より好ましくは４２０ｍＭ以下、更に好ましくは４００ｍＭ以下である。上記第２の溶質の濃度が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果を更により一層効果的に発揮することができる。
　上記水溶液における上記溶質の合計濃度が１２００ｍＭ以上である場合に、上記水溶液における上記第２の溶質の濃度は、好ましくは４００ｍＭ以上、より好ましくは１０００ｍＭ以上、更に好ましくは２０００ｍＭ以上、好ましくは７０００ｍＭ以下、より好ましくは６５００ｍＭ以下、更に好ましくは６０００ｍＭ以下である。上記第２の溶質の濃度が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果を更により一層効果的に発揮することができる。
　上記血液採取容器本体内に収容されている水溶液の量は、血液採取容器本体のサイズ、及び採取される血液量等により適宜変更される。上記血液採取容器本体内に収容されている水溶液の量は、好ましくは０．１ｍＬ以上、より好ましくは０．５ｍＬ以上、更に好ましくは０．７ｍＬ以上、好ましくは５ｍＬ以下、より好ましくは３ｍＬ以下、更に好ましくは２．５ｍＬ以下である。上記水溶液の量が上記下限以上及び上記上限以下であると、血液が過度に希釈されることなく、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　（血液採取容器本体）
　上記血液採取容器本体の形状としては、特に限定されない。上記血液採取容器本体は、有底の管状容器であることが好ましい。
　上記血液採取容器本体の素材は特に限定されない。上記血液採取容器本体の素材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル等の熱可塑性樹脂；不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ－アクリレート樹脂等の熱硬化性樹脂；酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、エチルセルロース、エチルキチン等の変性天然樹脂；ソーダ石灰ガラス、リンケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のケイ酸塩ガラス、石英ガラス等のガラスが挙げられる。上記血液採取容器本体の素材は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　（栓体）
　上記血液採取容器は、栓体を備えることが好ましい。上記栓体として、従来公知の栓体を用いることができる。上記栓体は、血液採取容器本体の開口に、気密的かつ液密的に取付けることが可能な素材、形状からなる栓体であることが好ましい。上記栓体は、採血針が刺通され得るように構成されていることが好ましい。
　上記栓体としては、血液採取容器本体の開口に嵌合する形状を有する栓体、シート状のシール栓体等が挙げられる。
　また、上記栓体は、ゴム栓等の栓本体と、プラスチック等で構成されたキャップ部材とを備える栓体であってもよい。この場合には、血液採取後に、血液採取容器本体の開口から栓体を引き抜く際に、血液が人体と接触するリスクを抑えることができる。
　上記栓体（又は上記栓本体）の材料としては、例えば、合成樹脂、エラストマー、ゴム、金属箔等が挙げられる。上記ゴムとしては、ブチルゴム、及びハロゲン化ブチルゴム等が挙げられる。上記金属箔としては、アルミニウム箔等が挙げられる。密封性を高める観点からは、上記栓体の材料は、ブチルゴムであることが好ましい。上記栓体（又は上記栓本体）は、ブチルゴム栓であることが好ましい。
　（血液採取容器の他の詳細）
　上記血液採取容器は、所定量の血液が採取される血液採取容器である。上記血液の上記所定量は、血液採取容器のサイズ及び内圧等により適宜変更される。上記血液の上記所定量は、１ｍＬ以上であってもよく、２ｍＬ以上であってもよく、４ｍＬ以上であってもよく、１２ｍＬ以下であってもよく、１１ｍＬ以下であってもよく、１０ｍＬ以下であってもよい。
