WO2022190975A1 - 光老化細胞の検出又は定量方法、及びその応用、光老化細胞の作製方法 - Google Patents

光老化細胞の検出又は定量方法、及びその応用、光老化細胞の作製方法 Download PDF

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    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7042—Aging, e.g. cellular aging

Definitions

  • the present invention provides a method for detecting or quantifying photoaged cells, a method for selecting photoaged cells as an application thereof, a method for screening substances that suppress the growth or development of photoaged cells or a substance that reduces photoaged cells, and photoaging.
  • the present invention relates to a kit for detection or quantification of cells or selection of photoaged cells, and a method for producing photoaged cells.
  • SASP cellular senescence-associated secretory
  • Cellular aging is roughly divided into two types: photoaging due to ultraviolet irradiation and natural aging due to aging.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose a method for photoaging by irradiating UVB or UVA to human skin or mouse skin transplanted to a mouse.
  • Patent Document 2 also discloses contacting a mouse fibroblast culture with a test compound, exposing the fibroblast culture to UVB, UVA or sunlight-simulating radiation, and measuring human elastin promoter activity in the blast cell culture, wherein a compound that reduces the measured human elastin promoter activity compared to a control mouse fibroblast culture inhibits skin photodamage.
  • a method for identifying a test compound exposing the fibroblast culture to UVB, UVA or sunlight-simulating radiation, and measuring human elastin promoter activity in the blast cell culture, wherein a compound that reduces the measured human elastin promoter activity compared to a control mouse fibroblast culture inhibits skin photodamage.
  • senescence markers such as senescence-associated acid ⁇ -galactosidase (SA- ⁇ -Gal) and cyclin-dependent kinase inhibitor (p16). All of these markers are intracellular markers, and there is a problem that it is not easy to sort viable cells. Furthermore, photosenescent cell-specific markers were previously unknown.
  • a method for producing photoaged cells comprises: It includes the step of irradiating the cells with light having an emission peak in the wavelength range of 300-315 nm.
  • the production method detects or quantifies the expression of at least one gene selected from the group consisting of GPR17, CD34, GABRR1, OR2AG2, CMKLR1, CDH19, CD93, AVPR2, CCR7 and OXGR1 in the cells irradiated with light. may further include the step of The production method may further include the step of selecting photosenescent cells.
  • a method for detecting or quantifying photosenescent cells comprises: It includes detecting or quantifying the expression of at least one gene selected from the group consisting of GPR17, CD34, GABRR1, OR2AG2, CMKLR1, CDH19, CD93, AVPR2, CCR7 and OXGR1 in cells.
  • a method for sorting photoaged cells comprises: This includes selecting cells positive for expression of at least one gene selected from the group consisting of GPR17, CD34, GABRR1, OR2AG2, CMKLR1, CDH19, CD93, AVPR2, CCR7 and OXGR1.
  • a screening method for a substance that suppresses the proliferation or development of photosenescent cells or a substance that reduces photosenescent cells which is one embodiment of the present disclosure, contacting the cell with at least one candidate substance; detecting or quantifying the expression of at least one gene selected from the group consisting of GPR17, CD34, GABRR1, OR2AG2, CMKLR1, CDH19, CD93, AVPR2, CCR7 and OXGR1 in cells contacted with the candidate substance; A step of selecting a substance that suppresses the proliferation or development of photosenescent cells or a substance that reduces photosenescent cells from the candidate substances based on the information obtained by detecting or quantifying the expression of the gene.
  • the detection or quantification of the gene is detection or quantification of the protein encoded by each gene. Since these proteins are presented on the cell surface, by detecting or quantifying the proteins on the cell surface, it is possible to sort living photosenescent cells, and the sorted cells can be used for screening. preferable.
  • a kit for detecting, quantifying or selecting photosenescent cells comprises (a) a primer set capable of amplifying the cDNA of at least one gene selected from the group consisting of GPR17, CD34, GABRR1, OR2AG2, CMKLR1, CDH19, CD93, AVPR2, CCR7 and OXGR1; (b) a probe that specifically hybridizes to the mRNA or cDNA of at least one gene selected from the group consisting of GPR17, CD34, GABRR1, OR2AG2, CMKLR1, CDH19, CD93, AVPR2, CCR7 and OXGR1, and (c) GPR17 , CD34, GABRR1, OR2AG2, CMKLR1, CDH19, CD93, AVPR2, CCR7 and OXGR1. At least include.
  • Antibodies or antibody fragments are preferable as substances capable of specifically binding to the proteins.
  • photoaged cells can be produced efficiently.
  • photosenescent cells can be easily detected or quantified.
  • the screening method of the present disclosure applying the detection or quantification method can efficiently select a substance that suppresses the growth or development of photosenescent cells or a substance that reduces photosenescent cells.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a method for producing photoaged cells used in each test example.
  • FIG. 1 is a microscopic image of normal human epidermal keratinocytes (NHEK) irradiated with ultraviolet rays at various doses obtained in Test Example 1.
  • Test Example 3 Hoechst staining images of NHEK without ultraviolet irradiation treatment (UV(-)) or NHEK after 80 mJ/cm 2 ultraviolet irradiation treatment (UV(+)-1 and -2, the same treatment was performed) (Hoechst), anti-GPR17 antibody staining image (anti-GPR17), and their superimposed image (Merge). 4 is a microscopic image of normal human skin fibroblasts (NHDF) irradiated with ultraviolet rays at various doses in Test Example 4.
  • expression of a gene includes, for example, the presence of mRNA, which is a transcription product of a gene, or the presence of a protein, which is a translation product of a gene.
  • detection represents qualitative determination of the presence or absence of a substance.
  • a method for producing photoaged cells comprises: It includes the step of irradiating the cells with light having an emission peak in the wavelength range of 300-315 nm.
  • cell As long as the cell is a viable cell, the origin and type of the cell are not particularly limited, but non-cancerous cells are preferred. Examples of organisms from which cells are derived include vertebrates (mammals, reptiles, birds, amphibians, fish), invertebrates, and the like. Among them, the cells are preferably derived from mammals (for example, primates such as humans, chimpanzees, rhesus monkeys, and green monkeys; rodents such as mice, rats, and guinea pigs; horses; cows; sheep; goats; dogs; cats, etc.). Yes, and more preferably human. Cell types include, for example, skin cells.
  • skin cells include, for example, epidermal cells such as keratinocytes, pigment cells (melanocytes), Langerhans cells, and Merkel cells; dermal cells such as fibroblasts; adipose tissue cells such as adipocytes; cells, hair matrix cells, inner root sheath cells, and hair follicle lineage cells such as outer root sheath cells.
  • epidermal cells or dermal cells are preferable, and keratinocytes or fibroblasts are more preferable.
  • the forms of cells to be irradiated with light include, for example, cultured cells such as primary cultured cells and cell lines; cells in a living body (organs or tissues of a living body); cells in an organ or tissue isolated from a living body; cultured cells are preferred.
  • Cells irradiated with light are, for example, induced pluripotent (iPS) cells, ES cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, differentiation induction from stem cells derived from living organisms such as neural stem cells; genetic recombination; genome editing and so on.
  • iPS induced pluripotent
  • the temperature of the cells during irradiation with light is, for example, 20-42°C, 25-40°C or 30-37°C. If the irradiation time is short, the irradiation may be performed in the air, but a chamber (for example, a CO 2 incubator) in which the CO 2 concentration and humidity can be appropriately adjusted according to the irradiation time, irradiation conditions, etc. can be used.
  • a chamber for example, a CO 2 incubator
  • the light has an emission peak in the wavelength range of 300-315 nm, preferably in the wavelength range of 300-310 nm. Such a wavelength component can promote photoaging of cells while suppressing cell damage.
  • the wavelength of the emission peak is 308 nm.
  • the light source for the light having the above emission peak include excimer discharge lamps (such as XeCl excimer discharge lamps), fluorescent lamps (such as those using a gadolinium-activated phosphor), and LEDs (for example, the light emission described in WO2018/142630).
  • an excimer discharge lamp or an LED can be preferably used as a light source because of advantages such as less risk of cell heating due to light irradiation and stabilization of the spectrum immediately after lighting.
  • an optical filter may be applied to the light source.
  • examples of such an optical filter include those made of borosilicate glass whose main components are silicon oxide, boric acid, and sodium oxide, and have a thickness of, for example, 1 to 3 mm.
  • anhydrous/oxygen-free aluminum fluoride glass can be used.
  • the anhydrous/oxygen-free fluorinated aluminum glass contains BaF 2 , CaF 2 and AlF 3 in a range of 14.00 to 24.00 mol % and 28.25 to 38.25 mol %.
