WO2023145137A1 - 血液採取容器、血漿の分離方法、細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法 - Google Patents

血液採取容器、血漿の分離方法、細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法 Download PDF

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WO2023145137A1
WO2023145137A1 PCT/JP2022/036449 JP2022036449W WO2023145137A1 WO 2023145137 A1 WO2023145137 A1 WO 2023145137A1 JP 2022036449 W JP2022036449 W JP 2022036449W WO 2023145137 A1 WO2023145137 A1 WO 2023145137A1
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WO
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collection container
blood collection
blood
plasma
aqueous solution
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Application number
PCT/JP2022/036449
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English (en)
French (fr)
Inventor
邦哉 駒井
エムディ シャハダット ホセイン
智雅 井上
Original Assignee
積水メディカル株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/10—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the present invention relates to a blood collection container.
  • the present invention also relates to a method for separating plasma, a method for separating extracellular free nucleic acid, and a method for separating extracellular vesicles using the blood collection container.
  • Blood collection containers such as blood collection tubes are widely used in clinical examinations to collect blood. After collecting blood in a blood collection container containing a plasma separation material, the blood can be separated into plasma and blood cells by centrifuging the blood collection container. At this time, the plasma is positioned above the plasma separation material, and the blood cells are positioned below.
  • the blood collection container containing the plasma separation material include a blood collection container containing a composition for plasma separation containing resin and inorganic powder (for example, Patent Document 1) and a blood collection container containing a jig for plasma separation. A container (for example, Patent Document 2) is known.
  • white blood cells may be mixed in the separated plasma.
  • the separated plasma is stored for a certain period of time without freezing until it is used for testing.
  • conventional blood collection containers such as those described in Patent Documents 1 and 2
  • leukocytes mixed in the plasma are destroyed over time due to death or the like, and the DNA in the leukocytes may leak into the plasma. Leakage of DNA in white blood cells into plasma can affect test results.
  • test results will vary greatly depending on the DNA leaked from the leukocytes.
  • a blood collection container main body a plasma separation material contained in the blood collection container main body, and an aqueous solution contained in the blood collection container main body, Specific gravity at 25°C is 1.027 or more and 1.060 or less, and the aqueous solution contains an anticoagulant and a water-soluble polymer compound or ammonium sulfate having a number average molecular weight of 500 or more and 180,000 or less.
  • a blood collection container is provided.
  • the aqueous solution contains a water-soluble polymer compound with a number average molecular weight of 500 or more and 180,000 or less.
  • the aqueous solution contains the ammonium sulfate.
  • the aqueous solution contains the water-soluble polymer compound having a number average molecular weight of 500 or more and 180,000 or less, and the ammonium sulfate.
  • the water-soluble polymer compound having a number average molecular weight of 500 or more and 180,000 or less is dextran, polyethylene glycol, or polyvinylpyrrolidone.
  • the water-soluble polymer compound having a number average molecular weight of 500 or more and 180,000 or less is a water-soluble polymer having a number average molecular weight of 2,000 or more and 150,000 or less. is a compound.
  • the aqueous solution further contains trehalose.
  • the aqueous solution further contains glucose, adenine or inositol.
  • the aqueous solution further contains an apoptosis inhibitor.
  • the blood collection container is a blood collection container from which a predetermined amount of blood is collected, and an amount of physiological fluid equivalent to the predetermined amount of blood collected in the blood collection container.
  • the mixture has an osmotic pressure of 300 mOsm/L or more.
  • the aqueous solution further contains propylene glycol.
  • the plasma separation material is a composition for plasma separation.
  • the composition for plasma separation contains an organic component having fluidity at 25° C. and an inorganic fine powder, the organic component contains a resin, and the The inorganic fine powder includes finely divided silica.
  • the finely divided silica contains hydrophilic silica.
  • the hydrophilic silica content is 0.01% by weight or more and 2.50% by weight or less in 100% by weight of the plasma separation composition.
  • the finely divided silica contains hydrophilic silica and hydrophobic silica.
  • the plasma separation composition has a specific gravity of 1.050 or more at 25° C., and the inorganic fine powder has a higher specific gravity than the fine powder silica. Contains fine powder.
  • the resin includes petroleum resin, cyclopentadiene resin, polyester resin, or (meth)acrylic resin.
  • the blood collection container is used to separate extracellular free nucleic acids or extracellular vesicles in blood.
  • a plasma separation method comprising the steps of: collecting blood in the blood collection container described above; and centrifuging the blood collection container containing the blood. .
  • a blood collection container comprises a blood collection container main body, a plasma separation material contained in the blood collection container main body, and an aqueous solution contained in the blood collection container main body.
  • the specific gravity at 25°C is 1.027 or more and 1.060 or less.
  • the aqueous solution contains an anticoagulant and a water-soluble polymer compound having a number average molecular weight of 500 or more and 180,000 or less, or ammonium sulfate. Since the blood collection container according to the present invention has the above configuration, it is possible to suppress the contamination of plasma with leukocyte-derived DNA during sample storage.
  • FIG. 1 is a front cross-sectional view schematically showing a blood collection container according to one embodiment of the present invention.
  • a blood collection container comprises a blood collection container main body, a plasma separation material contained in the blood collection container main body, and an aqueous solution contained in the blood collection container main body.
  • the specific gravity at 25°C is 1.027 or more and 1.060 or less.
  • the aqueous solution contains an anticoagulant and a water-soluble polymer compound having a number average molecular weight of 500 or more and 180,000 or less, or ammonium sulfate.
  • the blood collection container according to the present invention has the above configuration, it is possible to suppress contamination of plasma with leukocyte-derived DNA during sample storage.
  • the blood and the aqueous solution are mixed.
  • the present inventors have found that the specific water-soluble polymer compound or ammonium sulfate contained in the aqueous solution can suppress the contamination of the separated plasma with leukocytes. It was also found that the specific water-soluble polymer compound or ammonium sulfate contained in the aqueous solution can stabilize leukocytes contaminating the separated plasma. Therefore, in the blood collection container according to the present invention, leakage of DNA from leukocytes due to destruction of leukocytes over time can be effectively suppressed, and an increase in the amount of DNA in plasma during specimen storage can be suppressed. In addition, in the blood collection container according to the present invention, since the destruction of leukocytes mixed in plasma over time can be effectively suppressed, leakage of contents such as proteins from the leukocytes can also be effectively suppressed. .
  • (meth)acryl means one or both of “acryl” and “methacryl”.
  • the blood collection container includes a plasma separation material housed within the blood collection container main body.
  • a conventionally known plasma separation material can be used as the plasma separation material.
  • the plasma separation material include plasma separation compositions and plasma separation jigs.
  • the plasma separation material is preferably the plasma separation composition, because the plasma separation material can be easily produced.
  • the specific gravity of the plasma separation material at 25°C is 1.027 or more and 1.060 or less.
  • the specific gravity of the plasma separation material at 25°C is preferably 1.029 or more, more preferably 1.030 or more, still more preferably 1.032 or more, preferably 1.055 or less, and more preferably 1.050 or less. be.
  • the specific gravity of the plasma separation material at 25°C is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, plasma can be separated from blood more effectively, and leukocytes and erythrocytes are more effectively prevented from being mixed into plasma. can be effectively suppressed.
  • the storage location of the plasma separation material is not particularly limited as long as it is inside the blood collection container main body.
  • the plasma separation material may be arranged at the bottom of the blood collection container main body, or may be arranged on the inner wall surface of the blood collection container main body.
  • the plasma separation composition is a composition that migrates between the plasma layer and the blood cell layer during centrifugation to form a partition wall. Moreover, the composition for plasma separation is used for the purpose of preventing component migration between the plasma layer and the blood cell layer after centrifugation.
  • the plasma separation composition preferably has thixotropic properties.
  • the plasma separation composition may be contained in the bottom of the blood collection container main body, or may be arranged on the inner wall surface. From the viewpoint of exhibiting the effects of the present invention more effectively, the plasma separation composition is preferably contained in the bottom portion of the blood collection container main body.
  • a conventionally known composition for plasma separation can be used as the composition for plasma separation.
  • the composition for plasma separation preferably contains an organic component having fluidity at 25°C and an inorganic fine powder.
  • Each of the organic component having fluidity at 25° C. and the inorganic fine powder may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • the viscosity of the organic component at 25°C is preferably 10 Pa ⁇ s or more, more preferably 30 Pa ⁇ s or more, preferably 200 Pa ⁇ s or less, more preferably 100 Pa ⁇ s or less.
  • the viscosity is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the fluidity of the composition for plasma separation is enhanced, and the strength of partition walls formed by centrifugation can be enhanced.
  • the viscosity of the above organic component at 25°C is measured using an E-type viscometer (for example, "TVE-35" manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd.) under the conditions of 25°C and a shear rate of 1.0 sec -1 . .
  • the organic component preferably contains the resin, and more preferably contains the resin and the organic compound.
  • the organic component is a mixture of the resin and the organic compound, it is sufficient that the mixture (the organic component) has fluidity, and the resin or the organic compound has fluidity. It doesn't have to be.
  • the resin may be, for example, a solid resin at 25°C.
  • Each of the above resin and the above organic compound may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • Examples of the above resins include petroleum resins, cyclopentadiene resins, polyester resins, polyurethane resins, (meth)acrylic resins, silicone resins, ⁇ -olefin-fumarate ester copolymers, sebacic acid and 2,2-dimethyl-1. ,3-propanediol and 1,2-propanediol copolymers, polyether polyurethane resins, and polyether polyester resins. Only one kind of the above resin may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • the resin preferably contains petroleum resin, cyclopentadiene resin, polyester resin, or (meth)acrylic resin.
  • Examples of the cyclopentadiene-based resin include polymers of cyclopentadiene-based monomers, copolymers of cyclopentadiene-based monomers and aromatic monomers, and dicyclopentadiene resins.
  • the cyclopentadiene-based resin may be hydrogenated.
  • the polymer of the cyclopentadiene monomer and the copolymer of the cyclopentadiene monomer and the aromatic monomer may be oligomers.
  • cyclopentadiene-based monomers examples include cyclopentadiene, dicyclopentadiene, and alkyl-substituted derivatives of cyclopentadiene.
  • Styrene, methylstyrene, indene, methylindene and the like are mentioned as the aromatic monomers.
  • polyester resins include polyalkylene terephthalate resins and polyalkylene naphthalate resins.
  • polyalkylene terephthalate resin examples include polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate and poly-1,4-cyclohexanedimethylene terephthalate.
  • polyurethane resin examples include a reaction product of a polyol compound and an isocyanate compound.
  • the (meth)acrylic resin includes a resin obtained by polymerizing at least one (meth)acrylic acid ester monomer, and at least one (meth)acrylic acid ester monomer and at least one and a resin obtained by polymerizing a monomer other than the (meth)acrylic acid ester monomer.
  • Examples of the (meth)acrylic acid ester monomers include (meth)acrylic acid alkyl esters, (meth)acrylic acid polyalkylene glycol esters, (meth)acrylic acid alkoxyalkyl esters, (meth)acrylic acid hydroxyalkyl esters, ( meth)acrylic acid glycidyl ester, (meth)acrylic acid dialkylaminoalkyl ester, (meth)acrylic acid benzyl ester, (meth)acrylic acid phenoxyalkyl ester, (meth)acrylic acid cyclohexyl ester, (meth)acrylic acid isobornyl ester esters, and (meth)acrylic acid alkoxysilylalkyl esters, and the like.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group is preferably 1 or more and preferably 20 or less.
  • the (meth)acrylic acid alkyl ester is preferably a (meth)acrylic acid alkyl ester having an alkyl group having from 1 to 20 carbon atoms. Only one kind of the (meth)acrylic acid ester monomer may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • Examples of the above organic compounds include benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivatives.
  • the organic compound is preferably a benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivative. Therefore, the organic component is preferably a mixture of the resin and the benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivative.
  • benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivatives examples include phthalates, trimellitates, pyromellitic esters, and the like. Only one kind of the benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivative may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • trimellitate examples include tri-n-octyl trimellitate, triisooctyl trimellitate, and triisodecyl trimellitate.
  • Examples of the pyromellitic acid ester include tetraisooctyl pyromellitic acid.
  • trimellitate esters include “Monocizer W700” and “Monocizer W-750” manufactured by DIC, and “Sansocizer TOTM” and “Sansocizer TITM” manufactured by Shin Nippon Rika.
  • the benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivative is preferably a phthalate, a trimellitate, or a pyromellitate, more preferably a trimellitate.
  • the content of the organic component in 100% by weight of the composition for plasma separation is preferably 80% by weight or more, more preferably 85% by weight or more, still more preferably 90% by weight or more, and preferably 97% by weight or less. .
  • Inorganic fine powder examples include fine powder silica, titanium oxide powder, calcium carbonate powder, zinc oxide powder, alumina powder, glass fine powder, talc powder, kaolin powder, bentonite powder, titania powder, and zirconium powder.
