WO2022153898A1 - 標的抗原の測定方法並びにそれに用いる不溶性粒子及び標的抗原測定用キット - Google Patents

標的抗原の測定方法並びにそれに用いる不溶性粒子及び標的抗原測定用キット Download PDF

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target antigen
insoluble particles
amino acid
heavy chain
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大輔 小笠原
昌子 下本
公隆 山本
晴登 石川
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デンカ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a target antigen, insoluble particles used therein, and a kit for measuring the target antigen.
  • a method for measuring a target antigen using an immune reaction there is a method using a granular carrier such as latex.
  • a granular carrier to which an antibody specific for the target antigen is bound causes an antigen-antibody reaction in the presence of the target antigen. Then, due to its specificity and affinity, the target antigens bridge each other to bind to each other and aggregate. The presence / absence and abundance of the target antigen are measured by the presence / absence of agglomerates and the degree of agglomeration.
  • Patent Document 1 discloses a peptide containing a specific amino acid sequence and exhibiting a specific adsorption function with respect to the solid phase of the surface of the hydrophilized resin, and efficiently connects to the solid phase via such a peptide. A method of binding an antibody has been proposed.
  • One of the problems of the present invention is to provide a method for measuring a target antigen that does not cause such a problem, and to provide insoluble particles that can be used for such a measuring method.
  • the C-terminal lysine of the heavy chain of an antibody is removed by post-translational modification with carboxypeptidase, so that the C-terminal lysine of a commonly used antibody heavy chain is removed.
  • the present inventors have an excellent ability to aggregate insoluble particles when an antigen-antibody reaction occurs because the amount of the antibody bound to the insoluble particles increases due to the presence of lysine at the C-terminal of the heavy chain of the antibody. This has led to the completion of the present invention.
  • One aspect of the present invention is an insoluble particle containing a granular carrier and an antibody against a target antigen supported on the granular carrier, and the C-terminal amino acid of the heavy chain of the antibody is lysine.
  • the insoluble particles can be latex particles.
  • the above antibody can be IgG.
  • the Fc region of IgG may be a polypeptide having an amino acid sequence having 90% or more identity with any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 13 and the C-terminal amino acid being lysine, and IgG.
  • the Fc region of may be a polypeptide consisting of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 13.
  • Another aspect of the present invention is a kit for measuring a target antigen, which contains the insoluble particles or contains an antibody and a granular carrier for preparing the insoluble particles.
  • the above kit can be used for qualitatively evaluating the presence or absence of a target antigen in a test sample, or for quantitatively evaluating the concentration of a target antigen in a test sample.
  • Another aspect of the present invention is a method for measuring a target antigen using the insoluble particles.
  • the measuring method can include a step of bringing the insoluble particles into contact with a test sample that can contain a target antigen, and a step of measuring the agglutination reaction of the insoluble particles by the antigen-antibody reaction of the antibody and the target antigen. ..
  • the above measurement method can be a method for qualitatively evaluating the presence or absence of the target antigen in the test sample or for quantitatively evaluating the concentration of the target antigen in the test sample.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY it is possible to provide insoluble particles having excellent agglutination ability when an antigen-antibody reaction occurs. By using insoluble particles having excellent aggregating ability, highly sensitive detection of the target antigen can be expected.
  • the insoluble particles contain a granular carrier and an antibody against a target antigen supported on the granular carrier, and the C-terminal amino acid of the heavy chain of the antibody is lysine.
  • An antibody in which the C-terminal amino acid of the heavy chain is lysine has a high binding ability to a granular carrier.
  • insoluble particles containing an antibody in which the C-terminal amino acid of the heavy chain is lysine are excellent in agglutination ability when an antigen-antibody reaction occurs.
  • Target antigens include, for example, protein markers such as CRP (C-reactive protein), prostate-specific antigen, ferritin, ⁇ -2 microglobulin, myoglobin, hemoglobin, albumin, creatinine, immunoglobulins such as IgG, IgE, IgA, IgM, etc.
  • protein markers such as CRP (C-reactive protein), prostate-specific antigen, ferritin, ⁇ -2 microglobulin, myoglobin, hemoglobin, albumin, creatinine, immunoglobulins such as IgG, IgE, IgA, IgM, etc.
  • Various tumor markers lipoproteins such as LDL, HDL, TG, influenza A virus, influenza B virus, RS virus (RSV), rhinovirus, rotavirus, norovirus, adenovirus, astrovirus, HAV, HBs, HCV, Viral antigens such as HIV and EBV, chlamydia trachomatis, lytic bacteria, pertussis, helicobacter pylori, leptspira, treponema paridum, toxoplasma gondii, boleria, genus Regionella, charcoal bacterium, MRSA and other bacterial antigens, bacteria, etc.
  • Viral antigens such as HIV and EBV, chlamydia trachomatis, lytic bacteria, pertussis, helicobacter pylori, leptspira, treponema paridum, toxoplasma gondii, boleria, genus Regionella, charcoal
  • Produced toxins mycoplasma lipid antigens, peptide hormones such as human villous gonadotropin, steroids such as steroid hormones, physiologically active amines such as epinephrine and morphine, vitamins such as vitamin B, antibiotics such as prostaglandins and tetracyclines Examples include, but are not limited to, substances, pesticides, environmental hormones, etc.
  • the granular carrier examples include particles such as latex particles, ceramic particles, alumina particles, silica-alumina particles, and carbon black particles. Among these particles, latex particles are preferable.
  • the material of the latex include polystyrene, divinylbenzene and the like, and polystyrene is preferable.
  • the average particle size of the granular carrier can be 0.1 to 5 ⁇ m.
  • the particle size of the granular carrier can be measured by a dynamic light scattering method. In the present specification, the "average particle size" is the particle size when the integrated value from the small particle size reaches 50% of the total in the volume-based particle size distribution curve obtained by the dynamic light scattering method. It means (median diameter).
  • the antibody is not particularly limited as long as it can specifically bind to the target antigen, and can be, for example, IgG.
  • IgG is composed of two heavy chains (H chain) and two light chains (L chain).