  • the content of Ce is 1 to 10 at. %.
  • the irradiation dose of light to cells can be appropriately changed depending on the origin and type of cells, the desired degree of photoaging, and the like, but from the viewpoint of enhancing the degree of photoaging, it is, for example, 20 mJ/cm 2 or more, and is more preferable. is 40 mJ/cm 2 or more, more preferably 60 mJ/cm 2 or more, still more preferably 80 mJ/cm 2 or more. From the viewpoint of suppressing cell damage, the irradiation dose of light to cells is, for example, 200 mJ/cm 2 or less, preferably 180 mJ/cm 2 or less, more preferably 150 mJ/cm 2 or less, and even more preferably 120 mJ/cm 2 or less. Or 100 mJ/cm 2 or less.
  • the term “irradiation dose of light” refers to the irradiation dose calculated from the distance from the light source to the cell and the irradiation energy of the light source (theoretical irradiation dose when the light source to the cell is air), or the cell It is the measured irradiation dose obtained from the irradiation energy of the light beam detected by placing the detector at the position.
  • the irradiation time of the light beam to the cells can be appropriately adjusted depending on the irradiation amount and irradiation intensity of the light source, the origin and type of cells, the degree of photoaging of the cells to be produced, the distance between the light source and the cells, etc., but for example, 0 0.01-60 seconds, 0.1-30 seconds, 0.5-20 seconds, 1-10 seconds or 2-6 seconds.
  • This production method may include a step of further culturing the cells after irradiation with light, in order to recover damage to the cells.
  • Media used for culture include, for example, MEM, ⁇ -MEM, DMEM, IMEM, RPMI-1640, Ham's F-12, and specialized media for various cells.
  • Media further serum such as fetal bovine serum (FBS), horse serum, human serum; additives such as sodium bicarbonate, sodium pyruvate, L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine; PBS; Good buffer (HEPES, etc. ); buffer components such as Hanks, Ringer, Earle, Gey, Puck, Eagle, Rinaldini or Tyrode balanced salts.
  • the culture time can be, for example, 1 hour or longer, 3 hours or longer, 6 hours or longer, 12 hours or longer, 1 day or longer, 2 days or longer, or 3 days or longer, from the viewpoint of promoting cell recovery. days or less, 10 days or less, 7 days or less, or 5 days or less.
  • This production method may further include a separation step for separating individual cells.
  • cell separation include physical treatments such as detachment and stirring; treatments with salts such as sodium chloride; treatments with surfactants such as SDS and Triton-X100; treatments with enzymes such as dispase and protease.
  • a method for detecting or quantifying photosenescent cells comprises: It includes detecting or quantifying the expression of at least one gene selected from the group consisting of GPR17, CD34, GABRR1, OR2AG2, CMKLR1, CDH19, CD93, AVPR2, CCR7 and OXGR1 in cells.
  • Examples of the cells include the cells described in the above [Method for producing photoaged cells].
  • GPR17 G protein-coupled receptor 17
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • CD34 is a gene that encodes a transmembrane phosphorylated glycoprotein.
  • NCBI Gene ID for human CD34 is 947.
  • GABRR1 gamma-aminobutyric acid type A receptor subunit rho1
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • the NCBI Gene ID for human CD34 is 2569.
  • OR2AG2 olfactory receptor family 2 subfamily AG member 2
  • CMKLR1 chemerin chemokine-like receptor 1
  • CDH19 cadherin 19
  • cadherin 19 is a gene encoding cadherin 19, which is one of cadherins.
  • the above 10 genes of non-human cells correspond to orthologs of human genes, and can be obtained, for example, by entering the names of the above 10 genes into a query and searching with NCBI's Gene.
  • the detection or quantification of the gene expression is performed, for example, by detecting or quantifying mRNA, which is the transcription product of the gene, or detecting or quantifying protein, which is the translation product of the gene.
  • mRNAs and proteins may contain single or multiple splice variants or processing products.
  • the following means can be used, for example, after extracting mRNA from cells and optionally subjecting cDNA to reverse transcription, amplification reaction by PCR, or the like.
  • (b) RNA-Seq analysis is performed after appropriately amplifying the cDNA.
  • Quantitative PCR qPCR is performed using the cDNA as a template.
  • the following means can be used to detect or quantify proteins that are translation products of genes.
  • A binding a substance that specifically binds to the protein presented on the cell (e.g., an antibody or antibody fragment that uses these proteins as an antigen, an aptamer, etc.), directly or using a secondary antibody, etc.
  • Cells are stained and detected or quantified. Since the proteins encoded by the above 10 genes are exposed on the cell surface, this means can be applied to living cells. Such means specifically include, for example, detection or quantification by fluorescence in situ hybridization (FISH), flow cytometry, and the like.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • B Protein is extracted from cells, and the protein is detected or quantified by ELISA, dot blotting, Western blotting, or the like.
  • one of the embodiments includes detecting or quantifying the expression of the GPR17 gene.
  • GPR17 has two isoforms, Long form and Short form, which differ in the length of the N-terminal part due to differences in splicing (367 amino acid residues and 339 amino acid residues in humans, respectively; see, for example, American Journal of Physiology, 2009, Vol.297, Issue 4, C1029-C1040).
  • short-form, long-form, or both mRNAs or proteins can be detected or quantified.
  • detecting or quantifying the expression of the GPR17 gene is performed by detecting or quantifying the long form mRNA or protein of the GPR17 gene.
  • quantitative information includes, for example, the expression level of a gene in a cell population with a specific number of cells, the number of photoaging cells obtained by converting the expression level, and the expression of a gene. Examples include the number of detected cells, the number of cells whose expression level is greater than or equal to a specific value, and the like.
  • a method for sorting photoaged cells comprises: This includes selecting cells positive for expression of at least one gene selected from the group consisting of GPR17, CD34, GABRR1, OR2AG2, CMKLR1, CDH19, CD93, AVPR2, CCR7 and OXGR1.
  • Examples of the above cells include the cells described in the above [Method for producing photoaged cells].
  • the term "positive cell for gene expression” refers to a cell in which gene expression is detected, or a cell in which an expression level equal to or higher than a specific threshold is observed.
  • cells negative for gene expression refer to cells in which gene expression is not detected or cells whose expression level is below a specific threshold.
  • the threshold is appropriately set depending on the organism and type of cell origin, the means for detecting or quantifying gene expression to be used, and the like. For example, the threshold is set so that cells that have undergone photoaging and cells that have not undergone photoaging are prepared in advance, and cells that have undergone photoaging are judged to be positive, and cells that have not undergone photoaging are judged to be negative. good.
  • Means for detecting or quantifying gene expression include the means described in the above section [Method for detecting or quantifying photoaged cells]. Among them, a substance that specifically binds to the protein encoded by the gene presented in the living cells of (A) above is bound, and the cells are living cells directly or using a secondary antibody or the like. It is preferable to use a means of staining for detection or quantification. According to this means, cells can be sorted while they are still alive.
  • cell sorting is performed by flow cytometry.
  • Flow cytometry detects or quantifies the expression of the gene using, for example, an antibody or antibody fragment specific for the protein encoded by the gene.
  • This selection method is not particularly limited, but for example, (1) in the production of photoaged cells, to increase the ratio of photoaged cells to the total number of cells, or (2) to count cells that are positive or negative for the gene expression can be used to
  • a screening method for a substance that suppresses the proliferation or development of photosenescent cells or a substance that reduces photosenescent cells comprises: contacting the cell with at least one candidate substance; detecting or quantifying the expression of at least one gene selected from the group consisting of GPR17, CD34, GABRR1, OR2AG2, CMKLR1, CDH19, CD93, AVPR2, CCR7 and OXGR1 in cells contacted with the candidate substance; a step of detecting or quantifying photosenescent cells, and a substance that suppresses the growth or development of photosenescent cells or a substance that reduces photosenescent cells from the candidate substances based on the information obtained by the detection or quantification of the expression of the gene. selecting.
  • the mechanism of action of the candidate substance for suppressing the proliferation of photosenescent cells or reducing photosenescent cells is not particularly limited. etc. is brought about.
  • the candidate substance may be a single substance or a combination of two or more different substances.
  • the candidate substances are, for example, substances that are candidates for active ingredients of pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, or functional foods.
  • the cells include those described in the section [Method for detecting or quantifying photoaged cells].
  • the cells are photosenescent cells. Such an embodiment is suitable for selecting substances that inhibit photosenescent cell proliferation or reduce photosenescent cells.
  • the cells are cells that have not undergone photoaging. Such an embodiment is suitable for selecting substances that suppress the development of photoaging cells (prevent photoaging).