  • the inorganic fine powder preferably contains fine powder silica.
  • the inorganic fine powder includes finely powdered silica and an inorganic fine powder other than finely powdered silica (second inorganic fine powder). and more preferably.
  • the specific gravity of the plasma separation composition at 25° C. is 1.050 or higher
  • the inorganic fine powder may not contain the second inorganic fine powder.
  • the specific gravity of the composition for plasma separation at 25° C. is less than 1.050, the inorganic fine powder may contain the second inorganic fine powder.
  • Each of the inorganic fine powder, the fine silica powder, and the second inorganic fine powder may be used alone or in combination of two or more.
  • the finely divided silica includes natural silica and synthetic silica.
  • Synthetic silica includes hydrophilic silica and hydrophobic silica.
  • Hydrophilic silica has the effect of imparting thixotropy to the composition for plasma separation and adjusting the specific gravity, for example, by hydrogen bonding between hydroxyl groups on the particle surfaces.
  • hydrophobic silica has a smaller effect of imparting thixotropy than hydrophilic silica.
  • the finely divided silica preferably contains hydrophilic silica, and includes hydrophilic silica and hydrophobic silica. is more preferable.
  • the second inorganic fine powder is preferably an inorganic fine powder having a higher specific gravity than finely divided silica, and is an inorganic fine powder having a specific gravity of 3 or more, such as zinc oxide powder, titanium oxide powder, and alumina powder. is more preferred.
  • the specific gravity of the second inorganic fine powder is preferably 3 or more, more preferably 3.5 or more, and even more preferably 4 or more. The higher the specific gravity of the second inorganic fine powder, the better. When the specific gravity is equal to or higher than the lower limit, the specific gravity of the composition for plasma separation can be effectively increased.
  • the average particle size of the inorganic fine powder, the fine silica powder, and the second inorganic fine powder is not particularly limited.
  • the average particle size of the inorganic fine powder, the fine silica powder, and the second inorganic fine powder may be 1 nm or more, 10 nm or more, 500 nm or less, or 100 nm or less. There may be.
  • the average particle diameters of the inorganic fine powder, the fine silica powder, and the second inorganic fine powder are the average diameters measured on a volume basis, and are the values of the median diameter (D50) at 50%.
  • the volume average particle size (D50) can be measured by a laser diffraction/scattering method, an image analysis method, a Coulter method, a centrifugal sedimentation method, or the like.
  • the volume average particle size (D50) is preferably obtained by measurement by a laser diffraction/scattering method or an image analysis method.
  • the specific surface area of the finely divided silica is not particularly limited.
  • the specific surface area of the finely divided silica may be 20 m 2 /g or more, 100 m 2 /g or more, 500 m 2 /g or less, or 300 m 2 /g or less. good too.
  • the specific surface area of the finely divided silica is measured by the BET method.
  • the content of the hydrophilic silica in 100% by weight of the composition for plasma separation is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.10% by weight or more, and still more preferably 0.30% by weight or more. is 2.50% by weight or less, more preferably 2.00% by weight or less.
  • the content of the hydrophilic silica is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, both the specific gravity and thixotropy of the composition for plasma separation can be maintained within a more suitable range.
  • the content of the finely divided silica in 100% by weight of the composition for plasma separation is preferably 0.1% by weight or more, more preferably 0.5% by weight or more, preferably 10% by weight or less, more preferably 7% by weight. % by weight or less.
  • content of the finely divided silica is above the lower limit and below the upper limit, both the specific gravity and thixotropy of the composition for plasma separation can be maintained within a more suitable range.
  • the content of the second inorganic fine powder is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.1% by weight or more, and preferably 10% by weight or less. Preferably, it is 7% by weight or less.
  • the content of the second inorganic fine powder is not less than the lower limit and not more than the upper limit, the specific gravity of the plasma separation composition can be effectively increased.
  • the content of the inorganic fine powder in 100% by weight of the composition for plasma separation is preferably 0.1% by weight or more, more preferably 0.5% by weight or more, preferably 10% by weight or less, and more preferably 7% by weight. % by weight or less.
  • the specific gravity of the plasma separation composition can be effectively increased.
  • composition for plasma separation may contain other ingredients than those mentioned above as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • other components include organic gelling agents, thermoplastic elastomers, polyalkylene glycols, silicone oils, co-solvents, antioxidants, colorants and water.
  • organic gelling agents include organic gelling agents, thermoplastic elastomers, polyalkylene glycols, silicone oils, co-solvents, antioxidants, colorants and water.
  • the specific gravity of the plasma separation composition at 25° C. is preferably 1.027 or higher, more preferably 1.029 or higher, still more preferably 1.030 or higher, particularly preferably 1.032 or higher, and preferably 1.060. Below, more preferably 1.055 or less, still more preferably 1.050 or less.
  • the specific gravity of the composition for plasma separation at 25°C is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, plasma can be well separated from blood, and contamination of plasma with leukocytes can be effectively suppressed. can be done.
  • the specific gravity of the plasma separation composition at 25° C. is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, contamination of plasma with red blood cells can be effectively suppressed.
  • the specific gravity at 25°C of the composition for plasma separation may be 1.050 or more, or may exceed 1.050.
  • the specific gravity of the composition for plasma separation at 25° C. was obtained by dropping one drop of the composition for plasma separation sequentially into saline at 25° C. whose specific gravity was adjusted stepwise at intervals of 0.002, and floating and sinking in the saline. measured by
  • the viscosity of the plasma separation composition at 25°C is preferably 50 Pa ⁇ s or more, more preferably 70 Pa ⁇ s or more, preferably 500 Pa ⁇ s or less, more preferably 400 Pa ⁇ s or less.
  • the viscosity is at least the lower limit and at most the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the viscosity of the composition for plasma separation at 25° C. was measured using an E-type viscometer (eg, “TVE-35” manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd.) under conditions of 25° C. and a shear rate of 1.0 sec ⁇ 1 . measured.
  • E-type viscometer eg, “TVE-35” manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd.
  • the jig for plasma separation is a jig that moves between the plasma layer and the blood cell layer during centrifugation to form a partition wall. Moreover, the jig for plasma separation is used for the purpose of preventing component transfer between the plasma layer and the blood cell layer.
  • a conventionally known plasma separation jig can be used as the plasma separation jig.
  • Examples of the plasma separation jig include a mechanical separator (plasma separation jig) described in WO2010/132783A1 and the like.
  • Examples of materials for the plasma separation jig include elastomers.
  • the blood collection container includes an aqueous solution contained within the blood collection container body.
  • the aqueous solution preferably contains an anticoagulant and water.
  • the aqueous solution contains a water-soluble polymer compound having a number average molecular weight of 500 or more and 180,000 or less (hereinafter sometimes referred to as water-soluble polymer compound (X)) or ammonium sulfate.
  • the solute contained in the aqueous solution includes an anticoagulant.
  • the solute contained in the aqueous solution contains the water-soluble polymer compound (X) or ammonium sulfate.
  • the aqueous solution may contain the water-soluble polymer compound (X) and ammonium sulfate.
  • the aqueous solution contains an anticoagulant.
  • Conventionally known anticoagulants can be used as the anticoagulant. Only one kind of the anticoagulant may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • anticoagulant examples include heparin, heparin metal salts, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), EDTA metal salts, citric acid and sodium citrate.
  • the anticoagulant is preferably EDTA, a metal salt of EDTA, heparin, a metal salt of heparin, or sodium citrate.
  • the concentration of the anticoagulant in the aqueous solution is preferably 2 mM or more, more preferably 5 mM or more, still more preferably 10 mM or more, preferably 2000 mM or less, more preferably 1000 mM or less, even more preferably 500 mM or less, still more preferably 250 mM. Below, even more preferably 100 mM or less, particularly preferably 50 mM or less.
  • concentration of the anticoagulant is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, good anticoagulant performance can be exhibited.
  • the aqueous solution preferably contains a water-soluble polymer compound (water-soluble polymer compound (X)) having a number average molecular weight of 500 to 180,000 (500 to 180,000).
  • the reason why the contamination of the separated plasma with leukocytes can be suppressed by using the water-soluble polymer compound (X) is that the water-soluble polymer compound (X) keeps the viscosity of the blood good. It is presumed that this is because leukocytes move more smoothly during centrifugation, but the present invention is not limited to this.
  • water-soluble polymer compound (X) suppresses DNA leakage from leukocytes contaminating blood plasma. It is presumed that this is for stabilizing leukocytes, but is not limited to this.
  • water-soluble in the water-soluble polymer compound (X) means that 0.1 g or more is dissolved in 100 g of water at 25°C.
  • the water-soluble polymer compound (X) only one type may be used, or two or more types may be used in combination.
  • the number average molecular weight of the water-soluble polymer compound (X) is 500 or more and 180,000 or less.
  • the number average molecular weight of the water-soluble polymer compound (X) is preferably 1,000 or more, more preferably 1,500 or more, still more preferably 2,000 or more, particularly preferably 2,500 or more, preferably 170,000. 150,000 or less, more preferably 120,000 or less, and particularly preferably 100,000 or less.
  • the number average molecular weight of the water-soluble polymer compound (X) is at least the above lower limit and below the above upper limit, leukocyte contamination in the separated plasma can be further suppressed, and leukocytes can be further stabilized. and the effect of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the number average molecular weight of the water-soluble polymer compound (X) is the number average molecular weight in terms of standard polyethylene glycol measured by gel permeation chromatography (GPC).
  • water-soluble polymer compounds (X) include dextran, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, methylcellulose, hydroxyethylcellulose and corn starch.
  • the water-soluble polymer compound (X) is preferably dextran, polyethylene glycol, or polyvinylpyrrolidone.
  • leukocytes can be further stabilized, and the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • each water-soluble polymer compound (X) is preferably 0.1% by weight or more, more preferably 0.5% by weight or more, still more preferably 1% by weight or more, preferably It is 15% by weight or less, more preferably 10% by weight or less, and still more preferably 7% by weight or less.
  • each content of the water-soluble polymer compound (X) is equal to or more than the above lower limit and equal to or less than the above upper limit, leukocytes can be further stabilized, and the effects of the present invention can be exhibited more effectively. .
  • each content of the water-soluble polymer compound (X) refers to the content of the water-soluble polymer compound (X) when the aqueous solution contains one type of water-soluble polymer compound (X).
  • each content of the water-soluble polymer compound (X) refers to the content of the water-soluble polymer compound (X) when the aqueous solution contains one type of water-soluble polymer compound (X).
  • the aqueous solution contains two or more types of water-soluble polymer compounds (X), it means the content of each water-soluble polymer compound (X).
  • the content of the water-soluble polymer compound (X) in 100% by weight of the aqueous solution is preferably 0.1% by weight or more, more preferably 0.5% by weight or more, still more preferably 1% by weight or more, and preferably 20% by weight. % by weight or less, more preferably 15% by weight or less, and even more preferably 10% by weight or less.
  • the content of the water-soluble polymer compound (X) is at least the above lower limit and below the above upper limit, leukocytes can be further stabilized, and the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the content of the water-soluble polymer compound (X) is equal to or higher than the above lower limit, the osmotic pressure of the mixture obtained by mixing the collected blood and the aqueous solution can be effectively increased. The amount of leukocyte contamination can be further reduced.
  • the aqueous solution preferably contains ammonium sulfate.
  • the present inventors have found that the use of ammonium sulfate can further suppress the contamination of the separated plasma with leukocytes, and that the leakage of DNA from the leukocytes that are contamination with the plasma can be suppressed. Found it.
  • the aqueous solution contains the water-soluble polymer compound (X) and ammonium sulfate, the effects of the present invention are exhibited more effectively.
  • the content of ammonium sulfate in 100% by weight of the aqueous solution is preferably 0.5% by weight or more, more preferably 1% by weight or more, still more preferably 4% by weight or more, preferably 20% by weight or less, and more preferably 15% by weight. % or less, more preferably 10% by weight or less.
  • ammonium sulfate content is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, contamination of the separated plasma with leukocytes can be further suppressed, and leukocytes can be further stabilized. The effects of the invention can be exhibited more effectively.
  • the osmotic pressure of the mixed liquid obtained by mixing the collected blood and the aqueous solution can be effectively increased, so that the amount of leukocytes mixed into the plasma can be reduced. can be much less.
  • the aqueous solution preferably contains trehalose.
  • the solute contained in the aqueous solution preferably contains trehalose.
  • the content of trehalose in 100% by weight of the aqueous solution is preferably 0.5% by weight or more, more preferably 1% by weight or more, still more preferably 2% by weight or more, preferably 10% by weight or less, and more preferably 7% by weight. % or less, more preferably 5 wt % or less.
  • content of trehalose is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, leukocytes can be further stabilized, and the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the osmotic pressure of the mixed liquid in which the collected blood and the aqueous solution are mixed can be effectively increased, so that the amount of leukocytes mixed into the plasma can be reduced. can be much less.