　上記血液採取容器に採取される血液の所定量と等量の生理食塩水を上記血液採取容器内に採取して、上記生理食塩水と上記水溶液とが混合された混合液を得る。例えば、５ｍＬの血液が採取される血液採取容器では、５ｍＬの生理食塩水を該血液採取容器内に採取して、転倒混和するなどして、上記生理食塩水と上記水溶液とを混合し、混合液を得る。上記生理食塩水と上記水溶液とが混合された上記混合液の浸透圧は、３３０ｍＯｓｍ／Ｌ以上３８０ｍＯｓｍ／Ｌ以下であるか、又は、４４０ｍＯｓｍ／Ｌ以上であることが好ましい。この場合には、血液採取容器に血液が採取された場合に、白血球及び赤血球の比重を効果的に大きくすることができ、血漿中への白血球及び赤血球の混入をより一層効果的に抑えることができる。また、この場合には、血球細胞への過度なストレスを抑えることができ、血球細胞中の成分の混入をより一層効果的に抑えることができる。
　上記混合液の浸透圧が３３０ｍＯｓｍ／Ｌ以上３８０ｍＯｓｍ／Ｌ以下である場合に、上記混合液の浸透圧は、好ましくは３４０ｍＯｓｍ／Ｌ以上、より好ましくは３５０ｍＯｓｍ／Ｌ以上、好ましくは３７５ｍＯｓｍ／Ｌ以下、より好ましくは３７０ｍＯｓｍ／Ｌ以下である。上記混合液の浸透圧が上記下限以上及び上記上限以下であると、血液採取容器に血液が採取された場合に、白血球及び赤血球の比重を効果的に大きくすることができ、血漿中への白血球及び赤血球の混入をより一層効果的に抑えることができる。また、上記混合液の浸透圧が上記下限以上及び上記上限以下であると、血球細胞への過度なストレスを抑えることができ、血球細胞中の成分の混入をより一層効果的に抑えることができる。
　上記混合液の浸透圧が４４０ｍＯｓｍ／Ｌ以上である場合に、上記混合液の浸透圧は、好ましくは４５０ｍＯｓｍ／Ｌ以上、より好ましくは５００ｍＯｓｍ／Ｌ以上、好ましくは１３００ｍＯｓｍ／Ｌ以下、より好ましくは１０００ｍＯｓｍ／Ｌ以下である。上記混合液の浸透圧が上記下限以上及び上記上限以下であると、血液採取容器に血液が採取された場合に、白血球及び赤血球の比重を効果的に大きくすることができ、血漿中への白血球及び赤血球の混入をより一層効果的に抑えることができる。また、上記混合液の浸透圧が上記下限以上及び上記上限以下であると、血球細胞への過度なストレスを抑えることができ、血球細胞中の成分の混入をより一層効果的に抑えることができる。
　上記混合液の浸透圧は、浸透圧計（例えば、アークレイ社製「ＯＭ－６０６０」）を用いて、氷点降下法により測定される。
　上記血液採取容器では、収容されている上記水溶液１ｍＬに対して、血液が３ｍＬ以上採取されることが好ましく、４ｍＬ以上採取されることがより好ましく、１１ｍＬ以下採取されることが好ましく、７ｍＬ以下採取されることがより好ましい。この場合には、血液が過度に希釈されることなく、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　上記血液採取容器は、採血管であることが好ましい。上記血液採取容器本体は、採血管本体であることが好ましい。
　上記血液採取容器は、血液から血漿を分離するために用いられることが好ましい。また、上記血液採取容器は、血液中の細胞外遊離核酸又は細胞外小胞を分離するために用いられることが好ましく、血液中の細胞外遊離核酸又は細胞外小胞を単離するために用いられることが好ましい。
　上記血液採取容器は、例えば、以下のようにして製造することができる。
　上記抗凝固剤と上記第２の溶質とを水に溶解して水溶液を得る。得られた水溶液を血液採取容器本体内に添加する。水溶液を添加する前又は添加した後に、血液採取容器本体内に血漿分離材を収容する。
　図１は、本発明の一実施形態に係る血液採取容器を模式的に示す正面断面図である。
　図１に示す血液採取容器１は、血液採取容器本体２と、血漿分離用組成物３と、抗凝固剤及び第２の溶質を含む水溶液４と、栓体５とを備える。血液採取容器本体２は、一端に開口を有し、他端に閉じられている底部を有する。血漿分離用組成物３は、血液採取容器本体２の底部に収容されている。栓体５は、血液採取容器本体２の開口に挿入されている。
　水溶液４は、血漿分離用組成物３の表面上に配置されており、より具体的には、血漿分離用組成物３の上面（一端側の表面）に配置されている。水溶液４は、血液採取容器１を正立状態としたときに、血漿分離用組成物３の表面上に配置されている。抗凝固剤及び第２の溶質は、水に溶解した状態で、血液採取容器本体２内に収容されている。
　本発明に係る血液採取容器では、上記血漿分離用組成物が上記血液採取容器本体の側壁面上に配置されており、かつ上記水溶液が、血液採取容器を正立状態としたときに、血液採取容器本体の底部に配置されていてもよい。また、上記血漿分離用組成物の代わりに上記血漿分離用冶具が用いられてもよい。