  • the heavy chain is composed of a variable region (VH), a first constant region (CH1), a second constant region (CH2), and a third constant region (CH3) in this order from the N-terminal.
  • the light chain is composed of a variable region (VL) and a constant region (CL) in order from the N-terminal.
  • the portion composed of CH2 and CH3 is the Fc region.
  • One heavy chain and one light chain are bound by a disulfide bond of a cysteine residue present in CH1 and a cysteine residue present in CL.
  • the heavy chains are bonded to each other by a disulfide bond between cysteine residues existing in the hinge region located between CH1 and CH2.
  • the antibody may be a fragment of IgG in which a heavy chain is present, or rIgG (reduced IgG) composed of one heavy chain and one light chain, and may be composed of two heavy chains. It may be a fragment composed of one heavy chain.
  • the C-terminal of at least one heavy chain may be lysine, and the C-terminal of both heavy chains may be lysine.
  • the Fc region is a polypeptide having an amino acid sequence having 90% or more identity with any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 13 and the C-terminal amino acid being lysine. It is preferable, and it is more preferable that it is a polypeptide consisting of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 13.
  • a polypeptide having an amino acid sequence having 90% or more identity with any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 13 and having a C-terminal amino acid of lysine preferably has an effector function.
  • the polypeptide in which the effector function of the Fc region is maintained also has a high binding efficiency to insoluble particles.
  • SEQ ID NO: 1 is Protein Accession No. P01857 (human Ig gamma-1 C region), and SEQ ID NO: 2 is Protein Accession No. P01859 (human Ig gamma-2 C region), and SEQ ID NO: 3 Is Protein Accession No. P01860 (human Ig gamma-3 C region), SEQ ID NO: 4 is Protein Accession No. P01861 (human Ig gamma-4 C region), and SEQ ID NO: 5 is Protein Accession No. P01868 (mouse Ig gamma-1 C region), SEQ ID NO: 6 is Protein Accession No. P01863 (mouse Ig gamma-2a C region), and SEQ ID NO: 7 is Protein Accession No.
  • SEQ ID NO: 8 is Protein Accession No. P03987 (mouse Ig gamma-3 C region)
  • SEQ ID NO: 9 is Protein Accession No. P20759 (rat Ig gamma-1 C region).
  • SEQ ID NO: 10 is Protein Accession No. P20760 (rat Ig gamma-2a C region)
  • SEQ ID NO: 11 is Protein Accession No. P20761 (rat Ig gamma-2b C region)
  • SEQ ID NO: 12 is Protein Accession No. P20762 (rat Ig gamma-2c C region)
  • SEQ ID NO: 13 is Protein Accession No. P01870 (rabbit Ig gamma C region).
  • An antibody in which the C-terminal amino acid of the heavy chain is lysine can be produced by a genetically modified plant.
  • Antibodies produced from genetically modified plants have the characteristic that the C-terminal lysine of the heavy chain is not easily deleted.
  • Such an antibody can be produced by using a plant transient expression system, and for example, the method described in Japanese Patent No. 5015012 can be used. Since the antibody produced by this method is less likely to undergo post-translational modification with carboxypeptidase, it is easy to obtain an antibody in which the C-terminal lysine of the heavy chain is maintained.
  • an antibody in which the C-terminal amino acid of the heavy chain is lysine can also be obtained as a gene recombinant using a carboxypeptidase-deficient mammalian cell as an expression host.
  • the mammalian cells in this case include, but are not limited to, CHO (Chinese Hamster Ovaly) cells and HEK293 (Human Embryonic Kidney cells 293) cells.
  • a plasmid expression system a plasmid expression system in which a target gene is inserted into the genome of an expression host, and the like can be mentioned, and the present invention is not particularly limited.
  • a general method for example, a physical adsorption method or a chemical binding method can be used.
  • the method for measuring the target antigen of one embodiment uses insoluble particles containing a granular carrier and an antibody against the target antigen supported on the granular carrier, and the C-terminal amino acid of the heavy chain of the antibody is lysine. Such a measuring method can be performed to qualitatively evaluate the presence or absence of the target antigen in the test sample, or to quantitatively evaluate the concentration of the target antigen in the test sample.
  • the measurement method comprises an insoluble particle containing a granular carrier and an antibody against the target antigen supported on the granular carrier, and the C-terminal amino acid of the heavy chain of the antibody is lysine, and the target antigen. It includes a step of contacting a test sample that can be contained, and a step of measuring the agglutination reaction of the insoluble particles by the antigen-antibody reaction of the antibody and the target antigen.
  • the insoluble particles may be prepared, or may be prepared by binding a granular carrier and an antibody in which the C-terminal amino acid of the heavy chain is lysine at the time of measurement.
  • the insoluble particles can be brought into contact with the test sample that can contain the target antigen. When both are brought into contact with each other, the insoluble particles aggregate due to the interaction between the target antigen contained in the test sample and the antibody contained in the insoluble particles, and the absorbance of the suspension changes. The amount of change in absorbance (endpoint method) or rate of change (rate method) is measured. The turbidity method or the colorimetric method is preferably used for the measurement.
  • the aggregation reaction of the insoluble particles is carried out by irradiating light in the visible to near-infrared region, usually 300 nm to 1000 nm, preferably 500 nm to 900 nm, from the outside of the cell and detecting a change in absorbance or a change in the intensity of scattered light. Is measured.
  • the time for performing the agglutination reaction can be 1 minute to 30 minutes, preferably 1 minute to 10 minutes, but is not limited to these.
  • the temperature at which the agglutination reaction is carried out can be 35 ° C. to 40 ° C., and can be 36 to 38 ° C., but is not limited thereto.
  • a calibration curve is drawn by plotting the concentration of the antigen to be measured in the standard sample on the horizontal axis and the amount of change or rate of change in the measured absorbance on the vertical axis.
  • the target antigen in the test sample can be quantitatively evaluated by measuring the amount of change or the rate of change in absorbance of an unknown test sample by the same method and applying the measurement result to the above calibration curve.
  • a threshold value for the amount of change in absorbance or the rate of change in absorbance can be set in advance, and when the threshold value is exceeded, it can be qualitatively evaluated that the target antigen is present in the test sample.
