WO2022148715A4 - VERFAHREN DER RING-ARRAY-BELEUCHTUNGSMIKROSKOPIE MIT GROßEN ARBEITSABSTÄNDEN UND HOHER AUFLÖSUNG - Google Patents
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Abstract
1. Bezeichnung: Verfahren der Ring-Array Beleuchtungsmikroskopie mit großen Arbeitsabständen und hoher Auflösung. 2. Kurzfassung: Lichtmikroskopisches Verfahren mit sehr großem Arbeitsabstand bei gleichzeitig sehr hoher Auflösung, das eine direkte Integration in ein fokussiertes Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskop oder in andere Systeme der Mikroskopie erlaubt. 2.1. Technisches Problem der Erfindung: Für viele Anwendungen der fokussierten Ionenstrahl Rasterelektronenmikroskopie oder anderer Methoden der Mikroskopie zur Analyse von biologischen Objekten und medizinischen Präparaten sowie von Materialproben ist es vorteilhaft, zusätzlich noch ein lichtmikroskopisches, hochaufgelöstes Bild des Objekts zu erstellen, wobei das Objekt sich bereits in dem Rasterelektronenmikroskop (oder einem anderen bildgebenden System) befindet. Das hier beschriebene Verfahren der Ring-Array Beleuchtungsmikroskopie („Ring-Array Mikroskopie") erlaubt hier eine ganz erhebliche Verbesserung der lichtoptischen Auflösung. 2.3. Anwendungsgebiet: Die Erfindung erlaubt bei großen Arbeitsabständen eine optische Auflösung, wie sie die bislang nur mit Objektiven hoher numerischer Apertur und bei geringem Arbeitsabstand möglich waren, sowie substantielle Verbesserungen in Arbeitsablauf und Analyse der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie oder anderer Abbildungsverfahren.
Claims
GEÄNDERTE ANSPRÜCHE beim Internationalen Büro eingegangen am 22 August 2022 (22.08.2022)
1 ) Ein Verfahren der korrelativen Mikroskopie, welches unter Verwendung von kohärenten Lichtquellen mit Wellenlängen im Bereich zwischen 250 nm und 1200 nm bei großen Arbeitsabständen im Abrasterungsverfahren eine im Vergleich zu Linsenobjektiven mit gleich großem Arbeitsabstand erhöhte Auflösung eines Objekts ermöglicht, und die mit dieser erhöhten Auflösung erzielte Bildgebung des Objekts mit einer durch Objektive mit gleich großen Arbeitsabstand aber niedriger Numerischer Apertur, oder aber mittels Elektronenmikroskopie oder anderen Verfahren der Ultrastrukturanalyse durchgeführten korrelativen Bildgebung desselben Objekts im selben Mikroskopsystem kombiniert; wobei die zur Objektbeleuchtung verwendeten kohärenten Lichtquellen S-i, S2, ...Si,... SN, sich in einer als Ring-Array bezeichneten flachen Anordnung befinden, welche sich in einer ringförmigen, ovalen, viereckigen, rechteckigen oder sonstig geformten ebenen Fläche mit einer in der Mitte befindlichen, von der Fläche umschlossenen Aussparung befinden;
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GEÄNDERTES BLATT (ARTIKEL 19)
wobei die SrPositionen, von denen die aufgrund der Beleuchtung des Ring- Arrays kohärenten, z.B. kollimierten, Strahlen ausgehen, im Folgenden als Lichtquellen bezeichnet werden; wobei die Verteilung der durch Beleuchtung des Ring-Arrays mit einem oder mehreren Gaslasern oder mit einem oder mehreren Festkörperlasern erzeugten Lichtquellen des Ring-Arrays gleichmäßig oder ungleichmäßig erfolgt; wobei die Lichtquellen des Ring-Arrays aus einer einzigen Anordnung oder aus verschiedenen Anordnungen von Lichtquellen - als Array-Ringe bezeichnet - mit definierten Wellenlängen, Intensitäts-, Phasen- und Polarisationseinstellungen bestehen können; wobei die Lichtquellen eines bestimmten Array-Rings des Ring-Arrays mit einer