  • This embodiment may further include a culturing step, a step of promoting photoaging of cells, and the like, depending on the purpose of selection, the cytotoxicity of the substance, and the like, after contacting with the candidate substance.
  • the step of promoting photoaging of cells includes, for example, the method described in the above [Method for producing photoaged cells].
  • the step further comprises promoting photoaging of the cells.
  • Such an embodiment is suitable for selecting substances that suppress the development of photoaging cells (prevent photoaging).
  • Step of detecting or quantifying photosenescent cells Specific embodiments of the method for detecting or quantifying photoaged cells include those described in the above [Method for detecting or quantifying photoaged cells].
  • Step of selecting a substance that suppresses the proliferation or development of photosenescent cells or a substance that reduces photosenescent cells is selected from the candidate substances based on the information obtained by the detection or quantification of the gene expression described above.
  • the information is, for example, quantitative information, more specifically, the gene expression level itself in a cell population of a specific number of cells, the number of photoaging cells obtained by converting from the expression level, the gene The number of cells in which the expression of is detected, the number of cells whose expression level is a specific value or more, the number of cells in which gene expression is positive, and the like can be mentioned.
  • control cells of (2) and (3) above include, for example, untreated cells that have not been contacted with a candidate substance, cells that have been contacted with a candidate substance at a lower concentration, and the like.
  • a kit for detecting or quantifying photosenescent cells, or for sorting photosenescent cells which is one of the embodiments of the present disclosure, (a) A primer set capable of amplifying the cDNA of at least one gene selected from the group consisting of GPR17, CD34, GABRR1, OR2AG2, CMKLR1, CDH19, CD93, AVPR2, CCR7 and OXGR1 (b) GPR17, CD34, GABRR1, OR2AG2 , CMKLR1, CDH19, CD93, AVPR2, CCR7 and OXGR1. (c) GPR17, CD34, GABRR1, OR2AG2, CMKLR1, CDH19, CD93. , AVPR2, CCR7 and OXGR1.
  • the primer set (a) above can amplify at least part of the cDNA of at least one gene selected from the above 10 genes, the sequence, base length, length, chemical modification, etc. of each primer are It is not particularly limited. Each primer may, for example, create mismatches and/or gaps when hybridizing with a portion of the cDNA.
  • the primer set (a) is preferably capable of amplifying cDNA to include exon-exon boundaries of the gene.
  • the primer set of (a) can be used for qPCR, for example.
  • the length of the amplified fragment is preferably 500 bp or less, 400 bp or less, 300 bp or less, 200 bp or less, 150 bp or less, or 100 bp or less, and can be 50 bp or more.
  • the primer length of the primer set (a) is, for example, 15 to 40 nucleotides, or 17 to 25 nucleotides.
  • the probe (b) above is not particularly limited in sequence, length, chemical modification, etc., as long as it specifically hybridizes to the mRNA or cDNA of at least one gene selected from the ten genes above.
  • the probe of (b) includes DNA, RNA, and nucleic acids in which at least part of their phosphate groups are substituted with phosphorothioate, methylphosphonate, phosphorodithionate, etc.; peptide nucleic acid (PNA), morpholino nucleic acid, etc. It can be a nucleic acid analogue.
  • the probe of (b) preferably hybridizes to a portion of the mRNA or cDNA containing the exon-exon boundaries of the gene.
  • the probe (b) is preferably linked with a label such as microparticles, fluorescent substances, enzymes, biotin, radiolabels, magnetic particles, and the like.
  • the probe of (b) may be immobilized on beads, a substrate, a membrane, or the like, for example.
  • the length of the probe of (b) is, for example, 15-40 nucleotides, or 17-25 nucleotides.
  • the probes are, for example, microarray probes capable of detecting or quantifying mRNA or cDNA or amplifications thereof.
  • Each primer and probe can be designed, for example, considering the Tm value and complementarity obtained by a sequence analysis server or software such as Primer-BLAST based on the sequence information of each gene.
  • a sequence analysis server or software such as Primer-BLAST based on the sequence information of each gene.
  • existing sequences registered in databases such as various qPCR primer databases can also be used as primers or probes for the above genes.
  • the substance (c) above is not particularly limited as long as it can bind to at least a part of the protein encoded by at least one gene selected from the above 10 genes.
  • Such substances include, for example, antibodies (polyclonal antibodies or monoclonal antibodies) or antibody fragments, aptamers, etc., using these proteins as antigens.
  • Antibody fragments include, for example, Fab fragments, Fab′ fragments, F(ab′) 2 fragments, Fv fragments, ScFv fragments and the like.
  • the substance (c) is preferably linked with a label such as microparticles, fluorescent substances, enzymes, biotin, radiolabels, and magnetic particles.
  • the substance in (c) is an anti-GPR17 antibody, and in a more particular embodiment, an antibody directed against long form GPR17.
  • the substance (c) is a fluorescently labeled anti-GPR17 antibody, and in a more specific embodiment, it is a fluorescently labeled antibody whose antigen is long form GPR17.
  • Photoaged cells were produced by irradiating normal human epidermal keratinocytes (NHEK), which is a kind of human skin cells, with ultraviolet rays having a peak wavelength of 308 nm according to the following procedure. A schematic diagram of the procedure is shown in FIG. Cultivation and incubation were performed at 37° C. using a CO 2 incubator. Cerabeam (registered trademark) UV308 mini (manufactured by Ushio Inc.) was used as an ultraviolet light source.
  • NHEK normal human epidermal keratinocytes
  • the irradiated ultraviolet rays are light passing through borosilicate glass (thickness 1 mm) that cuts wavelengths around 280 nm using a XeCl excimer discharge lamp as a light source. 8b and 9b, UVB without components in the region below 297 nm.
  • NHEKs were cultured on a collagen-coated dish (manufactured by Corning) in a keratinocyte-specific medium (manufactured by LONZA) by a conventional method until subconfluent.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • FIG. 2 is a diagram comparing microscopic images of photoaged cells prepared at different irradiation doses.
  • the irradiation dose increased, the number of cells decreased, but few detached cells (dead cells) were observed. This indicates that as the irradiation dose increased, the number of cells exhibiting "arrest of cell division", which is a characteristic of senescent cells, increased. That is, it was found that when the irradiation dose was 40 mJ/cm 2 or more, the number of cells in which cell division had stopped remarkably increased, and when the irradiation dose was 80 mJ/cm 2 or more, senescent cells in which cell division had stopped sufficiently were obtained. Also, increasing the irradiation dose increased the size of the cells. This represents the “cell hypertrophy” that is characteristic of senescent cells. All of these cells showing cell division arrest or cell hypertrophy were stained with SA- ⁇ -Gal, confirming that they were senescent cells.
  • RNA-Seq analysis was performed. Between-group comparisons were performed by normalizing the read counts of all analyzed genes. The implementation of RNA-Seq and data analysis were outsourced to DNA Chip Research Institute, Inc.
  • Figure 3 shows the results of the read count comparison.
  • GPR17, CD34, GABRR1, OR2AG2, CMKLR1, CDH19, CD93, AVPR2, CCR7 and OXGR1 were found to be specifically increased in photoaged cells produced by UV irradiation.
  • UV-irradiated cells were produced in the same manner as in Test Example 1, except that a collagen-coated glass plate was used as the cell culture substrate.
  • the dose was 0 mJ/cm 2 (UV( ⁇ ) group) or 80 mJ/cm 2 (UV(+) group).
  • a commercially available anti-GPR17 antibody (product code: CSB-PA619758LA01HU, manufactured by CUSABIO) whose epitope is the N-terminal region of human GPR17 (residue numbers 1 to 36) was used as a primary antibody, Goat anti-Rabbit IgG (H +L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 (manufactured by Thermo Fischer Scientific) was used as a secondary antibody to stain the obtained keratinocytes. Also, the nuclei were stained with Hoechst. The resulting stained image is shown in FIG.
  • NHDF cells Normal human skin fibroblasts
  • NHDF cells Normal human dermal fibroblasts
  • Experimental conditions other than cell type and medium are the same as (1) to (5) of Test Example 1.
  • a medium a fibroblast-only medium (manufactured by PromoCell) was used.
  • Viable cells were observed at irradiation doses up to at least 120 mJ/cm 2 , similar to experiments using human epidermal keratinocyte cells.
  • the characteristics of senescent cells, "stop cell division” and "cell enlargement,” were confirmed. From the above, even if human skin cells other than human epidermal keratinocyte cells were used, photoaging cells could be produced efficiently by irradiation with ultraviolet rays having a peak wavelength of 308 nm.