　上記血液採取容器の内圧は特に限定されない。上記血液採取容器は、内部が排気された上で、上記栓体によって密閉された真空採血管として用いることもできる。真空採血管である場合、採血者の技術差によらず一定量の血液採取を簡便に行うことができる。
　細菌感染を防止する観点から、血液採取容器の内部はＩＳＯ又はＪＩＳの基準に則って滅菌されていることが好ましい。
　（血漿の分離方法）
　上記血液採取容器を用いて、血液から血漿を分離することができる。本発明に係る血漿の分離方法は、上述した血液採取容器内に血液を採取する工程と、上記血液が採取された上記血液採取容器を遠心分離する工程とを備える。
　本発明に係る血漿の分離方法では、上記血液を採取する工程と上記遠心分離する工程との間に、採取された血液と、上記水溶液とを混合する工程を備えることが好ましい。採取された血液と上記水溶液とを混合する方法としては、転倒混和等が挙げられる。
　上記遠心分離する工程における遠心分離条件は、上記血漿分離材により隔壁を形成させて、血漿と血球とを分離させることができる限り、特に限定されない。上記遠心分離条件としては、例えば、４００Ｇ以上４０００Ｇ以下で１０分間以上１２０分間以下で遠心分離する条件等が挙げられる。
　（細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法）
　本発明に係る細胞外遊離核酸の分離方法は、上述した血液採取容器内に血液を採取する工程と、上記血液が採取された上記血液採取容器を遠心分離して、血液から血漿を分離する工程と、分離された上記血漿から、細胞外遊離核酸を分離する工程とを備える。
　本発明に係る細胞外小胞の分離方法は、上述した血液採取容器内に血液を採取する工程と、上記血液が採取された上記血液採取容器を遠心分離して、血液から血漿を分離する工程と、分離された上記血漿から、細胞外小胞を分離する工程とを備える。
　本発明に係る細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法では、上記血液を採取する工程と上記遠心分離する工程との間に、採取された血液と、上記水溶液とを混合する工程を備えることが好ましい。採取された血液と上記水溶液とを混合する方法としては、転倒混和等が挙げられる。
　上記遠心分離する工程における遠心分離条件は、上記血漿分離材により隔壁を形成させて、血漿と血球とを分離させることができる限り、特に限定されない。上記遠心分離条件としては、例えば、４００Ｇ以上４０００Ｇ以下で１０分間以上１２０分間以下で遠心分離する条件等が挙げられる。
　上記細胞外遊離核酸を分離する工程では、従来公知の方法を用いて、血漿から細胞外遊離核酸を分離することができる。上記細胞外遊離核酸としては、ｃｅｌｌ　ｆｒｅｅ　ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ｃｅｌｌ　ｆｒｅｅ　ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）等が挙げられる。上記血漿から細胞外遊離核酸を分離する方法としては、市販の核酸精製キットを用いる方法等が挙げられる。市販の核酸精製キットを用いることで、血漿から細胞外遊離核酸を簡便に分離することができる。核酸精製キットの市販品としては、ＱＩＡａｍｐ　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）、ＱＩＡａｍｐ　ＭｉｎＥｌｕｔｅ　ｃｃｆＤＮＡ　Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社）及びＭａｇＭＡＸ　Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）等が挙げられる。
　上記細胞外小胞を分離する工程では、従来公知の方法を用いて、血漿から細胞外小胞を分離することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。
　血漿分離用組成物の材料として、以下を用意した。
　（２５℃で流動性を有する有機成分の材料）
　（メタ）アクリル系樹脂：
　アクリル酸－２－エチルヘキシルとアクリル酸ブチルとをアゾ系重合開始剤の存在下で溶液重合法によりラジカル重合させ、２５℃で流動性を有する（メタ）アクリル酸エステル系重合体を得た。