  • test sample is not particularly limited as long as it can contain the target antigen, and examples thereof include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, stool, saliva, tissue fluid, spinal fluid, and swab, or dilutions thereof. Blood, serum, plasma, urine, stool, spinal fluid or dilutions thereof are preferred.
  • the target antigen measurement kit contains an insoluble particle containing a granular carrier and an antibody against the target antigen supported on the granular carrier, and the C-terminal amino acid of the heavy chain of the antibody is lysine. ..
  • the target antigen measurement kit can be used to qualitatively evaluate the presence or absence of the target antigen in the test sample, or to quantitatively evaluate the concentration of the target antigen in the test sample, and more specifically. Can be used in the method for measuring the target antigen.
  • the target antigen measurement kit contains an antibody and a granular carrier for preparing the insoluble particles.
  • the target antigen measurement kit according to the present embodiment prepares the insoluble particles by binding an antibody and a granular carrier at the time of measurement.
  • the target antigen measurement kit may further contain a target antigen for use in positive control or calibration line preparation, a buffer for diluting the test sample, a buffer for mixing the insoluble particles with the test sample. , A buffer solution for binding the antibody and the granular carrier and the like may be contained.
  • Example 1 1.
  • An antibody in which the constant region of the heavy chain consists of SEQ ID NO: 5 was prepared by the following method.
  • Anti-IgE Ab-K67 Preparation of anti-IgE antibody (Anti-IgE Ab-K67) in which the C-terminal lysine of the heavy chain is not deleted It was prepared by the plant transient expression system described in Japanese Patent No. 5015012.
  • the light chain of the anti-IgE antibody was cloned into a tobacco mosaic virus (TMV) vector (manufactured by Icon Genetics), and each heavy chain (including CH3 deficient or CH2 deficient) was cloned into a potato virus X (PVX) vector (manufactured by Icon Genetics). Cloned to).
  • TMV tobacco mosaic virus
  • PVX potato virus X
  • the mixed solution of the culture solution was infiltrated into the leaves of Nikothiana benzamiana and harvested in about one week.
  • the harvested leaves (infected leaves) were frozen.
  • the purified anti-IgE antibody was reduced-alkylated and enzymatically digested (Trpsin / Lys-C), and the amino acid sequence of the protein was analyzed by LC-MS.
  • the lysine at the C-terminal of the heavy chain of the anti-IgE antibody (Anti-IgE Ab-K0) prepared by the mouse ascites method was completely deficient.
  • the heavy chain C-terminal lysine of the anti-IgE antibody (Anti-IgE Ab-K67) prepared in the plant transient expression system was found to be deficient in only 33% of the total.
  • Latex agglutination test of anti-IgE antibody The binding efficiency of the obtained antibody to latex was evaluated according to the following procedure.
  • the automatic analyzer used the Hitachi 7180 type automatic analyzer to perform automatic measurement by the endpoint method.
  • Antigen (IgE) at each concentration was measured using the reagents prepared as described above.
  • 140 ⁇ L of the buffer solution prepared in (1) above was added, and this mixed solution was stirred and mixed at 37 ° C.
  • 70 ⁇ L of the latex suspension was added, and the mixture was further stirred and mixed at 37 ° C.
  • the agglutination reaction for about 5 minutes was measured as the amount of change in absorbance.
  • Table 1 shows the results when the preparation conditions (amount of antibody and latex) were changed.
  • the antibody (Anti-IgE Ab-K67) in which the C-terminal lysine of the antibody heavy chain is not deficient is the antibody (Anti-IgE Ab-) in which the C-terminal lysine is deficient. It was confirmed that it binds to latex more efficiently than K0).
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the degree of cohesion due to the reaction with the antigen using the sensitized latexes of Anti-IgE Ab-K0 and Anti-IgE Ab-K67 prepared under the same conditions (preparation condition 1 and preparation condition 2 in Table 1, respectively). Shown in.
  • the latex carrying the antibody (Anti-IgE Ab-K67) in which the C-terminal lysine of the antibody heavy chain is not deficient is the antibody (Anti) in which the C-terminal lysine is deficient. It was confirmed that the degree of aggregation is larger than that of the latex carrying -IgE Ab-K0), and highly sensitive measurement is possible.
  • Example 2 1. Preparation of anti-CRP antibody An antibody in which the constant region of the heavy chain consists of SEQ ID NO: 1 was prepared by the following method.
  • Anti-CRP Ab-K26 lacking C-terminal lysine of heavy chain It was prepared using the following CHO transient expression system.
  • the heavy and light chains of the anti-CRP antibody were cloned into a pcDNA3.4 vector (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.). These vectors were transfected into ExpiCHO cells (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), cultured for 12 days, the cells were centrifuged, and the culture supernatant was collected.
  • the collected culture supernatant was filtered using Stericup-GV, 0.22 ⁇ m, PVDF (manufactured by Merck), and subjected to Protein A column chromatography to purify the anti-CRP antibody.
  • the operating procedure for Protein A column chromatography is as follows.
  • the filtered culture supernatant was applied to a MabSelect SuRe column (Global Life Science Technologies Japan Co., Ltd.) and washed with a PBS solution (Merc's OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate diluted 10-fold with ultrapure water).
  • the anti-CRP antibody was eluted with an elution solution (a solution of 100 mM glycine adjusted to pH 3.0 with hydrochloric acid).
  • the eluate was neutralized with a neutralizing solution (1M Tris adjusted to pH 9.0 with hydrochloric acid) and dialyzed against PBS solution. Kidney dialysis was performed 3 times with a volume of 200 times or more.
  • the anti-CRP antibody was concentrated with VIVASPIN (manufactured by Sartorius Japan Co., Ltd.) and filtered using Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 ⁇ m, PVDF (manufactured by Merck Co., Ltd.). The concentration of anti-CRP antibody was calculated assuming that the antibody concentration was 1 mg / mL when the absorbance at 280 nm was 1.38.