  • the aqueous solution preferably contains glucose, adenine, or inositol.
  • the solute contained in the aqueous solution preferably contains glucose, adenine or inositol.
  • the aqueous solution may contain only one of glucose, adenine and inositol, or may contain two or more of them.
  • the content of glucose in 100% by weight of the aqueous solution is preferably 0.1% by weight or more, more preferably 0.3% by weight or more, and more preferably 10% by weight or less. is 5% by weight or less.
  • the content of glucose is equal to or more than the lower limit and equal to or less than the upper limit, the effect of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the glucose content is equal to or higher than the lower limit, the osmotic pressure of the mixed liquid in which the collected blood and the aqueous solution are mixed can be effectively increased. can be much less.
  • the content of adenine in 100% by weight of the aqueous solution is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.05% by weight or more, and more preferably 2% by weight or less. is 1% by weight or less.
  • the adenine content is at least the lower limit and at most the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the osmotic pressure of the mixed liquid obtained by mixing the collected blood and the aqueous solution can be effectively increased, so that the amount of leukocytes mixed into plasma can be reduced. can be much less.
  • the content of inositol in 100% by weight of the aqueous solution is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.05% by weight or more, and more preferably 2% by weight or less. is 1% by weight or less.
  • the inositol content is at least the lower limit and at most the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the inositol content is equal to or higher than the lower limit, the osmotic pressure of the mixed liquid in which the collected blood and the aqueous solution are mixed can be effectively increased, so that the amount of leukocytes mixed into the plasma can be reduced. can be much less.
  • the aqueous solution preferably contains an apoptosis inhibitor.
  • the solute contained in the aqueous solution preferably contains an apoptosis inhibitor.
  • an apoptosis inhibitor By using an apoptosis inhibitor, cell death of leukocytes during sample storage can be effectively suppressed, and as a result, leakage of DNA from leukocytes contaminating plasma can be further suppressed. Only one kind of the apoptosis inhibitor may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • Examples of the apoptosis inhibitor include Q-VD-Oph and Z-VAD-FMK.
  • the apoptosis inhibitor is preferably a caspase inhibitor, more preferably Q-VD-Oph.
  • the aqueous solution preferably contains a caspase inhibitor, more preferably Q-VD-Oph.
  • the concentration of the apoptosis inhibitor in the aqueous solution is preferably 1 nM or higher, more preferably 20 nM or higher, preferably 10 ⁇ M or lower, more preferably 5 ⁇ M or lower.
  • concentration of the apoptosis inhibitor is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the aqueous solution preferably contains propylene glycol.
  • the solute contained in the aqueous solution preferably contains propylene glycol.
  • the content of propylene glycol in 100% by weight of the aqueous solution is preferably 1% by weight or more, more preferably 5% by weight or more, preferably 50% by weight or less, and more preferably 30% by weight or less.
  • the aqueous solution may contain components other than the components described above (anticoagulant, water-soluble polymer compound (X), ammonium sulfate, trehalose, glucose, adenine, inositol, apoptosis inhibitor, and propylene glycol).
  • Inorganic salts, sugars, sugar alcohols, and the like are mentioned as the above-mentioned other ingredients. Only one of the other components may be used, or two or more thereof may be used in combination.
  • inorganic salts examples include sodium salts such as sodium chloride and sodium hydrogen phosphate, and potassium salts such as potassium chloride and potassium hydrogen carbonate.
  • saccharides examples include dihydroxyacetone, fructose, galactose, sucrose, maltose, lactulose, and polysaccharides that do not correspond to the water-soluble polymer compound (X).
  • sugar alcohols examples include D-mannitol and D-sorbitol.
  • the amount of the aqueous solution contained in the blood collection container main body is appropriately changed depending on the size of the blood collection container main body, the amount of blood to be collected, and the like.
  • the amount of the aqueous solution contained in the blood collection container body is preferably 0.1 mL or more, more preferably 0.5 mL or more, still more preferably 0.7 mL or more, preferably 5 mL or less, more preferably 3 mL or less, More preferably, it is 2.5 mL or less.
  • the amount of the aqueous solution is equal to or more than the lower limit and equal to or less than the upper limit, the effects of the present invention can be exhibited more effectively without excessive dilution of blood.
  • the shape of the blood collection container main body is not particularly limited.
  • the blood collection container main body is preferably a bottomed tubular container.
  • the material of the blood collection container body is not particularly limited.
  • Materials for the blood collection container body include thermoplastic resins such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyethylene terephthalate, polymethyl methacrylate, and polyacrylonitrile; thermosetting resins such as unsaturated polyester resins, epoxy resins, and epoxy-acrylate resins; Modified natural resins such as cellulose acetate, cellulose propionate, ethyl cellulose and ethyl chitin; silicate glasses such as soda lime glass, phosphosilicate glass and borosilicate glass; and glasses such as quartz glass. Only one kind of material may be used for the blood collection container main body, or two or more kinds may be used in combination.
  • the blood collection container preferably has a stopper.
  • the stopper is preferably attached to the opening of the blood collection container main body.
  • a conventionally known plug can be used as the plug. It is preferable that the stopper is made of a material and has a shape that can be attached to the opening of the blood collection container main body in an airtight and liquid-tight manner.
  • the plug is preferably configured so that a blood collection needle can be pierced therethrough.
  • the plug examples include a plug having a shape that fits into the opening of the blood collection container main body, a sheet-like sealing plug, and the like.
  • the plug body may be a plug body including a plug body such as a rubber plug and a cap member made of plastic or the like. In this case, it is possible to reduce the risk of blood coming into contact with the human body when the plug is pulled out from the opening of the blood collection container main body after blood collection.
  • the plug body examples include synthetic resin, elastomer, rubber, and metal foil.
  • the rubber examples include butyl rubber and halogenated butyl rubber. Aluminum foil etc. are mentioned as said metal foil.
  • the material of the stopper is preferably butyl rubber.
  • the stopper (or the stopper body) is preferably a butyl rubber stopper.
  • the blood collection container is a blood collection container from which a predetermined amount of blood is collected.
  • the predetermined amount of blood is appropriately changed depending on the size and internal pressure of the blood collection container.
  • the predetermined amount of the blood may be 1 mL or more, 2 mL or more, 4 mL or more, 12 mL or less, 11 mL or less, or 10 mL or less. may be
  • a physiological saline solution in an amount equal to a predetermined amount of blood to be collected in the blood collection container is collected in the blood collection container to obtain a mixed liquid in which the physiological saline solution and the aqueous solution are mixed.
  • a mixed liquid in which the physiological saline solution and the aqueous solution are mixed For example, in a blood collection container from which 5 mL of blood is collected, 5 mL of physiological saline is collected into the blood collection container and mixed by inversion or the like to mix the physiological saline and the aqueous solution.
  • the osmotic pressure of the mixed solution obtained by mixing the physiological saline and the aqueous solution is preferably 300 mOsm/L or more, more preferably 330 mOsm/L or more, still more preferably 350 mOsm/L or more, and preferably 1300 mOsm/L or less. It is more preferably 1000 mOsm/L or less, still more preferably 800 mOsm/L or less. If the osmotic pressure of the mixed liquid is equal to or higher than the lower limit, when blood is collected in the blood collection container, the blood and the aqueous solution are mixed to increase the osmotic pressure of the blood.
  • the water content in white blood cells and the water content in red blood cells move out of the blood cells, and the specific gravities of white blood cells and red blood cells increase.
  • the white blood cells and red blood cells with increased specific gravity move well below the plasma separation material.
  • contamination of white blood cells and red blood cells into plasma can be effectively suppressed.
  • the osmotic pressure of the mixed solution is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, excessive stress on leukocytes can be suppressed, and leukocytes can be further stabilized, so that the effects of the present invention are further enhanced. can be effectively demonstrated.
  • the osmotic pressure of the above mixed solution is measured by the freezing point depression method using an osmometer (for example, "OM-6060” manufactured by ARKRAY).
  • 3 mL or more of blood is preferably collected, more preferably 4 mL or more, preferably 11 mL or less, and 10 mL or less is collected from 1 mL of the aqueous solution contained in the blood collection container. more preferably.
  • the effects of the present invention can be exhibited more effectively without excessive dilution of blood.
  • the blood collection container is preferably a blood collection tube.
  • the blood collection container main body is preferably a blood collection tube main body.
  • the blood collection container is preferably used for separating plasma from blood.
  • the blood collection container is preferably used for isolating extracellular free nucleic acids or extracellular vesicles in blood. preferably.
  • the blood collection container can be manufactured as follows.
  • An aqueous solution is obtained by dissolving an anticoagulant and a water-soluble polymer compound (X) or ammonium sulfate in water. If necessary, components other than these (trehalose, glucose, adenine, inositol, apoptosis inhibitor, propylene glycol, or other components mentioned above) are also dissolved in water to obtain an aqueous solution. The resulting aqueous solution is added into the body of the blood collection container. Before or after adding the aqueous solution, the plasma separation material is accommodated in the blood collection container main body.
  • FIG. 1 is a front cross-sectional view schematically showing a blood collection container according to one embodiment of the present invention.
  • the blood collection container main body 2 has an opening at one end and a closed bottom at the other end.
  • the plasma separation composition 3 is housed in the bottom of the blood collection container body 2 .
  • the aqueous solution 4 contains an anticoagulant and also contains a water-soluble polymer compound (X) or ammonium sulfate.
  • the stopper 5 is inserted into the opening of the blood collection container main body 2 .
  • the aqueous solution 4 is placed on the surface of the plasma separation composition 3, more specifically, on the upper surface (one end side surface) of the plasma separation composition 3.
  • the aqueous solution 4 is placed on the surface of the plasma separation composition 3 when the blood collection container 1 is in an upright state.
  • the composition for plasma separation is arranged on the side wall surface of the blood collection container main body, and the aqueous solution is applied to the blood collection container when the blood collection container is placed in an upright state. It may be arranged at the bottom of the container body. Moreover, the jig for plasma separation may be used instead of the composition for plasma separation.
  • the internal pressure of the blood collection container is not particularly limited.
  • the blood collection container can also be used as a vacuum blood collection tube whose inside is evacuated and then sealed with the stopper. In the case of a vacuum blood collection tube, a fixed amount of blood can be collected easily regardless of the skill of the blood collector.
  • the inside of the blood collection container is sterilized according to ISO or JIS standards.
  • the blood collection container can be used to separate plasma from blood.
  • a plasma separation method according to the present invention comprises the steps of collecting blood in the above-described blood collection container and centrifuging the blood collection container containing the blood.
  • the plasma separation method according to the present invention preferably includes a step of mixing the collected blood and the aqueous solution between the step of collecting the blood and the step of centrifuging.
  • a method for mixing the collected blood and the aqueous solution inversion mixing and the like can be mentioned.
  • the centrifugation conditions in the centrifugation step are not particularly limited as long as the plasma separation material can form partition walls to separate plasma and blood cells.
  • Examples of the centrifugation conditions include conditions for centrifugation at 400 G or more and 4000 G or less for 10 minutes or more and 120 minutes or less.
  • the method for separating extracellular free nucleic acids according to the present invention includes the steps of collecting blood in the above-described blood collection container, and centrifuging the blood collection container containing the blood to separate plasma from the blood. and separating extracellular free nucleic acids from the separated plasma.
  • a method for separating extracellular vesicles according to the present invention includes the steps of collecting blood in the blood collection container described above, and centrifuging the blood collection container containing the blood to separate plasma from the blood. and separating extracellular vesicles from the separated plasma.
  • the collected blood and the aqueous solution are mixed between the step of collecting the blood and the step of centrifuging. It is preferable to include steps.
  • steps As a method for mixing the collected blood and the aqueous solution, inversion mixing and the like can be mentioned.
  • the centrifugation conditions in the centrifugation step are not particularly limited as long as the plasma separation material can form partition walls to separate plasma and blood cells.
  • Examples of the centrifugation conditions include conditions for centrifugation at 400 G or more and 4000 G or less for 10 minutes or more and 120 minutes or less.
  • the extracellular free nucleic acid can be separated from plasma using a conventionally known method.
  • the extracellular free nucleic acid include cell free DNA (cfDNA), cell free RNA (cfRNA), and the like.
  • the method for isolating the extracellularly released nucleic acid from the plasma include a method using a commercially available nucleic acid purification kit.
  • Extracellular free nucleic acids can be easily separated from plasma by using a commercially available nucleic acid purification kit.
  • nucleic acid purification kits include QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manufactured by QIAGEN), QIAamp MinElute ccfDNA Kits (manufactured by QIAGEN) and MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit (Applied biosystem ms company) and the like.
  • extracellular vesicles can be separated from plasma using a conventionally known method.
  • the following materials were prepared for the plasma separation composition.