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Abstract

光老化細胞を効率よく作製することができる方法を提供する。また、光老化細胞の検出、定量又は選別に使用可能な新規な細胞マーカーを提供する。本開示は、３００～３１５ｎｍの波長範囲に発光ピークを有する光線を細胞に照射する工程を含む、光老化細胞の作製方法、並びに、細胞におけるＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子の発現を検出又は定量すること、を含む、光老化細胞の検出又は定量方法、を含む。

Description

光老化細胞の検出又は定量方法、及びその応用、光老化細胞の作製方法
　本発明は、光老化細胞の検出又は定量方法、その応用である光老化細胞の選別方法、光老化細胞の増殖若しくは発生を抑制する物質又は光老化細胞を減少させる物質のスクリーニング方法、及び光老化細胞の検出若しくは定量用又は光老化細胞の選別用キット、並びに、光老化細胞の作製方法に関する。
　細胞が老化すると、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞外マトリックス分解酵素、血小板増殖因子（ＰＤＧＦ）などの細胞老化関連分泌形質（ＳＡＳＰ）因子を放出し、さらに周囲の細胞に悪影響を及ぼすことで老化が進行していく。このような細胞老化の状態を予防又は改善するための医薬品の開発が課題となっている。
　細胞老化は、紫外線照射による光老化と、加齢などによる自然老化の２種類に大別される。
　皮膚の細胞の老化の８割は光老化であると言われている。皮膚の光老化は、顔、首、手の甲などの太陽光が当たる部分に好発し、シミ、シワ（特に深いシワ）、たるみ、皮膚の肥厚、皮膚の黄色や褐色の着色などの原因となる。一方、皮膚の自然老化は太陽光の照射に関わらず進行する。自然老化では、シミの形成はほとんどなく、シワも細かく浅いものが形成される。また、自然老化では皮膚が委縮する傾向にあり、皮膚の着色もない。
　このように、光老化は外観に関係する皮膚に好発して、その美的外観を損なうことから、光老化の状態を予防又は改善する化粧品や医薬部外品などの外用組成物の開発が盛んにおこなわれている。
　光老化の状態を予防又は改善する有効成分をインビトロでスクリーニングしようとする場合、まず光老化細胞を準備する必要がある。光老化した皮膚組織を作製する方法として、特許文献１及び２にはマウスに移植したヒト皮膚又はマウスの皮膚にＵＶＢ又はＵＶＡを照射して光老化させる方法が開示されている。また、特許文献２には、マウス線維芽細胞培養物を試験化合物と接触させること、線維芽細胞培養物をＵＶＢ、ＵＶＡ又は太陽光に模した放射線に曝露すること、及び、得られたマウス線維芽細胞培養物中のヒトエラスチンプロモーター活性を測定すること、を含み、測定されたヒトエラスチンプロモーター活性を対照のマウス線維芽細胞培養物と比較して減少させる化合物が皮膚の光損傷を抑制する化合物と同定する方法が開示されている。
　また、培養細胞の老化方法として、４０日以上の培養による自然老化、γ線などの照射によるＤＮＡ損傷による老化、そのほかＵＶ照射や過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）やタバコの煙への曝露など、様々な手法が報告されている。
特開２００７－１６７０６０号公報 特表２００２－５４２７６４号公報
　しかし、光照射以外の処理を経た細胞は、実際の光老化細胞と異なる可能性が高い。そして、紫外線照射によって光老化細胞を作製しようとすると、照射量が多ければ一定数の細胞は死滅して歩留まりが低下し、照射量が低ければ作製に時間を要するか、光老化が不十分となってしまうため、作製効率が低いという問題があった。
　さらに、光老化を予防又は改善する物質をスクリーニングするには、高い純度の光老化細胞の準備や効果の判定のために、光老化細胞を正常な細胞と選別することが必要となる。老化細胞を判別可能な手段としては、老化関連酸性β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－Ｇａｌ）やサイクリン依存性キナーゼ阻害因子（ｐ１６）のような老化マーカーを検出する手段が知られているが、これらのマーカーはいずれも細胞内マーカーであり、生細胞の選別が容易ではないという課題があった。さらに、光老化細胞特異的なマーカーはこれまで知られていなかった。
　そこで本開示では、光老化細胞を効率よく作製することができる方法を提供することを第１の課題とした。本開示はまた、光老化細胞の検出、定量又は選別に使用可能な新規な細胞マーカーを提供することを第２の課題とした。
　本開示の実施形態の一つである、光老化細胞の作製方法は、
　３００～３１５ｎｍの波長範囲に発光ピークを有する光線を細胞に照射する工程を含む。
　前記作製方法は、前記光線を照射された細胞のＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子の発現を検出又は定量する工程をさらに含んでもよい。
　前記作製方法は、光老化細胞を選別する工程をさらに含んでもよい。
　本開示の実施形態の一つである、光老化細胞の検出又は定量方法は、
　細胞におけるＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子の発現を検出又は定量することを含む。
　本開示の実施形態の一つである、光老化細胞の選別方法は、
　ＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子発現が陽性の細胞を選別することを含む。
　本開示の実施形態の一つである、光老化細胞の増殖若しくは発生を抑制する物質又は光老化細胞を減少させる物質のスクリーニング方法は、
　細胞に少なくとも１種以上の候補物質を接触させる工程、
　前記候補物質を接触させた細胞のＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子の発現を検出又は定量する工程、及び
　前記遺伝子の発現の検出又は定量によって得られた情報によって、前記候補物質から光老化細胞の増殖若しくは発生を抑制する物質又は光老化細胞を減少させる物質を選択する工程を含む。
　前記検出又は定量方法、選別方法及びスクリーニング方法において、一実施形態では、前記遺伝子の検出又は定量は、前記各遺伝子にコードされるタンパク質の検出又は定量である。
　これらのタンパク質は細胞表面に提示されるので、細胞表面のタンパク質を検出又は定量することにより、生きたまま光老化細胞を選別することができ、選別した細胞をスクリーニングに利用することができる点で好ましい。
　本開示の実施形態の一つである、光老化細胞の検出、定量又は選別のためのキットは、
　（ａ）ＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅可能なプライマーセット、
　（ｂ）ＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、及び
　（ｃ）ＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に特異的に結合可能な物質
　からなる群より選ばれる１以上を少なくとも含む。
　前記タンパク質に特異的に結合可能な物質としては、抗体又は抗体断片が好ましい。
　本開示の光老化細胞の作製方法によれば、光老化細胞を効率よく作製することができる。
　本開示の検出又は定量方法及びキットによれば、光老化細胞を簡易に検出又は定量することができる。そして、当該検出又は定量方法を、上記の選別方法に応用することで、光老化細胞を簡易に選別することができる。さらに当該検出又は定量方法を応用した本開示のスクリーニング方法は、光老化細胞の増殖若しくは発生を抑制する物質又は光老化細胞を減少させる物質を効率よく選択することができる。
各試験例で用いた光老化細胞の作製方法の概略図である。 試験例１で得られた種々の照射量で紫外線照射された正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）の顕微鏡画像である。 試験例２のＲＮＡ－Ｓｅｑ解析で得られた、紫外線照射処理なし（ＵＮ）、８０ｍＪ／ｃｍ２紫外線照射（Ｕ８０）、５０日継代培養処理（Ｐ５０）の各処理を経たＮＨＥＫの種々の遺伝子のｍＲＮＡ量を比較したグラフである。縦軸は正規化されたリードカウントである。 試験例３で、紫外線照射処理なしのＮＨＥＫ（ＵＶ（－））又は８０ｍＪ／ｃｍ２紫外線照射処理を経たＮＨＥＫ（ＵＶ（＋）－１及び－２、それぞれ同じ処理を行った）のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、抗ＧＰＲ１７抗体染色像（ａｎｔｉ－ＧＰＲ１７）、及びそれらの重ね合わせ像（Ｍｅｒｇｅ）である。 試験例４で種々の照射量で紫外線照射処理された正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の顕微鏡画像である。
　本明細書において、「光老化細胞」とは、紫外線照射によって老化状態となった生細胞であって、癌化していない細胞全般を表す。光老化細胞は、特に限定されないが、例えば以下の（１）～（３）の少なくとも１つ、好ましくは（１）～（３）すべての特徴を有する：
　（１）β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－Ｇａｌ）又はサイクリン依存性キナーゼ阻害因子（ｐ１６）陽性である；
　（２）細胞分裂の停止又は著しい低下が見られる；