  • Anti-CRP Ab-K78 Preparation of anti-CRP antibody (Anti-CRP Ab-K78) in which the C-terminal lysine of the heavy chain is not deleted Prepared by the plant transient expression system described in Japanese Patent No. 5015012.
  • the light chain of the anti-CRP antibody was cloned into a tobacco mosaic virus (TMV) vector (manufactured by Icon Genetics), and each heavy chain (including CH3 deficient or CH2 deficient) was cloned into a potato virus X (PVX) vector (Icon Genetics). Cloned to).
  • TMV tobacco mosaic virus
  • PVX potato virus X
  • the mixed solution of the culture solution was infiltrated into the leaves of Nikothiana benzamiana and harvested in about one week.
  • the harvested leaves (infected leaves) were frozen.
  • the purified anti-CRP antibody was reduced-alkylated and enzymatically digested (Trpsin / Lys-C), and the amino acid sequence of the protein was analyzed by LC-MS.
  • the heavy chain C-terminal lysine of the anti-CRP antibody (Anti-CRP Ab-K26) prepared by the mouse ascites method was 74% deficient.
  • the heavy chain C-terminal lysine of the anti-CRP antibody (Anti-CRP Ab-K78) prepared in the plant transient expression system was found to be deficient in only 22% of the total.
  • Latex agglutination test of anti-CRP antibody According to the following procedure, the binding efficiency of the obtained antibody to latex was evaluated.
  • the automatic analyzer was automatically measured by the rate method using a Hitachi 3500 type automatic analyzer. Antigen (CRP) at each concentration was measured using the reagents prepared as described above. To 20 ⁇ L of the CRP solution, 195 ⁇ L of the buffer solution prepared in (1) above was added, and this mixed solution was stirred and mixed at 37 ° C. After standing for about 1 minute and 30 seconds, 26 ⁇ L of the latex suspension was added, and the mixture was further stirred and mixed at 37 ° C. The agglutination reaction for about 2 minutes and 30 seconds was measured as the amount of change in the degree of scattering.
  • CRP Antigen
  • Table 1 shows the results when the preparation conditions (amount of antibody and latex) were changed.
  • the antibody (Anti-CRP Ab-K78) in which the C-terminal lysine of the antibody heavy chain is not deficient is an antibody (Anti-) in which most of the C-terminal lysine is deficient. It was confirmed that it binds to latex more efficiently than CRP Ab-K26).
  • FIG. 2 shows the results of evaluating the degree of cohesion due to the reaction with the antigen using the sensitized latexes of Anti-CRP Ab-K26 and Anti-CRP Ab-K78 prepared under the same conditions (preparation condition 1 and preparation condition 2 in Table 1, respectively). Shown in.
  • the latex carrying the antibody (Anti-CRP Ab-K78) in which the C-terminal lysine of the antibody heavy chain is not deficient is the antibody (Anti) in which the C-terminal lysine is deficient.
  • Anti the degree of aggregation is larger than that of the latex carrying CRP Ab-K26), and highly sensitive measurement is possible.

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Abstract

粒状担体と、上記粒状担体に担持された、標的抗原に対する抗体と、を含有する不溶性粒子であって、上記抗体の重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである、不溶性粒子を開示する。

Description

標的抗原の測定方法並びにそれに用いる不溶性粒子及び標的抗原測定用キット
　本発明は、標的抗原の測定方法並びにそれに用いる不溶性粒子及び標的抗原測定用キットに関する。
　免疫反応を利用した標的抗原の測定方法として、ラテックスなどの粒状担体を利用する方法がある。標的抗原に特異的な抗体が結合された粒状担体は、標的抗原が存在すると、抗原抗体反応を生じる。そして、その特異性及び親和力により、標的抗原を橋渡しにして互いに結合し、凝集する。生じた凝集塊の有無及び凝集の程度により、標的抗原の有無及び存在量が測定される。