  • (Material of organic component having fluidity at 25°C) (Meth) acrylic resin 1: 2-Ethylhexyl acrylate and butyl acrylate are radically polymerized by a solution polymerization method in the presence of an azo polymerization initiator to form a (meth)acrylic acid ester polymer ((meth)acrylic ester polymer having fluidity at 25°C). A system resin 1) was obtained. The specific gravity of the (meth)acrylic resin 1 at 25° C. was 1.034.
  • (Meth) acrylic resin 2 A (meth)acrylic acid ester-based fluid at 25° C. was prepared in the same manner as in (meth)acrylic resin 1, except that the blending ratio of 2-ethylhexyl acrylate and butyl acrylate was changed. A polymer ((meth)acrylic resin 2) was obtained. The specific gravity of the (meth)acrylic resin 2 at 25° C. was 1.015.
  • Trimellitate ester (benzene polycarboxylic acid alkyl ester derivative, "Monocizer W700" manufactured by DIC)
  • Hydrophilic silica fine powder silica, "200CF” manufactured by Nippon Aerosil Co., Ltd.
  • Hydrophobic silica fine powder silica, "R974" manufactured by Nippon Aerosil Co., Ltd.
  • Titanium oxide powder (“A-100” manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.)
  • Silicone oil (“SF8410” manufactured by Dow Corning Toray Co., Ltd.)
  • Organic gelling agent (“Gelol D” manufactured by Shin Nippon Rika Co., Ltd.) 1-methyl-2-pyrrolidone (co-solvent)
  • Preparation of plasma separation compositions A, B, and D An organic component, an inorganic fine powder, and other components having flowability at 25° C. were mixed at the mixing ratios shown in Table 1 to prepare compositions A, B, and D for plasma separation.
  • Preparation of plasma separation composition C The materials of the organic component having fluidity at 25°C shown in Table 1 were blended, heated and dissolved at 130°C, and mixed to prepare an organic component having fluidity at 25°C. Next, the organic component, the inorganic fine powder, and the other components, which are fluid at 25°C, were mixed at the mixing ratio shown in Table 1 to prepare a composition C for plasma separation.
  • PET bottomed tube polyethylene terephthalate tube with a length of 100 mm and an inner diameter of 14 mm at the opening
  • Example 1 An aqueous solution was obtained by dissolving the components shown in Table 2 in water. Table 2 shows the types and concentrations of the components in the resulting aqueous solution.
  • 1.2 g of plasma separation composition A was accommodated in the bottom of the blood collection container main body. Also, 1 mL of the obtained aqueous solution was added onto the surface of the composition A for plasma separation. The inside of the blood collection container was evacuated so that the blood collection volume was 8 mL, and the container was sealed with a butyl rubber stopper. Thus, a blood collection container was produced.
  • Examples 2 to 12 and Comparative Examples 2 and 3 The type of composition for plasma separation and the composition of the aqueous solution were changed as shown in Tables 2-5.
  • a blood collection container was produced in the same manner as in Example 1 except for these.
  • composition A for plasma separation was accommodated in the bottom of the blood collection container main body. Also, 60 mg of the obtained mixture was applied to the inner wall surface of the blood collection container main body and dried. The inside of the blood collection container was evacuated so that the blood collection volume was 8 mL, and the container was sealed with a butyl rubber plug. Thus, a blood collection container was produced.
  • the number of white blood cells in the plasma was measured by analyzing the collected plasma using a multiitem automatic blood cell analyzer ("XE5000" manufactured by Sysmex Corporation).
  • the prepared blood (whole blood sample) was similarly measured for the white blood cell count in the whole blood sample.
  • the above white blood cell count is the average value of the results obtained by evaluating the prepared blood of three persons.
  • the residual ratio of leukocytes was calculated by the following formula.
  • Leukocyte survival rate (%) (number of leukocytes contained in separated plasma (cells)) / (number of leukocytes contained in whole blood sample (cells)) x 100
  • Leukocyte residual rate is less than 10%
  • Leukocyte residual rate is 10% or more
  • DNA contained in the collected plasma was purified using a cfDNA purification kit ("QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit” manufactured by QIAGEN). The DNA purification operation was performed on the day plasma was collected from the blood collection container.
  • the DNA concentration in the extract after purification was measured using the Qubit dsDNA HS Assay kit (manufactured by Invitrogen). Then, the cfDNA concentration (the content of cfDNA contained per 1 mL of plasma) was calculated according to the following formula.
  • cfDNA concentration [A] x [B]/[C]
  • the average concentration of cfDNA collected from plasma on the day of blood collection is defined as “cfDNA concentration (on the day of collection)", and the average concentration of cfDNA collected from plasma after storage for 7 days is defined as “cfDNA concentration (storage for 7 days)”. and in addition, the difference between the cfDNA concentration (stored for 7 days) and the cfDNA concentration (on the day of collection) was defined as "increased amount of cfDNA concentration”.
  • the average value of the cfDNA concentration is the average value of the results obtained using the blood of three persons.
  • the recovered amount of cfDNA was determined according to the following criteria. During storage, the more leukocytes contaminating the plasma are destroyed, the greater the amount of increase in the cfDNA concentration. Therefore, the smaller the increase in the cfDNA concentration, the more the leakage of DNA from leukocytes contaminating plasma is suppressed, and the contamination of leukocyte-derived DNA into plasma during specimen storage is suppressed.
  • the concentration of anticoagulant means the concentration of EDTA2K, not the concentration of EDTA2K ⁇ 2H 2 O.

Abstract

検体保存中における血漿への白血球由来ＤＮＡの混入を抑えることができる血液採取容器を提供する。　本発明に係る血液採取容器は、血液採取容器本体と、前記血液採取容器本体内に収容された血漿分離材と、前記血液採取容器本体内に収容された水溶液とを備え、前記血漿分離材の２５℃での比重が、１．０２７以上１．０６０以下であり、前記水溶液が、抗凝固剤を含み、かつ、数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物又は硫酸アンモニウムを含む。

Description

血液採取容器、血漿の分離方法、細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法
　本発明は、血液採取容器に関する。また、本発明は、上記血液採取容器を用いた血漿の分離方法、細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法に関する。
　臨床検査において、血液を採取するために採血管等の血液採取容器が広く用いられている。血漿分離材が収容された血液採取容器に血液を採取した後、血液採取容器を遠心分離することで、血液を血漿と血球とに分離することができる。このとき、血漿は血漿分離材よりも上側に位置し、血球は下側に位置する。血漿分離材が収容された血液採取容器としては、樹脂及び無機粉末を含む血漿分離用組成物が収容された血液採取容器（例えば、特許文献１）や、血漿分離用冶具が収容された血液採取容器（例えば、特許文献２）が知られている。
ＷＯ２０１０／０５３１８０Ａ１ ＷＯ２０１０／１３２７８３Ａ１
　血漿分離材が収容された血液採取容器を用いて血液から血漿を分離した場合、分離された血漿中に白血球が混入していることがある。
　ところで、分離された血漿は、検査に用いられるまで、凍結させずに一定期間保管される。特許文献１，２に記載のような従来の血液採取容器では、血漿中に混入している白血球が死滅等によって経時的に破壊されて、白血球中のＤＮＡが血漿中に漏れ出ることがある。白血球中のＤＮＡが血漿中に漏れ出ると、検査結果に影響を及ぼすことがある。
　例えば、血漿中の細胞外遊離核酸（例えばｃｅｌｌ　ｆｒｅｅ　ＤＮＡ）を検出する検査では、白血球から漏れ出たＤＮＡによって、検査結果が大きく変動する。
　本発明の目的は、検体保存中における血漿への白血球由来ＤＮＡの混入を抑えることができる血液採取容器を提供することである。また、本発明は、上記血液採取容器を用いた血漿の分離方法、細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法を提供することも目的とする。