bestimmten Wellenlänge durch Beleuchtung mit einer bestimmten kohärenten Laserstrahlung generiert werden; wobei die Anzahl der Lichtquellen je Array-Ring mit gleichen optischen Eigenschaften zwischen N = 10 und N = 1.000 betragen kann, für alle Lichtquellen im Ring-Array zusammen maximal 10.000; wobei diese Lichtquellen in Bezug auf den Schnittpunkt von Optischer Achse und Objektebene über einen Raumwinkel Qarray = 4p - Qcenter - ßbottom verteilt sind; wobei die Raumwinkel Qcenter und Qbottom minimal mindestens 0.01 p betragen; wobei der durch den Raumwinkel Qcenter gegebene innere Bereich des Ring- Arrays die für eine korrelative Mikroskopie mit einem Lichtobjektiv geringer Numerischer Apertur bzw. für eine korrelative Elektronenmikroskopie oder andere Verfahren der Ultrastrukturmikroskopie benötigten Elemente enthält;
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GEÄNDERTES BLATT (ARTIKEL 19)
wobei durch geeignete, z.B. mithilfe von dielektrischen Piezospiegeln, Spatial Light Modulators, Digital Mirror Arrays, diffraktiven Elementen, polarisationsändernden Elementen, Glasfaseranordnungen oder anderen erfindungsgemäßen Verfahren nach dem Stand der Technik, Anpassungen der von einem bestimmten Array-Ring des Ring-Arrays emittierten kohärenten Emissionen mit definierten, individuell einstellbaren Ausbreitungsrichtungen, Intensitäten, Phasen- und Polarisationsbeziehungen auf der Grundlage numerischer skalarer bzw. elektromagnetischer Simulationsrechnungen oder mittels experimenteller Kalibrierungen, derart vorgenommen werden, dass mittels konstruktiver Interferenz der vom kohärent beleuchteten Ring-Array bzw. von kohärent beleuchteten Array-Ringen ausgehenden kohärenten Strahlen im Objekt eine zur optischen Analyse mit erhöhter Auflösung geeignete Intensitätsverteilung erzeugt wird; wobei die Erzeugung der vom Ring-Array emittierten kohärenten, insbesondere auch kollimierten Strahlen einer bestimmten Ring-Array Anordnung von Lichtquellen mit einer bestimmten Wellenlänge mit definierten Intensitäts-, Phasen- und Polarisationsbeziehungen durch Beleuchtung des Ring-Arrays bzw. einer bsteimmten Array-Ring Anordnung erfolgt, indem kohärentes Licht einer bestimmten Wellenlänge von einer einzelnen Laserlichtquelle durch geeignete Spiegelkonfigurationen oder einer auf Glasfasern basierenden Anordnung gemäß dem Stand der Technik zu den gewünschten Positionen der Lichtquellen S-i, S2,...SN in der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung geleitet werden; wobei die Lichtquellen S-i, S2, ..., SN, die kohärente Lichtstrahlen erzeugen, an bestimmten Stellen (x,, y,; i = 1 , ..., N,) in der Ring-Array Anordnung positioniert sind, mit definierten, individuell einstellbaren Ausbreitungsrichtungen, Intensitäten, Phasen- und Polarisationsbeziehungen; wobei entsprechend konfigurierte diffraktive optisches Elemente (DOEs) oder ein räumlicher Lichtmodulator (SLM) verwendet werden können;
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GEÄNDERTES BLATT (ARTIKEL 19)