　特許文献１では、特定のアミノ酸配列を含み、親水化処理された樹脂表面の固相に対して特異的な吸着機能を発現させるペプチドが開示されており、かかるペプチドを介して固相に効率よく抗体を結合させる方法が提案されている。
特許第５５５３３３６号公報
　特許文献１の方法では、本来存在しないアミノ酸配列が抗体に付加されているため、非特異的な反応及び抗体の発現量の低下といった、好ましくない特性が抗体に付与される可能性がある。本発明の課題の一つは、かかる問題点が生じない、標的抗原の測定方法を提供することにあり、また、かかる測定方法に利用可能な不溶性粒子を提供することにある。
　通常、抗体の重鎖のＣ末端リジンは、カルボキシペプチダーゼによる翻訳後修飾により除去されるため、一般的に使用される抗体の重鎖はＣ末端リジンが除去されている。本発明者らは、抗体の重鎖のＣ末端にリジンが存在することで、抗体の不溶性粒子への結合量が増加し、抗原抗体反応が生じたときの不溶性粒子の凝集能に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明の一側面は、粒状担体と、上記粒状担体に担持された、標的抗原に対する抗体と、を含有する不溶性粒子であり、上記抗体の重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである。
　上記不溶性粒子はラテックス粒子とすることができる。
　上記抗体はＩｇＧとすることができる。また、ＩｇＧのＦｃ領域は、配列番号１～１３のいずれか一つのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｃ末端アミノ酸がリジンであるポリペプチドであってよく、ＩｇＧのＦｃ領域は、配列番号１～１３のいずれか一つのアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
　本発明の他の一側面は、上記不溶性粒子を含む、又は上記不溶性粒子を調製するための抗体及び粒状担体を含む、標的抗原測定用キットである。
　上記キットは、被験試料中の標的抗原の有無を定性的に評価するための、又は被検試料中の標的抗原の濃度を定量的に評価するためのキットとすることができる。
　本発明の他の一側面は、上記不溶性粒子を用いる標的抗原の測定方法である。
　上記測定方法は、上記不溶性粒子と標的抗原を含有し得る被験試料を接触させる工程、並びに上記抗体及び上記標的抗原の抗原抗体反応による上記不溶性粒子の凝集反応を測定する工程、を含むことができる。
　上記測定方法は、被験試料中の標的抗原の有無を定性的に評価するための、又は被検試料中の標的抗原の濃度を定量的に評価するための方法とすることができる。
　本発明により、抗原抗体反応が生じたときの凝集能に優れた不溶性粒子を提供することができる。凝集能に優れた不溶性粒子を使用することで、標的抗原の高感度な検出が期待できる。
抗ＩｇＥ抗体感作ラテックスの凝集反応の結果を示すグラフである。 抗ＣＲＰ抗体感作ラテックスの凝集反応の結果を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
　一実施形態に係る不溶性粒子は、粒状担体と、上記粒状担体に担持された、標的抗原に対する抗体と、を含有しており、上記抗体の重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである。重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである抗体は、粒状担体への結合能が高い。また、重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである抗体を含有する不溶性粒子は、抗原抗体反応が生じたときの凝集能に優れる。
　標的抗原は、例えば、ＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白質）、前立腺特異抗原、フェリチン、β－２マイクログロブリン、ミオグロビン、ヘモグロビン、アルブミン、クレアチニン等のタンパク質マーカー、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等の免疫グロブリン、各種腫瘍マーカー、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ＴＧ等のリポ蛋白、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、アストロウイルス、ＨＡＶ、ＨＢs、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ等のウイルス抗原、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、レジオネラ属菌、炭疽菌、ＭＲＳＡ等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ脂質抗原、ヒト絨毛製ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミンＢ類等のビタミン類、プロスタグランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、農薬、環境ホルモン等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
　粒状担体は、ラテックス粒子、セラミック粒子、アルミナ粒子、シリカ－アルミナ粒子、カーボンブラック粒子等の粒子が挙げられる。これらの粒子の中ではラテックス粒子が好ましい。ラテックスの材質は、例えば、ポリスチレン、ジビニルベンゼン等が挙げられ、ポリスチレンであることが好ましい。粒状担体の平均粒径は０．１～５μｍとすることができる。なお、粒状担体の粒径は、動的光散乱法によって測定することができる。本明細書において「平均粒径」とは、動的光散乱法によって得られた体積基準の粒径の分布曲線において、小粒径からの積算値が全体の５０％に達した時の粒径（メディアン径）を意味する。
　抗体は、標的抗原に特異的に結合し得るものであれば特に制限されず、例えば、ＩｇＧとすることができる。ＩｇＧは２本の重鎖（Ｈ鎖）及び２本の軽鎖（Ｌ鎖）から構成される。重鎖はＮ末端から順に、可変領域（ＶＨ）、第一定常領域（ＣＨ１）、第二定常領域（ＣＨ２）及び第三定常領域（ＣＨ３）から構成されている。軽鎖はＮ末端から順に、可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）から構成されている。ＣＨ２及びＣＨ３から構成される部分がＦｃ領域である。１本の重鎖と１本の軽鎖は、ＣＨ１に存在するシステイン残基及びＣＬに存在するシステイン残基のジスルフィド結合により結合している。また、重鎖同士は、ＣＨ１とＣＨ２の間に位置するヒンジ領域に存在するシステイン残基同士のジスルフィド結合により結合している。抗体は、重鎖が存在するＩｇＧの断片であってもよく、１本の重鎖及び１本の軽鎖から構成されるｒＩｇＧ（還元型ＩｇＧ）であってもよく、２本の重鎖から構成される断片であってもよく、１本の重鎖から構成される断片であってよい。２本の重鎖が存在する抗体において、少なくとも一方の重鎖のＣ末端がリジンであればよく、両方の重鎖のＣ末端がリジンであってもよい。
　抗体がＩｇＧである場合、そのＦｃ領域は、配列番号１～１３のいずれか一つのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｃ末端アミノ酸がリジンであるポリペプチドであることが好ましく、配列番号１～１３のいずれか一つのアミノ酸配列からなるポリペプチドであることがより好ましい。配列番号１～１３のいずれか一つのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｃ末端アミノ酸がリジンであるポリペプチドは、エフェクター機能を有することが好ましい。Ｆｃ領域の有するエフェクター機能が維持されたポリペプチドは、不溶性粒子への結合効率も高くなる。
　ここで、配列番号１は、Protein Accession No. P01857 (human Ig gamma-1 C region)であり、配列番号２は、Protein Accession No. P01859 (human Ig gamma-2 C region)であり、配列番号３は、Protein Accession No. P01860 (human Ig gamma-3 C region)であり、配列番号４は、Protein Accession No. P01861 (human Ig gamma-4 C region)であり、配列番号５は、Protein Accession No. P01868 (mouse Ig gamma-1 C region)であり、配列番号６は、Protein Accession No. P01863 (mouse Ig gamma-2a C region)であり、配列番号７は、Protein Accession No. P01867 (mouse Ig gamma-2b C region)であり、配列番号８は、Protein Accession No. P03987 (mouse Ig gamma-3 C region)であり、配列番号９は、Protein Accession No. P20759 (rat Ig gamma-1 C region)であり、配列番号１０は、Protein Accession No. P20760 (rat Ig gamma-2a C region)であり、配列番号１１は、Protein Accession No. P20761 (rat Ig gamma-2b C region)であり、配列番号１２は、Protein Accession No. P20762 (rat Ig gamma-2c C region)であり、配列番号１３は、Protein Accession No. P01870 (rabbit Ig gamma C region)である。
　重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである抗体は、遺伝子組み換え植物により作製することができる。遺伝子組み換え植物により作製した抗体は、重鎖のＣ末端リジンが欠損し難いという特性がある。かかる抗体は、植物一過性発現系を用いることで作製することができ、例えば、特許第５０１５０１２号公報に記載の方法を利用することができる。かかる方法で作製した抗体はカルボキシペプチダーゼによる翻訳後修飾を受けにくいため、重鎖のＣ末端リジンが維持された抗体を得られやすい。また、重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである抗体は、カルボキシペプチダーゼを欠損させた哺乳動物細胞を発現宿主に用いた遺伝子組換え体としても得る事が可能である。その場合の哺乳動物細胞としては、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞やＨＥＫ２９３（Ｈｕｍａｎ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｋｉｄｎｅｙ　ｃｅｌｌｓ　２９３）細胞等が挙げられるが、この限りではない。更に遺伝子組換え体として得る手法に関しても、自立複製能を欠いたプラスミドベクターやウイルスベクターを用いたｔｒａｎｓｉｅｎｔ発現系や、核移行性シグナルを付与し且つ自立複製能を有したｅｐｉｓｏｍａｌ　ｖｅｃｔｏｒを用いたｓｅｍｉ－ｓｔａｂｌｅ発現系、また目的遺伝子を発現宿主のゲノムへ挿入したｓｔａｂｌｅ発現系等が挙げられ、特に限定されるものではない。
　粒状担体と重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである抗体の結合は、一般的な手法、例えば、物理吸着法及び化学結合法などを用いることができる。
　一実施形態の標的抗原の測定方法は、粒状担体と、上記粒状担体に担持された、標的抗原に対する抗体とを含有し、上記抗体の重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである不溶性粒子を用いる。かかる測定方法は、被験試料中の標的抗原の有無を定性的に評価するために、又は被検試料中の標的抗原の濃度を定量的に評価するために行うことができる。
　一実施形態において、上記測定方法は、粒状担体と、上記粒状担体に担持された、標的抗原に対する抗体とを含有し、上記抗体の重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである不溶性粒子と標的抗原を含有し得る被験試料を接触させる工程、並びに上記抗体及び上記標的抗原の抗原抗体反応による上記不溶性粒子の凝集反応を測定する工程、を含む。上記不溶性粒子は、調製済みのものを用いてもよく、測定に際して、粒状担体と重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである抗体とを結合させることにより調製してもよい。
　粒状担体と、上記粒状担体に担持された、標的抗原に対する抗体とを含有し、上記抗体の重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである不溶性粒子を含む懸濁液と被検試料とを混合することで、上記不溶性粒子と標的抗原を含有し得る上記被験試料を接触させることができる。両者を接触させると、上記被検試料中に含まれる標的抗原と上記不溶性粒子に含まれる抗体との間の相互作用によって上記不溶性粒子が凝集し、懸濁液の吸光度が変化する。この吸光度の変化量（エンドポイント法）又は変化率（レート法）を測定する。測定は、比濁法又は比色法が好適に用いられる。例えば、セル外部より可視光から近赤外域の光、通常３００ｎｍ～１０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ～９００ｎｍの光を照射し、吸光度変化又は散乱光の強度変化を検出することにより、上記不溶性粒子の凝集反応が測定される。
　凝集反応を行う時間は、１分～３０分とすることができ、好ましくは１分～１０分であるが、これらに限られない。凝集反応を行う温度は、３５℃～４０℃とすることができ、３６～３８℃とすることもできるが、これらに限られない。
　測定すべき標的抗原を種々の既知濃度で含む複数の標準試料を準備し、それらについて上記方法により吸光度の変化量又は変化率を測定する。標準試料中の測定すべき抗原の濃度を横軸、測定された吸光度の変化量又は変化率を縦軸にプロットして検量線を描く。未知の被検試料についても同じ方法により吸光度の変化量又は変化率を測定し、測定結果を上記検量線に当てはめることにより、被検試料中の標的抗原を定量的に評価することができる。また、あらかじめ吸光度の変化量又は変化率の閾値を設定しておき、閾値を超えた場合に被験試料中に標的抗原が存在すると定性的に評価することができる。
　被験試料は、標的抗原を含有し得るものであれば特に限定されないが、血液、血清、血漿、尿、便、唾液、組織液、髄液、ぬぐい液等の体液等又はその希釈物が挙げられ、血液、血清、血漿、尿、便、髄液又はこれらの希釈物が好ましい。
　一実施形態に係る標的抗原測定用キットは、粒状担体と、上記粒状担体に担持された、標的抗原に対する抗体とを含有し、上記抗体の重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである不溶性粒子を含む。標的抗原測定用キットは、被験試料中の標的抗原の有無を定性的に評価するため、又は被検試料中の標的抗原の濃度を定量的に評価するために用いることができ、より具体的には、上記標的抗原の測定方法に用いることができる。
　一実施形態において、標的抗原測定用キットは、上記不溶性粒子を調製するための抗体及び粒状担体を含む。本実施形態にかかる標的抗原測定用キットは、測定に際して抗体及び粒状担体を結合させて上記不溶性粒子を調製する。
　標的抗原測定用キットは、さらに、陽性対照又は検量線作成に用いるための標的抗原を含んでいてもよく、被験試料を希釈する緩衝液、不溶性粒子と被検試料とを混合するための緩衝液、抗体と粒状担体とを結合させるための緩衝液などを含んでいてもよい。
実施例１
１．抗ＩｇＥ抗体の作製
　重鎖の定常領域が配列番号５からなる抗体を以下の方法で作製した。
１．１．重鎖のＣ末端リジンが欠損した抗ＩｇＥ抗体（Ａｎｔｉ－ＩｇＥ　Ａｂ－Ｋ０）の作製
　抗ＩｇＥ抗体産生ハイブリドーマをマウスの腹腔内に投与し数日～数十日後に腹水を採取した。腹水をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａカラムクロマトグラフィーにかけることで不純物を除去した。
１．２．重鎖のＣ末端リジンが欠損していない抗ＩｇＥ抗体（Ａｎｔｉ－ＩｇＥ　Ａｂ－Ｋ６７）の作製
　特許第５０１５０１２号公報に記載の植物一過性発現系で調製した。抗ＩｇＥ抗体の軽鎖はタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベクター（Ｉｃｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）にクローニングし、各重鎖（ＣＨ３欠損体又はＣＨ２欠損体を含む）はジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）ベクター（Ｉｃｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）にクローニングした。これらのベクターをそれぞれ別々のアグロバクテリウムに導入して形質転換して培養した後、培養液の混合液をニコチアナベンサミアーナの葉にインフィルトレーションし、１週間ほどで収穫した。収穫した葉（感染葉）を凍結した。
　凍結した感染葉２００ｇを量りとり、カッターミキサーで粉砕した。粉砕物に抽出溶液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ　ＮａＣｌ、４０ｍＭ　アスコルビン酸ナトリウム）５００ｍＬを添加し、感染葉を繰り返し粉砕した。遠心分離して上清を回収した。回収した液を硫安沈殿により濃縮した後、０．２２μｍフィルターで濾過した。濾過液をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａカラムクロマトグラフィーにかけることで純物を除去した。
２．抗ＩｇＥ抗体重鎖Ｃ末端リジンの分析
　精製した抗ＩｇＥ抗体を還元アルキル化及び酵素消化（Ｔｒｐｓｉｎ／Ｌｙｓ－Ｃ）し、ＬＣ－ＭＳでタンパク質のアミノ酸配列を解析した。マウス腹水法で調製した抗ＩｇＥ抗体（Ａｎｔｉ－ＩｇＥ　Ａｂ－Ｋ０）の重鎖Ｃ末端のリジンは完全に欠損していた。一方で、植物一過性発現系で調製した抗ＩｇＥ抗体（Ａｎｔｉ－ＩｇＥ　Ａｂ－Ｋ６７）の重鎖Ｃ末端リジンは全体の３３％しか欠損が認められなかった。
３．抗ＩｇＥ抗体のラテックス凝集試験
　以下の手順に従い、得られた抗体のラテックスへの結合効率を評価した。
（１）試薬の調製
　抗ＩｇＥ抗体を用いて、以下の通りに免疫凝集法による測定試薬を調製した。
ｉ）抗体をポリスチレンラテックス浮遊液１ｍＬに対し０．１ｍｇ担持させてなる感作粒子を、０．１％となるように緩衝液（グリシン、ｐＨ７．３）中で懸濁し、ラテックス浮遊液を調製した。
ｉｉ）緩衝液（グリシン、ｐＨ８．３）を準備した。
（２）自動分析装置による測定
　自動分析装置は日立社製７１８０型自動分析装置によりエンドポイント法で自動測定を行った。上記の通りに調製した試薬を用いて、各濃度の抗原（ＩｇＥ）の測定を行った。ＩｇＥ溶液３．５μＬに対し、上記（１）で調製した緩衝液１４０μＬを添加し、この混合液を３７℃で撹拌混合した。５分間放置後、ラテックス浮遊液７０μＬを添加し、更に３７℃で撹拌混合した。約５分間の凝集反応を吸光度変化量として測定した。
　調製条件（抗体とラテックスの量）を変化させたときの結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示した結果から明らかなように、抗体重鎖のＣ末端リジンが欠損していない抗体（Ａｎｔｉ－ＩｇＥ　Ａｂ－Ｋ６７）は、Ｃ末端リジンが欠損している抗体（Ａｎｔｉ－ＩｇＥ　Ａｂ－Ｋ０）に比べ、効率良くラテックスに結合することを確認した。
　同一条件で調製したＡｎｔｉ－ＩｇＥ　Ａｂ－Ｋ０及びＡｎｔｉ－ＩｇＥ　Ａｂ－Ｋ６７の感作ラテックス（それぞれ表１の調製条件１と調製条件２）で抗原との反応による凝集度を評価した結果を図１に示す。図１に示した結果から明らかなように、抗体重鎖のＣ末端リジンが欠損していない抗体（Ａｎｔｉ－ＩｇＥ　Ａｂ－Ｋ６７）を担持するラテックスは、Ｃ末端リジンが欠損している抗体（Ａｎｔｉ－ＩｇＥ　Ａｂ－Ｋ０）を担持するラテックスに比べ、凝集度が大きく、高感度な測定が可能であることを確認した。
実施例２
１．抗ＣＲＰ抗体の作製
　重鎖の定常領域が配列番号１からなる抗体を以下の方法で作製した。
１．１．重鎖のＣ末端リジンが欠損した抗ＣＲＰ抗体（Ａｎｔｉ－ＣＲＰ　Ａｂ－Ｋ２６）の作製
　以下のＣＨＯ一過性発現系を用いて調製した。
　抗ＣＲＰ抗体の重鎖と軽鎖をｐｃＤＮＡ３．４ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）にクローニングした。これらのベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）にトランスフェクションし１２日間培養後、細胞を遠心除去し、培養上清を回収した。
　回収した培養上清をステリカップ－ＧＶ，０．２２μｍ，ＰＶＤＦ（メルク社製）を用いてろ過し、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａカラムクロマトグラフィーにかけることで抗ＣＲＰ抗体を精製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａカラムクロマトグラフィーについての操作手順は以下のとおりである。ろ過した培養上清をＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅカラム（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）にアプライし、ＰＢＳ溶液（メルク社のＯｍｎｉＰｕｒ　１０Ｘ　ＰＢＳ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを超純水で１０倍希釈した溶液）で洗浄した。その後、溶出溶液（１００ｍＭ　グリシンを塩酸でｐＨ３．０に調整した溶液）で抗ＣＲＰ抗体を溶出した。溶出液を中和溶液（１Ｍ　Ｔｒｉｓを塩酸でｐＨ９．０に調整した溶液）で中和し、ＰＢＳ溶液で透析した。透析は２００倍以上の容積で３回行った。透析後、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（ザルトリウス・ジャパン株式会社製）で抗ＣＲＰ抗体を濃縮し、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ　Ｓｙｒｉｎｇｅ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔ，０．２２μｍ，ＰＶＤＦ（メルク社製）を用いてろ過した。