　本発明の広い局面によれば、血液採取容器本体と、前記血液採取容器本体内に収容された血漿分離材と、前記血液採取容器本体内に収容された水溶液とを備え、前記血漿分離材の２５℃での比重が、１．０２７以上１．０６０以下であり、前記水溶液が、抗凝固剤を含み、かつ、数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物又は硫酸アンモニウムを含む、血液採取容器が提供される。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記水溶液が、前記数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物を含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記水溶液が、前記硫酸アンモニウムを含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記水溶液が、前記数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物と、前記硫酸アンモニウムとを含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物が、デキストラン、ポリエチレングリコール、又はポリビニルピロリドンである。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物が、数平均分子量が２，０００以上１５０，０００以下の水溶性高分子化合物である。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記水溶液が、トレハロースをさらに含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記水溶液が、グルコース、アデニン又はイノシトールをさらに含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記水溶液が、アポトーシス阻害剤をさらに含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記血液採取容器は、所定量の血液が採取される血液採取容器であり、血液採取容器に採取される血液の所定量と等量の生理食塩水を血液採取容器内に採取して、前記生理食塩水と前記水溶液とが混合された混合液を得たときに、前記混合液の浸透圧が、３００ｍＯｓｍ／Ｌ以上である。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記水溶液が、プロピレングリコールをさらに含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記血漿分離材が、血漿分離用組成物である。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記血漿分離用組成物が、２５℃で流動性を有する有機成分と、無機微粉末とを含み、前記有機成分が、樹脂を含み、前記無機微粉末が、微粉末シリカを含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記微粉末シリカが、親水性シリカを含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記血漿分離用組成物１００重量％中、前記親水性シリカの含有量が、０．０１重量％以上２．５０重量％以下である。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記微粉末シリカが、親水性シリカと疎水性シリカとを含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記血漿分離用組成物の２５℃での比重が１．０５０以上であり、前記無機微粉末が、前記微粉末シリカよりも比重が大きい無機微粉末を含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記樹脂が、石油樹脂、シクロペンタジエン系樹脂、ポリエステル樹脂又は（メタ）アクリル系樹脂を含む。
　本発明に係る血液採取容器のある特定の局面では、前記血液採取容器は、血液中の細胞外遊離核酸又は細胞外小胞を分離するために用いられる。
　本発明の広い局面によれば、上述した血液採取容器内に血液を採取する工程と、前記血液が採取された前記血液採取容器を遠心分離する工程とを備える、血漿の分離方法が提供される。
　本発明の広い局面によれば、上述した血液採取容器内に血液を採取する工程と、前記血液が採取された前記血液採取容器を遠心分離して、血液から血漿を分離する工程と、分離された前記血漿から、細胞外遊離核酸を分離する工程とを備える、細胞外遊離核酸の分離方法が提供される。
　本発明の広い局面によれば、上述した血液採取容器内に血液を採取する工程と、前記血液が採取された前記血液採取容器を遠心分離して、血液から血漿を分離する工程と、分離された前記血漿から、細胞外小胞を分離する工程とを備える、細胞外小胞の分離方法が提供される。
　本発明に係る血液採取容器は、血液採取容器本体と、上記血液採取容器本体内に収容された血漿分離材と、上記血液採取容器本体内に収容された水溶液とを備え、上記血漿分離材の２５℃での比重が１．０２７以上１．０６０以下である。本発明に係る血液採取容器では、上記水溶液が、抗凝固剤を含み、かつ、数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物又は硫酸アンモニウムを含む。本発明に係る血液採取容器では、上記の構成が備えられているので、検体保存中における血漿への白血球由来ＤＮＡの混入を抑えることができる。
図１は、本発明の一実施形態に係る血液採取容器を模式的に示す正面断面図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明に係る血液採取容器は、血液採取容器本体と、上記血液採取容器本体内に収容された血漿分離材と、上記血液採取容器本体内に収容された水溶液とを備え、上記血漿分離材の２５℃での比重が１．０２７以上１．０６０以下である。本発明に係る血液採取容器では、上記水溶液が、抗凝固剤を含み、かつ、数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物又は硫酸アンモニウムを含む。
　本発明に係る血液採取容器では、上記の構成が備えられているので、検体保存中における血漿への白血球由来ＤＮＡの混入を抑えることができる。
　本発明に係る血液採取容器内に血液を採取すると、血液と上記水溶液とが混合される。本発明者らは、上記水溶液に含まれる特定の水溶性高分子化合物又は硫酸アンモニウムにより、分離された血漿中への白血球の混入を抑制できることを見出した。また、上記水溶液中に含まれる特定の水溶性高分子化合物又は硫酸アンモニウムにより、分離された血漿に混入している白血球を安定化させることができることも見出した。そのため、本発明に係る血液採取容器では、白血球の経時的な破壊による白血球からのＤＮＡ漏出が効果的に抑えられ、検体保存中における血漿中のＤＮＡ量の増加を抑えることができる。また、本発明に係る血液採取容器では、血漿に混入している白血球の経時的な破壊が効果的に抑えられるので、該白血球からの蛋白質等の内容物の漏出も効果的に抑えることができる。
　以下、本発明に係る血液採取容器の詳細などを説明する。なお、本明細書において、「（メタ）アクリル」は「アクリル」と「メタクリル」との一方又は双方を意味する。
　（血漿分離材）
　上記血液採取容器は、上記血液採取容器本体内に収容された血漿分離材を備える。上記血漿分離材として、従来公知の血漿分離材を用いることができる。上記血漿分離材としては、血漿分離用組成物、及び血漿分離用冶具等が挙げられる。血漿分離材の作製が容易であることから、上記血漿分離材は、上記血漿分離用組成物であることが好ましい。
　血液から血漿を良好に分離する観点から、上記血漿分離材の２５℃での比重は、１．０２７以上１．０６０以下である。
　上記血漿分離材の２５℃での比重は、好ましくは１．０２９以上、より好ましくは１．０３０以上、更に好ましくは１．０３２以上、好ましくは１．０５５以下、より好ましくは１．０５０以下である。上記血漿分離材の２５℃での比重が上記下限以上及び上記上限以下であると、血液から血漿をより一層良好に分離することができ、また、血漿への白血球及び赤血球の混入をより一層効果的に抑えることができる。
　上記血漿分離材の収容箇所は、上記血液採取容器本体内であれば特に限定されない。上記血漿分離材は、上記血液採取容器本体の底部に配置されていてもよく、上記血液採取容器本体の内壁面上に配置されていてもよい。
　＜血漿分離用組成物＞
　上記血漿分離用組成物は、遠心分離時に血漿層と血球層との間に移動して隔壁を形成する組成物である。また、上記血漿分離用組成物は、遠心分離後に血漿層と血球層との間の成分移行を防止する目的で用いられる。上記血漿分離用組成物は、チクソトロピー性を有することが好ましい。上記血漿分離用組成物は、上記血液採取容器本体の底部に収容されていてもよく、内壁面上に配置されていてもよい。本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点から、上記血漿分離用組成物は、上記血液採取容器本体の底部に収容されていることが好ましい。
　上記血漿分離用組成物として、従来公知の血漿分離用組成物を用いることができる。
　上記血漿分離用組成物は、２５℃で流動性を有する有機成分と、無機微粉末とを含むことが好ましい。上記２５℃で流動性を有する有機成分、及び上記無機微粉末はそれぞれ、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　２５℃で流動性を有する有機成分：
　上記「２５℃で流動性を有する」とは、２５℃での粘度が５００Ｐａ・ｓ以下であることを意味する。
　上記有機成分の２５℃での粘度は、好ましくは１０Ｐａ・ｓ以上、より好ましくは３０Ｐａ・ｓ以上、好ましくは２００Ｐａ・ｓ以下、より好ましくは１００Ｐａ・ｓ以下である。上記粘度が上記下限以上及び上記上限以下であると、血漿分離用組成物の流動性が高められ、遠心分離操作により形成される隔壁の強度を高めることができる。
　上記有機成分の２５℃での粘度は、Ｅ型粘度計（例えば、東機産業社製「ＴＶＥ－３５」）を用いて、２５℃及びせん断速度１．０秒－１の条件で測定される。
　上記有機成分としては、樹脂、及び樹脂と可塑剤等の有機化合物との混合物等が挙げられる。したがって、上記有機成分は、上記樹脂を含むことが好ましく、上記樹脂と上記有機化合物とを含むことがより好ましい。上記有機成分が、上記樹脂と上記有機化合物との混合物である場合に、該混合物（上記有機成分）として流動性を有していればよく、該樹脂又は該有機化合物が流動性を有していなくてもよい。上記有機成分が、上記樹脂と上記有機化合物との混合物である場合に、該樹脂は、例えば、２５℃で固体の樹脂であってもよい。上記樹脂及び上記有機化合物はそれぞれ１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記樹脂としては、石油樹脂、シクロペンタジエン系樹脂、ポリエステル樹脂、ポリウレタン樹脂、（メタ）アクリル系樹脂、シリコーン樹脂、α－オレフィン－フマル酸エステル共重合体、セバシン酸と２，２－ジメチル－１，３－プロパンジオールと１，２－プロパンジオールとの共重合体、ポリエーテルポリウレタン系樹脂、及びポリエーテルポリエステル系樹脂等が挙げられる。上記樹脂は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記樹脂は、石油樹脂、シクロペンタジエン系樹脂、ポリエステル樹脂又は（メタ）アクリル系樹脂を含むことが好ましい。
　上記石油樹脂の市販品としては、イーストマンケミカル社製「リガライトＳ５０９０」等が挙げられる。
　上記シクロペンタジエン系樹脂としては、シクロペンタジエン系モノマーの重合体、シクロペンタジエン系モノマーと芳香族系モノマーとの共重合体、及びジシクロペンタジエン樹脂等が挙げられる。上記シクロペンタジエン系樹脂は、水素添加されていてもよい。上記シクロペンタジエン系モノマーの重合体及び上記シクロペンタジエン系モノマーと芳香族系モノマーとの共重合体は、オリゴマーであってもよい。
　上記シクロペンタジエン系モノマーとしては、シクロペンタジエン、ジシクロペンタジエン、及びシクロペンタジエンのアルキル置換誘導体等が挙げられる。
　上記芳香族系モノマーとしては、スチレン、メチルスチレン、インデン、及びメチルインデン等が挙げられる。
　上記ジシクロペンタジエン樹脂の市販品としては、コロン社製「スコレッツＳＵ５００」及び「スコレッツＳＵ９０」等が挙げられる。
　上記ポリエステル樹脂としては、ポリアルキレンテレフタレート樹脂、及びポリアルキレンナフタレート樹脂等が挙げられる。上記ポリアルキレンテレフタレート樹脂としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート及びポリ－１，４－シクロヘキサンジメチレンテレフタレート等が挙げられる。
　上記ポリウレタン樹脂としては、ポリオール化合物とイソシアネート化合物との反応物等が挙げられる。
　上記（メタ）アクリル系樹脂としては、少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステル単量体を重合することにより得られる樹脂、及び少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステル単量体と少なくとも１種の該（メタ）アクリル酸エステル単量体以外の単量体とを重合することにより得られる樹脂が挙げられる。
　上記（メタ）アクリル酸エステル単量体としては、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸ポリアルキレングリコールエステル、（メタ）アクリル酸アルコキシアルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルエステル、（メタ）アクリル酸グリシジルエステル、（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル、（メタ）アクリル酸ベンジルエステル、（メタ）アクリル酸フェノキシアルキルエステル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシルエステル、（メタ）アクリル酸イソボルニルエステル、及び（メタ）アクリル酸アルコキシシリルアルキルエステル等が挙げられる。上記（メタ）アクリル酸エステル単量体がアルキル基を有する場合に、該アルキル基の炭素数は、好ましくは１以上、好ましくは２０以下である。上記（メタ）アクリル酸アルキルエステルは、炭素数が１以上２０以下であるアルキル基を有する（メタ）アクリル酸アルキルエステルであることが好ましい。上記（メタ）アクリル酸エステル単量体は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記有機化合物としては、ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体等が挙げられる。上記有機化合物は、ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体であることが好ましい。したがって、上記有機成分は、上記樹脂と、上記ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体との混合物であることが好ましい。
　上記ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体としては、フタル酸エステル、トリメリット酸エステル、及びピロメリット酸エステル等が挙げられる。上記ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記トリメリット酸エステルとしては、トリメリット酸トリｎ－オクチル、トリメリット酸トリイソオクチル、及びトリメリット酸トリイソデシル等が挙げられる。
　上記ピロメリット酸エステルとしては、ピロメリット酸テトライソオクチル等が挙げられる。
　上記トリメリット酸エステルの市販品としては、ＤＩＣ社製「モノサイザーＷ７００」、及び「モノサイザーＷ－７５０」、新日本理化社製「サンソサイザーＴＯＴＭ」及び「サンソサイザーＴＩＴＭ」等が挙げられる。
　上記ピロメリット酸エステルの市販品としては、ＤＩＣ社製「モノサイザーＷ－７０１０」等が挙げられる。
　上記ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体は、フタル酸エステル、トリメリット酸エステル、又はピロメリット酸エステルであることが好ましく、トリメリット酸エステルであることがより好ましい。