　その他の樹脂：
　石油樹脂（イーストマンケミカル社製「リガライトＳ５０９０」）
　ジシクロペンタジエン樹脂１（コロン社製「スコレッツＳＵ５００」）
　ジシクロペンタジエン樹脂２（コロン社製「スコレッツＳＵ９０」）
　有機化合物：
　トリメリット酸エステル（ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体、ＤＩＣ社製「モノサイザーＷ７００」）
　（無機微粉末）
　親水性シリカ（微粉末シリカ、日本アエロジル社製「２００ＣＦ」）
　疎水性シリカ（微粉末シリカ、日本アエロジル社製「Ｒ９７４」）
　酸化チタン粉末（第２の無機微粉末、石原産業社製「Ａ－１００」）
　（その他の成分）
　シリコーンオイル（東レダウコーニング社製「ＳＦ８４１０」）
　有機ゲル化剤（新日本理化社製「ゲルオールＤ」）
　１－メチル－２－ピロリドン（補助溶媒）
　血漿分離用組成物Ａ，Ｂの作製：
　表１に記載の配合割合で、２５℃で流動性を有する有機成分と無機微粉末とその他の成分とを混合し、血漿分離用組成物Ａ，Ｂを作製した。
　血漿分離用組成物Ｃの作製：
　表１に記載の２５℃で流動性を有する有機成分の材料を配合し、１３０℃で加熱溶解し、混合して、２５℃で流動性を有する有機成分を作製した。次いで、表１に記載の配合割合で、２５℃で流動性を有する有機成分と無機微粉末とその他の成分とを混合し、血漿分離用組成物Ｃを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られた血漿分離用組成物１滴を、比重を０．００２の間隔で段階的に調整した２５℃の食塩水中に順次滴下し、食塩水中における浮沈により比重を測定した。得られた血漿分離用組成物の２５℃での比重は表２～４に示した。
　水溶液の溶質として、以下を用意した。
　（抗凝固剤）
　エチレンジアミン四酢酸二カリウム二水和物（ＥＤＴＡ２Ｋ・２Ｈ２Ｏ）
　（第２の溶質）
　塩化カリウム（ＫＣｌ）
　塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）
　スクロース
　グルコース
　プロピレングリコール
　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）
　血液採取容器本体として、以下を用意した。
　長さ１００ｍｍ、開口部の内径１４ｍｍのＰＥＴ有底管（ポリエチレンテレフタレート管）
　（実施例１）
　抗凝固剤及び第２の溶質を水に溶解して水溶液を得た。得られた水溶液の配合成分の種類及び濃度を表２に示す。
　１．２ｇの血漿分離用組成物Ｃを、血液採取容器本体の底部に収容した。また、得られた水溶液１ｍＬを血漿分離用組成物Ｃの表面上に添加した。血液採取容器内部を、血液採取量が５ｍＬとなるように減圧し、ブチルゴム栓により密封した。このようにして血液採取容器を作製した。
　（実施例２～７及び比較例２～４）
　血漿分離用組成物の種類、及び水溶液の組成を表２～４のように変更した。また、実施例５及び比較例２，３では、血液採取容器内部を、血液採取量が１０ｍＬとなるように減圧し、ブチルゴム栓により密封した。これら以外は、実施例１と同様にして、血液採取容器を作製した。
　（比較例１）
　抗凝固剤３２重量部を、水６８重量部に溶解して、混合液を得た。１．２ｇの血漿分離用組成物Ｃを、血液採取容器本体の底部に収容した。また、得られた混合液６０ｍｇを、血液採取容器本体の内壁面に塗布し、乾燥させた。血液採取容器内部を、血液採取量が１０ｍＬとなるように減圧し、ブチルゴム栓により密封した。このようにして血液採取容器を作製した。
　（評価）
　（１）混合液の浸透圧
　実施例１～４，６，７で得られた血液採取容器に生理食塩水５ｍＬを採取した。また、実施例５で得られた血液採取容器に生理食塩水１０ｍＬを採取した。生理食塩水を採取した後、転倒混和して、生理食塩水と血液採取容器内に収容された水溶液とを混合し、混合液を得た。得られた混合液の浸透圧を、浸透圧計（アークレイ社製「ＯＭ－６０６０」）を用いて、氷点降下法により測定した。
　（２）ｃｆＤＮＡの回収量
　３名の血液を使用し、それぞれについて以下の操作を行った。実施例１～４，６，７及び比較例４で得られた血液採取容器を各２本用意し、それぞれに血液５ｍＬを採取した。また、実施例５及び比較例１～３で得られた血液採取容器を各２本用意し、それぞれに血液１０ｍＬを採取した。血液を採取した後、転倒混和して、血液と血液採取容器内に収容された水溶液とを混合した。次いで、血液採取容器を１５００Ｇで１５分間遠心分離した。遠心分離後、血漿分離用組成物により形成された隔壁よりも上方に血漿が位置していた。
　血漿分離後の血液採取容器２本のうちの１本については、血液を採取した当日に血液採取容器から血漿を回収した。また、血漿分離後の血液採取容器２本のうちの残りの１本については、血漿が分離された状態の血液採取容器を室温（２５℃）で７日間保管した後、血液採取容器から血漿を回収した。
　ｃｆＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製「ＱＩＡａｍｐ　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｋｉｔ」）を用いて、回収した血漿に含まれるＤＮＡを精製した。なお、ＤＮＡの精製操作は、血液採取容器から血漿を回収した日に実施した。
　精製後の抽出液中のＤＮＡ濃度を、Ｑｕｂｉｔ　ｄｓＤＮＡ　ＨＳ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて測定した。次いで、以下の式に従い、ｃｆＤＮＡ濃度（血漿１ｍＬあたりに含まれるｃｆＤＮＡの含量）を算出した。
　ｃｆＤＮＡ濃度（ｎｇ／血漿１ｍＬ）＝［Ａ］×［Ｂ］／［Ｃ］
　［Ａ］：精製後の抽出液中のＤＮＡ濃度の測定値（ｎｇ／ｍＬ）
　［Ｂ］：精製後の抽出液の全量（ｍＬ）
　［Ｃ］：ＤＮＡ精製に使用した血漿の量（ｍＬ）
　血液採取当日の血漿から回収したｃｆＤＮＡの濃度の平均値を「ｃｆＤＮＡ濃度（採取当日）」とし、７日間保管後の血漿から回収したｃｆＤＮＡの濃度の平均値を「ｃｆＤＮＡ濃度（７日保管）」とした。また、ｃｆＤＮＡ濃度（７日保管）とｃｆＤＮＡ濃度（採取当日）との差を「ｃｆＤＮＡ濃度の増加量」とした。なお、上記ｃｆＤＮＡの濃度の平均値とは、３名の血液を用いた結果の平均値である。
　ｃｆＤＮＡの回収量を以下の基準で判定した。なお、血漿中の白血球の混入量が多いほど、また、血漿中の白血球が不安定であるほど、保管中の白血球の破壊に伴ってｃｆＤＮＡ濃度の増加量が大きくなる。したがって、ｃｆＤＮＡ濃度の増加量が小さいほど、血漿中への白血球の混入及び白血球中の成分の混入が抑えられている。
　＜ｃｆＤＮＡの回収量の判定基準＞
　〇〇：ｃｆＤＮＡ濃度の増加量が２０ｎｇ／血漿１ｍＬ未満である
　○：ｃｆＤＮＡ濃度の増加量が２０ｎｇ／血漿１ｍＬ以上１００ｎｇ／血漿１ｍＬ未満である
　×：ｃｆＤＮＡ濃度の増加量が１００ｎｇ／血漿１ｍＬ以上である
　構成及び結果を下記の表２～４に示す。なお、表中、抗凝固剤の濃度は、ＥＤＴＡ２Ｋ・２Ｈ２Ｏの濃度ではなく、ＥＤＴＡ２Ｋの濃度を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　１…血液採取容器
　２…血液採取容器本体
　３…血漿分離用組成物
　４…水溶液
　５…栓体

Claims (19)

  1. 　血液採取容器本体と、
    　前記血液採取容器本体内に収容された血漿分離材と、
    　前記血液採取容器本体内に収容された水溶液とを備え、
    　前記水溶液に含まれる溶質が、抗凝固剤を含み、
    　前記水溶液における前記溶質の合計濃度が、１００ｍＭ以上４５０ｍＭ以下であるか、又は、１２００ｍＭ以上である、血液採取容器。
  2. 　前記水溶液における前記溶質の合計濃度が、２５０ｍＭ以上３９０ｍＭ以下であるか、又は、１２００ｍＭ以上６５００ｍＭ以下である、請求項１に記載の血液採取容器。
  3. 　前記水溶液に含まれる前記溶質が、抗凝固剤以外の第２の溶質を含み、
    　前記第２の溶質が、無機塩、又は糖類を含む、請求項１又は２に記載の血液採取容器。
  4. 　前記第２の溶質が、無機塩を含み、
    　前記無機塩が、ナトリウム塩、又はカリウム塩を含む、請求項３に記載の血液採取容器。
  5. 　前記第２の溶質が、糖類を含み、
    　前記糖類が、グルコース、スクロース、又はトレハロースを含む、請求項３又は４に記載の血液採取容器。
  6. 　前記抗凝固剤が、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡの金属塩、ヘパリン、ヘパリンの金属塩又はクエン酸ナトリウムである、請求項１～５のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  7. 　所定量の血液が採取される血液採取容器であり、
    　血液採取容器に採取される血液の所定量と等量の生理食塩水を血液採取容器内に採取して、前記生理食塩水と前記水溶液とが混合された混合液を得たときに、前記混合液の浸透圧が、３３０ｍＯｓｍ／Ｌ以上３８０ｍＯｓｍ／Ｌ以下であるか、又は、４４０ｍＯｓｍ／Ｌ以上１３００ｍＯｓｍ／Ｌ以下である、請求項１～６のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  8. 　前記血漿分離材の２５℃での比重が１．０３０以上１．１２０以下である、請求項１～７のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  9. 　前記血漿分離材が、血漿分離用組成物である、請求項１～８のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  10. 　前記血漿分離用組成物が、２５℃で流動性を有する有機成分と、無機微粉末とを含み、
    　前記有機成分が、樹脂を含み、
    　前記無機微粉末が、微粉末シリカを含む、請求項９に記載の血液採取容器。
  11. 　前記微粉末シリカが、親水性シリカを含む、請求項１０に記載の血液採取容器。
  12. 　前記血漿分離用組成物１００重量％中、前記親水性シリカの含有量が、０．０１重量％以上２．５０重量％以下である、請求項１１に記載の血液採取容器。
  13. 　前記微粉末シリカが、親水性シリカと疎水性シリカとを含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  14. 　前記血漿分離用組成物の２５℃での比重が１．０５０以上であり、
    　前記無機微粉末が、前記微粉末シリカよりも比重が大きい無機微粉末を含む、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  15. 　前記樹脂が、石油樹脂、シクロペンタジエン系樹脂、ポリエステル樹脂、又は（メタ）アクリル系樹脂を含む、請求項１０～１４のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  16. 　血液中の細胞外遊離核酸又は細胞外小胞を分離するために用いられる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  17. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の血液採取容器内に血液を採取する工程と、
    　前記血液が採取された前記血液採取容器を遠心分離する工程とを備える、血漿の分離方法。
  18. 　請求項１～１６のいずれか１項に記載の血液採取容器内に血液を採取する工程と、
    　前記血液が採取された前記血液採取容器を遠心分離して、血液から血漿を分離する工程と、
    　分離された前記血漿から、細胞外遊離核酸を分離する工程とを備える、細胞外遊離核酸の分離方法。
  19. 　請求項１～１６のいずれか１項に記載の血液採取容器内に血液を採取する工程と、
    　前記血液が採取された前記血液採取容器を遠心分離して、血液から血漿を分離する工程と、
    　分離された前記血漿から、細胞外小胞を分離する工程とを備える、細胞外小胞の分離方法。
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KR1020237032624A KR20240013088A (ko) 2021-05-28 2022-05-27 혈액 채취 용기, 혈장의 분리 방법, 세포외 유리 핵산의 분리 방법 및 세포외 소포의 분리 방법
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EP22811410.4A EP4350348A1 (en) 2021-05-28 2022-05-27 Blood collection container, method for separating plasma, method for separating extracellular free nucleic acid, and method for separating extracellular vesicle