　（３）細胞が肥大化している。
　本明細書において、「遺伝子の発現」とは、例えば、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの存在、又は、遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の存在が挙げられる。
　本明細書において、「検出」とは、物質の有無の定性的な判別を表す。
　［光老化細胞の作製方法］
　本開示の実施形態の一つである、光老化細胞の作製方法は、
　３００～３１５ｎｍの波長範囲に発光ピークを有する光線を細胞に照射する工程を含む。
　（細胞）
　細胞は生細胞であれば、その由来生物及び種類は特に限定されないが、癌化していない細胞が好ましい。
　細胞の由来生物としては、例えば、脊椎動物（哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、魚類）、無脊椎動物などが挙げられる。中でも、細胞の由来生物は、好ましくは哺乳類（例えばヒト、チンパンジー、アカゲザル、ミドリザルなどの霊長類；マウス、ラット、モルモットなどのげっ歯類；ウマ；ウシ；ヒツジ；ヤギ；イヌ；ネコなど）であり、より好ましくはヒトである。
　細胞の種類としては、例えば皮膚の細胞が挙げられる。皮膚の細胞の具体例としては、例えば、ケラチノサイト、色素細胞（メラノサイト）、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞などの表皮系細胞；線維芽細胞などの真皮系細胞；脂肪細胞などの脂肪組織系細胞；毛乳頭細胞、毛母細胞、内毛根鞘細胞、外毛根鞘細胞などの毛包系細胞などが挙げられる。中でも細胞の種類としては、表皮系細胞又は真皮系細胞が好ましく、ケラチノサイト又は線維芽細胞がより好ましい。
　光線を照射する細胞の形態としては、例えば、初代培養細胞、セルラインなどの培養細胞；生体中（生体の器官又は組織中）の細胞；生体から分離した器官中又は組織中の細胞などが挙げられるが、中でも培養細胞が好ましい。
　光線を照射する細胞は、例えば、人工多能性（ｉＰＳ）細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞などの人工又は生体由来の幹細胞からの分化誘導；遺伝子組換え；ゲノム編集などを経ていてもよい。
　（光線の照射工程）
　光線の照射は、例えばサブコンフルエントなどのコンフルエントに達していない培養細胞に対して行うことが好ましい。
　光線の照射の際に乾燥などを防ぐため、細胞は液体に浸されていることが好ましい。液体としては、細胞傷害や細胞の破裂を引き起こさないものであれば特に限定されない。そのような液体としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；グッドバッファー（ＨＥＰＥＳ等）；Ｈａｎｋｓ、Ｒｉｎｇｅｒ、Ｅａｒｌｅ、Ｇｅｙ、Ｐｕｃｋ、Ｅａｇｌｅ、Ｒｉｎａｌｄｉｎｉ又はＴｙｒｏｄｅの平衡塩類などの緩衝成分から選ばれる１種又は２種以上の成分が挙げられる。また、当該液体は、波長３００ｎｍ～３１５ｎｍの紫外線を吸収する成分（例えば、タンパク質、核酸、フェノールレッド等の色素、など）を含有しないことが好ましい。
　光線の照射の際の細胞の温度は、例えば２０～４２℃、２５～４０℃又は３０～３７℃である。照射時間が短い場合は大気中で照射してもよいが、照射時間、照射条件等によって適宜ＣＯ２濃度、湿度が調整可能なチャンバー（例えば、ＣＯ２インキュベーター）を使用することができる。
　光線は、３００～３１５ｎｍの波長範囲、好ましくは３００～３１０ｎｍの波長範囲に発光ピークを有する。このような波長成分により、細胞傷害を抑えつつ細胞の光老化を促進することができる。特定の実施形態では、発光ピークの波長は３０８ｎｍである。
　上記発光ピークを有する光線の光源としては、例えば、エキシマ放電ランプ（ＸｅＣｌエキシマ放電ランプなど）、蛍光ランプ（ガドリニウム付活の蛍光体を用いたものなど）、ＬＥＤ（例えばＷＯ２０１８／１４２６３０に記載の発光ピークが３１２ｎｍ以上又は３１３ｎｍ以上であり、３１５ｎｍ以下であり、半値幅が２０ｎｍ以下であるＬＥＤ素子など）が挙げられる。中でも、光照射に伴う細胞の加熱リスクが少ない、点灯直後からスペクトルが安定するなどの利点から、エキシマ放電ランプ又はＬＥＤを光源として好適に使用することができる。
　上記光源に対して、例えば、光学フィルターを適用してもよい。そのような光学フィルターとしては、例えば主成分が酸化シリコン、硼酸、酸化ナトリウムである硼珪酸ガラスよりなるものを挙げることができ、その厚みは、例えば１～３ｍｍである。また例えば、無水・無酸素フッ化アルミニウムガラスも使用することができる。無水・無酸素フッ素化アルミニウムガラスは、具体的には、ＢａＦ２、ＣａＦ２、ＡｌＦ３の含有量がそれぞれ１４．００～２４．００モル％の範囲、２８．２５～３８．２５モル％の範囲、３７．２５～４７．２５モル％の範囲であり、かつ、ＹＦ３、ＳｒＦ２、ＬａＦ３から選ばれる１つを含み、その含有量は、含有物がＹＦ３である場合２．５～２０モル％、含有物がＳｒＦ２である場合２．５～７．５モル％、含有物がＬａＦ３である場合２．５～７．５モル％であり、かつ、Ｃｅを含有し、無水・無酸素である組成を有する。ここに、Ｃｅの含有量は、１～１０ａｔ．％であることが好ましい。
　細胞に対する光線の照射量は、細胞の由来生物及び種類、目的とする光老化の度合いなどにより適宜変更し得るが、光老化の度合いを強める観点から、例えば２０ｍＪ／ｃｍ２以上であり、より好ましくは４０ｍＪ／ｃｍ２以上、更に好ましくは６０ｍＪ／ｃｍ２以上、更により好ましくは８０ｍJ／ｃｍ２以上である。
　また細胞に対する光線の照射量は、細胞傷害を抑える観点から、例えば２００ｍＪ／ｃｍ２以下であり、好ましくは１８０ｍＪ／ｃｍ２以下、より好ましくは１５０ｍＪ／ｃｍ２以下、更に好ましくは１２０ｍＪ／ｃｍ２以下又は１００ｍＪ／ｃｍ２以下である。
　本明細書において、「光線の照射量」とは、光源から細胞までの距離と光源の照射エネルギーから計算される照射量（光源から細胞までが空気である場合の理論照射量）、又は細胞の位置に検出器を置いて検出される光線の照射エネルギーから得られる実測照射量である。
　細胞に対する光線の照射時間は、上記の光源の照射量、照射強度、細胞の由来生物及び種類、作製する細胞の光老化の度合い、光源と細胞との距離などによって適宜調整し得るが、例えば０．０１～６０秒、０．１～３０秒、０．５～２０秒、１～１０秒又は２～６秒とすることができる。
　（細胞の培養工程）
　本作製方法には、細胞の傷害を回復させるために、光線を照射後に細胞をさらに培養する工程を設けてもよい。培養に使用する培地は、例えば、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、各種細胞の専用培地などが挙げられる。培地、さらにウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウマ血清、ヒト血清などの血清；炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンなどの添加物；ＰＢＳ；グッドバッファー（ＨＥＰＥＳ等）；Ｈａｎｋｓ、Ｒｉｎｇｅｒ、Ｅａｒｌｅ、Ｇｅｙ、Ｐｕｃｋ、Ｅａｇｌｅ、Ｒｉｎａｌｄｉｎｉ又はＴｙｒｏｄｅの平衡塩類などの緩衝成分から選ばれる１種又は２種以上の成分を含んでもよい。
　培養時間は、細胞の回復を促進する観点から、例えば１時間以上、３時間以上、６時間以上、１２時間以上、１日以上、２日以上又は３日以上とすることができ、また、１４日以下、１０日以下、７日以下又は５日以下とすることができる。
　（その他工程）
　本作製方法には、さらに個々の細胞を分離するための分離工程を設けてもよい。細胞の分離には、例えば剥離、攪拌などの物理的処理；塩化ナトリウムなどの塩による処理；ＳＤＳやＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００などの界面活性剤による処理；ディスパーゼ、プロテアーゼなどの酵素による処理などが挙げられる。
　本作製方法には、さらに光線照射を経て光老化が惹起された細胞を選別する工程を設けてもよい。一実施形態では、当該選別工程は、例えば後述の選別方法に記載した工程を含む。
　［光老化細胞の検出又は定量方法］
　本開示の実施形態の一つである、光老化細胞の検出又は定量方法は、
　細胞におけるＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子の発現を検出又は定量することを含む。
　前記細胞としては、例えば、上記の［光老化細胞の製造方法］に記載した細胞が挙げられる。
　ＧＰＲ１７（G protein-coupled receptor 17）は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属し、システイニルロイコトリエン受容体をコードする遺伝子である。例えばヒトのＧＰＲ１７のＮＣＢＩ（ＵＲＬ：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のＧｅｎｅ　ＩＤは２８４０である。
　ＣＤ３４は、膜貫通リン酸化糖タンパク質をコードする遺伝子である。例えばヒトのＣＤ３４のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは９４７である。
　ＧＡＢＲＲ１（gamma-aminobutyric acid type A receptor subunit rho1）は、リガンド依存性クロライドチャネルであるγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体をコードする遺伝子である。例えばヒトのＣＤ３４のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは２５６９である。
　ＯＲ２ＡＧ２（olfactory receptor family 2 subfamily AG member 2）は、ＧＰＣＲスーパーファミリーに属し、嗅覚受容体をコードする遺伝子である。例えばヒトのＯＲ２ＡＧ２のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは３３８７５５である。
　ＣＭＫＬＲ１（chemerin chemokine-like receptor 1）は、走化性アディポカインであるケメリン（chemerin）をリガンドとするＧＰＣＲをコードする遺伝子である。例えばヒトのＣＭＫＬＲ１のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは１２４０である。
　ＣＤＨ１９（cadherin 19）は、カドヘリンの一つであるカドヘリン１９をコードする遺伝子である。例えばヒトのＣＤＨ１９のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは２８５１３である。
　ＣＤ９３は、Ｃ型レクチン膜貫通型受容体をコードする遺伝子である。例えばヒトのＣＤ９３のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは２２９１８である。
　ＡＶＰＲ２（arginine vasopressin receptor 2）は、ＧＰＣＲスーパーファミリーに属するバソプレシン受容体２型をコードする遺伝子である。例えばヒトのＡＶＰＲ２のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは５５４である。
　ＣＣＲ７（C-C motif chemokine receptor 7）は、ケモカインであるＣＣＬ１９とＣＣＬ２１をリガンドとするＧＰＣＲをコードする遺伝子である。例えばヒトのＣＣＲ７のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは１２３６である。
　ＯＸＧＲ１（oxoglutarate receptor 1）は、ＧＰＣＲスーパーファミリー内のオキソグルタル酸受容体ファミリーに属するＧＰＣＲをコードする遺伝子である。例えばヒトのＯＸＧＲ１のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは２７１９９である。
　ヒト以外の細胞の上記１０遺伝子は、ヒトの遺伝子のオルソログに対応し、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｅで上記１０遺伝子の名称をクエリーに入力して検索することによって得ることができる。
　上記遺伝子の発現の検出又は定量は、例えば、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの検出若しくは定量、又は、遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の検出若しくは定量によって行われる。ここで、それらのｍＲＮＡ及びタンパク質は、単独又は複数のスプライスバリアント又はプロセッシング産物を含むものであってもよい。
　ｍＲＮＡの検出又は定量には、細胞からｍＲＮＡを抽出し、場合によってｃＤＮＡに逆転写、ＰＣＲ法による増幅反応などを行ったうえで、例えば下記の手段を用いることができる。
　（ａ）遺伝子のｍＲＮＡ又ｃＤＮＡ若しくはその増幅物を、それらに特異的にハイブリダイズするプローブで検出又は定量する。具体的には、例えば、ノーザンブロッティング、ＤＮＡチップなどのアレイ解析などが挙げられる。
　（ｂ）ｃＤＮＡを適宜増幅したうえでＲＮＡ－Ｓｅｑ解析する。
　（ｃ）ｃＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行う。
　遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の検出又は定量には、例えば下記の手段を用いることができる。
　（Ａ）細胞に提示された当該タンパク質に対して特異的に結合する物質（例えば、これらタンパク質を抗原とする抗体又は抗体断片、アプタマーなど）を結合させ、直接又は二次抗体などを用いて、細胞を染色して検出又は定量する。
　上記１０遺伝子にコードされたタンパク質は細胞表面に露出するため、当該手段は生細胞に対して適用することが可能である。そのような手段として、具体的には、例えば、蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、フローサイトメトリーなどによる検出又は定量が含まれる。
　（Ｂ）細胞からタンパク質を抽出し、当該タンパク質をＥＬＩＳＡ法、ドットブロット法、ウェスタンブロット法などにより検出又は定量する。
　例えば、本実施形態の一つは、ＧＰＲ１７遺伝子の発現を検出又は定量することを含む。
　例えば、ＧＰＲ１７はスプライシングの違いによってＮ末端の部分の長さの異なるＬｏｎｇ　ｆｏｒｍとＳｈｏｒｔ　ｆｏｒｍの２つのアイソフォーム（ヒトではそれぞれ３６７アミノ酸残基、３３９アミノ酸残基；例えば、American Journal of Physiology, 2009, Vol.297, Issue 4, C1029-C1040を参照）がある。上記遺伝子の発現の検出又は定量には、Ｓｈｏｒｔ　ｆｏｒｍ、Ｌｏｎｇ　ｆｏｒｍのいずれか又はその両方のｍＲＮＡ又はタンパク質を検出又は定量の対象とすることができる。一実施形態では、ＧＰＲ１７遺伝子の発現の検出又は定量は、ＧＰＲ１７遺伝子のＬｏｎｇ　ｆｏｒｍのｍＲＮＡ又はタンパク質を検出又は定量することによって行われる。
　本方法によって得られる情報のうち、定量的な情報としては、例えば、特定の細胞数の細胞集団における遺伝子の発現量そのもの、当該発現量から換算して得られる光老化細胞数、遺伝子の発現が検出された細胞の数、発現量が特定の値以上の細胞の数、などが挙げられる。
　［光老化細胞の選別方法］
　本開示の実施形態の一つである光老化細胞の選別方法は、
　ＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子の発現が陽性の細胞を選別することを含む。
　上記細胞としては、上記の［光老化細胞の製造方法］に記載した細胞が挙げられる。
　本明細書において、遺伝子の発現が陽性の細胞とは、遺伝子の発現が検出された細胞、又は特定の閾値以上の発現量が見られた細胞を表す。
　また本明細書において、遺伝子の発現が陰性の細胞とは、遺伝子の発現が検出されない細胞又は特定の閾値以下の発現量である細胞を表す。
　ここで、当該閾値は、細胞の由来生物及び種類、使用する遺伝子発現の検出又は定量手段などによって適宜設定される。閾値は、例えば、予め光老化を受けた細胞と受けていない細胞を準備したうえで、光老化を受けた細胞が陽性、光老化を受けていない細胞が陰性と判定されるように設定すればよい。
　遺伝子の発現の検出又は定量手段としては、上記の［光老化細胞の検出又は定量方法］の項に記載した手段が挙げられる。中でも、上記（Ａ）の、生細胞に提示された、上記遺伝子にコードされたタンパク質に対して特異的に結合する物質を結合させ、直接又は二次抗体などを用いて、生きたまま細胞を染色して検出又は定量する手段を用いることが好ましい。当該手段によれば、細胞を生きたままの状態で選別することができる。
　一実施形態では、細胞の選別は、フローサイトメトリーによって行われる。フローサイトメトリーでは、例えば、上記遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体又は抗体断片を用いて、上記遺伝子の発現の検出又は定量が行われる。
　本選別方法は、特に限定されないが、例えば、（１）光老化細胞の作製において、光老化細胞の全細胞数に対する割合を高めるため、又は（２）上記遺伝子発現が陽性又は陰性の細胞を計数するために使用することができる。
　［光老化細胞の増殖又は発生を抑制する物質又は光老化細胞を減少させる物質のスクリーニング方法］
　本開示の実施形態の一つである光老化細胞の増殖若しくは発生を抑制する物質又は光老化細胞を減少させる物質のスクリーニング方法は、
　細胞に少なくとも１種以上の候補物質を接触させる工程、
　上記候補物質を接触させた細胞のＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子の発現を検出又は定量する工程、及び
　光老化細胞を検出又は定量する工程、及び
　前記遺伝子の発現の検出又は定量によって得られた情報によって、前記候補物質から光老化細胞の増殖若しくは発生を抑制する物質又は光老化細胞を減少させる物質を選択する工程、を含む。
　光老化細胞の増殖の抑制又は光老化細胞の減少は、その候補物質の作用メカニズムは特に限定されず、例えば、候補物質が光老化細胞を傷害すること、光老化細胞の老化状態を改善することなどによってもたらされる。
　光老化細胞の発生の抑制は、予め候補物質が接触することによって細胞が光老化しにくくなることを含む。細胞が光老化しにくくなることは、例えば、細胞の光老化の予防又は防止と同義である。
　（候補物質を接触させる工程）
　細胞に少なくとも１種以上の候補物質を接触させる手段としては、例えば、培地に候補物質を添加すること、細胞を含む生体（例えば、ヒトを除く）、器官又は組織に候補物質を投与又は摂取させること、などが包含される。
　上記候補物質は、１種単独の物質であっても、２種以上の異なる物質の組み合わせであってもよい。上記候補物質は、例えば、医薬品、医薬部外品、化粧品又は機能性食品の有効成分の候補となる物質である。
　上記細胞としては、例えば［光老化細胞の検出又は定量方法］の項に記載したものが挙げられる。
　一実施形態では、上記細胞は光老化細胞である。このような実施形態は、光老化細胞の増殖を抑制する、又は光老化細胞を減少させる物質を選択するのに適する。
　別の実施形態では、上記細胞は光老化を受けていない細胞である。このような実施形態は、光老化細胞の発生を抑制する（光老化を予防する）物質を選択するのに適する。
　本実施形態には、上記候補物質を接触させた後に、選択の目的、物質の細胞傷害性などに応じて、培養工程、細胞の光老化を促進する工程などをさらに含んでもよい。細胞の光老化を促進する工程としては、例えば、上記の［光老化細胞の作製方法］に記載した方法が挙げられる。
　一実施形態では、光老化を受けていない細胞に候補物質を接触させた後で、細胞の光老化を促進する工程をさらに含む。このような実施形態は、光老化細胞の発生を抑制する（光老化を予防する）物質を選択するのに適する。
　（光老化細胞を検出又は定量する工程）
　光老化細胞を検出又は定量の方法の具体的な実施形態は、上記の［光老化細胞の検出又は定量方法］に記載したものが挙げられる。
　（光老化細胞の増殖若しくは発生を抑制する物質又は光老化細胞を減少させる物質を選択する工程）
　本工程では、上記の遺伝子の発現の検出又は定量で得られた情報によって、候補物質から光老化細胞の増殖若しくは発生を抑制する物質又は光老化細胞を減少させる物質を選択する。ここで当該情報としては、例えば定量的な情報であり、より具体的には、特定の細胞数の細胞集団における遺伝子の発現量そのもの、当該発現量から換算して得られる光老化細胞数、遺伝子の発現が検出された細胞の数、発現量が特定の値以上の細胞、遺伝子の発現が陽性の細胞の数、などが挙げられる。
　上記情報による候補物質からの特定の物質の選択のさらに具体的態様は、例えば下記のものが挙げられるが、それらに限定されない。
　（１）予め基準値を定めたうえで、候補物質を接触させた細胞の光老化細胞の定量値が基準値以下である場合、当該候補物質を光老化細胞の増殖又は発生を抑制する、又は光老化細胞を減少させる物質として選択する。
　（２）候補物質を接触させた細胞が、対照細胞に比べて、上記遺伝子の発現量が小さい場合、当該候補物質を光老化細胞の増殖又は発生を抑制する、又は光老化細胞を減少させる物質として選択する。
　（３）候補物質を接触させた細胞が、対照細胞に比べて、上記の遺伝子の発現が陽性の細胞の数の全細胞数に対する割合が小さい場合、当該候補物質を光老化細胞の増殖又は発生を抑制する、又は光老化細胞を減少させる物質として選択する。
　上記（２）及び（３）の対照細胞の具体例としては、例えば、候補物質を接触させていない未処理の細胞、より低い濃度の候補物質を接触させた細胞などが挙げられる。
　［光老化細胞の検出、定量、又は選別用キット］
　本開示の実施形態の一つである、光老化細胞の検出若しくは定量用、又は、光老化細胞の選別用である、キットは、
　（ａ）ＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅可能なプライマーセット
　（ｂ）ＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ
　（ｃ）ＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に特異的に結合可能な物質
　より選ばれる１以上を少なくとも含む。
　上記（ａ）のプライマーセットは、上記１０遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡの少なくとも一部を増幅可能なものであれば、それぞれのプライマーの配列、塩基長、長さ、化学修飾などは特に限定されない。それぞれのプライマーは、例えば、ｃＤＮＡの一部とハイブリダイズする際にミスマッチ及び／又はギャップを生じるものであってもよい。
　（ａ）のプライマーセットは、上記遺伝子のエキソン－エキソン境界を含むようにｃＤＮＡを増幅可能であることが好ましい。
　（ａ）のプライマーセットは、例えば、ｑＰＣＲに使用することができる。ｑＰＣＲにおいては、増幅断片の長さは、好ましくは５００ｂｐ以下、４００ｂｐ以下、３００ｂｐ以下、２００ｂｐ以下、１５０ｂｐ以下、又は１００ｂｐ以下であり、また５０ｂｐ以上とすることができる。
　（ａ）のプライマーセットのプライマーの長さは、例えば１５～４０ヌクレオチド、又は１７～２５ヌクレオチドである。
　上記（ｂ）のプローブは、上記１０遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、その配列、長さ、化学修飾などは特に限定されない。例えば、（ｂ）のプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡのほか、それらのリン酸基の少なくとも一部をホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどに置換した核酸；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ核酸などの核酸類似体であり得る。
（ｂ）のプローブは、上記遺伝子のエキソン－エキソン境界を含むｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの部分にハイブリダイズすることが好ましい。
　本明細書において、（ｂ）のプローブは、例えば、微小粒子、蛍光物質、酵素、ビオチン、放射性標識体、磁性粒子などの標識が連結されることが好ましい。
　（ｂ）のプローブは、例えば、ビーズ、基板、メンブレンなどに固相化されていてもよい。
　（ｂ）のプローブの長さは、例えば１５～４０ヌクレオチド、又は１７～２５ヌクレオチドである。
　一実施形態では、プローブは、例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ若しくはその増幅物を検出又は定量可能なマイクロアレイのプローブである。
　各プライマー及びプローブは、例えば、各遺伝子の配列情報をもとにＰｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴなどの配列解析サーバ又はソフトウェアで得られるＴｍ値及び相補性を考慮して設計することができる。また、上記各遺伝子のプライマー又はプローブとして、各種ｑＰＣＲ用プライマーデータベースなどのデータベースに登録された既存の配列を使用することもできる。
　上記（ｃ）の物質は、上記１０遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質の少なくとも一部に結合可能なものであれば特に限定されない。そのような物質としては、例えば、これらタンパク質を抗原とする抗体（ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体）又は抗体断片、アプタマーなどが挙げられる。抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ＳｃＦｖ断片などが挙げられる。
　（ｃ）の物質は、例えば、微小粒子、蛍光物質、酵素、ビオチン、放射性標識体、磁性粒子などの標識が連結されることが好ましい。
　一実施形態では、（ｃ）の物質は、抗ＧＰＲ１７抗体であり、より特定の実施形態では、Ｌｏｎｇ　ｆｏｒｍのＧＰＲ１７を抗原とする抗体である。
　また、一実施形態では、（ｃ）の物質は、蛍光標識された抗ＧＰＲ１７抗体であり、より特定の実施形態では、Ｌｏｎｇ　ｆｏｒｍのＧＰＲ１７を抗原とする蛍光標識抗体である。
　例えば上記抗体は、上記１０遺伝子にコードされるタンパク質を抗原として動物を免疫刺激して作製することができるほか、ファージライブラリなどの抗体ライブラリのスクリーニングによって作製することができる。また市販品の抗体を使用することもできる。抗体断片は、抗体又はその遺伝情報をもとに作製することができる。アプタマーは、例えば試験管内分子進化法（ＳＥＬＥＸ）、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、酵母ツーハイブリッド法などによって核酸、ペプチドなどの大規模ライブラリから選択して入手することができる。
　本キットのより具体的な態様及び好ましい態様は、上記［光老化細胞の検出又は定量方法］及び［光老化細胞の選別方法］の記載から理解することができる。
　以下、本発明に関し、実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
　［試験例１．光老化ケラチノサイトの作製］
　ヒト皮膚細胞の一種である正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）に対して、以下の手順でピーク波長が３０８ｎｍの紫外線を照射して光老化細胞を作製した。図１に手順の模式図を示した。培養及びインキュベートはＣＯ２インキュベーターを使用して３７℃で行った。紫外線光源には、セラビーム（登録商標）ＵＶ３０８　ｍｉｎｉ（ウシオ電機製）を使用した。即ち、照射した紫外線は、ＸｅＣｌエキシマ放電ランプを光源として、２８０ｎｍ付近の波長をカットする硼珪酸ガラス（厚さ１ｍｍ）を通した光であり、そのスペクトルは、特開２００７－２６７９３６号公報の図８ｂ及び図９ｂで表され、２９７ｎｍ未満の領域の成分を有しないＵＶＢである。
　（１）コラーゲンコートディッシュ（Corning社製）に、ケラチノサイト専用培地（LONZA社製）で常法によりＮＨＥＫをサブコンフルエントになるまで培養した。
　（２）培地を除去して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回細胞を洗浄してから、細胞が十分浸るようにＰＢＳを加えた。
　（３）０ｍＪ／ｃｍ２、２０ｍＪ／ｃｍ２、４０ｍＪ／ｃｍ２、８０ｍＪ／ｃｍ２又は１００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を照射した。ここで、各照射量は、照射時間を０、１、３、５又は６秒間とすることで得られた。
　（４）ディッシュのＰＢＳをケラチノサイト専用培地（LONZA社製）に置換して、３日間培養した。
　（５）培地を吸引除去し、ＳＡ－β－Ｇａｌ前処理液（CELL BIOLABS社製）を培地に２ｍＬ加えて、２時間インキュベートした。
（６）ＳＡ－β－Ｇａｌ前処理液を吸引除去し、ＳＡ－β－Ｇａｌ基質溶液（CELL BIOLABS社製）を培地に１０μＬ加えて、さらに１日培養した。
　図２は、各照射量で作製した光老化細胞の顕微鏡画像を比較した図である。照射量の増加につれて、細胞の数が少なくなったが、剥離した細胞（死細胞）はあまり観察されなかった。これは、照射量を増加させると、老化細胞の特徴である「細胞分裂の停止」を示す細胞が増加したことを表す。すなわち、照射量が４０ｍＪ／ｃｍ２以上では、細胞分裂を停止した細胞が顕著に増加し、８０ｍＪ／ｃｍ２以上で十分に細胞分裂が停止した老化細胞が得られることがわかった。
　また、照射量を増加させると、細胞の大きさが大きくなった。これは老化細胞の特徴である「細胞の肥大化」を表す。
　なお、これらの細胞分裂の停止又は細胞の肥大化を示した細胞は、いずれもＳＡ－β－Ｇａｌ染色されていたことから、老化細胞であることが確かめられた。
　よって、ピーク波長が３０８ｎｍの紫外線を照射することにより、生きた光老化細胞を効率よく作製することができることが示された。
　また、ピーク波長が３８０ｎｍの紫外線を照射した場合は、照射量が１００ｍＪ／ｃｍ２の場合においても細胞の死滅は少ないのに対し、ピーク波長が２８０ｎｍ付近の紫外線を照射した場合は、照射量が１０ｍＪ／ｃｍ２でも細胞７割程度死滅した。よって、ピーク波長が３０８ｎｍの紫外線を照射しても、通常のＵＶＢに比べて細胞が死滅しにくいことが示された。
　以上から、ピーク波長が３０８ｎｍの紫外線の照射量を調整することにより、細胞に与えるダメージを制御して、光老化細胞を効率よく作製することができると結論される。
　［試験例２．光老化ケラチノサイトのｍＲＮＡ発現解析］
　試験例１の（１）～（５）と同じ手順で、０ｍJ／ｃｍ２の照射量（光照射なし）のケラチノサイト（ＵＮ群）、８０ｍＪ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射処理したケラチノサイト（Ｕ８０群）を作製した。また、５０日間ケラチノサイト専用培地で継代して、自然老化したヒト正常ケラチノサイト（Ｐ５０群）を作製した。各群ｎ＝１０である。各群の細胞をディッシュから回収し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標、Thermo Fischer Scientific社製）を用いて細胞からｍＲＮＡを抽出して、ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を行った。解析された全遺伝子のリードカウント数について正規化して群間比較を行った。ＲＮＡ－Ｓｅｑの実施及びデータの解析は、株式会社ＤＮＡチップ研究所に委託して行った。
　図３にリードカウントの比較の結果を示した。ＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１が、紫外線照射によって作製された光老化細胞で特異的に増加していることが見出された。
　以上から、上記の１０遺伝子及びそれらタンパク質は、光老化細胞を検出又は定量するためのマーカーとして使用可能であることが示された。
　中でも、ＧＰＲ１７、ＧＡＢＲＲ１、ＣＭＫＬＲ１、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１は、Ｕ８０群以外にはｍＲＮＡ発現が観察されなかった。これらの遺伝子は光老化細胞おいて顕著に特異的なマーカーであることが示された。
　［試験例３．ＧＰＲ１７を用いた光老化細胞の検出］
　細胞培養基材としてコラーゲンコートしたガラスプレートを用いたこと以外は試験例１と同じ方法によって紫外線を照射した細胞を作製した。照射量は０ｍＪ／ｃｍ２（ＵＶ（－）群）又は８０ｍＪ／ｃｍ２（ＵＶ（＋）群）とした。コラーゲンコートしたガラスプレートとして、セルマトリックス　Ｔｙｐｅ　Ｉ－Ｃ（新田ゼラチン社製）０．１ｍＬを希釈液（希塩酸ｐＨ３．０）０．９ｍＬに加えたものを、Ｍｕｌｔｉｔｅｓｔ　ｓｌｉｄｅ，　８－ｗｅｌｌ（MP Biomedical社製）に２０μＬ／ｗｅｌｌ加え、３０分室温にて静置後、ケラチノサイト専用培地２０μＬ／ｗｅｌｌで２回洗浄して得られたものを使用した。
　次に、ヒトＧＰＲ１７のＮ末端領域（残基番号１～３６）をエピトープとする市販の抗ＧＰＲ１７抗体（製品コード：CSB-PA619758LA01HU、CUSABIO社製）を１次抗体、Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 (Thermo Fischer Scientific社製)を２次抗体に用いて、得られたケラチノサイトを染色した。また、核をＨｏｅｃｈｓｔ染色した。得られた染色像を図４に示した。ＵＶ（＋）群の細胞は抗ＧＰＲ１７抗体で染色されたが、ＵＶ（－）群の細胞は染色されなかった。ＧＰＲ１７は細胞表面に存在するタンパク質であることから、抗ＧＰＲ１７抗体によって光老化細胞が簡便に染色され、検出可能であることが示された。
　さらに、フローサイトメトリーを用いることで、上記の抗ＧＰＲ１７抗体で染色した光老化細胞を容易に選別することができた。
　［試験例４．線維芽細胞の光老化細胞の作製］
　正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ細胞）に対し、波長３０８ｎｍの紫外線を照射し、光老化細胞の作製を行った。正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ細胞）は、ヒト表皮ケラチノサイト細胞よりも、もう一段深い真皮領域の細胞である。細胞の種類及び培地以外の実験条件は、試験例１の（１）～（５）と同じである。培地は、線維芽細胞専用培地（PromoCell社製）を用いた。
　図５にその結果を示した。ヒト表皮ケラチノサイト細胞を使用した実験と同様、少なくとも１２０ｍＪ／ｃｍ２までの照射量で、生きた細胞が確認された。また、照射量の増加につれて、老化細胞の特徴である「細胞分裂の停止」および「細胞の肥大化」が確認できた。以上より、ヒト表皮ケラチノサイト細胞以外のヒト皮膚細胞を用いても、ピーク波長３０８ｎｍの紫外線の照射により、光老化細胞を効率よく作製することができた。
 

Claims (5)

  1. 　細胞におけるＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子の発現を検出又は定量することを含む、光老化細胞の検出又は定量方法。
  2. 　ＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子の発現が陽性の細胞を選別することを含む、光老化細胞の選別方法。
  3. 　光老化細胞の増殖若しくは発生を抑制する物質又は光老化細胞を減少させる物質のスクリーニング方法であって、
    　細胞に少なくとも１種以上の候補物質を接触させる工程、
    　前記候補物質を接触させた細胞のＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子の発現を検出又は定量する工程、及び
    　前記遺伝子の発現の検出又は定量によって得られた情報によって、前記候補物質から光老化細胞の増殖若しくは発生を抑制する物質又は光老化細胞を減少させる物質を選択する工程を含む、スクリーニング方法。
  4. 　下記（ａ）～（ｃ）より選ばれる１以上を少なくとも含む、光老化細胞の検出、定量又は選別のためのキット：
    　（ａ）ＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅可能なプライマーセット；
    　（ｂ）ＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ；
    　（ｃ）ＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に特異的に結合可能な物質。
  5. 　３００～３１５ｎｍの波長範囲に発光ピークを有する光線を照射された細胞のＧＰＲ１７、ＣＤ３４、ＧＡＢＲＲ１、ＯＲ２ＡＧ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ９３、ＡＶＰＲ２、ＣＣＲ７及びＯＸＧＲ１からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子の発現を検出又は定量する工程を含む、光老化細胞の作製方法。
     
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