　上記血漿分離用組成物１００重量％中、上記有機成分の含有量は、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは８５重量％以上、更に好ましくは９０重量％以上、好ましくは９７重量％以下である。
　無機微粉末：
　上記無機微粉末としては、微粉末シリカ、酸化チタン粉末、炭酸カルシウム粉末、酸化亜鉛粉末、アルミナ粉末、ガラス微粉末、タルク粉末、カオリン粉末、ベントナイト粉末、チタニア粉末、及びジルコニウム粉末等が挙げられる。
　血漿分離用組成物の比重とチクソトロピー性との双方を共に好適な範囲に維持する観点からは、上記無機微粉末は、微粉末シリカを含むことが好ましい。２５℃での比重が１．０５０以上である血漿分離用組成物を得る場合には、上記無機微粉末は、微粉末シリカと、微粉末シリカ以外の無機微粉末（第２の無機微粉末）とを含むことがより好ましい。ただし、血漿分離用組成物の２５℃での比重が１．０５０以上である場合であっても、上記無機微粉末は、上記第２の無機微粉末を含んでいなくてもよい。また、血漿分離用組成物の２５℃での比重が１．０５０未満である場合であっても、上記無機微粉末は、上記第２の無機微粉末を含んでいてもよい。上記無機微粉末、上記微粉末シリカ及び上記第２の無機微粉末はそれぞれ、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記微粉末シリカとしては、天然シリカ及び合成シリカが挙げられる。合成シリカとしては、親水性シリカ及び疎水性シリカが挙げられる。親水性シリカは、例えば、粒子表面の水酸基同士が水素結合することにより、血漿分離用組成物にチクソトロピー性を付与すると共に、比重を調整する作用を有する。一方、疎水性シリカは、親水性シリカに比べてチクソトロピー性の付与効果は小さい。
　血漿分離用組成物の比重とチクソトロピー性との双方を共に好適な範囲に維持する観点からは、上記微粉末シリカは、親水性シリカを含むことが好ましく、親水性シリカと疎水性シリカとを含むことがより好ましい。
　上記第２の無機微粉末は、微粉末シリカよりも比重が大きい無機微粉末であることが好ましく、酸化亜鉛粉末、酸化チタン粉末、アルミナ粉末等の比重が３以上である無機微粉末であることがより好ましい。
　上記第２の無機微粉末の比重は、好ましくは３以上、より好ましくは３．５以上、更に好ましくは４以上である。上記第２の無機微粉末の比重は大きいほどよい。上記比重が上記下限以上であると、血漿分離用組成物の比重を効果的に大きくすることができる。
　上記無機微粉末、上記微粉末シリカ及び上記第２の無機微粉末の平均粒子径は、特に限定されない。上記無機微粉末、上記微粉末シリカ及び上記第２の無機微粉末の平均粒子径は、１ｎｍ以上であってもよく、１０ｎｍ以上であってもよく、５００ｎｍ以下であってもよく、１００ｎｍ以下であってもよい。
　上記無機微粉末、上記微粉末シリカ及び上記第２の無機微粉末の平均粒子径は、体積基準で測定される平均径であり、５０％となるメディアン径（Ｄ５０）の値である。上記体積平均粒子径（Ｄ５０）は、レーザー回折・散乱法、画像解析法、コールター法、及び遠心沈降法等により測定可能である。上記体積平均粒子径（Ｄ５０）は、レーザー回折・散乱法又は画像解析法による測定により求めることが好ましい。
　上記微粉末シリカの比表面積は、特に限定されない。上記微粉末シリカの比表面積は、２０ｍ２／ｇ以上であってもよく、１００ｍ２／ｇ以上であってもよく、５００ｍ２／ｇ以下であってもよく、３００ｍ２／ｇ以下であってもよい。
　上記微粉末シリカの比表面積は、ＢＥＴ法により測定される。
　上記血漿分離用組成物１００重量％中、上記親水性シリカの含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．１０重量％以上、更に好ましくは０．３０重量％以上、好ましくは２．５０重量％以下、より好ましくは２．００重量％以下である。上記親水性シリカの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、血漿分離用組成物の比重とチクソトロピー性との双方をより一層好適な範囲に維持することができる。
　上記血漿分離用組成物１００重量％中、上記微粉末シリカの含有量は、好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．５重量％以上、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは７重量％以下である。上記微粉末シリカの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、血漿分離用組成物の比重とチクソトロピー性との双方をより一層好適な範囲に維持することができる。
　上記血漿分離用組成物１００重量％中、上記第２の無機微粉末の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．１重量％以上、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは７重量％以下である。上記第２の無機微粉末の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、血漿分離用組成物の比重を効果的に大きくすることができる。
　上記血漿分離用組成物１００重量％中、上記無機微粉末の含有量は、好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．５重量％以上、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは７重量％以下である。上記無機微粉末の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、血漿分離用組成物の比重を効果的に大きくすることができる。
　他の成分：
　上記血漿分離用組成物は、本発明の効果を損なわない限り、上述した成分以外の他の成分を含んでいてもよい。上記他の成分としては、有機ゲル化剤、熱可塑性エラストマー、ポリアルキレングリコール、シリコーンオイル、補助溶媒、酸化防止剤、着色剤及び水等が挙げられる。上記他の成分はそれぞれ、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記血漿分離用組成物の２５℃での比重は、好ましくは１．０２７以上、より好ましくは１．０２９以上、更に好ましくは１．０３０以上、特に好ましくは１．０３２以上、好ましくは１．０６０以下、より好ましくは１．０５５以下、更に好ましくは１．０５０以下である。上記血漿分離用組成物の２５℃での比重が上記下限以上及び上記上限以下であると、血液から血漿を良好に分離することができ、また、血漿への白血球の混入を効果的に抑えることができる。また、上記血漿分離用組成物の２５℃での比重が上記下限以上及び上記上限以下であると、血漿への赤血球の混入も効果的に抑えることができる。但し、上記血漿分離用組成物の２５℃での比重は、１．０５０以上であってもよく、１．０５０を超えていてもよい。
　上記血漿分離用組成物の２５℃での比重は、血漿分離用組成物１滴を、比重を０．００２の間隔で段階的に調整した２５℃の食塩水中に順次滴下し、食塩水中における浮沈により測定される。
　上記血漿分離用組成物の２５℃での粘度は、好ましくは５０Ｐａ・ｓ以上、より好ましくは７０Ｐａ・ｓ以上、好ましくは５００Ｐａ・ｓ以下、より好ましくは４００Ｐａ・ｓ以下である。上記粘度が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。
　上記血漿分離用組成物の２５℃での粘度は、Ｅ型粘度計（例えば、東機産業社製「ＴＶＥ－３５」）を用いて、２５℃及びせん断速度１．０秒－１の条件で測定される。
　＜血漿分離用冶具＞
　上記血漿分離用冶具は、遠心分離時に血漿層と血球層との間に移動して隔壁を形成する冶具である。また、上記血漿分離用冶具は、血漿層と血球層との間の成分移行を防止する目的で用いられる。
　上記血漿分離用冶具として、従来公知の血漿分離用冶具を用いることができる。上記血漿分離用冶具としては、例えば、ＷＯ２０１０／１３２７８３Ａ１等に記載の機械的セパレータ（血漿分離用冶具）等が挙げられる。
　上記血漿分離用冶具の材料としては、例えば、エラストマー等が挙げられる。
　（水溶液）
　上記血液採取容器は、上記血液採取容器本体内に収容された水溶液を備える。上記水溶液は、抗凝固剤と、水とを含むことが好ましい。上記水溶液は、数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物（以下、水溶性高分子化合物（Ｘ）と記載することがある）又は硫酸アンモニウムを含む。上記水溶液に含まれる溶質は、抗凝固剤を含む。上記水溶液に含まれる溶質は、水溶性高分子化合物（Ｘ）又は硫酸アンモニウムを含む。上記水溶液は、水溶性高分子化合物（Ｘ）と硫酸アンモニウムとを含んでいてもよい。
　＜抗凝固剤＞
　上記水溶液は、抗凝固剤を含む。上記抗凝固剤として、従来公知の抗凝固剤を用いることができる。上記抗凝固剤は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記抗凝固剤としては、ヘパリン、ヘパリンの金属塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡの金属塩、クエン酸及びクエン酸ナトリウム等が挙げられる。
　抗凝固性能を良好に発揮させる観点から、上記抗凝固剤は、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡの金属塩、ヘパリン、ヘパリンの金属塩又はクエン酸ナトリウムであることが好ましい。
　上記水溶液における上記抗凝固剤の濃度は、好ましくは２ｍＭ以上、より好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは１０ｍＭ以上、好ましくは２０００ｍＭ以下、より好ましくは１０００ｍＭ以下、より一層好ましくは５００ｍＭ以下、更に好ましくは２５０ｍＭ以下、更により一層好ましくは１００ｍＭ以下、特に好ましくは５０ｍＭ以下である。上記抗凝固剤の濃度が上記下限以上及び上記上限以下であると、抗凝固性能を良好に発揮させることができる。
　＜数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物（水溶性高分子化合物（Ｘ））＞
　上記水溶液は、数平均分子量が５００以上１８０，０００以下（５百以上１８万以下）の水溶性高分子化合物（水溶性高分子化合物（Ｘ））を含むことが好ましい。水溶性高分子化合物（Ｘ）を用いることにより、分離された血漿中への白血球の混入を抑制することができる理由は、水溶性高分子化合物（Ｘ）が血液の粘度を良好に保つことで、遠心分離時の白血球の移動がよりスムーズに行われるためであると推察されるが、これに限定されない。また、水溶性高分子化合物（Ｘ）を用いることにより、血漿に混入している白血球からのＤＮＡの漏出が抑えられる理由は、水溶性高分子化合物（Ｘ）が白血球の細胞膜を効果的に保護することによって、白血球を安定化させるためであると推察されるが、これに限定されない。なお、水溶性高分子化合物（Ｘ）における水溶性とは、２５℃の水１００ｇに、０．１ｇ以上溶解することを意味する。水溶性高分子化合物（Ｘ）は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　本発明の効果を発揮させる観点から、水溶性高分子化合物（Ｘ）の数平均分子量は５００以上１８０，０００以下である。
　水溶性高分子化合物（Ｘ）の数平均分子量は、好ましくは１，０００以上、より好ましくは１，５００以上、更に好ましくは２，０００以上、特に好ましくは２，５００以上、好ましくは１７０，０００以下、より好ましくは１５０，０００以下、更に好ましくは１２０，０００以下、特に好ましくは１００，０００以下である。水溶性高分子化合物（Ｘ）の数平均分子量が上記下限以上及び上記上限以下であると、分離された血漿中への白血球の混入をより一層抑制することができ、また、白血球をより一層安定化させることができ、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。
　水溶性高分子化合物（Ｘ）の数平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定される標準ポリエチレングリコール換算での数平均分子量である。
　水溶性高分子化合物（Ｘ）としては、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及びコーンスターチ等が挙げられる。
　水溶性高分子化合物（Ｘ）は、デキストラン、ポリエチレングリコール、又はポリビニルピロリドンであることが好ましい。この場合には、白血球をより一層安定化させることができ、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。
　上記水溶液１００重量％中、水溶性高分子化合物（Ｘ）の各含有量は、好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．５重量％以上、更に好ましくは１重量％以上、好ましくは１５重量％以下、より好ましくは１０重量％以下、更に好ましくは７重量％以下である。水溶性高分子化合物（Ｘ）の各含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、白血球をより一層安定化させることができ、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。また、水溶性高分子化合物（Ｘ）の各含有量が上記下限以上であると、採取した血液と上記水溶液とが混合された混合液の浸透圧を効果的に大きくすることができるので、血漿への白血球の混入量をより一層少なくすることができる。なお、上記「水溶性高分子化合物（Ｘ）の各含有量」とは、上記水溶液が１種類の水溶性高分子化合物（Ｘ）を含む場合に、該水溶性高分子化合物（Ｘ）の含有量を意味し、上記水溶液が２種類以上の水溶性高分子化合物（Ｘ）を含む場合に、水溶性高分子化合物（Ｘ）それぞれの含有量を意味する。
　上記水溶液１００重量％中、水溶性高分子化合物（Ｘ）の含有量は、好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．５重量％以上、更に好ましくは１重量％以上、好ましくは２０重量％以下、より好ましくは１５重量％以下、更に好ましくは１０重量％以下である。水溶性高分子化合物（Ｘ）の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、白血球をより一層安定化させることができ、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。また、水溶性高分子化合物（Ｘ）の含有量が上記下限以上であると、採取した血液と上記水溶液とが混合された混合液の浸透圧を効果的に大きくすることができるので、血漿への白血球の混入量をより一層少なくすることができる。
　＜硫酸アンモニウム＞
　上記水溶液は、硫酸アンモニウムを含むことが好ましい。本発明者らは、硫酸アンモニウムを用いることにより、分離された血漿中への白血球の混入をより一層抑制することができ、また、血漿に混入している白血球からのＤＮＡの漏出が抑えられることを見出した。なお、上記水溶液が水溶性高分子化合物（Ｘ）と硫酸アンモニウムとを含む場合には、本発明の効果がより一層効果的に発揮される。
　上記水溶液１００重量％中、硫酸アンモニウムの含有量は、好ましくは０．５重量％以上、より好ましくは１重量％以上、更に好ましくは４重量％以上、好ましくは２０重量％以下、より好ましくは１５重量％以下、更に好ましくは１０重量％以下である。上記硫酸アンモニウムの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、分離された血漿中への白血球の混入をより一層抑制することができ、また、白血球をより一層安定化させることができ、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。また、上記硫酸アンモニウムの含有量が上記下限以上であると、採取した血液と上記水溶液とが混合された混合液の浸透圧を効果的に大きくすることができるので、血漿への白血球の混入量をより一層少なくすることができる。
　＜トレハロース＞
　本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、上記水溶液は、トレハロースを含むことが好ましい。上記水溶液に含まれる溶質は、トレハロースを含むことが好ましい。トレハロースを用いることにより、白血球の細胞膜が効果的に保護され、白血球を安定化させることができ、その結果、血漿に混入している白血球からのＤＮＡの漏出をより一層抑えることができる。