CN202280038108.2A CN117413181A (zh) 2021-05-28 2022-05-27 血液采集容器、血浆的分离方法、细胞外游离核酸的分离方法和细胞外囊泡的分离方法
CA3218292A CA3218292A1 (en) 2021-05-28 2022-05-27 Blood collection container, method for separating plasma, method for separating extracellular free nucleic acid, and method for separating extracellular vesicle

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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001083144A (ja) * 1999-09-09 2001-03-30 Asahi Kasei Corp 血液処理方法および組成物
JP2005017189A (ja) * 2003-06-27 2005-01-20 Srl Inc 血中インスリン濃度測定用添加剤組成物及びそれを含む採血管
WO2010053180A1 (ja) 2008-11-07 2010-05-14 日立化成工業株式会社 血清又は血漿分離材及びそれを用いた採血管
WO2010132783A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Becton, Dickinson And Company Density phase separation device
WO2016159236A1 (ja) * 2015-03-31 2016-10-06 積水メディカル株式会社 血清または血漿分離用組成物、並びに血液採取容器
WO2020132747A1 (en) 2018-12-24 2020-07-02 Deltadna Biosciences Inc Composition and method for segregating extracellular dna in blood
JP2021500585A (ja) * 2017-10-19 2021-01-07 ストレック， インコーポレイテッド 溶血、凝固調節および細胞外小胞の安定化のための組成物

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001083144A (ja) * 1999-09-09 2001-03-30 Asahi Kasei Corp 血液処理方法および組成物
JP2005017189A (ja) * 2003-06-27 2005-01-20 Srl Inc 血中インスリン濃度測定用添加剤組成物及びそれを含む採血管
WO2010053180A1 (ja) 2008-11-07 2010-05-14 日立化成工業株式会社 血清又は血漿分離材及びそれを用いた採血管
WO2010132783A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Becton, Dickinson And Company Density phase separation device
WO2016159236A1 (ja) * 2015-03-31 2016-10-06 積水メディカル株式会社 血清または血漿分離用組成物、並びに血液採取容器
JP2021500585A (ja) * 2017-10-19 2021-01-07 ストレック， インコーポレイテッド 溶血、凝固調節および細胞外小胞の安定化のための組成物
WO2020132747A1 (en) 2018-12-24 2020-07-02 Deltadna Biosciences Inc Composition and method for segregating extracellular dna in blood

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