　抗ＣＲＰ抗体の濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度が１．３８のときに抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬであるとして算出した。
１．２．重鎖のＣ末端リジンが欠損していない抗ＣＲＰ抗体（Ａｎｔｉ－ＣＲＰ　Ａｂ－Ｋ７８）の作製
　特許第５０１５０１２号公報に記載の植物一過性発現系で調製した。抗ＣＲＰ抗体の軽鎖はタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベクター（Ｉｃｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）にクローニングし、各重鎖（ＣＨ３欠損体又はＣＨ２欠損体を含む）はジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）ベクター（Ｉｃｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）にクローニングした。これらのベクターをそれぞれ別々のアグロバクテリウムに導入して形質転換して培養した後、培養液の混合液をニコチアナベンサミアーナの葉にインフィルトレーションし、１週間ほどで収穫した。収穫した葉（感染葉）を凍結した。
　凍結した感染葉２００ｇを量りとり、カッターミキサーで粉砕した。粉砕物に抽出溶液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ　ＮａＣｌ、４０ｍＭ　アスコルビン酸ナトリウム）５００ｍＬを添加し、感染葉を繰り返し粉砕した。遠心分離して上清を回収した。回収した液を硫安沈殿により濃縮した後、０．２２μｍフィルターで濾過した。濾過液をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａカラムクロマトグラフィーにかけることで純物を除去した。
２．抗ＣＲＰ抗体重鎖Ｃ末端リジンの分析
　精製した抗ＣＲＰ抗体を還元アルキル化及び酵素消化（Ｔｒｐｓｉｎ／Ｌｙｓ－Ｃ）し、ＬＣ－ＭＳでタンパク質のアミノ酸配列を解析した。マウス腹水法で調製した抗ＣＲＰ抗体（Ａｎｔｉ－ＣＲＰ　Ａｂ－Ｋ２６）の重鎖Ｃ末端のリジンは７４％欠損していた。一方で、植物一過性発現系で調製した抗ＣＲＰ抗体（Ａｎｔｉ－ＣＲＰ　Ａｂ－Ｋ７８）の重鎖Ｃ末端リジンは全体の２２％しか欠損が認められなかった。
３．抗ＣＲＰ抗体のラテックス凝集試験
　以下の手順に従い、得られた抗体のラテックスへの結合効率を評価した。
（１）試薬の調製
　抗ＣＲＰ抗体を用いて、以下の通りに免疫凝集法による測定試薬を調製した。
ｉ）抗体をポリスチレンラテックス浮遊液１ｍＬに対し０．０１ｍｇ担持させてなる感作粒子を、０．０４％となるように緩衝液（グリシン、ｐＨ７．３）中で懸濁し、ラテックス浮遊液を調製した。
ｉｉ）緩衝液（グリシン、ｐＨ７．０）を準備した。
（２）自動分析装置による測定
　自動分析装置は日立社製３５００型自動分析装置によりレート法で自動測定を行った。上記の通りに調製した試薬を用いて、各濃度の抗原（ＣＲＰ）の測定を行った。ＣＲＰ溶液２０μＬに対し、上記（１）で調製した緩衝液１９５μＬを添加し、この混合液を３７℃で撹拌混合した。約１分３０秒間放置後、ラテックス浮遊液２６μＬを添加し、更に３７℃で撹拌混合した。約２分３０秒間の凝集反応を散乱度変化量として測定した。
　調製条件（抗体とラテックスの量）を変化させたときの結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示した結果から明らかなように、抗体重鎖のＣ末端リジンが欠損していない抗体（Ａｎｔｉ－ＣＲＰ　Ａｂ－Ｋ７８）は、Ｃ末端リジンの大部分が欠損している抗体（Ａｎｔｉ－ＣＲＰ　Ａｂ－Ｋ２６）に比べ、効率良くラテックスに結合することを確認した。
　同一条件で調製したＡｎｔｉ－ＣＲＰ　Ａｂ－Ｋ２６及びＡｎｔｉ－ＣＲＰ　Ａｂ－Ｋ７８の感作ラテックス（それぞれ表１の調製条件１と調製条件２）で抗原との反応による凝集度を評価した結果を図２に示す。図２に示した結果から明らかなように、抗体重鎖のＣ末端リジンが欠損していない抗体（Ａｎｔｉ－ＣＲＰ　Ａｂ－Ｋ７８）を担持するラテックスは、Ｃ末端リジンが欠損している抗体（Ａｎｔｉ－ＣＲＰ　Ａｂ－Ｋ２６）を担持するラテックスに比べ、凝集度が大きく、高感度な測定が可能であることを確認した。

Claims (10)

  1. 　粒状担体と、前記粒状担体に担持された、標的抗原に対する抗体と、を含有する不溶性粒子であって、前記抗体の重鎖のＣ末端アミノ酸がリジンである、不溶性粒子。
  2. 　前記粒状担体はラテックス粒子である、請求項１に記載の不溶性粒子。
  3. 　前記抗体はＩｇＧである、請求項１又は２に記載の不溶性粒子。
  4. 　前記ＩｇＧのＦｃ領域は、配列番号１～１３のいずれか一つのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｃ末端アミノ酸がリジンである、請求項３に記載の不溶性粒子。
  5. 　前記ＩｇＧのＦｃ領域は、配列番号１～１３のいずれか一つのアミノ酸配列からなる、請求項３に記載の不溶性粒子。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の不溶性粒子を含む、又は請求項１～５のいずれか一項に記載の不溶性粒子を調製するための抗体及び粒状担体を含む、標的抗原測定用キット。
  7. 　被験試料中の標的抗原の有無を定性的に評価するための、又は被検試料中の標的抗原の濃度を定量的に評価するための、請求項６に記載のキット。
  8. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の不溶性粒子を用いる、標的抗原の測定方法。
  9. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の不溶性粒子と標的抗原を含有し得る被験試料を接触させる工程、並びに
    　前記抗体及び前記標的抗原の抗原抗体反応による前記不溶性粒子の凝集反応を測定する工程、
    を含む、標的抗原の測定方法。
  10. 　被験試料中の標的抗原の有無を定性的に評価するための、又は被検試料中の標的抗原の濃度を定量的に評価するための、請求項８又は９に記載の方法。
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ZHANG XINTAO; TANG HONGPING; SUN YA-TING; LIU XUPING; TAN WEN-SONG; FAN LI: "Elucidating the effects of arginine and lysine on a monoclonal antibody C-terminal lysine variation in CHO cell cultures", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, SPRINGER BERLIN HEIDELBERG, BERLIN/HEIDELBERG, vol. 99, no. 16, 7 May 2015 (2015-05-07), Berlin/Heidelberg, pages 6643 - 6652, XP035521106, ISSN: 0175-7598, DOI: 10.1007/s00253-015-6617-y *

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