　上記水溶液１００重量％中、トレハロースの含有量は、好ましくは０．５重量％以上、より好ましくは１重量％以上、更に好ましくは２重量％以上、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは７重量％以下、更に好ましくは５重量％以下である。上記トレハロースの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、白血球をより一層安定化させることができ、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。また、上記トレハロースの含有量が上記下限以上であると、採取した血液と上記水溶液とが混合された混合液の浸透圧を効果的に大きくすることができるので、血漿への白血球の混入量をより一層少なくすることができる。
　＜グルコース、アデニン、イノシトール＞
　本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、上記水溶液は、グルコース、アデニン又はイノシトールを含むことが好ましい。上記水溶液に含まれる溶質は、グルコース、アデニン又はイノシトールを含むことが好ましい。この場合に、上記水溶液は、グルコース、アデニン及びイノシトールの内の１種のみを含んでいてもよく、２種以上を含んでいてもよい。これらの化合物を用いることにより、白血球へ栄養源が供給されるので、白血球の生存率を高めることができ、その結果、血漿に混入している白血球からのＤＮＡの漏出をより一層抑えることができる。
　上記水溶液がグルコースを含む場合に、上記水溶液１００重量％中、グルコースの含有量は、好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．３重量％以上、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは５重量％以下である。上記グルコースの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。また、上記グルコースの含有量が上記下限以上であると、採取した血液と上記水溶液とが混合された混合液の浸透圧を効果的に大きくすることができるので、血漿への白血球の混入量をより一層少なくすることができる。
　上記水溶液がアデニンを含む場合に、上記水溶液１００重量％中、アデニンの含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、好ましくは２重量％以下、より好ましくは１重量％以下である。上記アデニンの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。また、上記アデニンの含有量が上記下限以上であると、採取した血液と上記水溶液とが混合された混合液の浸透圧を効果的に大きくすることができるので、血漿への白血球の混入量をより一層少なくすることができる。
　上記水溶液がイノシトールを含む場合に、上記水溶液１００重量％中、イノシトールの含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、好ましくは２重量％以下、より好ましくは１重量％以下である。上記イノシトールの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。また、上記イノシトールの含有量が上記下限以上であると、採取した血液と上記水溶液とが混合された混合液の浸透圧を効果的に大きくすることができるので、血漿への白血球の混入量をより一層少なくすることができる。
　＜アポトーシス阻害剤＞
　本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、上記水溶液は、アポトーシス阻害剤を含むことが好ましい。上記水溶液に含まれる溶質は、アポトーシス阻害剤を含むことが好ましい。アポトーシス阻害剤を用いることにより、検体保存中の白血球の細胞死が効果的に抑えられ、その結果、血漿に混入している白血球からのＤＮＡの漏出をより一層抑えることができる。上記アポトーシス阻害剤は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記アポトーシス阻害剤としては、Ｑ－ＶＤ－Ｏｐｈ、及びＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫ等が挙げられる。
　本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、上記アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤であることが好ましく、Ｑ－ＶＤ－Ｏｐｈであることがより好ましい。上記水溶液は、カスパーゼ阻害剤を含むことが好ましく、Ｑ－ＶＤ－Ｏｐｈを含むことがより好ましい。
　上記水溶液におけるアポトーシス阻害剤の濃度は、好ましくは１ｎＭ以上、より好ましくは２０ｎＭ以上、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは５μＭ以下である。上記アポトーシス阻害剤の濃度が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　＜プロピレングリコール＞
　本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、上記水溶液は、プロピレングリコールを含むことが好ましい。上記水溶液に含まれる溶質は、プロピレングリコールを含むことが好ましい。
　上記水溶液１００重量％中、プロピレングリコールの含有量は、好ましくは１重量％以上、より好ましくは５重量％以上、好ましくは５０重量％以下、より好ましくは３０重量％以下である。
　＜他の成分＞
　上記水溶液は、上述した成分（抗凝固剤、水溶性高分子化合物（Ｘ）、硫酸アンモニウム、トレハロース、グルコース、アデニン、イノシトール、アポトーシス阻害剤及びプロピレングリコール）以外の他の成分を含んでいてもよい。
　上記他の成分としては、無機塩、糖類、及び糖アルコール等が挙げられる。上記他の成分は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記無機塩としては、塩化ナトリウム及びリン酸水素ナトリウム等のナトリウム塩、並びに、塩化カリウム及び炭酸水素カリウム等のカリウム塩等が挙げられる。
　上記糖類としては、ジヒドロキシアセトン、フルクトース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラクツロース、及び水溶性高分子化合物（Ｘ）に相当しない多糖類等が挙げられる。
　上記糖アルコールとしては、Ｄ－マンニトール及びＤ－ソルビトール等が挙げられる。
　上記血液採取容器本体内に収容されている水溶液の量は、血液採取容器本体のサイズ、及び採取される血液量等により適宜変更される。上記血液採取容器本体内に収容されている水溶液の量は、好ましくは０．１ｍＬ以上、より好ましくは０．５ｍＬ以上、更に好ましくは０．７ｍＬ以上、好ましくは５ｍＬ以下、より好ましくは３ｍＬ以下、更に好ましくは２．５ｍＬ以下である。上記水溶液の量が上記下限以上及び上記上限以下であると、血液が過度に希釈されることなく、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　（血液採取容器本体）
　上記血液採取容器本体の形状は特に限定されない。上記血液採取容器本体は、有底の管状容器であることが好ましい。
　上記血液採取容器本体の素材は特に限定されない。上記血液採取容器本体の素材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル等の熱可塑性樹脂；不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ－アクリレート樹脂等の熱硬化性樹脂；酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、エチルセルロース、エチルキチン等の変性天然樹脂；ソーダ石灰ガラス、リンケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のケイ酸塩ガラス、石英ガラス等のガラスが挙げられる。上記血液採取容器本体の素材は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　（栓体）
　上記血液採取容器は、栓体を備えることが好ましい。上記栓体は、血液採取容器本体の開口に取り付けられていることが好ましい。上記栓体として、従来公知の栓体を用いることができる。上記栓体は、血液採取容器本体の開口に、気密的かつ液密的に取付けることが可能な素材、形状からなる栓体であることが好ましい。上記栓体は、採血針が刺通され得るように構成されていることが好ましい。
　上記栓体としては、血液採取容器本体の開口に嵌合する形状を有する栓体、シート状のシール栓体等が挙げられる。
　また、上記栓体は、ゴム栓等の栓本体と、プラスチック等で構成されたキャップ部材とを備える栓体であってもよい。この場合には、血液採取後に、血液採取容器本体の開口から栓体を引き抜く際に、血液が人体と接触するリスクを抑えることができる。
　上記栓体（又は上記栓本体）の材料としては、例えば、合成樹脂、エラストマー、ゴム、金属箔等が挙げられる。上記ゴムとしては、ブチルゴム、及びハロゲン化ブチルゴム等が挙げられる。上記金属箔としては、アルミニウム箔等が挙げられる。密封性を高める観点からは、上記栓体の材料は、ブチルゴムであることが好ましい。上記栓体（又は上記栓本体）は、ブチルゴム栓であることが好ましい。
　（血液採取容器の他の詳細）
　上記血液採取容器は、所定量の血液が採取される血液採取容器である。上記血液の上記所定量は、血液採取容器のサイズ及び内圧等により適宜変更される。上記血液の上記所定量は、１ｍＬ以上であってもよく、２ｍＬ以上であってもよく、４ｍＬ以上であってもよく、１２ｍＬ以下であってもよく、１１ｍＬ以下であってもよく、１０ｍＬ以下であってもよい。
　上記血液採取容器に採取される血液の所定量と等量の生理食塩水を上記血液採取容器内に採取して、上記生理食塩水と上記水溶液とが混合された混合液を得る。例えば、５ｍＬの血液が採取される血液採取容器では、５ｍＬの生理食塩水を該血液採取容器内に採取して、転倒混和するなどして、上記生理食塩水と上記水溶液とを混合し、混合液を得る。上記生理食塩水と上記水溶液とが混合された上記混合液の浸透圧は、好ましくは３００ｍＯｓｍ／Ｌ以上、より好ましくは３３０ｍＯｓｍ／Ｌ以上、更に好ましくは３５０ｍＯｓｍ／Ｌ以上、好ましくは１３００ｍＯｓｍ／Ｌ以下、より好ましくは１０００ｍＯｓｍ／Ｌ以下、更に好ましくは８００ｍＯｓｍ／Ｌ以下である。上記混合液の浸透圧が上記下限以上であると、血液採取容器内に血液を採取したときに、血液と上記水溶液とが混合されて、血液の浸透圧が大きくなる。そのため、白血球内の水分及び赤血球内の水分が血球外へ移動し、白血球及び赤血球の比重が大きくなる。比重が大きくなった白血球及び赤血球は、血液採取容器を遠心分離することにより、血漿分離材よりも下方に良好に移動する。その結果、血漿中への白血球及び赤血球の混入を効果的に抑えることができる。また、上記混合液の浸透圧が上記下限以上及び上記上限以下であると、白血球への過度なストレスが抑えられ、白血球をより一層安定化させることができるので、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。
　上記混合液の浸透圧は、浸透圧計（例えば、アークレイ社製「ＯＭ－６０６０」）を用いて、氷点降下法により測定される。
　上記血液採取容器では、収容されている上記水溶液１ｍＬに対して、血液が３ｍＬ以上採取されることが好ましく、４ｍＬ以上採取されることがより好ましく、１１ｍＬ以下採取されることが好ましく、１０ｍＬ以下採取されることがより好ましい。この場合には、血液が過度に希釈されることなく、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　上記血液採取容器は、採血管であることが好ましい。上記血液採取容器本体は、採血管本体であることが好ましい。
　上記血液採取容器は、血液から血漿を分離するために用いられることが好ましい。また、上記血液採取容器は、血液中の細胞外遊離核酸又は細胞外小胞を分離するために用いられることが好ましく、血液中の細胞外遊離核酸又は細胞外小胞を単離するために用いられることが好ましい。
　上記血液採取容器は、例えば、以下のようにして製造することができる。
　抗凝固剤と、水溶性高分子化合物（Ｘ）又は硫酸アンモニウムとを水に溶解して水溶液を得る。なお、必要に応じてこれら以外の成分（トレハロース、グルコース、アデニン、イノシトール、アポトーシス阻害剤、プロピレングリコール又は上記他の成分等）も水に溶解して水溶液を得る。得られた水溶液を血液採取容器本体内に添加する。水溶液を添加する前又は添加した後に、血液採取容器本体内に血漿分離材を収容する。
　図１は、本発明の一実施形態に係る血液採取容器を模式的に示す正面断面図である。
　図１に示す血液採取容器１は、血液採取容器本体２と、血漿分離用組成物３と、水溶液４と、栓体５とを備える。血液採取容器本体２は、一端に開口を有し、他端に閉じられている底部を有する。血漿分離用組成物３は、血液採取容器本体２の底部に収容されている。水溶液４は、抗凝固剤を含み、かつ、水溶性高分子化合物（Ｘ）又は硫酸アンモニウムを含む。栓体５は、血液採取容器本体２の開口に挿入されている。
　水溶液４は、血漿分離用組成物３の表面上に配置されており、より具体的には、血漿分離用組成物３の上面（一端側の表面）に配置されている。水溶液４は、血液採取容器１を正立状態としたときに、血漿分離用組成物３の表面上に配置されている。
　本発明に係る血液採取容器では、上記血漿分離用組成物が上記血液採取容器本体の側壁面上に配置されており、かつ上記水溶液が、血液採取容器を正立状態としたときに、血液採取容器本体の底部に配置されていてもよい。また、上記血漿分離用組成物の代わりに上記血漿分離用冶具が用いられてもよい。
　上記血液採取容器の内圧は特に限定されない。上記血液採取容器は、内部が排気された上で、上記栓体によって密閉された真空採血管として用いることもできる。真空採血管である場合、採血者の技術差によらず一定量の血液採取を簡便に行うことができる。
　細菌感染を防止する観点から、血液採取容器の内部はＩＳＯ又はＪＩＳの基準に則って滅菌されていることが好ましい。
　（血漿の分離方法）
　上記血液採取容器を用いて、血液から血漿を分離することができる。本発明に係る血漿の分離方法は、上述した血液採取容器内に血液を採取する工程と、上記血液が採取された上記血液採取容器を遠心分離する工程とを備える。
　本発明に係る血漿の分離方法では、上記血液を採取する工程と上記遠心分離する工程との間に、採取された血液と、上記水溶液とを混合する工程を備えることが好ましい。採取された血液と上記水溶液とを混合する方法としては、転倒混和等が挙げられる。
　上記遠心分離する工程における遠心分離条件は、上記血漿分離材により隔壁を形成させて、血漿と血球とを分離させることができる限り、特に限定されない。上記遠心分離条件としては、例えば、４００Ｇ以上４０００Ｇ以下で１０分間以上１２０分間以下で遠心分離する条件等が挙げられる。
　（細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法）
　本発明に係る細胞外遊離核酸の分離方法は、上述した血液採取容器内に血液を採取する工程と、上記血液が採取された上記血液採取容器を遠心分離して、血液から血漿を分離する工程と、分離された上記血漿から、細胞外遊離核酸を分離する工程とを備える。
　本発明に係る細胞外小胞の分離方法は、上述した血液採取容器内に血液を採取する工程と、上記血液が採取された上記血液採取容器を遠心分離して、血液から血漿を分離する工程と、分離された上記血漿から、細胞外小胞を分離する工程とを備える。
　本発明に係る細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法では、上記血液を採取する工程と上記遠心分離する工程との間に、採取された血液と、上記水溶液とを混合する工程を備えることが好ましい。採取された血液と上記水溶液とを混合する方法としては、転倒混和等が挙げられる。
　上記遠心分離する工程における遠心分離条件は、上記血漿分離材により隔壁を形成させて、血漿と血球とを分離させることができる限り、特に限定されない。上記遠心分離条件としては、例えば、４００Ｇ以上４０００Ｇ以下で１０分間以上１２０分間以下で遠心分離する条件等が挙げられる。
　上記細胞外遊離核酸を分離する工程では、従来公知の方法を用いて、血漿から細胞外遊離核酸を分離することができる。上記細胞外遊離核酸としては、ｃｅｌｌ　ｆｒｅｅ　ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ｃｅｌｌ　ｆｒｅｅ　ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）等が挙げられる。上記血漿から細胞外遊離核酸を分離する方法としては、市販の核酸精製キットを用いる方法等が挙げられる。市販の核酸精製キットを用いることで、血漿から細胞外遊離核酸を簡便に分離することができる。核酸精製キットの市販品としては、ＱＩＡａｍｐ　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＱＩＡａｍｐ　ＭｉｎＥｌｕｔｅ　ｃｃｆＤＮＡ　Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）及びＭａｇＭＡＸ　Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等が挙げられる。
　上記細胞外小胞を分離する工程では、従来公知の方法を用いて、血漿から細胞外小胞を分離することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。
　血漿分離用組成物の材料として、以下を用意した。
　（２５℃で流動性を有する有機成分の材料）
　（メタ）アクリル系樹脂１：
　アクリル酸－２－エチルヘキシルとアクリル酸ブチルとをアゾ系重合開始剤の存在下で溶液重合法によりラジカル重合させ、２５℃で流動性を有する（メタ）アクリル酸エステル系重合体（（メタ）アクリル系樹脂１）を得た。なお、（メタ）アクリル系樹脂１の２５℃での比重は、１．０３４であった。
　（メタ）アクリル系樹脂２：
　アクリル酸－２－エチルヘキシルとアクリル酸ブチルとの配合比を変更したこと以外は、（メタ）アクリル系樹脂１の作製方法と同様にして、２５℃で流動性を有する（メタ）アクリル酸エステル系重合体（（メタ）アクリル系樹脂２）を得た。なお、（メタ）アクリル系樹脂２の２５℃での比重は、１．０１５であった。
　その他の樹脂：
　石油樹脂（イーストマンケミカル社製「リガライトＳ５０９０」）
　ジシクロペンタジエン樹脂１（コロン社製「スコレッツＳＵ５００」）
　ジシクロペンタジエン樹脂２（コロン社製「スコレッツＳＵ９０」）
　有機化合物：
　トリメリット酸エステル（ベンゼンポリカルボン酸アルキルエステル誘導体、ＤＩＣ社製「モノサイザーＷ７００」）
　（無機微粉末）
　親水性シリカ（微粉末シリカ、日本アエロジル社製「２００ＣＦ」）
　疎水性シリカ（微粉末シリカ、日本アエロジル社製「Ｒ９７４」）
　酸化チタン粉末（石原産業社製「Ａ－１００」）
　（その他の成分）
　シリコーンオイル（東レダウコーニング社製「ＳＦ８４１０」）
　有機ゲル化剤（新日本理化社製「ゲルオールＤ」）
　１－メチル－２－ピロリドン（補助溶媒）
　血漿分離用組成物Ａ，Ｂ，Ｄの作製：
　表１に記載の配合割合で、２５℃で流動性を有する有機成分と無機微粉末とその他の成分とを混合し、血漿分離用組成物Ａ，Ｂ，Ｄを作製した。
　血漿分離用組成物Ｃの作製：
　表１に記載の２５℃で流動性を有する有機成分の材料を配合し、１３０℃で加熱溶解し、混合して、２５℃で流動性を有する有機成分を作製した。次いで、表１に記載の配合割合で、２５℃で流動性を有する有機成分と無機微粉末とその他の成分とを混合し、血漿分離用組成物Ｃを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られた血漿分離用組成物１滴を、比重を０．００２の間隔で段階的に調整した２５℃の食塩水中に順次滴下し、食塩水中における浮沈により比重を測定した。得られた血漿分離用組成物の２５℃での比重は表２～５に示した。
　水溶液の溶質として、以下を用意した。
　（抗凝固剤）
　エチレンジアミン四酢酸二カリウム二水和物（ＥＤＴＡ２Ｋ・２Ｈ２Ｏ）
　（水溶性高分子化合物（Ｘ））
　デキストラン（数平均分子量：４０，０００）
　デキストラン（数平均分子量：７０，０００）
　ポリエチレングリコール（数平均分子量：３，０００）
　ポリエチレングリコール（数平均分子量：２０，０００）
　ポリビニルピロリドン（数平均分子量：１０，０００）
　ポリビニルピロリドン（数平均分子量：５８，０００）
　（水溶性高分子化合物（Ｘ）に相当しない水溶性高分子化合物）
　デキストラン（数平均分子量：２００，０００）
　ポリエチレングリコール（数平均分子量：５００，０００）
　硫酸アンモニウム
　トレハロース
　グルコース
　アデニン
　ｍｙｏ－イノシトール
　アポトーシス阻害剤（Ｑ－ＶＤ－Ｏｐｈ）
　プロピレングリコール
　（他の成分）
　塩化ナトリウム（浸透圧調整剤）
　血液採取容器本体として、以下を用意した。
　長さ１００ｍｍ、開口部の内径１４ｍｍのＰＥＴ有底管（ポリエチレンテレフタレート管）
　（実施例１）
　表２に示す成分を水に溶解して水溶液を得た。得られた水溶液中の成分の種類及び濃度を表２に示す。
　１．２ｇの血漿分離用組成物Ａを、血液採取容器本体の底部に収容した。また、得られた水溶液１ｍＬを血漿分離用組成物Ａの表面上に添加した。血液採取容器内部を、血液採取量が８ｍＬとなるように減圧し、ブチルゴム栓により密封した。このようにして血液採取容器を作製した。
　（実施例２～１２及び比較例２，３）
　血漿分離用組成物の種類、及び水溶液の組成を表２～５のように変更した。これら以外は、実施例１と同様にして、血液採取容器を作製した。
　（比較例１）
　抗凝固剤２４重量部を、水７６重量部に溶解して、混合液を得た。１．２ｇの血漿分離用組成物Ａを、血液採取容器本体の底部に収容した。また、得られた混合液６０ｍｇを、血液採取容器本体の内壁面に塗布し、乾燥させた。血液採取容器内部を、血液採取量が８ｍＬとなるように減圧し、ブチルゴム栓により密封した。このようにして血液採取容器を作製した。
　（評価）
　（１）混合液の浸透圧
　得られた血液採取容器に生理食塩水８ｍＬを採取した。生理食塩水を採取した後、転倒混和して、生理食塩水と血液採取容器内に収容された水溶液（実施例１～１２及び比較例２，３）又は水溶成分（比較例１）とを混合し、混合液を得た。得られた混合液の浸透圧を、浸透圧計（アークレイ社製「ＯＭ－６０６０」）を用いて、氷点降下法により測定した。
　（２）白血球の残存量
　３名の血液を用意し、それぞれについて以下の操作を行った。血液採取容器を各１本用意し、それぞれに血液８ｍＬを採取した。血液を採取した後、転倒混和して、血液と血液採取容器内に収容された水溶液（実施例１～１２及び比較例２，３）又は水溶成分（比較例１）とを混合した。次いで、血液採取容器を１５００Ｇで１５分間遠心分離した。遠心分離後、血漿分離用組成物により形成された隔壁よりも上方に血漿が位置していた。上記隔壁よりも上方に位置する血漿をピペッティングにより撹拌し、該隔壁上に堆積して残存した血球を懸濁してから、血漿を回収した。多項目自動血球分析装置（シスメックス社製「ＸＥ５０００」）を用いて、回収した血漿を分析することにより、血漿中の白血球数を測定した。また、用意した血液（全血サンプル）についても、同様にして、全血サンプル中の白血球数を測定した。なお、上記白血球数は、用意した３名の血液で評価して得られた結果の平均値である。下記式により、白血球の残存率を算出した。
　白血球の残存率（％）＝（分離した血漿中に含まれる白血球の数（ｃｅｌｌｓ））／（全血サンプルに含まれる白血球の数（ｃｅｌｌｓ））×１００
　＜白血球の残存量の判定基準＞
　〇：白血球の残存率が１０％未満
　×：白血球の残存率が１０％以上
　（３）ｃｆＤＮＡの回収量
　３名の血液を用意し、それぞれについて以下の操作を行った。血液採取容器を各２本用意し、それぞれに血液８ｍＬを採取した。血液を採取した後、転倒混和して、血液と血液採取容器内に収容された水溶液（実施例１～１２及び比較例２，３）又は水溶成分（比較例１）とを混合した。次いで、血液採取容器を１５００Ｇで１５分間遠心分離した。遠心分離後、血漿分離用組成物により形成された隔壁よりも上方に血漿が位置していた。
　血漿分離後の血液採取容器２本のうちの１本については、血液を採取した当日に血液採取容器から血漿を回収した。また、血漿分離後の血液採取容器２本のうちの残りの１本については、血漿が分離された状態の血液採取容器を室温（２５℃）で７日間保管した後、血液採取容器から血漿を回収した。
　ｃｆＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製「ＱＩＡａｍｐ　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｋｉｔ」）を用いて、回収した血漿に含まれるＤＮＡを精製した。なお、ＤＮＡの精製操作は、血液採取容器から血漿を回収した日に実施した。
　精製後の抽出液中のＤＮＡ濃度を、Ｑｕｂｉｔ　ｄｓＤＮＡ　ＨＳ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定した。次いで、以下の式に従い、ｃｆＤＮＡ濃度（血漿１ｍＬあたりに含まれるｃｆＤＮＡの含量）を算出した。
　ｃｆＤＮＡ濃度（ｎｇ／血漿１ｍＬ）＝［Ａ］×［Ｂ］／［Ｃ］
　［Ａ］：精製後の抽出液中のＤＮＡ濃度の測定値（ｎｇ／ｍＬ）
　［Ｂ］：精製後の抽出液の全用量（ｍＬ）
　［Ｃ］：ＤＮＡ精製に使用した血漿の用量（ｍＬ）
　血液採取当日の血漿から回収したｃｆＤＮＡの濃度の平均値を「ｃｆＤＮＡ濃度（採取当日）」とし、７日間保管後の血漿から回収したｃｆＤＮＡの濃度の平均値を「ｃｆＤＮＡ濃度（７日保管）」とした。また、ｃｆＤＮＡ濃度（７日保管）とｃｆＤＮＡ濃度（採取当日）との差を「ｃｆＤＮＡ濃度の増加量」とした。なお、上記ｃｆＤＮＡの濃度の平均値とは、３名の血液を用いた結果の平均値である。
　ｃｆＤＮＡの回収量を以下の基準で判定した。なお、保管中に、血漿に混入している白血球が破壊されるほどｃｆＤＮＡ濃度の増加量が大きくなる。したがって、ｃｆＤＮＡ濃度の増加量が小さいほど、血漿に混入している白血球からのＤＮＡの漏出が抑えられており、検体保存中における血漿への白血球由来ＤＮＡの混入が抑えられている。
　＜ｃｆＤＮＡの回収量の判定基準＞
　○○：ｃｆＤＮＡ濃度の増加量が１０ｎｇ／血漿１ｍＬ未満である
　○：ｃｆＤＮＡ濃度の増加量が１０ｎｇ／血漿１ｍＬ以上７０ｎｇ／血漿１ｍＬ未満である
　×：ｃｆＤＮＡ濃度の増加量が７０ｎｇ／血漿１ｍＬ以上である
　構成及び結果を下記の表２～５に示す。なお、表中、抗凝固剤の濃度は、ＥＤＴＡ２Ｋ・２Ｈ２Ｏの濃度ではなく、ＥＤＴＡ２Ｋの濃度を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　１…血液採取容器
　２…血液採取容器本体
　３…血漿分離用組成物
　４…水溶液
　５…栓体

Claims (22)

  1. 　血液採取容器本体と、
    　前記血液採取容器本体内に収容された血漿分離材と、
    　前記血液採取容器本体内に収容された水溶液とを備え、
    　前記血漿分離材の２５℃での比重が、１．０２７以上１．０６０以下であり、
    　前記水溶液が、抗凝固剤を含み、かつ、数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物又は硫酸アンモニウムを含む、血液採取容器。
  2. 　前記水溶液が、前記数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物を含む、請求項１に記載の血液採取容器。
  3. 　前記水溶液が、前記硫酸アンモニウムを含む、請求項１又は２に記載の血液採取容器。
  4. 　前記水溶液が、前記数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物と、前記硫酸アンモニウムとを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  5. 　前記数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物が、デキストラン、ポリエチレングリコール、又はポリビニルピロリドンである、請求項１～４のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  6. 　前記数平均分子量が５００以上１８０，０００以下の水溶性高分子化合物が、数平均分子量が２，０００以上１５０，０００以下の水溶性高分子化合物である、請求項１～５のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  7. 　前記水溶液が、トレハロースをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  8. 　前記水溶液が、グルコース、アデニン又はイノシトールをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  9. 　前記水溶液が、アポトーシス阻害剤をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  10. 　所定量の血液が採取される血液採取容器であり、
    　血液採取容器に採取される血液の所定量と等量の生理食塩水を血液採取容器内に採取して、前記生理食塩水と前記水溶液とが混合された混合液を得たときに、前記混合液の浸透圧が、３００ｍＯｓｍ／Ｌ以上である、請求項１～９のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  11. 　前記水溶液が、プロピレングリコールをさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  12. 　前記血漿分離材が、血漿分離用組成物である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  13. 　前記血漿分離用組成物が、２５℃で流動性を有する有機成分と、無機微粉末とを含み、
    　前記有機成分が、樹脂を含み、
    　前記無機微粉末が、微粉末シリカを含む、請求項１２に記載の血液採取容器。
  14. 　前記微粉末シリカが、親水性シリカを含む、請求項１３に記載の血液採取容器。
  15. 　前記血漿分離用組成物１００重量％中、前記親水性シリカの含有量が、０．０１重量％以上２．５０重量％以下である、請求項１４に記載の血液採取容器。
  16. 　前記微粉末シリカが、親水性シリカと疎水性シリカとを含む、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  17. 　前記血漿分離用組成物の２５℃での比重が１．０５０以上であり、
    　前記無機微粉末が、前記微粉末シリカよりも比重が大きい無機微粉末を含む、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  18. 　前記樹脂が、石油樹脂、シクロペンタジエン系樹脂、ポリエステル樹脂又は（メタ）アクリル系樹脂を含む、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  19. 　血液中の細胞外遊離核酸又は細胞外小胞を分離するために用いられる、請求項１～１８のいずれか１項に記載の血液採取容器。
  20. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載の血液採取容器内に血液を採取する工程と、
    　前記血液が採取された前記血液採取容器を遠心分離する工程とを備える、血漿の分離方法。
  21. 　請求項１～１９のいずれか１項に記載の血液採取容器内に血液を採取する工程と、
    　前記血液が採取された前記血液採取容器を遠心分離して、血液から血漿を分離する工程と、
    　分離された前記血漿から、細胞外遊離核酸を分離する工程とを備える、細胞外遊離核酸の分離方法。
  22. 　請求項１～１９のいずれか１項に記載の血液採取容器内に血液を採取する工程と、
    　前記血液が採取された前記血液採取容器を遠心分離して、血液から血漿を分離する工程と、
    　分離された前記血漿から、細胞外小胞を分離する工程とを備える、細胞外小胞の分離方法。
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JP2007271388A (ja) * 2006-03-30 2007-10-18 Hidetoshi Tsuchida 血清または血漿の分離方法および血液分離管
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