wobei die Orte der Lichtquellen S, (i = zusätzliche optische Elemente nach dem Stand der Technik enthalten können, um individuell die Richtung, Phase, Polarisation oder die Leistung der emittierten Strahlen ändern zu können; wobei die Kalibrierung der Phasenbeziehungen zwischen den von den N Lichtquellen S-i, S2, ...SN emittierten kohärenten Strahlen auch mit Hilfe von Kalibrierungsobjekten erfolgen kann, deren relative Phase zwischen jeweils zwei unter einem bestimmten Winkel gegeneinander stehenden und somit interferierenden Wellen so modifiziert wird, dass die Intensität des von der Detektionsoptik erhaltenen detektierten Signals an einer gegebenen Position in der Objektebene maximiert wird, und die Phasenanpassungen nacheinander durchgeführt werden; wobei die Detektion der Signalantwort durch optische Elemente erfolgt, die sich außerhalb des vom Ring-Array belegten Raumwinkels Qarray = 4p - Qcenter ^bottom befinden, wobei die zur Detektion der Signalantwort genutzten, außerhalb des Raumwinkels Qarray befindlichen optischen Elemente aus Linsensystemen, detektierenden endoskopischen Faserelementen oder anderen optischen Bauelementen bestehen können, mit deren Hilfe das vom Objekt emittierte Licht einem oder mehreren Detektoreinrichtungen zugeleitet wird; wobei der Arbeitsabstand, der durch den Mindestabstand des Objekts zu den Lichtquellen S-i, S2,...SN im Ring-Array gegeben ist, so gewählt werden kann, dass er zwischen 0,5 cm und 50 cm beträgt.
2) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Phasen, Polarisationen, Richtungen und Intensitäten des kohärenten, z.B. kollimierten Lichts, das gemäß einem oder mehreren der vorherigen Ansprüche erzeugt
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GEÄNDERTES BLATT (ARTIKEL 19)
wurde, mittels der durch numerische Simulationsrechnungen erhaltenen Werte und/oder durch experimentelle Kaslibrierung so angepasst werden, dass in der Objektebene eine fokussierte Intensitätsverteilung mit einem Hauptmaximum erhalten wird;
3) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Phasen, Polarisationen, Richtungen und Intensitäten des kohärenten, z.B. kollimierten Lichts, das gemäß einem oder mehreren der vorherigen Ansprüche erzeugt wurde, mittels der durch numerische Simulationsrechnungen erhaltenen Werte und/oder durch experimentelle Kaslibrierung so angepasst werden, dass in der Objektebene eine Intensitätsverteilung erhalten wird, die einer Donutstruktur zur Verwendung in der STED/MINFLUX Mikroskopie entspricht.
4) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Phasen, Polarisationen, Richtungen und Intensitäten der kohärenten Lichtstrahlen, die gemäß einem oder mehreren der vorherigen Ansprüche erzeugt wurden, so eingestellt werden, dass in der Objektebene eine Intensitätsverteilung mit einer Anzahl von Hauptmaxima erhalten wird, die durch mindestens eine halbe Wellenlänge der vom Ring-Array emittierten kohärenten Strahlung getrennt sind, die zur Beleuchtung der Ring-Array Anordnung verwendet wird.
5) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei zwei oder mehr verschiedene Array-Ring Anordnungen kohärenter Lichtquellen derart verwendet werden, dass unterschiedliche Anregungswellenlängen genutzt werden.
6) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie, wobei periodische Intensitätsverteilungen mit einer Anzahl von Hauptmaxima erhalten werden, die durch mindestens eine halbe Wellenlänge der vom Ring- Array emittierten kohärenten Strahlung getrennt sind, die zur Verbesserung der
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GEÄNDERTES BLATT (ARTIKEL 19)
Auflösung nach dem Prinzip der Mikroskopie mit Strukturierter Beleuchtung genutzt werden.
7) Ein optisches Verfahren der korrelativen Mikroskopie gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der ein, zwei oder mehr Sätze von gepulsten kohärenten Lichtquellen mit verschiedenen Wellenlängen angewandt werden, die im Objekt Fluoreszenzanregungen mit gleichen oder unterschiedlichen Fluoreszenzdetektionslebensdauern erlauben.
8) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die von den kohärenten Lichtquellen S-i, S2,... SN der von der Ring-Array Anordnung emittierten Strahlen alle die gleiche Intensität haben.
9) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die von der Ring- Array Anordnung emittierten kohärenten Strahlen sphärische Wellen mit einem gegebenen Öffnungswinkel sind.
10) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der die von den kohärenten Lichtquellen S-i, S2,... SN der Ring-Array Anordnung emittierten Strahlen individuell unterschiedlich einstellbare Intensitäten aufweisen können, einschließlich einer Intensität von Null für mehrere oder die meisten Lichtquellen.
11 ) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine bestimmte Anzahl S , S2*,... SL* der kohärenten Lichtquellen einer Ring-Array Anordnung verwendet wird, um bei einer Wellenlänge ASTED eine Donutförmige Intensitätsverteilung in der Objektebene zur Nutzung in STED Mikroskopie zu erzeugen, während eine andere Anzahl von Lichtquellen S1 **, S2 **, S3 **, ... SM ** der Ring-Array Anordnung dazu verwendet wird, eine fokale Anregungsverteilung der Intensität mit einem Flauptmaximum zu erzeugen, um
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GEÄNDERTES BLATT (ARTIKEL 19)
die Fluoreszenz gemäß dem Stand der Technik der STED-Mikroskopie anzuregen.
12) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine bestimmte Anzahl S , S2*,... SL* der Quellen einer Ring-Array Anordnung verwendet wird, um in der Objektebene eine zur Nutzung in der Einzelmolekülmikroskopie geeignete Intensitätsverteilung zu erzeugen.
13) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine bestimmte Anzahl S-i*, S2 *,... SL* der Lichtquellen einer Ring-Array Anordnung verwendet wird, um bei einer Wellenlänge AMINFLUX eine Donut-förmige Intensitätsverteilung in der Objektebene zur Nutzung in der MINFLUX Mikroskopie zu erzeugen.
14) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine bestimmte Anzahl S-i*, S2 *,... SL* der kohärenten Lichtquellen einer Ring-Array Anordnung verwendet wird, um in der Objektebene eine zur Nutzung in der
Einzelmolekülmikroskopie oder Einzelmolekülspektroskopie geeignete Intensitätsverteilung zu erzeugen.
15) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine bestimmte Anzahl S-i*, S2 *,... SL* der kohärenten Lichtquellen einer Ring-Array Anordnung verwendet wird, um in der Objektebene eine zur Nutzung in der
Materialbearbeitung oder in der Photochemie geeignete Intensitätsverteilung zu erzeugen, z.B. auch für das präzise Aktivieren von caged Compounds, womit man lokal zelluläre Prozesse auslösen, steuern kann.
16) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine bestimmte Anzahl S1*, S2*,... SL* der Lichtquellen einer Ring-Array Anordnung verwendet wird, um mithilfe einer geeigneten Intensitätsverteilung an
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GEÄNDERTES BLATT (ARTIKEL 19)
Oberflächenstrukturen wie z.B. optischen oder elektronischen Bauteilen kleine Verunreinigungen zu entfernen oder Unebenheiten zu beseitigen.
17) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der die von der Ring-Array Anordnung emittierten Strahlen im Raum so verteilt werden, dass sie Vorrichtungen zur funktionsgerechten Objekthalterung, Elektronenanregung und Elektronendetektion in einem Focused-Ion Beam Scanning Elektronenmikroskop, FIB-SEM genannt, einem atomaren Rasterkraftmikroskop, oder einer anderen Elektronenmikroskopischen oder mit anderen ionisierten Teilchen nutzbaren Vorrichtung erlauben.
18) Eine Optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der die von der Ring-Array Anordnung emittierten Strahlen im Raum so verteilt werden, dass sie anstelle einer FIB-SEM Anordnung zusätzliche Vorrichtungen zur funktionsgerechten Objekthalterung, Anregung mit Röntgenlicht und Detektion des durch das Röntgenlicht induzierten Signals in einer Röntgenmikroskop Anordnung erlauben.
19) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die durch Beleuchtung des Ring-Arrays mit einem oder mehreren Gaslasern oder mit einem oder mehreren Festkörperlasern oder mit anderen Verfahren erzeugte kohärente Emission der Lichtquellen des Ring-Arrays einer Mehrkanalphasenmodulation durch endoskopische Fasern unterzogen wird, die mit einem Prisma oder einer anderen optischen Grenzfläche an der Faserspitze ausgestattet sind, um die Strahlrichtung einzustellen, und die durch konstruktive Interferenz in die Objektebene fokussiert werden, um eine maximale Intensitätsverteilung für eine punktförmige Beleuchtung oder eine Donut-förmige Intensitätsverteilung für die STED- oder MINFLUX Mikroskopie, oder eine nicht fokussierte strukturierte Anregung, oder eine Lichtblattanregung zu erzeugen, wobei die maximale Anzahl der verwendeten endoskopischen Fasern pro Array-Ring Anordnung auf 200 begrenzt wird.
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GEÄNDERTES BLATT (ARTIKEL 19)
20) Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Intensitäten, Richtungen Polarisationen und Phasen der Lichtquellen derart eingestellt werden, dass eine Intensitätsverteilung entsprechend einem Lichtblatt gemäß den Erfordernissen der Lichtblattmikroskopie in einer gegebenen Richtung in Bezug auf den Brennpunkt und die optische Achse erzeugt wird.
21)Eine optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche bezüglich des für die Beleuchtung verwendeten Raumwinkels, der dem eines auf Objektivlinsen basierenden Mikroskopiesystems entspricht, wobei die Intensitäten und Phasen der Lichtquellen so eingestellt werden, dass die Position und die Richtung der Intensitätsverteilung in der Objektebene in Bezug auf die optische Achse innerhalb des Raumwinkels Qarray um beliebige Winkel gedreht werden kann.
22)Optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Beleuchtungsstrahlen innerhalb eines Raumwinkels Qarray so angeordnet sind, dass die Vorrichtungen eines fokussierten lonenstrahl- Rasterelektronenmikroskops oder anderen korrelativer Vorrichtungen, die zur Beleuchtung, Detektion und Halterung des zu untersuchenden Objekts verwendet werden, frei sind von Beleuchtungsstrahlen, sodass eine direkte Integration in ein solches fokussiertes lonenstrahl-Rasterelektronenmikroskop oder in ein anderes System der Ultrastrukturmikroskopie oder der korrelativen Lichtmikroskopie zur Analyse von biologischen und Materialproben ermöglicht wird. Dies können z.B. jede Form von Rasterelektronenmikroskopen, Röntgenmikroskopen atomarer Rasterkraftmikroskope oder Lichtmikroskope sein.
23)Optische Vorrichtung und Verfahren der korrelativen Mikroskopie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der die erfindungsgemäß in der Objektebene erzeugte Intensitätsverteilung dazu verwendet wird, um Seriendünnschnitte, aufgebracht auf einen elektrisch leitenden, flachen Träger, im Rastermikroskop sowohl lichtoptisch wie elektronenoptisch zu analysieren,
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GEÄNDERTES BLATT (ARTIKEL 19)
um damit ein 3D Volumen von präzise lokalisierten Fluoreszenz- und Ultrastrukturaufnahmen zu erhalten, wobei diese Methode auch mit Serial Block Face Scanning Elektronenmikroskopie Methoden verwendet werden kann, einem Rastermikroskop Verfahren mit eingebautem Mikrotom, das automatisch Schnitte erzeugt, die direkt Elektronen- und mit dem Ring-Array Prinzip lichtoptisch aufgenommen werden.
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GEÄNDERTES BLATT (ARTIKEL 19)
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 22706505 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 22706505 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |